CN115491307B - 一种细胞和基因治疗中用于细胞培养的pet膜及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种细胞和基因治疗中用于细胞培养的PET膜及应用,涉及细胞培养加工技术领域,所述的PET膜为长轴式卷膜,螺旋卷曲后整体形成圆柱状的膜柱,其中,PET膜的结构为规则的纵横交错设置的膜网支架结构;该PET膜的膜表面经过硬化处理之后的硬化值在3H‑4H之间;该PET膜内部的纤维呈网格状,且纤维直径在20‑30μm范围之间;在干燥条件下,该PET膜的拉伸强度在3‑6.5MPa范围之间;该PET膜具有亲水性;该PET膜整体呈透明无色,透光率大于90%。本发明的PET膜,针对贴壁细胞能进行大规模3D培养,对于研究细胞生理状态和活动有更科学的借鉴意义。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域,具体涉及到一种细胞和基因治疗中用于细胞培养的PET膜及应用。
背景技术
细胞治疗和基因治疗(CGT)可在分子层面通过基因表达、沉默或体外改造的手段来实现疗法升级或治疗罕见病。细胞培养技术广泛应用于生物学研究、疾病诊断、组织工程、药物筛选等技术领域,该技术也是实现CGT规模化生产的技术核心。用于3D细胞培养体系中的PET(Polyethylene terephthalate)膜,是一种新型的细胞培养材料,为贴壁细胞的生长繁殖提供了一种三维立体环境。传统的2D细胞培养器皿,与体内细胞真实生长环境存在着较大差异,导致细胞生长特性及功能一定程度上发生改变,PET膜是一种与体内生理状态更加接近的实验材料,这种3D细胞培养体系更好地模拟了体内细胞生长的微环境,且容易实现规模放大。
现有3D细胞培养主要是无支架培养体系,即通过悬滴让细胞在重力的作用下自组装形成的微球体或微载体材料。然而,这些方法实验操作复杂度较高、装置耗材成本昂贵,人员需要额外的技术培训,需制备的细胞接种量较大。因此,在细胞培养领域需要一种简单高效的、性价比高、适用于贴壁细胞规模化培养的实验材料。
发明内容
针对现有技术所存在的不足,本发明目的在于提出一种细胞和基因治疗中用于细胞培养的PET膜,具体方案如下:
一种细胞和基因治疗中用于细胞培养的PET膜,所述的PET膜为长轴式卷膜,螺旋卷曲后整体形成圆柱状的膜柱,其中,PET膜的结构为规则的纵横交错设置的膜网支架结构;
该PET膜的膜表面经过硬化处理之后的硬化值在3H-4H之间;
该PET膜内部的纤维呈网格状,且纤维直径在20-30μm范围之间;
在干燥条件下,该PET膜的拉伸强度在3-6.5MPa范围之间;
该PET膜具有亲水性;
该PET膜整体呈透明无色,透光率大于90%。
致密结构的PET膜经螺旋卷曲后形成的圆柱体多层膜网结构,对细胞有良好的拦截作用,并且在初期进行细胞接种时,浓稠的细胞悬液可以穿过膜的层层孔隙,另细胞均匀地固定于立体的3D培养系统,实现均一分布;
PET膜的纤维呈网格状多孔隙的结构,传质阻力较小,利于液体在孔隙间的穿梭流动,培养基液流可以顺利地穿过膜网,没有死角地与细胞进行充分接触,使细胞全方位地充分接触培养基,在扩增阶段吸收的营养物质均衡,故细胞的生长状态更均匀,细胞存活率更高。
进一步的,所述的PET膜可用于培养的贴壁细胞包括哺乳动物细胞,体细胞,干细胞,祖细胞,成熟细胞,成纤维细胞,骨骼组织,心肌与平滑肌、肝、肺、肾、乳腺皮肤、神经胶质细胞,内分泌细胞,黑色素细胞以及各种肿瘤细胞。
进一步的,成熟细胞可包括神经细胞、心肌细胞、视网膜细胞和肝细胞;
干细胞可包括间充质干细胞、iPS细胞、ES细胞、Muse细胞、胚胎癌症细胞、胚胎生殖干细胞。
进一步的,所述的PET膜进行细胞贴附、培养的工作过程为:
将通过各种参数测试后的PET膜置于孔板中,加入适量培养基后,接种细胞,每隔3小时将载体转移至新的孔板,并收集未贴附的细胞进行计数,计算得到贴附率,直至贴附率接近80%;
继续对上述完成贴附的细胞进行培养,培养过程中定时更换培养基,每隔 24小时进行细胞取样,对从PET膜上取下的细胞进行消化裂解后,进行细胞密度的检测,绘制生长曲线。
进一步的,在PET膜进行细胞贴附之前,对所述PET膜进行碱中和处理、灭菌处理以及支原体检测和细菌内毒素检测;
碱中和处理具体为:0.5M的NaOH溶液完全浸泡PET膜2h后,超纯水循环冲洗2遍,第一次冲洗2h,更换超纯水后再进行二次冲洗4h;
灭菌处理具体为:将经过碱中和处理后的PET膜放入高压蒸汽灭菌锅中,压力100kPa,温度121℃,灭菌45min后晾干;
支原体检测的标准为无支原体,细菌内毒素检测的标准为内毒素的含量<0.25EU/件。
进一步的,所述PET膜进行细胞培养时,对应的容器载体可采用细胞培养皿、细胞培养用方瓶或转瓶、细胞工厂、细胞生物反应器。
进一步的,所述PET膜进行细胞培养时,可将PET膜裁剪出若干个小型长条取样条,所述长条取样条放置在所述膜柱的内层、中间层以及外层的不同位置。
所述细胞和基因治疗中用于细胞培养的PET膜作为载体,在细胞培养中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
(1)现有贴壁细胞培养主要有2D培养和3D培养两种形式,2D培养方法为平面法培养,其培养面的面积限制了贴壁细胞的扩增倍数,产量较少,不能满足市场大规模生产的需求。相较于现有技术,本发明的PET膜的多层致密的膜网结构所构建的3D培养体系给细胞提供了几何倍数的立体生长空间,有效避免了培养过程中出现接触抑制而降低扩增速率的问题,细胞扩增量远远高于普通培养模式,适用于大规模生产和工艺放大。
(2)本发明解决了现有技术中无法针对贴壁细胞进行大规模3D培养的问题,PET膜的支架结构所构建的3D细胞培养系统很好地模仿体内细胞生长的微你环境,对于研究细胞生理状态和活动有更科学的借鉴意义。
附图说明
图1为PET分子结构示意图。
图2为适用于大规模细胞培养的PET膜的结构示意图。
图3为PET膜支架结构及其对细胞贴附作用示意图。
图4为PET膜显微结构示意图。
图5为电镜下PET膜的孔隙率直观图。
图6为PET膜的拉伸曲线图。
图7为材料亲疏水性测试示意图。
图8为HEK293T细胞在PET膜上的贴附情况示意图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步的详细说明,但本发明的实施方式不仅限于此。
现有技术中,PET全称是聚对苯二甲酸乙二醇酯,它是由对苯二甲酸与乙二醇缩合聚合反应而制得的,其电性能较好,抗蠕变性、耐疲劳性、耐摩擦性、材料稳定性都较好。具体阐述如下:
1.有良好的力学性能,冲击强度是其他材质薄膜的3-5倍,耐折性好。
2.耐油脂类、耐稀酸、稀碱,耐大多数溶剂。和实验试剂安全性接触,维持膜的原有特性。
3.PET有酯键,高、低温环境下对其机械性能影响很小,使用温度达-100 至120℃。可耐受高温高压灭菌,且高压蒸汽灭菌后材料的亲水性得到了小幅度改善提升,原因是高温下微量的酯键断裂产生了亲水的羧基和羟基。
4.气体和水蒸汽渗透率低,有优良的阻气、水、油及异味性能。
5.透明度高,可耐紫外线杀菌,透光性及光泽性好。
6.无毒、无味,卫生安全性好,适用于医疗包装和器材设备。
而且,生产PET膜所用的乙二醇价格便宜,就原材料制造成本而言,PET材料是工程塑料中价格最低的,具有很高的性价比。
基于上述内容,本发明提出一种细胞和基因治疗中用于细胞培养的PET膜,该PET膜具体为一种用于贴壁细胞3D培养的实验材料,材质为PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)膜,化学式为(C10H8O4)n,分子结构图如图1。
具体来说,本发明的PET膜的在整体外观构造上来看,为长轴式卷膜,螺旋卷曲后整体形成圆柱状的膜柱(如图2),在使用时,可按细胞培养容器或载体的规格灵活适配裁剪。
支架是常用的培养基质材料,它可以提供物理支撑,细胞可以进入支架内部进行生长和行使功能(如图3)。因此,本发明的PET膜的结构从内部构造来看,为规则的纵横交错设置的膜网支架结构,利用膜网支架结构对细胞的拦截作用从而实现贴壁细胞的3D培养,因此,PET膜内部的膜网支架结构具有生物安全性的同时,稳定性和力学性也能相对较好。
当然,支架的表面结构、孔隙率和支架的力学性能等也都会影响细胞的迁移行为和生长状态。支架同样可以进行功能化赋予不同的性能,进一步探究细胞的 3D行为。
因此,本发明根据贴壁细胞的生长特性,对各种PET材质的膜结构展开一系列试验测试,确定合适的参数,筛选出最适合细胞大规模贴壁培养的PET膜材料,这种PET膜便是本发明的所要保护的内容。
首先,PET膜需要存在一定的空隙用于细胞和培养基的分布,将PET膜材料固定在样品台上进行喷金处理,随后用扫描电子显微镜进行观察,结果如图4 所示。从PET膜的显微结构来看,可见PET膜的纤维呈网格状均匀地分布在视野中,形成了多空隙的结构,传质阻力较小,有利于培养基的流动。纤维的交叉处有熔融的痕迹,采用熔喷的方法生产而成,其中少有热熔的痕迹,纤维之间存在膜状结构,因此通过粘合剂或交联剂来实现纤维间的连接。
其次,PET膜的纤维直径和孔隙率是影响细胞与培养表面接触概率的关键性指标,接近贴壁细胞(20μm-50μm)的纤维直径,有利于细胞贴附和铺展。其中,本发明的PET膜的纤维直径在20-30μm范围之间,利于细胞贴壁着床,为了防止孔隙太大,细胞难以贴附于材料生长,导致细胞聚团或死亡等较为严重的情况出现,本发明进行了纤维直径测试实验,筛选多个具有不同纤维直径的PET 材料后,选择具有合适的纤维直径的PET膜材料。具体方法如下:
将不同PET膜的电镜照片导入Image J软件中,需要说明的是,该软件为纤维直径测试实验中自带的现有软件,不涉及到改进。选定表层的纤维后,计算所选区域占整张照片的面积,可以得到材料的孔隙率。处理结果如图5从左至右的 a、b、c三张小图所示,经计算所筛选的三种PET膜材料孔隙率分别为83%、84%、 76%。优选的,孔隙率为84%的PET膜,细胞贴附性强,细胞的贴壁率最高。
再其次,PET膜的力学性能也是影响的指标之一,本发明对PET膜进行了拉伸强度测试,具体方法如下:
将PET膜剪成条状样品,通过厚度和宽度测出横截面积,然后将样品的上下端固定于拉伸仪上,测得样品的拉伸曲线。如图6所示,由于材料的纤维排列方向和分布密度是随机的,因此每份样品的抗拉伸能力都存在差异,湿的PET膜较干的PET膜的拉伸强度稍稍略低,原因是PET膜中的粘合剂遇水后粘合作用下降,导致PET膜变松散。优选的,PET膜的拉伸强度在3-6.5MPa之间。此时的PET 膜有良好的力学性能,耐折性、抗蠕变性、耐疲劳性、尺寸稳定性都很好,最适合用于大规模细胞培养。
再其次,固体材料表面的润湿性是固体材料表面的重要性质,表面润湿性能取决于材料表面的化学成分和微观的几何结构。当液滴滴在固体材料水平表面上时,液滴可能铺展于材料表面或形成一定角度的液滴停在表面,在固、液、气三相交界处,自固-液界面经过液体内部到气-液界面之间的夹角称为接触角(θ)。通常以接触角来衡量某种固体材料表面的润湿性。习惯上,将θ=90°作为材料表面润湿与否的标准。当接触角小于90°时,称该液体可润湿固体材料,角度越小,润湿性越好;反之,当接触角大于90°时,称该液体不可润湿固体材料表面,角度越大,润湿性越差。若该液体是水,就可以根据固体材料表面接触角大小,将材料分为亲水性材料和疏水性材料。
亲水材料更利于细胞黏附与铺展,疏水(或超疏水)环境不利于细胞的黏附。但如果材料的亲水性过高,则容易在材料的表面形成水化层,同样不利于贴壁细胞的大规模培养。选用了三种测试材料进行测试,材料为相同材质且孔隙率经测定分别为83%、84%、76%的PET膜,PET膜为本发明中提到的PET膜,三者亲疏水性的实验结果如图7所示。所选择的三种孔隙率分别为83%、84%、76%的细胞培养PET膜材料从图7中从左至右的顺序的接触角分别为55.75°、39.5°、 102.75°。优选的,所选的PET膜接触角为39.5°,亲水性合适,而且经实验验证,高压蒸汽灭菌后PET膜的亲水性不仅不受影响,由于高温下微量的酯键断裂产生了亲水的羧基和羟基,亲水性能略有提高,对贴壁细胞的贴附和生长均属有益的影响。
再其次,PET膜的材质特点也是影响细胞培养质量的指标之一,PET膜需要设置为透明无色的,透光率是PET膜材料的主要性质,一般透光率在90%以上,利于在显微镜下观察细胞培养状态,另外其具有易着色,加工流动性好,刚性好及耐化学腐蚀性好等优点。
再其次,支架的表面结构也是影响细胞培养质量的指标之一,本发明中,对 PET膜表面经过了硬化处理,即通过适当的方法使零件的表层硬化而零件的心部仍然具有强韧性的处理,PET作为高分子薄膜,具有优秀的光学性能和物理机械性能,但由于高分子自身的缺陷,大多数高分子薄膜表面硬度较低,通过在材料表面高温热固化附加的表面硬化涂层以提高材料表面的硬度,增加纤维材料的硬度以支撑膜纤维上数量众多贴壁生长的细胞。
硬化处理的大致过程为采用二月桂酸二丁基锡作为固化剂,在120℃下热固化3h,可得到PET表面硬化度在3H-4H之间。PET膜表面硬化越好,材料支撑性越强,耐磨性越强。优选的,表面的硬化值在3H-4H之间,较好地支撑细胞粘附。
基于上述内容,综述来说,为实现细胞大规模贴壁培养,本发明的PET膜除了在结构上需要设置成膜柱以及膜网支架结构,在参数设置上,也还有一定的要求,具体要求如下:
该PET膜的膜表面经过硬化处理之后的硬化值在3H-4H之间;
该PET膜内部的纤维呈网格状,且纤维直径在20-30μm范围之间;
在干燥条件下,该PET膜的拉伸强度在3-6.5MPa范围之间;
该PET膜具有亲水性;
该PET膜整体呈透明无色,透光率大于90%。
筛选出来的PET膜,可在细胞和基因治疗中作为载体,实现在细胞培养中的应用。实际上,该种PET膜可用于对多种细胞的培养,具体来说,PET膜可用于培养的贴壁细胞包括人、小鼠、大鼠、猪、牛和猴等的哺乳动物细胞,体细胞,干细胞,祖细胞,成熟细胞,成纤维细胞,骨骼组织(骨及软骨),心肌与平滑肌、肝、肺、肾、乳腺皮肤、神经胶质细胞,内分泌细胞,黑色素细胞以及各种肿瘤细胞。这些种类的细胞均为已公开的细胞,本发明中只进行举例,不做具体限制。其中,比如成熟细胞可包括神经细胞、心肌细胞、视网膜细胞和肝细胞等,干细胞可包括间充质干细胞(MSC)、iPS细胞、ES细胞、Muse细胞、胚胎癌症细胞、胚胎生殖干细胞等。
在PET膜上进行细胞贴附、培养时,本发明对应提出了使用方法,具体工作过程如下:
首先,在PET膜进行细胞贴附之前,对PET膜进行碱中和处理以除去细菌内毒素、灭菌处理以除去细菌和支原体,并进行支原体检测和细菌内毒素检测,避免在细胞培养过程中影响细胞的生长以及质量。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的脂多糖。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来,碱溶液可化学降解玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上的内毒素,碱中和处理具体为:0.5M的NaOH溶液完全浸泡PET膜2h后,超纯水循环冲洗2遍,第一次冲洗2h,更换超纯水后再进行二次冲洗4h;利用高温高压消除细菌和支原体,灭菌处理具体为:将经过碱中和处理后的PET膜放入高压蒸汽灭菌锅中,压力100kPa,温度121℃,灭菌45min后晾干。进行完碱中和处理、灭菌处理的 PET膜继续进行支原体检测和细菌内毒素检测,支原体检测的标准为无支原体,细胞培养物被支原体污染后会出现在各种比如生长减慢的问题;根据《中华人民共和国药典》2020版,通过鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理,以判断供试品中内毒素限量是否符合规定。合格标准:产品细菌内毒素含量<0.25EU/ 件,细胞培养物被内毒素污染后会出现在各种比如改变细胞外形的问题。当两个检测的结果为合格后,该PET膜可正常使用。
将通过各种参数测试后的PET膜置于孔板中,加入适量培养基后,接种细胞,每隔3小时将载体转移至新的孔板,并收集未贴附的细胞进行计数,计算得到贴附率,直至贴附率接近80%;继续对上述完成贴附的细胞进行培养,培养过程中定时更换培养基,每隔24小时进行细胞取样,对从PET膜上取下的细胞进行消化裂解后,进行细胞密度的检测,绘制生长曲线。
需要说明的是,PET膜进行细胞培养时,可将PET膜裁剪出若干个小型长条取样条,长条取样条放置在膜柱的内层、中间层以及外层的不同位置,可以对体外细胞实验时PET膜内部更多的位置进行取样,取样条的设置可以方便实验监测,满足各参数和条件的摸索,工艺开发的需求。
PET膜进行细胞培养时,对应的容器载体可使用以往公知的容器主体(容器)。容器主体的形状和尺寸没有特别限定。作为容器主体,可采用细胞培养皿、细胞培养用方瓶或转瓶,作为大规模细胞培养容器主体,可采用细胞工厂、细胞生物反应器。
结合上述内容,本实施例中,以HEK293T细胞在PET膜中进行贴附、培养进行举例说明。具体阐述如下:
将经过各种参数筛选测试后,优选的PET膜置于孔板中,加入适量培养基后,接种HEK293T细胞,每隔3小时将载体转移至新的孔板,并收集未贴附的细胞进行计数。结果如图8所示,HEK293T细胞接种到PET膜上后,随着时间延长,细胞贴附率逐渐升高:细胞接种后3小时,即有60%以上的细胞完成贴附;随着时间延长,贴附率进一步提高,接种12小时后贴附率基本保持稳定,最终贴附率接近80%。
此时可知,在静态条件下HEK293T细胞在PET膜上的贴附能力良好。如果用于生物反应器的动态培养条件,此贴附率可进一步得到提高,适合工业化大规模细胞培养。
继续对上述完成贴附的HEK293T细胞进行培养,培养过程中注意及时更换培养基,及跟踪各培养参数的变化,同时每隔24小时进行细胞取样;将优选的PET 膜上的细胞进行消化裂解后,多次实验进行细胞密度的检测确定,绘制细胞生长曲线。最终实验结果如图8所示,从图中可以看到细胞在优选的PET膜上能够正常进行扩增和生长,生长曲线良好,效果优于其他参数的PET膜材料。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例,凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种细胞和基因治疗中用于细胞培养的PET膜,其特征在于,所述的PET膜为长轴式卷膜,螺旋卷曲后整体形成圆柱状的膜柱,其中,PET膜的结构为规则的纵横交错设置的膜网支架结构;
该PET膜的膜表面经过硬化处理之后的硬化值在3H-4H之间;
该PET膜内部的纤维呈网格状,且纤维直径在20-30μm范围之间,纤维的孔隙率在76%-84%范围之间;
在干燥条件下,该PET膜的拉伸强度在3-6.5MPa范围之间;
该PET膜具有亲水性;
该PET膜整体呈透明无色,透光率大于90%。
2.根据权利要求1所述的细胞和基因治疗中用于细胞培养的PET膜,其特征在于,所述的PET膜可用于培养的贴壁细胞包括哺乳动物细胞,体细胞,干细胞,祖细胞,成熟细胞,成纤维细胞,骨骼组织,心肌与平滑肌、肝、肺、肾、乳腺皮肤、神经胶质细胞,内分泌细胞,黑色素细胞以及各种肿瘤细胞。
3.根据权利要求2所述的细胞和基因治疗中用于细胞培养的PET膜,其特征在于,成熟细胞可包括神经细胞、心肌细胞、视网膜细胞和肝细胞;
干细胞可包括间充质干细胞、iPS细胞、ES细胞、Muse细胞、胚胎癌症细胞、胚胎生殖干细胞。
4.根据权利要求2所述的细胞和基因治疗中用于细胞培养的PET膜,其特征在于,所述的PET膜进行细胞贴附、培养的工作过程为:
将通过各种参数测试后的PET膜置于孔板中,加入适量培养基后,接种细胞,每隔3小时将载体转移至新的孔板,并收集未贴附的细胞进行计数,计算得到贴附率,直至贴附率接近80%;
继续对上述完成贴附的细胞进行培养,培养过程中定时更换培养基,每隔24小时进行细胞取样,对从PET膜上取下的细胞进行消化裂解后,进行细胞密度的检测,绘制生长曲线。
5.根据权利要求4所述的细胞和基因治疗中用于细胞培养的PET膜,其特征在于,在PET膜进行细胞贴附之前,对所述PET膜进行碱中和处理、灭菌处理以及支原体检测和细菌内毒素检测;
碱中和处理具体为:0.5M的NaOH溶液完全浸泡PET膜2h后,超纯水循环冲洗2遍,第一次冲洗2h,更换超纯水后再进行二次冲洗4h;
灭菌处理具体为:将经过碱中和处理后的PET膜放入高压蒸汽灭菌锅中,压力100kPa,温度121℃,灭菌45min后晾干;
支原体检测的标准为无支原体,细菌内毒素检测的标准为内毒素的含量<EU/ml。
6.根据权利要求4所述的细胞和基因治疗中用于细胞培养的PET膜,其特征在于,所述PET膜进行细胞培养时,对应的容器载体可采用细胞培养皿、细胞培养用方瓶或转瓶、细胞工厂、细胞生物反应器。
7.根据权利要求4所述的细胞和基因治疗中用于细胞培养的PET膜,其特征在于,所述PET膜进行细胞培养时,可将PET膜裁剪出若干个小型长条取样条,所述长条取样条放置在所述膜柱的内层、中间层以及外层的不同位置。
8.权利要求1-3中任意一项所述细胞和基因治疗中用于细胞培养的PET膜作为载体,在细胞培养中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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