TWI774156B - 用於細胞生質生產的載體及包含其之細胞培養裝置 - Google Patents

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Abstract

本發明揭露一種3D多孔生長表面，其包含具有多個網狀層的的織物，該些織物可透過捲曲各網狀層而形成柱狀固定床，或透過堆疊或充填該多層網狀結構物而形成其他形狀的固定床。其可強化細胞生長表面，並促進細胞生長後的細胞回收率，同時在該多層網狀結構的四周進行封邊以阻隔纖維或顆粒的釋出，因此在細胞培養及細胞回收的過程中可以降低釋放顆粒，藉由結合以上種種方式以提升細胞產量。本發明同時教示一種透過維持網狀層的孔徑及結構的方式來強化細胞生長的方法。

Description

用於細胞生質生產的載體及包含其之細胞培養裝置
本發明涉及一種細胞培養基質領域，特別是一種真核細胞的生物質量(Biomass)量產的細胞培養基質。
隨著生物科技的快速發展，用於原核細胞或真核細胞的細胞培養技術已越來越重要。一般來說，真核細胞生長較慢且易受到剪應力及汙染的影響而受損，而大部分的真核細胞具有貼壁性(anchorage-dependent)，其需要貼附生長表面才得以生長。為了培養該些具有貼壁性的真核細胞，因而發展多種具有生長表面的培養載體(carrier)，常用的培養載體包含由葡聚醣基材料(dextran-based material)製成之具有平滑面的培養載體、由聚氨酯(polyurethane)或聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate)製成的多孔基質、以及由聚碸(polysulfone)或醋酸纖維素(cellulose acetate)所製成之具有中空纖維的半透膜(semi-permeable membrane)。然而，從上述培養載體中收集細胞容易受到這些載體因剪切力破壞所釋放的碎屑顆粒所汙染，尤其是具有多孔結構的載體而言，要將細胞由載體孔隙中回收更是困難。因此，貼壁細胞的細胞製程放大(scale up) 過程緩慢，不僅耗時費力且費用亦高昂。有鑑於此，有必要發展適合的細胞培養載體以解決上述細胞收集的問題。
目前用於貼壁細胞的培養載體主要包含下列兩種：微粒(particulate)平滑面載體(無孔或少孔)及多孔載體。平滑面載體因受限於自身的生長表面積，進而限制了貼附及生長於其上的細胞數量。而另一方面，多孔載體則提供了三維腔體(three-dimensional cavity)以容置細胞，其多孔性亦提供了額外的生長面積供細胞貼附，藉以保護細胞免於受到在曝氣、攪拌及進料等細胞培養過程中所造成的剪應力帶來的間接影響。然而，從多孔載體中收集細胞並非易事。用於細胞回收(cell recovery)的初代多孔載體為BioNOC II®載體(CESCO® Bioengineering Co.,Ltd.)，其是由聚酯不織布(polyester non-woven fabrics)所製成。從多孔BioNOC II®載體收集細胞是由平面水平堆疊的纖維所形成的孔洞經過熱壓後形成的多層結構來收集。其中，纖維之間的開口都是以朝著相同的方向的形式排列，相較於其他的多孔材料(例如以隨機方向分布於基質內的通道孔洞結構)，較易於釋放細胞。然而，以BioNOC II®載體收集細胞具有以下缺點：1.隨機層疊於纖維中的孔洞會形成超過二十層的多重層疊結構，其中的孔洞具有幾微米至幾百微米不等的孔徑尺寸。基於上述超過二十層纖維的物理障礙(physical obstacle)，細胞的釋出並無法如在平坦表面那麼直接。2.在收集細胞的過程中，纖維也容易同步被釋出而造成細胞汙染。3.上述被釋出的纖維具有與細胞類似的尺寸，因此難以與所收集的細胞分離。這些分離纖維與細胞的過程不僅導致成本提升，同時亦造成細胞損失，因此阻礙了BioNOC II®載體在細胞生產(cellular production)領域的應用。上述缺點造成應用的限制抑或增加生產成本，特別是對於將細胞作為生物性產品的生產標的。
生物技術和基因工程的革命性進化已經創造了細胞產品市場的高需求，例如蛋白質藥物、細胞激素、單株抗體、病毒相關產品、疫苗、核酸、酵素以及細胞及/或組織。因應這些產品的需求，同步產生了對效益性及經濟性生產方法的不斷增長的需求。
真核細胞，例如哺乳動物細胞，已成為提供高質量及高產量蛋白質或細胞產物的熱門標的。長期以來，培養哺乳動物細胞一直用於疫苗、基因工程蛋白、藥物及其他細胞產品的生產。一般來說，真核細胞可為貼壁細胞、非貼壁細胞、或同時包含兩者特性。貼壁細胞需要生長表面以定錨(anchor)、生長及生產所需的細胞產物。舉例而言，貼壁細胞可為胚胎幹細胞(embryonic stem cells)、間葉幹細胞(mesenchymal stem cells)、纖維母細胞(fibroblasts)、上皮細胞(epithelial cells)及內皮細胞(endothelial cells)。真核細胞，例如淋巴細胞、某些轉移的細胞及癌細胞，可為非貼壁細胞，且可懸浮地生長。然，無論是哪一種類，大部分的真核細胞在培養時都具有以下共同特徵(此將於以下段落詳細說明)，這些特徵在設計有效的生長表面及培養裝置時都扮演了關鍵性的角色。
貼壁細胞對生長表面的貼附依賴性是影響細胞活力的關鍵，並且是所有類型細胞的培養技術基礎，包括但不限於傳統的單層培養或以載體及/或微載體系統培養。由於貼壁細胞僅能在貼附適合的生長表面後增殖，因此所使用的促進細胞貼附之生長表面及培養程序十分的重要。細胞貼附包含將貼附因子(例如蛋白質)吸附到培養表面、使細胞接觸該培養表面、將細胞貼附於適合細胞貼附之處理過後的表面、在整個生長表面散佈及複製貼附的細胞直到該些細胞與另一個表面生長的細胞接觸(亦即，接觸抑制(contact inhibition))。
為了進行可行的貼壁細胞培養，培養裝置需要建置有適當的培養生長表面或載體、用於循環特定細胞培養基的機制，並且以適當的通氣以提供充足的溶氧以維持細胞生長。目前有幾種不同的培養細胞方法，包含，儘管需要添加氧氣、但在培養過程中並不額外補充養分的批次培養系統(batch system)；需要對養分及氧氣進行監控及補充的饋料批次培養系統(fed batch systems)；以及透過持續補充新鮮的培養基來監控及控制養分及廢棄產物的連續灌注培養系統(perfusion systems)。
在本領域中已知幾種類型的培養載體。舉例而言，葡聚醣基(dextran-based)(例如cytodex I,DEAD-葡聚醣(DEAE-dextran)及Cytodex III、豬膠原蛋白塗佈之葡聚醣(porcine collagen-coated dextran)；)Cytiva,US,(formally GE Healthcare Life Sciences、或塗佈聚苯乙烯基的(coated polystyrene-based(e.g.,SoloHill,U.S.))微載體(microcarrier)。微載體通常很小，其直徑約為50至250微米(micrometers)，然而，較大或較小尺寸的微載體也已有使用過(U.S.Pat.No.5,114,855 issued May 19,1992 to Hu et al.)。第二種細胞培養載體包含由陶瓷(ceramics)或聚氨酯泡沫(polyurethane foam)製成的多孔基質材料；由聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,PET)製成的織物；或由聚乳酸聚乙醇酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)、膠原蛋白(collagen)、殼聚醣(chitosan)所製成的生物可降解材料。
細胞培養載體亦可根據其表面特性進行分類。舉例而言，存在無孔(non-porous/poreless)的多孔載體。由於多孔載體提供更大的表面積/體積比以及對細胞的隔離保護(insulated cells)，因而多孔載體通常較無孔載體具有更多優點。因為多孔的特性，該些載體在生長表面形成多個三維腔體，因而可使細胞 附著率最大化，並且可保護細胞免於受到在曝氣、攪拌及進料等細胞培養過程中所造成的剪應力帶來的間接影響。
本領域目前許多可用的細胞培養系統採用多孔及/或無孔的微載體。這些微載體，例如現今常用的微珠載體(microcarrier beads)，常用在貼壁細胞的生產系統。這些微載體必須與攪拌設備及/或曝氣功能一起使用。然而，微載體系統常見的問題在於，維持細胞培養的攪拌動作會破壞甚至殺死細胞，從而降低細胞培養系統的效率及所需的細胞產量。
微載體系統亦可以使用由離子交換凝膠(ion exchange gel)、葡聚醣(dextran)、聚苯乙烯(polystyrene)、聚丙烯酰胺(polyacrylamide)或膠原蛋白為基礎的材料(collagen-based material)所製成的微小球體(spheres)。這些材料的選用在於其與細胞的相容性、對攪拌的承受性(resilience)及可使微載體持續懸浮於培養基中的特定重力。微載體通常在緩慢攪拌下會持續地懸浮於培養基中，以確保養分及空氣對所有細胞的平均分布。目前，微載體系統被認為是最適合大規模細胞培養的系統，因為具有最高的表面積/體積比，並能將養分均勻地分配至細胞。
然而，目前的微載體系統具有嚴重的缺點，這些缺點包含高成本及高細胞死亡率，其中高細胞死亡率是因為在培養過程中因攪拌及曝氣所引起的高剪切應力。其次，最常用的微載體是使用多孔非剛性葡聚醣(porous non-rigid dextran)作為載體基質，當微載體攪拌的反應器中發生碰撞時，這種可壓縮的(compressible)基質被認為可減少對於微載體及附著於其上之細胞的潛在破壞(Microcarrier Cell Culture：Principles and Methods,Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden,pages 5-33(1981))。然而，這些多孔微載體在保留細胞產物方 面亦具有嚴重的缺點，其會導致生長因子及其他成分從培養基中被吸附(Butler,M.,"Growth Limitations in Microcarder Cultures",Adv.Biochem.Eng./Biotech.4：57-84(1987))。
專利公告案(U.S.Patent No.5,015,576 issued May 14,1991 to Nilsson et al.)是有關於一種透過於基質材料水溶液中添加不溶於水的固體(water-insoluble solid)、液體或氣體之空腔產生化合物(cavity generating compound)以產生具有空腔的顆粒。接著透過在不溶於水的分散介質中分散該些顆粒，再藉由冷卻、共價交聯反應(covalent cross-linking)或聚合反應(polymerization)以使基質不溶於水。接著，將空腔產生化合物洗掉。而後，該些顆粒可在膠體過濾程序(gel filtration processes)、疏水層析法(hydrophobic chromatography)或親和層析法(affinity chromatography)中作為離子交換劑使用，任選地衍生顆粒(optionally subsequent to derivatizing the particles)。這些顆粒亦可用以作為培養貼壁細胞的微載體。
專利公告案(U.S.Patent No.5,385,836 issued January 31,1995 to Kimura et al.)是有關於一種於細胞培養時用於貼附動物細胞的載體，或用於固定(immobilization)動物細胞的載體。該載體是藉由將包含殼聚醣混和物形式的細胞貼附材料塗佈於多孔基材而產生。該多孔基材是透過將包含絲蛋白(silk fibroin)、明膠(gelatin)及殼聚醣的樹脂黏著劑(binder resin)注入(impregnating)不織布網(nonwoven fabric web)中而獲得的不織布(nonwoven fabric)。藉由將不織布與添加有蛋白及明膠的殼聚醣酸性水溶液中以進行塗佈不織布的製程，接著乾燥上述不織布並用鹼處理以獲得不易溶解的殼聚糖。
專利前案(U.S.Patent No.5,565,361 issued October 15,1996 to Mutsakis et al.)是有關於一種具有固定貼附細胞之靜態混合元件(motionless mixing element)的生物反應器，其可用於增強生物反應器中細胞的培養及增殖。該生物反應器具有外殼及靜態混合元件，細胞可貼附於該靜態混合元件上以生長及增殖。靜態混合元件及生物反應器具有多孔纖維片狀材料，例如波狀或編織狀的線材，如不鏽鋼或鈦。且纖維的高度與直徑具有預定的尺寸以便提供用於待培養細胞貼附的最大表面積。
專利公告案(U.S.Patent No.5,739,021 issued April 14,1998 to Katinger et al.)是有關於一種用於生物催化劑(biocatalysts)的多孔載體，其具有非水溶性無機填料及選自聚乙烯(polyethylene)及聚丙烯(polypropylene)的聚烯烴粘合劑(polyolefine binder)，且具有開放性的孔洞以允許細胞穿透並生長於孔洞中。該些孔洞的密度約高於1g/cm3。
專利公告案(U.S.Patent No.6,214,618 issued April 10,2001 to Hillegas et al.)是有提供一種微珠載體的製備方法，該微珠載體是藉由在珠體的表面上形成具有苯乙烯共聚物核(styrene copolymer core)輕度交聯(lightly crosslinked)之官能基，並以鹼性及酸性溶液洗滌微珠載體後以使該微珠載體適用於細胞培養。微珠載體亦可由外部具有三甲胺(tri-methylamine)的苯乙烯共聚物核所製成，該苯乙烯共聚物核已經鹼性及酸性溶液洗滌而使用於細胞培養。
儘管在前述先前專利前案中教示了多種用於細胞培養的載體，然而該些載體均無法滿足3D培養中的高細胞密度需求、易於回收細胞的需求、以及收集細胞時無額外顆粒釋放的需求。
為了解決上述缺點，本發明提供一種細胞培養基質：1.以網狀結構(nettings or meshes)取代纖維作為載體的基底。2.使用薄片網狀結構，且以模擬不織布載體方式(例如BioNOC II®載體)層疊該薄片網狀結構。3.將層片四周圍以熱壓或超音波或膠黏處理密封以避免格網纖維脫落。4.將該層片捲曲或堆疊層疊或充填為柱狀或其他形狀/結構，以使其作為固定床培養系統中的固定床，特別是在TideMotionTM培養系統中的BelloCell®及TideCell®生物反應器系統。TideMotionTM培養系統的定義為透過間歇性地使固定床沉浸(submerging)及暴露(emerging)於多孔基質中，以帶入養分及氧氣使細胞生長於多孔基質上/內，同時從多孔基質中去除廢物及多餘的二氧化碳。在這樣的設計下，相較於不織布載體，本發明可具有以下優點：1.各層中孔洞的形狀及尺寸維持一致性。2.多層薄層片網狀結構可再堆疊或捲曲，或製成其他形狀，以此來建構生物反應器的填充床可具有較高的細胞培養密度及獲得較高的細胞回收率。3.相較於不織布載體二十幾層結構，本發明的薄層片網狀結構的層疊數量調降，更有利於細胞由載體中釋出。4.網狀結構相較於不織布更加堅固且不易釋出微粒與纖維，尤其將該多層網狀結構周邊密封後，更可以大幅降低纖維或顆粒的釋出。5.網狀結構的紗線(yarns)的直徑遠大於細胞，因此可輕易地從細胞液中過濾而分離，降低純化回收細胞的成本與損失。6.藉由捲曲或堆疊或充填多層薄片網狀結構可將供細胞生長的表面積最大化，特別是使用於BelloCell®及TideCell®生物反應器系統。綜合上述，透過本發明所設計的載體結構，可實現高密度細胞培養及高產量的細胞生產。
整體而言，本發明提供一種藉由以薄層片或條狀格網的網狀結構，並藉由層疊該網狀結構作為細胞生長表面及結構，可顯著地提升貼壁細胞的培養效率及細胞回收率。更特別地，本發明教示一種新穎的細胞生長表面及結構、及其製造方法。本發明揭露一種用於培養細胞之新穎的生長表面及結構，其可使細胞貼附率及細胞存活率最大化、使細胞生長密度增加、同時增加細胞回收率並避免載體上釋出微粒從所述生長表面釋出。因此，根據本發明所揭露之獨特的細胞培養生長表面、結構及其製造方法，可彌補現有技術之缺點及不足，更可應用於供細胞生產應用的細胞/組織培養。
本發明提供一種新式的載體結構，其為層疊網狀結構，且每層本身具有一致的孔洞結構及尺寸，而當此載體結構為較大的尺寸時，可便於捲曲或堆疊而形成單一固定床單元(single fixed bed unit)，此載體結構亦可為小尺寸的載體結構，藉由在限定區域空間充填複數個載體結構以形成固定床。由多層格網堆疊形成的層狀結構的四周以熱壓或超音波或膠黏密封，可藉以避免或降低格網纖維或顆粒的釋放。由網狀織物所製成的大尺寸薄片尺寸可為1cm x 20cm至10m x 100m，其尺寸取決於固定床的大小。更精確地，由網狀織物所製成的薄片尺寸可為3cm x 50cm至2m x 20m。基質床亦可藉由將多個具有相同結構的小塊載體隨機充填在一個容器內(randomly disposed而形成。若為小尺寸的載體結構，則其尺寸可為0.3cm~1cm x 0.5cm~10cm，更精確地，由網狀織物所製成的小尺寸薄片可為0.5cm~1cm x 1cm~5cm。其中，網狀結構(netting or mesh)的定義為網眼(mesh)(也稱為網眼織物(netting fabric))，其通常被定義為具有大量相互間隔孔洞的織物，這些孔洞的特徵在於其孔口開放的外觀(net open appearance)以及紗線(yarns)之間的間隔。該網狀結構可以編織(knit)、機織 (woven)、擠壓(extruded)、或打結(knotted)的方式來建構，且可應用於多種結構，包含針織(knits)、花邊(laces)或鉤編織物(crocheted fabrics)。
不織布的定義是由人造纖維(staple fiber)(短)及長纖維(連續長纖維)所製成的織物狀材料(fabric-like material)，其是通過化學、機械、熱或溶劑處理而黏合在一起。
網狀結構的表面可被處理為具有生物相容性(biocompatible)及親水性(hydrophilic)，從而使細胞貼附於其上並生長。網狀結構的外表面具有另一網層，其具有較大的孔徑及較粗的紗線，該網層可經表面處理或不經表面處理，其主要作為隔離層以允許培養基或空氣自由地流通上述經表面處理的多個網狀結構層之間。藉由將堆疊的多層網狀結構(用於供細胞貼附及生長)以及用於做為間隔層的網層相互捲曲可形成較大的基質床(matrix bed)。此由網狀織物所製成的大尺寸薄片尺寸可為1cm x 20cm至10m x 100m，其尺寸取決於固定床的大小。更精確地來說，在捲曲及堆疊之前，網狀結構的尺寸可為3cm x 50cm至2m x 20m。基質床亦可藉由將多個具有相同結構的小塊載體隨機充填(randomly disposed)在一個容器內而形成。若為小尺寸的載體結構，則尺寸可為0.3cm~1cm x 0.5cm~10cm，更精確地，由網狀織物所製成的小尺寸薄片可為0.5cm~1cm x 1cm~5cm.。網狀織物內作為經線及緯線的紗線寬度可為50um到1000um，更精確地來說，該紗線寬度可為50um到500um，其寬度遠大於細胞直徑(約5~20um)，因此即使由網狀織物內脫離，亦容易以過濾方式與細胞分離。須說明的是，上述作為經線及緯線的紗線，由剖面觀之，可依實際狀況而呈現為圓柱狀、橢圓狀、或矩形，故，於本說明書中，所述紗線的寬度或紗線的直徑皆可用於說明紗線的尺寸大小。於此，上述小塊載體包含供細胞貼附生長的多層網狀結構 及其用於做為間隔層的網層。在捲曲或堆疊以形成用於生物反應器的固定床之後，該多層網狀結構最適用於TideMotionTM系統(例如BelloCell®或TideCell®)。在該些系統中，細胞培養的機制是透過間歇性地使固定床沉浸(submerging)及暴露(emerging)於培養基中。根據上述TideMotionTM系統的細胞培養機制，培養基仍可離開固定床並允許新鮮空氣進入固定床。因而可實現細胞生長表面積的最大化。
考量到細胞培養過程的重要性及本領域中已知載體系統的不足，本發明提供一種細胞培養載體系統，其可使細胞以高密度培養於3D結構中，且可有利地應用於培養基自由流動的培養容器或生物反應器中。本發明之載體系統獨特的特點在於，其可促進細胞培養後細胞或組織的回收，並且使非細胞來源的額外顆粒釋放最小化。儘管在網狀結構仍有顆粒釋放的可能，然而由於該載體的格網線(紗線)直徑遠大於細胞尺寸，因此可透過過濾的方式輕易的去除。是以，根據本發明所提供之用於細胞培養生長的表面及結構可彌補現有技術的缺點及不足。
本發明提供一種適用於細胞培養之高效且新穎的生長表面及結構，且可提供大規模的細胞或組織收穫(harvest)，本發明更提供該生長表面及結構的製造方法。本發明之一目的在於但不限於：提供新穎的細胞培養生長表面，其中包含一致的孔洞結構及尺寸，從而可供細胞貼附且使細胞展現更一致的生長表現(growth for more consistent performance)；提供細胞培養生長表面，其可整合至TideMotionTM培養系統，例如BelloCell及TideCell生物反應器系統，以提供最大化的細胞生長表面；提供細胞培養生長表面，可在培養完成後有利於細胞 或組織的回收；以及提供細胞培養生長表面，可大幅降低細胞培養及細胞回收時額外的非細胞相關之顆粒釋出。
本發明教示一種三維多孔生長表面，其是由天然或人造聚合物材料所製成之網狀結構所構成，特別是由聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,PET)製成。該生長表面可強化細胞生長表面、促進細胞的固定及增殖、維持表面結構的完整性、有利於細胞回收、且不易造成任何人造顆粒的釋放，因而可提升細胞產量。
本發明之一目的在於提供一種用於細胞培養的載體，其包含網狀結構單元，該網狀結構單元包含至少一第一網層，其具有由第一經線及第一緯線交織所形成之複數個第一網孔，且該至少一第一網層具有生物相容性及親水性；及第二網層，其具有由第二經線及第二緯線交織所形成之複數個第二網孔，該第二網層平行地設置於該至少一第一網層之上或之下。
較佳地，網狀結構單元可包含兩層第一網層及一層第二網層，其中第二網層設置於兩層第一網層中間、或設置於兩層第一網層之上、或設置於兩層第一網層之下。
較佳地，網狀結構單元可包含至少三層第一網層及一層第二網層，其中第二網層設置於三層第一網層之任兩層之間、或設置於三層第一網層之上、或設置於三層第一網層之下。
較佳地，第一網層的材料可包含聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,PET)，而第二網層的材料可包含聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,PET)、聚丙烯(polypropylene)、聚乙烯(polyethylene,PE)、聚四氟乙烯(polytetrafluoroethene,PTFE)或尼龍(nylon)。
較佳地，複數個第一網孔的孔徑可為30um至800um，而複數個第二網孔的孔徑可為1mm至5mm。
較佳地，該第一網層係為經過親水性表面處理的一格網材料，以及該第二網層係為具有支撐性的格網材料。
較佳地，載體的型態可為由網狀結構單元捲曲而形成之一或多個柱體、由多個網狀結構單元依序層疊而形成之一或多個柱體、或由多個網狀結構單元隨機堆疊而形成之堆疊體。
較佳地，至少一第一網層的周邊與第二網層的周邊是以熱壓、超音波或膠黏的方式封合。
較佳地，在各至少一第一網層中，複數個第一網孔的孔徑可全部相同或部分相同。
較佳地，在第二網層中，複數個第二網孔的孔徑可全部相同或部分相同。
較佳地，任一條第一經線、任一條第一緯線的寬度可為50um到500um，而任一條第二經線、或任一條第二緯線的寬度可為100um到1000um。
較佳地，任一條第一經線、任一條第一緯線的寬度可為50um到250um，而任一條第二經線、或任一條第二緯線的寬度可為250um到500um。
本發明之另一目的在於提供一種細胞培養裝置，其包含培養腔室及用於細胞培養的載體，該載體設置於培養腔室中且具有網狀結構單元，該網狀結構單元包含至少一第一網層，其具有由第一經線及第一緯線交織所形成之複數個第一網孔，且該至少一第一網層具有生物相容性及親水性；及第二網層， 其具有由第二經線及第二緯線交織所形成之複數個第二網孔，該第二網層平行地設置於該至少一第一網層之上或之下。
更特別的是，本發明所請之新穎的生長表面包含至少一層表面以PET處理過之網狀結構(nettings/meshes)，其具有30um至800um之孔洞以供細胞貼附及生長；以及一層經表面處理或不經表面處理之網層，其具有1mm至5mm之孔洞，較佳地，可由聚丙烯(polypropylene)或尼龍(nylon)製成，其作為間隔物以促進養分及空氣流通於上述多個網狀結構層之間。藉由將堆疊的多層網狀結構(用於供細胞貼附及生長)以及用於做為間隔層的網層相互捲曲、或推疊或充填可形成基質床(matrix bed)用於填充床(packed-bed)生物反應器，特別是BelloCell®或TideCell®生物反應器。此經過表面處理的PET多層網狀結構可為至少一層或多達十層或以上，其取決於網狀結構的厚度及/或細胞培養及細胞回收的容易度。當本發明之載體經由捲曲狀、堆疊或充填形成載體床時，且當其應用於BelloCell®或TideCell®細胞培養系統時，其可達到最大的生質生產(biomass production)結果。這是因為TideCell細胞培養系統使用TideMotionTM培養機制，其是透過間歇性地使載體沉浸(submerge)及暴露(emerge)於培養基中。在TideMotionTM培養機制中，即使將填充床緊密地堆疊(如捲曲或堆疊或充填)，仍可使氧氣進入基質床而不會導致細胞溺斃(drowning of cells)。其他的細胞培養生物反應器並無法在如此高密度的填充條件下進行細胞培養。因此，本發明結合BelloCell®或TideCell®細胞培養系統可在性能上達到最大的效果，此可從後附之實施例及詳細的說明中得知。
10:第一網層
11、21:網孔
20:第二網層
100、200、210、300:載體
101:第一經線
102:第一緯線
201:第二經線
202:第二緯線
30:網狀結構單元
400:培養腔室
A:培養液流動方向
以下所提供的圖式僅為例示性說明，並不意欲限制本發明於任何所述的特定實施例。該些說明可以理解為用於結合附圖於此作為本說明書的參照內容。
圖1為根據本發明一實施例之新穎的載體結構爆炸示意圖。
圖2為本發明另一實施例之新穎的載體結構爆炸示意圖。
圖3為本發明再一實施例之新穎的載體結構爆炸示意圖。
圖4為本發明之第一網層及第二網層的周邊密封示意圖。
圖5為本發明又一實施例之新穎的載體結構示意圖。
圖6為本發明另一實施例之新穎的載體結構示意圖。
圖7為本發明再一實施例之新穎的載體結構示意圖。
圖8為根據本發明一實施例之新穎的載體結構之剖面微觀示意圖。
圖9為根據本發明另一實施例之新穎的載體結構之剖面微觀示意圖。
圖10為根據本發明再一實施例之新穎的載體結構之剖面微觀示意圖。
圖11為根據本發明一實施例之新穎的載體結構的使用示意圖。
圖12為根據本發明一實施例之新穎的載體結構的使用示意圖。
圖13為間葉幹細胞生長於本發明之載體結構的示意圖。
圖14為間葉幹細胞生長於本發明之載體結構的示意圖。
圖15為在細胞收穫後其中一層網狀結構的載體結構示意圖。
圖16為在細胞收穫後其中一層網狀結構的載體結構示意圖。
圖17為從BelloCell培養系統中之載體結構回收之細胞數目及回收率結果。
圖18為從含有細胞之培養液中之額外顆粒的計數結果。
本發明教示一種三維多孔生長表面，其是由多層網狀結構(netting/mesh)所構成。其可強化細胞生長表面、促進細胞的固定、有利於細胞回收、降低顆粒釋放、且可因此增加細胞產量。本發明更教示一種改善生長表面的方法，其可使用於真核細胞培養，其包含下列步驟：提供多孔及三維結構的生長表面；將該生長表面進行處理以促進細胞貼附；將該生長表面設置於任意的細胞培養裝置中並使細胞於其中生長並增殖。上述生長表面可使細胞生長，且在培養完成後，在該生長表面添加胰蛋白酶(trypsin/EDTA)、蛋白酶、膠原酶(collagenase)及/或DNA酶可使細胞/組織釋放以獲得單一顆細胞。
下述僅為例示性說明，並不意欲限制本發明於任一特定的所述實施例。該些說明配合圖式作為例示，使讀者對本發明有較完整的瞭解可理解。為避免不必要地限制前述內容，以下將揭露本發明之優選的實施例。根據本發明的實施例適用於真核細胞的培養，尤其適用於動物細胞及/或哺乳動物細胞。本發明特別地教示了適用於培養貼壁細胞的新穎生長表面及結構，可易於在細胞生長完成後收集細胞。
根據本發明之新穎的生長表面是由多層網狀結構所製成，其包含用於支撐或間隔的網層、以及用於供細胞貼附及生長的一層或多層網狀結構。其中，供細胞貼附及生長的網狀結構可為至少一層(如圖3所示)、兩層(如圖2所示)、三層(如圖1所示)、或根據所欲培養的細胞而可為更多層。
圖1為根據本發明一實施例之新穎的載體結構示意圖，其中該結構由兩層片狀網狀結構所製成。頂部一層具有較小的孔洞尺寸(30um至800um)，而底部層具有較大的孔洞尺寸(1mm至5mm)。頂部一層是由易於表面處 理的格網材料所製成，例如聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,PET)，而底部層是由可支撐性的格網材料所製作，可由例如聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,PET)、聚丙烯(polypropylene)、聚乙烯(polyethylene,PE)、聚四氟乙烯(polytetrafluoroethene,PTFE)或尼龍(nylon)之材料所製成，其具剛性和支撐性且可於建構基質床時作為間隔物及支撐物。頂部一層網狀結構的表面處理為具有生物相容性(biocompatible)及親水性(hydrophilic)，從而使細胞貼附於其上並生長。底部的網層可作為間隔物，可不須經表面處理，即使經表面處理也不會影響其功能。其中，整個二層網狀結構的四周以熱壓或超音波或膠黏處理方式密封(圖上未示)，可以進一步避免格網纖維及顆粒的釋放。
如圖1所示，本發明之載體結構100包含網狀結構單元30，該網狀結構單元30包含：至少一第一網層10，其具有由複數條第一經線101及複數條第一緯線102彼此交織所形成之複數個第一網孔11，至少一第一網層10具有生物相容性及親水性；第二網層20，其具有由複數條第二經線201及複數條第二緯線202交織所形成之複數個網孔21。第二網層20是平行地設置於至少一第一網層10之上或之下。其中，複數個第二網孔21的孔徑大於複數個第一網孔11的孔徑，並且，複數個第一網孔11的開口方向垂直於第一經線101及第一緯線102，而複數個第二網孔21的開口方向垂直於第二經線201及第二緯線202。
然而，本發明並不限於此，網狀結構可包含兩層第一網層10及一層第二網層20，如圖2所示。圖2為本發明另一實施例之新穎的載體結構示意圖，其中該結構由三層網狀結構所製成。頂部兩層具有較小的孔洞尺寸(30um至800um)，而底部層具有較大的孔洞尺寸(1mm至5mm)。頂部兩層是由易於表面處理的格網材料所製成，例如聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate, PET)，而底部層是由可支撐性的格網材料所製作，可由例如聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,PET)、聚丙烯(polypropylene)、聚乙烯(polyethylene,PE)、聚四氟乙烯(polytetrafluoroethene,PTFE)或尼龍(nylon)之材料所製成，其具剛性和支撐性且可於建構基質床時作為間隔物及支撐物。頂部兩層網狀結構的表面處理為具有生物相容性(biocompatible)及親水性(hydrophilic)，從而使細胞貼附於其上並生長。底部的網層可作為間隔物，可不須經表面處理，即使經表面處理也不會影響其功能。其中，整個三層網狀結構的四周以熱壓或超音波或膠黏處理方式密封，可以進一步避免格網纖維及顆粒的釋放。
在圖2中，第二網層20是設置於兩層第一網層10之下，然本發明並不限於此，第二網層20可依需求而設置於兩層第一網層10中間、或設置於兩層第一網層10之上。
在本發明之另一實施例中，網狀結構可包含三層第一網層10及一層第二網層20，如圖3所示。圖3為本發明再一實施例之新穎的載體結構示意圖，其中該結構由四層網狀結構所製成。頂部三層具有較小的孔洞尺寸(30um至800um)，而底部層具有較大的孔洞尺寸(1mm至5mm)。頂部三層是由易於表面處理的格網材料所製成，例如聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,PET)，而底部層是由可支撐性的格網材料所製作，可由例如聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,PET)、聚丙烯(polypropylene)、聚乙烯(polyethylene,PE)、聚四氟乙烯(polytetrafluoroethene,PTFE)或尼龍(nylon)之材料所製成，其具剛性和支撐性且可於建構基質床時作為間隔物及支撐物。頂部三層網狀結構的表面處理為具有生物相容性(biocompatible)及親水性(hydrophilic)，從而使細胞貼附於其上並生長。底部的網層可作為間隔物，可不須經表面處理，即使經表面 處理也不會影響其功能。其中，整個四層網狀結構的四周以熱壓或超音波或膠黏處理方式密封，可以進一步避免格網纖維及顆粒的釋放。
在圖3中，第二網層20是設置於三層第一網層10之下，然本發明並不限於此，第二網層20可依需求而設置於三層第一網層10的任兩層之間、或設置於三層第一網層10之上。
其中，在第一網層10中，可依需求調整每一第一經線101及第一緯線102之間的間距而改變複數個第一網孔11的孔徑為全部相同或部分相同。在另一實施例中，第二網層20中的第二經線201及第二緯線202之間的間距亦可依需求而調整以使複數個第二網孔21的孔徑為全部相同或部分相同。再者，作為經線或緯線的紗線的直徑遠大於細胞，可輕易地由細胞液中過濾而和細胞分離。該網狀織物內紗線的寬度可為50um到1000um，更精確地來說，該紗線寬度可為50um到500um.其寬度遠大於細胞直徑(約5~20um)，因此即使由網狀織物內脫離，亦容易以過濾方式與細胞分離。此外，如圖4所示，第一網層10的周邊與第二網層20的周邊是以熱壓、超音波或膠黏的方式封合(見圖4周邊處的孔洞因熱壓使網材融熔填入孔洞中的部分)，藉由這樣的設置可避免在細胞收穫時形成或產生額外的顆粒，舉例而言，來自載體的顆粒被釋放。
作為支撐或間隔的第二網層20具有剛性，舉例而言，可由聚丙烯(polypropylene)或尼龍(nylon)所製成，且具有多孔，可設置於供細胞貼附及生長之網狀結構的上方或下方或各生長之網狀結構中間，如圖5、圖6及圖7所示。當整個培養載體捲曲(如圖5及圖6所示)或堆疊(如圖7所示)或充填，可設置於生物反應器(例如BelloCell或TideCell生物反應器)中形成為填充床。
圖5為本發明另一實施例之新穎的載體結構示意圖，其中可以將多層網狀結構單元30捲曲為柱狀而建構載體200作為基質床，其中底部網層作為個結構之間的間隔物以使培養基或氧氣可於細胞培養時自由地流動。而本發明並不僅限於一個柱狀載體結構，如圖6所示，載體210可透過將多個捲曲為柱狀之網狀結構單元30而建構。圖7為本發明再一實施例之新穎的載體結構示意圖，其中可以將多層網狀結構單元30彼此依序堆疊於容器中而建構載體300作為基質床。其中多層網狀結構單元30可被切割為任意形狀的薄片，其尺寸較佳為2cm x 2cm至2m x 2m，因而得以形成基質床。然，本發明並不以此為限制，在本發明之另一實施例中，更可將多個網狀結構單元30隨機的堆疊而形成堆疊體以作為基質床(可參考圖10)。
圖8為根據本發明一實施例之新穎的載體結構之剖面微觀示意圖，請同時參考圖1，載體結構經捲曲或堆疊或充填以在生物反應器中形成基質床。在本實施例中，網狀結構單元是由一層親水性網狀結構(第一網層10)及一層未經處理作為間隔物的網層(第二網層20)所構成。作為間隔物的網層具有較大的孔洞尺寸並提供支撐性，可使培養基、溶液、空氣自由地穿透。
圖9為根據本發明另一實施例之新穎的載體結構之剖面微觀示意圖，請同時參考圖2，該載體結構經捲曲或堆疊或充填以在生物反應器中形成基質床。在本實施例中，網狀結構單元是由兩層親水性網狀結構(第一網層10)及一層未經處理作為間隔物的網層(第二網層20)所構成。作為間隔物的網層具有較大的孔洞尺寸且可使培養基、溶液、空氣自由地穿透。
圖10為根據本發明一實施例之新穎的載體結構之剖面微觀示意圖，請同時參考圖3，該載體結構經捲曲或堆疊或充填以在生物反應器中形 成基質床。在本實施例中，網狀結構單元是由三層親水性網狀結構(第一網層10)及一層未經處理作為間隔物的網層(第二網層20)所構成。作為間隔物的網層具有較大的孔洞尺寸且可使培養基、溶液、空氣自由地穿透。
供細胞貼附及生長之網狀結構(第一網層10)可由任何天然或人造聚合物所製成，但優選的可為聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,PET)，其較易於表面處理，由於網狀結構的開口尺寸精確且一致(可參考回圖1至圖3，第一網層10的網孔11的開口方向垂直於第一經線101及第一緯線102，而第二網層20的網孔21的開口方向垂直於第二經縣201及第二緯線202，第一網層10的網孔11與第二網層20的網孔21的開口方向一致)，因而可優化細胞培養並提供更一致的表現。由於多層的網狀結構上之開口皆朝向相同的方向，其可有利於細胞從生長表面釋放及被收集。該由供細胞貼附及生長的一層或多層網狀結構及用於支撐或間隔的網層所結合的多層的網狀結構可在其周圍經由熱壓、超音波或膠黏處理的方式封合，可以避免或降低纖維或顆粒的釋放。
供細胞貼附及生長之網狀結構(第一網層10)的多孔結構具有30um至800um的孔徑。較佳地，第一網層10的孔徑可以在50um至200um的範圍內。而用於支撐及間隔的網層(第二網層20)則具有1mm至10mm的孔徑。更優選地，第二網層20的孔徑可以在2mm至5mm的範圍內。
根據本發明之載體結構可最大化細胞的生長表面積，可促進細胞貼附及細胞增殖、更有利於細胞脫落因而可提供最大化的細胞密度及細胞產物。
本發明所提供之新穎的生長表面在符合本發明所請之範疇的情況下可依需求而具有任意尺寸、形狀、形式、結構或幾何構型。該生長表面可為任何合適的形式，例如，可為粒狀(pellet)、條狀(strip)、片狀(sheet)或任何三 維結構。在一實施例中，網狀結構單元30可呈現為片狀，且可被捲曲以形成一柱體(column)型態的載體200(如圖5所示)或多個柱體型態的載體210(如圖6所示)，可設置於培養槽、培養容器或生物反應器(例如BelloCell®或TideCell®生物反應器)內。該些網狀結構具有較大的尺寸以便於捲曲而形成單一固定床單元(single fixed bed unit)，而非局限於限定的區域放置小塊載體以形成固定床。由網狀織物所製成的薄片尺寸可為1cm(高)x20 cm(寬)至10m(高)x100m(寬)，其尺寸取決於固定床的大小。更精確地，由網狀織物所製成的薄片尺寸可為3cm(高)x 50cm(寬)至2m(高)x 20m(寬)。
在另一實施例中，網狀結構單元30可為片狀的形式且被依序堆疊以形成一柱體型態的載體300或多個柱體，如圖7所示。其可被設置於培養槽、培養容器或生物反應器(例如BelloCell®或TideCell®生物反應器)內。該些網狀結構具有較大的尺寸以便於捲曲而形成單一固定床單元(single fixed bed unit)，而非局限於限定的區域放置小塊載體以形成固定床。片狀的網狀結構可為尺寸為1cm x 1cm至2m x 2m的正方形、或直徑為1cm至2m的圓形。然，並不限於此，可依固定床的尺寸及形狀而調整網狀結構為任意的形狀及尺寸。更精確地，片狀之網狀織物的尺寸可為5cm x 5cm至0.5m x 0.5m的正方形、或直徑為5cm至0.5m的圓形。
當捲曲本發明之載體結構並設置於TideCell®培養系統中時，其可提供最大化的生質生產(biomass production)結果。這是由於TideCell®培養系統所使用的培養基至為TideMotionTM，其是間歇性地使培養載體沉浸及暴露於培養基中，在這樣的培養機制下，即使將填充床緊密地堆疊(如捲曲或堆疊或充填)，仍可使氧氣進入基質床而不會導致細胞溺斃(drowning of cells)。其他的細胞培養生 物反應器並無法在如此高密度的填充條件下進行細胞培養。因此，本發明結合BelloCell®或TideCell®細胞培養系統可在性能上達到最大的效果。
對於所屬領域具有通常知識者而言，可理解的是，生長表面的某些特徵可能會對其性能產生影響。載體或生長表面，例如，其表面特性、載體密度、尺寸、毒性(toxicity)及剛性(rigidity)皆會影響生長表面的性能，從而影響細胞培養的表現(特別是細胞密度及整體的細胞產量)。具體而言，生長表面上的孔洞尺寸會影響細胞生長的表現。第一網層10的較佳的孔洞尺寸約為30um至800um。
於此，所述培養的細胞包含大部分的真核細胞，更具體來說為動物細胞，在更具體來說為哺乳類細胞。舉例而言，可為真皮纖維母細胞(dermal fibroblasts)、由骨隨分離之間質幹細胞(mesenchymal stem cells)、購自Wharton’s Jelly之間質幹細胞、由脂肪組織分離之脂肪間質幹細胞等。
細胞生長後，可以依常規的細胞收集程序，透過胰蛋白酶處理(trypsinization)或其他酵素處理，例如膠原蛋白酶(collagenase)、AccuMAX、Accutase或TrypLE等。
實例1：材料準備
本實例為將細胞生長於本發明所請的載體結構上。材料及方法：備妥網孔尺寸為3mm×3mm的聚丙烯(Polypropylene,PP)網格、以及備妥網孔尺寸為200um x 200um的聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,PET)網格，每一整個網格的大小為43cm(長)x 3cm(寬)。兩層PET網層設置於一層PP網層上，接著以熱壓方式將其周邊熱封，然後將此結構物進行表面親水處理，接著將其捲曲為直徑約4cm且高度為3cm的柱體型態的載體200。將該柱體載體200 設置於BelloCell®培養瓶(培養腔室400)中(CESCO® Bioengineering Co.,Ltd.)，並使用γ射線以25kGy至35kGy的劑量範圍滅菌，如圖11所示。將載體結構捲曲為柱狀的微觀結構如圖9所示。其中，在捲曲成為柱體之前，將層疊的二層PET網層和一層PP網層以熱壓方式熱壓網格四周，以使得多層網層的四周壓合成封閉邊。
實例2：細胞培養
使用由人類Wharton’s Jelly中分離之間質幹細胞(MSCs)約3x107的數量於100ml的培養基中，並將其種入(seed)上述具有本發明之載體結構的BelloCell瓶中3小時。在確認種植率(seeding efficiency)超過90%後，添加400ml的新鮮培養基使得總培養基為500ml。接著將上述BelloCell瓶安裝至BelloStage-3000機器(CESCO Bioengineering Co.,Ltd.)，並使用以下參數：上升速度：1mm/s；T_H：10秒；下降速度：1mm/s；B_H：30秒，在攝氏37度及5%CO2濃度下進行30分鐘。在培養第4天及第8天時檢查細胞生長狀況，確認細胞生長已達融合(confluency)後，在第8天進行細胞收穫(harvest)。
本發明所請之載體的型態亦可為由多個網狀結構單元隨機堆疊而形成之堆疊體，如圖12所示，其為根據本發明一實施例之新穎的載體結構的使用示意圖。其中，網狀結構單元30可為條狀，且是隨機地堆疊(或充填)於培養腔室400)中，以於BelloCell®(CESCO Bioengineering Co.,Ltd)中形成填充床，以用於細胞培養之用。
圖13為間葉幹細胞(mesenchymal stem cells)生長於本發明之載體結構的部分放大示意圖，其中細胞以緻密及3D結構形式生長。請同時參考圖2和圖13，在本實施例中，載體結構是以兩層網狀結構(PET)及一層網層(PP)所構 成，其中第二網層的網孔21較第一網層的網孔11大，故在顯微鏡下的放大顯示中，網孔21的範圍內可以二個網孔11重疊，且細胞生長於其間。而圖14為間葉幹細胞(mesenchymal stem cells)生長於本發明之載體結構的示意圖，請同時參考圖3和圖14，其中細胞以緻密及3D結構形式生長。在本實施例中，載體結構是以三層網狀結構(PET)及一層網層(PP)所構成，故重疊三層的第一網層在顯微鏡的放大顯示下較為暗沉。
圖15為使用兩層網狀結構(PET)及一層網層(PP)所構成之載體的實施例，可同時參考圖2和圖15，其在細胞收穫後將其中一層PET網狀結構剝離出來進行觀察的載體結構示意圖可發現在細胞收穫後並無觀察到殘留的細胞。圖16為使用三層網狀結構(PET)及一層網層(PP)所構成之載體的實施例，可同時參考圖3和圖16，其在細胞收穫後將其中一層PET網狀結構剝離出來進行觀察的載體結構示意圖。可發現，在細胞收穫後僅在有限的區域可觀察到一些細胞外基質(extracellular matrixes)及少量細胞。
實例3：細胞/組織釋放
在細胞生長達到融合後，以D-PBS沖洗生長表面3次，且接著將胰蛋白酶/EDTA浸沒生長表面5分鐘。在細胞與生長表面分離之前，將胰蛋白酶/EDTA溶液移除。輕敲並搖晃BelloCell®瓶並使生長表面撞擊BelloCell®瓶的瓶壁，以迫使細胞分離，接著再以D-PBS沖洗。重複輕敲/搖晃及沖洗的動作3次。接著收集所有的產物，進行離心、再懸浮(re-suspend)、以及檢查細胞數目及存活狀況。結果顯示於圖17。根據數據顯示，使用本發明之載體結構的每一個BelloCell®瓶中生長的細胞密度可達到9x107。於此，使用兩層PET網格及一層PP網格的載體(組別1)、以及三層PET網格及一層PP網格的載體(組別2)，兩者個尺 寸皆為直徑為4cm且高度為3cm。透過檢查生長表面上的染色細胞來計算細胞回收率。藉由估算整理細胞的生產率，若增加基質床以填充BelloCell®瓶的整個基質床空間，其中的細胞生產率可能超過8x108。與BioNOC II®載體相比，其僅能獲得2x108個細胞，回收率約為70~80%(未顯示)。使用本發明之載體可使細胞生產率提升四倍。更甚者，細胞收穫後並沒有觀察到人工顆粒，如圖18所示。有關於顆粒釋放的問題，使用BioNOC II®載體的BelloCell®瓶在收穫細胞後可能會發現14,000根纖維。相較之下，本發明之載體不需額外的程序去除人工顆粒。
綜上所述，根據本發明所請的用於細胞培養之載體具有三維多孔結構，其是由具有不同孔徑的多層網狀結構所構成，該些網狀層的開口方向一致，可強化細胞生長表面、促進細胞的固定、有利於細胞回收、且可因此增加細胞產量。此外，本發明所請的載體結構相較於傳統使用不織布的載體，可在收獲細胞時降低額外顆粒的產生，降低生產成本及少時間的浪費。
又，本發明教示一種強化細胞回收率的方法，其使用上述網狀層相較於以不織布或其他多孔材料製成的載體具有較少的障礙物(obstacle)，可強化細胞回收率。本發明更提供一種在收集細胞過程中降低顆粒生成的方法，透過於該多層網狀結構的四周進行封邊以阻隔纖維或顆粒的釋出，並利用網狀層上的紗線直徑大於細胞的壁尺寸以易於過濾分離。由本發明所提供之生長表面可透過簡易地捲曲多個網狀層而易於製成固定床，不僅可降低製造成本，同時有利於固定床生物反應器的載體之大量製造。本發明所請的固定床基質可用於固定床生物反應器，特別是用於以TideMotionTM機制進行細胞培養的BelloCell及TideCell細胞培養系統。
10:第一網層
11、21:網孔
20:第二網層
100:載體
101:第一經線
102:第一緯線
201:第二經線
202:第二緯線
30:網狀結構單元

Claims (17)

  1. 一種用於細胞培養的載體，其包含一網狀結構單元，該網狀結構單元包含：至少一第一網層，其具有由複數條第一經線及複數條第一緯線彼此交織所形成之複數個第一網孔，且該至少一第一網層具有生物相容性及親水性以提供細胞貼附於上生長，其中任一該第一網孔的孔徑為30um至800um，任一該第一經線或任一該第一緯線的寬度為50um到500um；及一第二網層，其具有由複數條第二經線及複數條第二緯線彼此交織所形成之複數個第二網孔，該第二網層平行地設置於該至少一第一網層之上或之下並具有剛性和支撐性；其中任一該第二網孔的孔徑大於任一該第一網孔的孔徑，任一該第二經線或任一該第二緯線的寬度為100um到1000um，並且該至少一第一網層的周邊與該第二網層的周邊相互封合。
  2. 如請求項1所述之用於細胞培養的載體，其中該網狀結構單元包含兩層該第一網層及一層該第二網層，其中該第二網層設置於兩層該第一網層中間、或設置於兩層該第一網層之上、或設置於兩層該第一網層之下。
  3. 如請求項1所述之用於細胞培養的載體，其中該網狀結構單元包含至少三層該第一網層及一層該第二網層，其中該第二網層設置於三層該第一網層之任兩層之間、或設置於三層該第一網層之上、或設置於三層該第一網層之下。
  4. 如請求項1所述之用於細胞培養的載體，其中該第一網層的材料包含聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,PET)，而該第二網層的材料包含聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,PET)、聚丙烯 (polypropylene)、聚乙烯(polyethylene,PE)、聚四氟乙烯(polytetrafluoroethene,PTFE)或尼龍(nylon)。
  5. 如請求項1所述之用於細胞培養的載體，其中該第一網層係為經過親水性表面處理的一格網材料，以及該第二網層係為具有支撐性的一格網材料。
  6. 如請求項1所述之用於細胞培養的載體，其中任一該第二網孔的孔徑為1mm至5mm。
  7. 如請求項1所述之用於細胞培養的載體，其中該載體的型態為由該網狀結構單元捲曲而形成之一或多個柱體、由多個該網狀結構單元依序層疊而形成之一或多個柱體、或由多個該網狀結構單元隨機堆疊而形成之一堆疊體。
  8. 如請求項1所述之用於細胞培養的載體，其中該至少一第一網層的周邊與該第二網層的周邊是以熱壓、超音波或膠黏的方式封合。
  9. 如請求項1所述之用於細胞培養的載體，其中在各該至少一第一網層中，該複數個第一網孔的孔徑全部相同或部分相同。
  10. 如請求項1所述之用於細胞培養的載體，其中在該第二網層中，該複數個第二網孔的孔徑全部相同或部分相同。
  11. 如請求項1所述之用於細胞培養的載體，其中任一該複數條第一經線、任一該複數條第一緯線的寬度為50um到250um；其中任一該複數條第二經線或任一該複數條第二緯線的寬度為250um到500um。
  12. 一種細胞培養裝置，其包含如請求項1所述之用於細胞培養的載體以及一培養腔室容置該用於細胞培養的載體。
  13. 如請求項12所述之細胞培養裝置，其中，該網狀結構單元捲曲而形成之一或多個柱體以放置於該培養腔室中；或是由多個該網狀結構單元依序層疊而形成之一或多個柱體以放置於該培養腔室中；或是由多個該網狀結構單元隨機堆疊而形成之一堆疊體以放置於該培養腔室中。
  14. 如請求項13所述之細胞培養裝置，其中，該網狀結構單元包含兩層或三層該第一網層及一層該第二網層，其中該第二網層設置於任兩層該第一網層中間、或設置於所有該第一網層之上、或設置於所有該第一網層之下。
  15. 如請求項12所述之細胞培養裝置，其中該第一網層的材料包含聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,PET)，而該第二網層的材料包含聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,PET)、聚丙烯(polypropylene)、聚乙烯(polyethylene,PE)、聚四氟乙烯(polytetrafluoroethene,PTFE)或尼龍(nylon)。
  16. 如請求項12所述之細胞培養裝置，其中該第一網層係為經過親水性表面處理的一格網材料，以及該第二網層係為具有支撐性的一格網材料。
  17. 如請求項12所述之細胞培養裝置，其中任一該第二網孔的孔徑為1mm至5mm。
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