JP2005237274A - 細胞培養方法、チャンバ及びそれを利用した細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 コンパクトな構成で接着依存性細胞を継代培養することができる。
【解決手段】 本発明の細胞培養方法は、チャンバ１０内に存在するマイクロディスク５に細胞を接着させる接着工程と、細胞をマイクロディスク５に接着させた状態でチャンバ１０内の液体培地中で培養し増殖させる増殖工程と、増殖工程で増殖した細胞をチャンバ１０内でマイクロディスク５から剥離させる剥離工程と、剥離工程のあとチャンバ１０内に細胞及びマイクロディスク５を残してチャンバ１０内の液状物を排出し該チャンバ１０内に新たな液体培地を入れて細胞を懸濁させる懸濁工程と、マイクロディスク５が増殖工程時にチャンバ１０内に存在していた量より多くなるように該チャンバ１０内へマイクロディスク５を追加する担体追加工程と、を繰り返し実行するものである。こうすれば、各工程を一つのチャンバ内で継代培養を行うことができる。
【選択図】 図１

Description

本発明は、細胞培養方法、チャンバ及びそれを利用した細胞培養装置に関し、特に細胞増殖の足場となる微小担体（以下、マイクロキャリアと云う）を使って継代培養を行う際に利用される細胞培養方法、チャンバ及び細胞培養装置に関する。

近年、生体外(in vitro)で細胞を培養し、増殖させた細胞や再構築させた培養組織を治療のために患者に使用したり、医薬品や化粧品などのスクリーニング試験に利用したりと、細胞培養技術が種々の領域で利用されている。

例えば、ヒト表皮細胞(Keratinocyte)による医療用の培養細胞シートの作製過程は、次のような手順で行われる。最初に患者の健康な部位から少量の組織片を採取し、酵素処理によって細胞を分散させた後、表皮細胞を回収する。次いで、初代培養を行った後、初代培養で増殖させた細胞をトリプシンなどのプロテアーゼによって培養容器から剥離し、別の複数の培養容器に分けて継代培養する。この継代培養を繰り返すことによって、必要数の培養細胞シートを作製できる細胞数にまで増殖させた後、三次元培養（重層化）を施し、これを移植用の培養細胞シートとして病院へ輸送し、移植を行う。このような細胞培養技術は古くから行われているが、その工程のほとんどは人手によるマニュアル操作であって作業者の負担が大きい。

このような状況において、これらの各工程を簡素化するための技術が種々案出されている。例えば、特許文献１では、マイクロキャリアを用いた浮遊培養において、マイクロキャリアからの細胞の剥離状態を吸光度センサからの検出値により監視して最適条件で継代培養を実施する方法が開示されている。具体的には、種培養槽でマイクロキャリアに付着させた細胞を培養し増殖させたあとマイクロキャリアから剥離させるとき、種培養槽に取り付けた吸光度センサからの検出値に基づいてマイクロキャリアから剥離した細胞数を算出し、その細胞数に応じた最適なマイクロキャリア濃度を算出し、そのマイクロキャリア濃度と種培養槽中のマイクロキャリア濃度とから次の培養（つまり継代培養）を行う培養槽に投入すべき新品のマイクロキャリアの数を算出する。このようにして算出した数の新品のマイクロキャリアをマイクロキャリア調製槽から培養槽へ注入すると共に、種培養液（増殖後の細胞と古いマイクロキャリアとの混合液）を種培養槽から培養槽へ注入したあと、この培養槽で継代培養を行う。
特開平１０−１１３１６７号公報

しかしながら、特許文献１では、マイクロキャリアに付着させた細胞を培養し増殖させるための種培養槽と、増殖後の細胞を用いて継代培養を行うための培養槽とがそれぞれ必要になるため、全体の装置構成が大型化するという問題があった。

本発明は、このような課題に鑑みなされたものであり、コンパクトな構成で接着依存性細胞を継代培養することができる細胞培養方法を提供することを目的の一つとする。また、このような細胞培養方法に適したチャンバや細胞培養装置を提供することを目的の一つとする。

本発明は、上述の目的の少なくとも一つを達成するために以下の手段を採った。

本発明の細胞培養方法は、
チャンバ内に存在するマイクロキャリアに接着依存性細胞を接着させる接着工程と、
前記接着依存性細胞を前記マイクロキャリアに接着させた状態で前記チャンバ内の液体培地中で培養し増殖させる増殖工程と、
該増殖工程で増殖した前記接着依存性細胞を前記チャンバ内で前記マイクロキャリアから剥離させる剥離工程と、
該剥離工程のあと前記チャンバ内に前記接着依存性細胞及び前記マイクロキャリアを残して該チャンバ内の液状物の少なくとも一部を排出し該チャンバ内に新たな液体培地を入れて前記接着依存性細胞を懸濁させる懸濁工程と、
前記マイクロキャリアが前記増殖工程時に前記チャンバ内に存在していた量より多くなるように該チャンバ内へ前記マイクロキャリアを追加する担体追加工程と、
を繰り返し実行するものである。

この細胞培養方法では、同じチャンバ内で接着工程、増殖工程、剥離工程、懸濁工程を実施したあと、接着依存性細胞の数が増えていることからそのチャンバ内へマイクロキャリアを追加し、再びそのチャンバ内で接着工程、増殖工程、剥離工程、懸濁工程を繰り返し実施するので、一つのチャンバ内で継代培養を行うことができる。つまり、コンパクトな構成で接着依存性細胞の継代培養を行うことができる。

ここで、接着工程では、チャンバ内に存在するマイクロキャリアに接着依存性細胞を接着させる。通常、チャンバ内にマイクロキャリアと細胞懸濁液（接着依存性細胞と液体培地などの溶液）を入れた状態でマイクロキャリアに接着依存性細胞を接着させる。このとき、マイクロキャリアに接着依存性細胞を接着させるには、静置状態としてもよいし、断続的な攪拌を行ってもよい。なお、マイクロキャリアとは、接着依存性細胞を接着可能な数１０μｍ〜数ｍｍの大きさのキャリアであり、例えばゼラチン、コラーゲン、ガラス、セルロース、デキストラン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド又はＤＥＡＥで形成された三次元形状物（球体など）又は平面形状物（円盤体など）が挙げられる。また、接着依存性細胞とは、培養面に直接又は間接的に接着したあとその接着面積を広げていきその後細胞分裂する細胞（足場依存性細胞ともいう）をいい、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル等の温血動物から採取された種々の接着依存性細胞が好ましい。この種の細胞としては、例えば、表皮細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、筋細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞若しくは間質細胞、又はこれらの細胞の前駆細胞、幹細胞若しくは接着依存性のガン細胞が挙げられる。また、間葉系幹細胞（MSCs：Mesenchymal Stem Cells）や胚性幹細胞（ESCs：Embryonic Stem Cells）を使用することもできる。或いは、エリスロポエチン、成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インスリン、インターフェロン、血液凝固第VIII因子等の血液凝固因子、グルカゴン、組織プラスミノーゲンアクチゲーター、ドーパミン、ガン遺伝子、ガン抑制遺伝子等をコードする外来遺伝子を前記細胞に導入し、それらの遺伝子を種々のプロモータを用いて強制的に又は特定の条件下で発現させるように構成した形質転換細胞を使用してもよい。

また、増殖工程では、接着依存性細胞をマイクロキャリアに接着させた状態でチャンバ内の液体培地中で培養し増殖させる。通常、液体培地を攪拌して接着依存性細胞が接着した状態のマイクロキャリアを浮遊させて行う。このときの攪拌速度は、マイクロキャリアが浮遊状態を保つように設定する。また、適時、培地交換を行ってもよい。そして、細胞種にもよるが、接着依存性細胞がコンフルエント状態に至った後は、それ以上マイクロキャリア上で増殖できないので、接着依存性細胞がマイクロキャリア上でコンフルエント状態に達する前に増殖工程を終えることが好ましい。なお、細胞種によってはコンフルエント状態に至った後に分化を開始する細胞種もあるので、後述の回収工程において分化後の細胞を得たい場合などには、コンフルエント状態に至った後も適切な時間だけ、細胞分化のための培養を継続してから増殖工程を終えてもよい。

また、剥離工程では、増殖工程で増殖した接着依存性細胞をチャンバ内で前記マイクロキャリアから剥離させる。通常、トリプシンに代表されるプロテアーゼを含む溶液を細胞剥離液としてチャンバ内へ投入することにより接着依存性細胞をマイクロキャリアから剥離させ、その後剥離作用を停止させる停止液（例えば細胞剥離液がトリプシン溶液のときには血清添加培地など）をチャンバ内へ投入する。

また、懸濁工程では、剥離工程のあとチャンバ内に接着依存性細胞及びマイクロキャリアを残してそのチャンバ内の液状物の少なくとも一部を排出しそのチャンバ内に新たな液体培地を入れて接着依存性細胞を懸濁させる。

また、担体追加工程では、マイクロキャリアが増殖工程時にチャンバ内に存在していた量より多くなるようにそのチャンバ内へマイクロキャリアを追加する。マイクロキャリアの追加量は、例えば、予め接着依存性細胞の細胞数とマイクロキャリアの量との相関関係を経験的に定めておき、増殖後の接着依存性細胞の総細胞数に応じたマイクロキャリアの総量を先の相関関係から算出し、その総量から現在チャンバ内に存在しているマイクロキャリアの量を差し引いた分を追加量とする。なお、例えば細胞数に比してマイクロキャリアの量が多すぎると個々のマイクロキャリアに接着する細胞数が少なくなるため、細胞が接着していないマイクロキャリアが存在したり、細胞増殖に必要な期間が長くなったりすることによって、効率よく細胞を増殖させることが困難となる。したがって、接着依存性細胞の細胞数とマイクロキャリアの量との相関関係は、接着依存性細胞の細胞数と、投入されるマイクロキャリアの総表面積との関係に基づけば、播種密度として理解することができる。

本発明の細胞培養方法において、前記接着工程では、前記接着依存性細胞は通過するがマイクロキャリアは通過しないフィルタによってフィルタ内部とフィルタ外部とに仕切られたチャンバを用意し該フィルタ内部に投入したマイクロキャリアに接着依存性細胞を接着させ、前記剥離工程では、前記マイクロキャリアから剥離した前記接着依存性細胞を遠心力により前記フィルタ外部へ通過させ、前記担体追加工程では、前記フィルタ内部へ前記マイクロキャリアを追加してもよい。こうすれば、剥離後の接着依存性細胞とマイクロキャリアとはフィルタを介して分離されるため、剥離後の接着依存性細胞がマイクロキャリアによってダメージを受けることがない。また、マイクロキャリアと接着依存性細胞を容易に分離できるので、剥離工程で使用した廃液（細胞剥離剤＋停止液）を容易に排出でき、後述の回収工程においてマイクロキャリアを含まない状態の細胞懸濁液を容易に回収できる。

本発明の細胞培養方法において、前記接着工程では、前記接着依存性細胞は入り込めるがマイクロキャリアは入り込めない大きさの細胞集積部を外周に備えたチャンバを用意し該チャンバに投入したマイクロキャリアに接着依存性細胞を接着させ、前記剥離工程では、前記接着依存性細胞を前記マイクロキャリアから剥離させ遠心力により前記細胞集積部に集積させてもよい。こうすれば、剥離後の接着依存性細胞は細胞集積部に集積されるのに対してマイクロキャリアはこの細胞集積部へ入り込むことができないため、剥離後の接着依存性細胞がマイクロキャリアによってダメージを受けることがない。また、マイクロキャリアと接着依存性細胞を容易に分けることができるので、剥離工程で使用した廃液（細胞剥離剤＋停止液）を容易に排出でき、後述の回収工程においてマイクロキャリアを含まない状態の細胞懸濁液を容易に回収できる。

本発明の細胞培養方法は、前記接着依存性細胞が所定の細胞数に到達したときには該接着依存性細胞を回収する回収工程、を含んでいてもよい。こうすれば、所定の細胞数の接着依存性細胞を得ることができる。この回収工程では、マイクロキャリアを回収せず接着依存性細胞を選択的に回収することが好ましい。例えば、接着依存性細胞は通過するがマイクロキャリアは通過しないフィルタを介してチャンバ内の流動物を回収することにより、マイクロキャリアを回収せず接着依存性細胞を選択的に回収してもよい。

本発明の細胞培養方法において、前記マイクロキャリアは、直径が０．５〜５ｍｍのディスク状（以下、マイクロディスクと云う）であることが好ましい。こうすれば、マイクロキャリアの接着面が細胞の大きさに比して十分に大きいので、接着依存性細胞の接着および増殖が効率よく行われる。また、マイクロキャリアと接着依存性細胞のサイズの差が大きいため、上述のようなフィルタや細胞集積部などによる接着依存性細胞とマイクロキャリアとの選別が容易に行える。

本発明のチャンバは、
前記接着依存性細胞は通過するがマイクロキャリアは通過しないフィルタと、
前記フィルタが内部空間を仕切ることにより略中央に形成されたフィルタ内部と、
前記フィルタが前記内部空間を仕切ることにより前記フィルタ内部の外側に形成されたフィルタ外部と、
を備えたものである。

このチャンバでは、フィルタ内部でマイクロキャリアに接着した接着依存性細胞を培養し増殖させたあと、マイクロキャリアから接着依存性細胞を剥離させ、その後その接着依存性細胞を遠心力によりフィルタ内部からフィルタ外部へ通過させる。このとき、マイクロキャリアはフィルタを通過できないためフィルタ内部に残ったままとなり、その結果、剥離後の接着依存性細胞とマイクロキャリアとは分離される。したがって、このチャンバを利用すれば、殊に遠心分離時などにおいて、剥離後の接着依存性細胞がマイクロキャリアによってダメージを受けることがない。ここで、前記フィルタは、カゴ部材の少なくとも外周面に形成されていてもよいし、仕切り壁として形成されていてもよい。また、このチャンバは、２本の遠心沈降管の開口を接着した形状を呈していてもよく、こうすれば、接着依存性細胞が遠心力によりフィルタを通過しやすい。また、フィルタは、接着依存性細胞は通過するが直径０．５〜５ｍｍのマイクロディスクは通過しないものとしてもよい。

本発明のチャンバは、
外端に設けられ前記接着依存性細胞は入り込めるがマイクロキャリアは入り込めない大きさの細胞集積部、
を備えたものとしてもよい。

このチャンバでは、チャンバ内でマイクロキャリアに接着した接着依存性細胞を培養し増殖させたあと、マイクロキャリアから接着依存性細胞を剥離させ、その後その接着依存性細胞を遠心力により細胞集積部へ集めることができる。このとき、マイクロキャリアは細胞集積部へ入り込めないため、剥離後の接着依存性細胞とマイクロキャリアとは分離される。したがって、このチャンバを利用すれば、殊に遠心分離時などにおいて、剥離後の接着依存性細胞がマイクロキャリアによってダメージを受けることがない。なお、このチャンバは、２本の遠心沈降管の開口を接着した形状を呈していてもよく、こうすれば、接着依存性細胞が遠心力により細胞集積部へ集まりやすい。また、細胞集積部は、接着依存性細胞は入り込めるが直径０．５〜５ｍｍのマイクロディスクは入り込めないものとしてもよい。

本発明の細胞培養装置は、
上述したチャンバと、
前記チャンバ内の流動体に渦流を発生させる渦流発生手段と、
前記チャンバ内へ流動体を供給可能な流動体供給手段と、
前記流動体供給手段の一つであって前記チャンバ内へ前記マイクロキャリアを供給可能なマイクロキャリア供給手段と、
前記チャンバ内から流動体を排出可能な流動体排出手段と、
を備えたものである。

この細胞培養装置では、例えば上述した細胞培養方法を実行する際に用いられる。即ち、接着工程においては、チャンバ内にマイクロキャリアをマイクロキャリア供給手段により供給し、接着依存性細胞の懸濁液を流動体供給手段により供給する。また、必要に応じて、渦流発生手段によりチャンバ内の流動体に渦流を発生させてマイクロキャリアを浮遊させる。増殖工程においては、必要に応じて、渦流発生手段によりチャンバ内の流動体に渦流を発生させてマイクロキャリアを浮遊させたり流動体排出手段により古い培地を排出したり流動体供給手段により新たな培地を供給したりする。剥離工程では、チャンバ内へ流動体供給手段により剥離液を供給したり剥離停止液を供給したりする。また、必要に応じて、渦流発生手段によりチャンバ内の流動体に渦流を発生させてマイクロキャリアを浮遊させる。懸濁工程では、チャンバ内から流動体排出手段により細胞を残して流動体を排出したあと流動体供給手段により新たな液体培地を供給する。また、渦流発生手段によりチャンバ内の流動体に渦流を発生させて接着依存性細胞を懸濁させる。担体追加工程では、マイクロキャリア供給手段によりマイクロキャリアをチャンバ内へ供給する。したがって、この細胞培養装置は、上述した細胞培養方法を実施するのに適している。ただし、上述した細胞培養方法とは異なる方法を実施するのを妨げるものではない。なお、渦流発生手段は、チャンバを軸回転させることによりチャンバ内の流動体に渦流を発生させてもよいし、チャンバ内に設置した回転体を回転させることによりチャンバ内の流動体に渦流を発生させてもよい。

本発明の細胞培養装置は、前記流動体排出手段の一つであって前記接着依存性細胞及び前記マイクロキャリアが存在する前記チャンバ内から前記接着依存性細胞を選択的に排出する細胞排出手段、を備えていてもよい。こうすれば、継代培養により細胞数が所定数に達したあと、マイクロキャリアと分けて接着依存性細胞を回収することができる。

次に、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。図１は、本発明の一実施形態である細胞培養装置の構成の概略を示す構成図である。本実施形態の細胞培養装置１は、フィルタを備えたチャンバ１０と、このチャンバ１０内の流動体に渦流を発生させる渦流発生用のモータ２０と、各種供給管３２ａ〜３２ｆを介してチャンバ１０内へ各種流動体を供給可能な供給ポンプ群３０と、各種排出管４２ａ〜４２ｅを介してチャンバ１０内から流動体を排出可能な排出ポンプ群４０と、各種制御を実行する制御部５０と、を備えている。

この細胞培養装置１のうちチャンバ１０とモータ２０は、滅菌可能な収容容器３に収容されている。この収容容器３は、密閉可能な開閉蓋（図示せず）を備えた筐体であり、上面や周面には各種供給管３２ａ〜３２ｆや各種排出管４２ａ〜４２ｅのほか、開閉弁３６の開閉により滅菌ガスを供給したり滅菌ガスの供給を停止したりする滅菌ガス供給管３８や開閉弁４６の開閉により滅菌ガスを排出したり滅菌ガスの排出を停止したりする滅菌ガス排出管４８が、密閉状態を保って貫通されている。

チャンバ１０は、二つの遠心沈降管の開口を向かい合わせて接合したような形状の容器であり、換言すれば水平方向に扁平した略紡錘形の容器である。このチャンバ１０は、中央上部に開口１２を有し、底面には中心から外方向に向かって複数の凸状のフィン１４が設けられている。また、チャンバ１０の周縁部分には、接着依存性細胞は通過するが直径１〜３ｍｍのポリスチレン製のマイクロディスク５は通過しないフィルタとして機能する仕切り壁１６が設けられており、仕切り壁１６から外側の領域（フィルタ外部）が細胞集積部１７として利用され、仕切り壁１６から内側の領域（フィルタ内部）が接着依存性細胞を培養する細胞培養部１８として利用される。

モータ２０は、回転軸２２に固定された受け台２４を備え、この受け台２４にチャンバ１０を固定バンド（図示せず）で固定することが可能なものである。このようにチャンバ１０を受け台２４に固定した状態でモータ２０の回転軸２２が回転すると、それに伴ってチャンバ１０も回転する。

供給ポンプ群３０は、収容容器３の外に配置された各種供給槽３４ａ〜３４ｆに貯溜されている各種流動体を各種供給管３２ａ〜３２ｆを介してチャンバ１０へ供給するものであり、第１供給ポンプ３０ａから第６供給ポンプ３０ｆによって構成されている。第１供給ポンプ３０ａは第１供給管３２ａを介してチャンバ１０内へ第１供給槽３４ａに貯溜された細胞懸濁液を供給するものであり、第２供給ポンプ３０ｂは第２供給管３２ｂを介してチャンバ１０内へ第２供給槽３４ｂに貯溜されたマイクロディスク浮遊液を供給するものであり、第３供給ポンプ３０ｃは第３供給管３２ｃを介してチャンバ１０内へ第３供給槽３４ｃに貯溜された培養液（液体培地）を供給するものであり、第４供給ポンプ３０ｄは第４供給管３２ｄを介してチャンバ１０内へ第４供給槽３４ｄに貯溜された洗浄液を供給するものであり、第５供給ポンプ３０ｅは第５供給管３２ｅを介してチャンバ１０内へ第５供給槽３４ｅに貯溜された細胞剥離液（トリプシン溶液）を供給するものであり、第６供給ポンプ３０ｆは第６供給管３２ｆを介してチャンバ１０内へ第６供給槽３４ｆに貯溜された剥離停止液を供給するものである。第１〜第６供給管３２ａ〜３２ｆは、供給口がチャンバ１０の開口１２上方に位置するように固定されている。

ここで、培養液である液体培地としては培養対象となる接着依存性細胞に応じて既知の培地から選択すればよいが、例えばダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）が挙げられ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などを含有していてもよい。また、マイクロディスク浮遊液はマイクロディスクを液体培地に浮遊させたものであり、細胞懸濁液は培養対象となる接着依存性細胞を液体培地に懸濁させたものである。更に、洗浄液としては抗生物質を添加したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）が挙げられ、細胞剥離液としてはトリプシンを含有するトリプシン溶液が挙げられ、剥離停止液としてはトリプシンの作用を停止させるトリプシンインヒビター溶液が挙げられる

排出ポンプ群４０は、チャンバ１０に貯溜された流動体（液体、浮遊液、懸濁液など）を各種排出管４２ａ〜４２ｅを介してチャンバ１０の外へ排出するものであり、第１排出ポンプ４０ａから第５排出ポンプ４０ｅによって構成されている。第１排出ポンプ４０ａは第１排出管４２ａを介してチャンバ１０内から液体培地を第１回収槽４４ａへ排出するものであり、第２排出ポンプ４０ｂは第２排出管４２ｂを介してチャンバ１０内から洗浄液を第２回収槽４４ｂへ排出するものであり、第３排出ポンプ４０ｃは第３排出管４２ｃを介してチャンバ１０内から細胞剥離液と剥離停止液との混合液を第３回収槽４４ｃへ排出するものであり、第４排出ポンプ４０ｄは第４排出管４２ｄを介してチャンバ１０内から細胞懸濁液を第４回収槽４４ｄへ排出するものであり、第５排出ポンプ４０ｅは第５排出管４２ｅを介してチャンバ１０内からマイクロディスク浮遊液を第５回収槽４４ｅへ排出するものである。第１〜第５排出管４２ａ〜４２ｅは、開口１２からチャンバ１０内に挿入されており、その排出口がチャンバ１０の底面からわずかに浮いた状態で固定されている。また、第１〜第４排出管４２ａ〜４２ｄの吸引口にはマイクロディスク５は通過せず接着依存性細胞は通過可能な大きさの孔を複数備えた規制キャップ（図示せず）が固着されているが、第５排出管４２ｅの吸引口にはこのような規制キャップは固着されておらずその管径もマイクロディスク５が容易に通過できる大きさに設定されている。

制御部５０は、周知のマイクロコンピュータとして構成され、メモリ５２に記憶されたプログラムを適時読み出し、そのプログラムに基づいて内蔵タイマ５４で計時したり、また計時しつつ供給ポンプ群３０や排出ポンプ群４０の各ポンプの動作を制御したり、モータ２０の駆動制御を行ったりする。また、制御部５０は、入力操作部５６を介してオペレータが入力した各種設定値をメモリ５２に記憶し、その設定値に基づいてプログラムを実行する。

次に、本実施形態の細胞培養装置１を利用した継代培養処理について説明する。ここでは、生体組織としてヒト表皮組織を挙げ、接着依存性細胞としてヒト表皮細胞を継代培養させる例を説明する。

オペレータは細胞培養に先立って、採取されたヒト皮膚組織から表皮細胞を単離し、表皮細胞懸濁液を調製する。具体的には、次のような工程を経て表皮細胞懸濁液を得る。まず、インフォームド・コンセントを行ったヒトから約１ｃｍ^２の皮膚組織を採取し、次いで、採取した皮膚組織をディスパーゼを含む表皮剥離用培地で処理することにより真皮層と表皮層とに分離し、この表皮層をトリプシン処理することで表皮細胞懸濁液を調製する。このようにして調製した表皮細胞懸濁液を第１供給槽３４ａに貯蔵する。また、第２〜第６供給槽３４ｂ〜３４ｆにも同様に、マイクロディスク浮遊液、液体培地、洗浄液、細胞剥離液、剥離停止液をそれぞれ貯溜する。一方、オペレータは、制御部５０の入力操作部５６を介して各種設定値を入力する。ここでは、各工程における各種液の投入量や排出量のほか、モータ回転速度、モータ回転時間、モータ回転方向などの設定を行う。

次に、オペレータは、制御部５０の入力操作部５６を操作して細胞培養処理のプログラムの開始を指示する。すると、制御部５０は、メモリ５２から細胞培養処理のプログラムを読み出し、そのプログラムを実行する。図２は細胞培養処理のフローチャートである。このプログラムが開始されると、制御部５０は、第１〜第３供給ポンプ３０ａ〜３０ｃを同時に又は順次駆動させ、第１〜第３供給管３２ａ〜３２ｃを通じてチャンバ１０の細胞培養部１８内に細胞懸濁液、マイクロディスク浮遊液、液体培地を投入する（ステップＳ１００）。投入量は各供給ポンプ３０ａ〜３０ｃの吐出量と吐出時間に基づいて演算しつつその投入量が予め入力された設定値に達したとき、各ポンプ３０ａ〜３０ｃの駆動を停止させる。

続いて、制御部５０は、チャンバ１０内の細胞がマイクロディスク５に接着するまでの所定時間、静置状態を保つ（ステップＳ１０４）。このステップが接着工程に相当する。この静置時間は、投入された細胞数とマイクロディスク数との関係に基づいて設定すればよく、オペレータによって入力操作部５６からマニュアル入力で設定されてもよい。なお、接着工程では、断続的に攪拌を行ってもよい。

次いで、制御部５０は、モータ２０を予め定められた所定の回転速度で回転させる（ステップＳ１０６）。これにより、回転軸２２に固定されているチャンバ１０が回転し、チャンバ１０内の液体培地に渦流が発生し、細胞が接着したマイクロディスク５を浮遊させて浮遊培養を行い、細胞を増殖させる。したがって、このステップが増殖工程に相当する。このとき、モータ回転速度は浮遊培養に適した回転数、例えば３０〜１５０ｒｐｍ程度の低速回転に設定されている。このステップＳ１０６におけるモータ２０の回転は、浮遊培養開始から所定時間が経過したときに停止させる。ここで、所定時間は、マイクロディスク５上で細胞がコンフルエント状態に至らない範囲で十分に増殖し得る時間が確保されていればよく、対象とする細胞の種類やマイクロディスクの形状や材質によって適宜決定される。また、回転は断続的に行ってもよい。

次いで、制御部５０は、チャンバ１０が停止した後、第１排出ポンプ４０ａを駆動させて第１排出管４２ａを介してチャンバ１０内の液体培地を第１回収槽４４ａに排出する（ステップＳ１０８）。ここで、第１排出管４２ａの吸引口には前出の規制キャップが取り付けられているので、細胞が接着しているマイクロディスク５が吸引されることなく、培地のみが吸引され排出される。液体培地を排出した後、制御部５０は、第４供給槽３４ｄに貯溜されている洗浄液を第４供給ポンプ３０ｄによってチャンバ１０内に投入し（ステップＳ１１０）、洗浄液投入後、モータ２０を駆動させて、チャンバ１０内に渦流を所定時間だけ発生させて細胞が接着した状態のマイクロディスク５を洗浄する（ステップＳ１１２）。この際のモータ２０は、５０〜２００ｒｐｍ程度の低速回転であって、順逆回転させることが好ましい。続いて、制御部５０は第２排出ポンプ４０ｂを駆動させて、第２排出管４２ｂを介してチャンバ１０内の洗浄液を第２回収槽４４ｂへ排出する（ステップＳ１１４）。このとき、第２排出管４２ｂの吸引口にも前出の規制キャップが取り付けられているので、細胞が接着したマイクロディスク５が吸引されることなく、洗浄液のみが選択的に吸引され排出される。以上のステップＳ１０８〜Ｓ１１４が洗浄工程に相当する。

洗浄液を排出した後、制御部５０は、第５供給ポンプ３０ｅを駆動させて第５供給管３２ｅを通じてチャンバ１０へ細胞剥離液を投入する（ステップＳ１１６）。この細胞剥離液の投入量は、第５供給ポンプ３０ｅの吐出量と吐出時間に基づいて演算でき、その投入量が予め入力された設定値に達したとき、第５供給ポンプ３０ｅの駆動を停止させる。続いて制御部５０は、モータ２０を予め定められた所定の低回転速度、回転時間だけ回転させる（ステップＳ１１８）。このとき、モータ回転速度は５０〜５００ｒｐｍに設定され、モータ回転時間は１〜３０分に設定されている。この低速回転操作によってチャンバ１０に貯溜された細胞剥離液に緩やかな水流が発生し、その水流と細胞剥離液の作用によりマイクロディスク５に接着していた細胞が剥離して徐々に分散する。また、この水流は、チャンバ１０の底面に設けられたフィン１４により効果的に発生する。このようにして剥離した細胞は溶液中を浮遊する。また、モータ回転方向は順回転のみとしてもよいが、順逆回転を交互に行うことが好ましい。例えば、０．２〜２秒間隔でモータ回転方向の順逆回転を切り替えることにより、細胞剥離液に発生する水流の順逆方向を切り替えてもよい。続いて制御部５０は、第６供給ポンプ３０ｆを駆動させ、第６供給管３２ｆを通じて第６供給槽３４ｆに貯溜されている剥離停止液をチャンバ１０へ投入する（ステップＳ１２０）。第６供給ポンプ３０ｆの吐出量と吐出時間に基づいて剥離停止液の投入量を演算し、その投入量が予め入力された設定値に達したとき、第６供給ポンプ３０ｆの駆動を停止させる。これにより細胞剥離液の作用が停止するため、マイクロディスク５から剥離した細胞がその後細胞剥離液によってダメージを受けるおそれがない。なお、剥離停止液の液量の設定値は、細胞剥離液の作用を停止させるのに十分な量で且つチャンバ１０から溢れない程度に設定されている。続いて制御部５０は、モータ２０を予め定められた所定の高回転速度、回転時間だけ回転させる（ステップＳ１２２）。このとき、回転速度は１０００〜２０００ｒｐｍに設定され、回転時間は１〜１０分に設定されている。また、モータ回転方向は順回転のみの一方向である。この高速回転操作によってチャンバ１０に貯溜された細胞剥離液と剥離停止液の混合液に勢いのある水流が発生し、また、この水流はチャンバ１０の底面に設けられたフィン１４により効果的に発生する。そして、混合液中のマイクロディスク５と細胞はこの水流によって中心から外向きの遠心力を受けて仕切り壁１６の方向へと移動する。ここで、細胞は細胞培養部１８から仕切り壁１６を通過して細胞集積部１７に細胞ペレットとして集積するが、マイクロディスク５は仕切り壁１６を通過できないため細胞培養部１８に残る。このため、細胞集積部１７に集積した細胞がマイクロディスク５によってダメージを受けることがない。また、細胞集積部１７は、遠心力の方向に沿って尖った形状に形成されているため遠心力を受けた細胞が集積し細胞ペレットになりやすい。続いて制御部５０は、第３排出ポンプ４０ｃを駆動させることにより第３排出管４２ｃを通じてチャンバ１０に貯溜している溶液（細胞剥離液と剥離停止液との混合液）を第３回収槽４４ｃへ排出する（ステップＳ１２４）。この際、細胞は細胞集積部１７に細胞ペレットとして集積しており、さらに、第３排出管４２ｃの吸引口には前出の規制キャップが取り付けられているので、第３排出管４２ｃを介して排出されるものは、混合液のみとなる。以上のステップＳ１１６〜Ｓ１２４が剥離工程に相当する。

次に、制御部５０は、第３供給ポンプ３０ｃを駆動させて第３供給管３２ｃを通じてチャンバ１０へ液体培地を投入し、第３供給ポンプ３０ｃの吐出量と吐出時間に基づいて培地の投入量を演算しつつその投入量が予め入力された設定値に達したとき、第３供給ポンプ３０ｃの駆動を停止させる（ステップＳ１２６）。なお、液体培地の液量の設定値は、洗浄液と同程度に決められている。続いて制御部５０は、モータ２０を予め定められた所定の回転速度、回転時間だけ回転させる（ステップＳ１２８）。これにより、チャンバ１０が回転し、チャンバ１０に貯溜されている液体培地に水流が発生し、細胞集積部１７に集積していた細胞ペレットを構成する細胞が分散し液体培地に懸濁したあと仕切り壁１６を通過して細胞培養部１８内に拡散する。このとき、細胞集積部１７に集積した細胞を液体培地内に懸濁させることを目的としているので、剥離工程における高速回転操作のときよりも低速で回転させることが好ましく、このため回転速度は５０〜２００ｒｐｍに設定され、また、順逆回転を交互に行うのが好ましい。以上のステップＳ１２６及びＳ１２８が懸濁工程に相当する。

続いて、制御部５０は、第４排出ポンプ４０ｄを駆動させることによってチャンバ１０内の細胞懸濁液の一部を第４排出管４２ｄを通じて第４回収槽４４ｄにサンプリングする（ステップＳ１３０）。オペレータは、サンプリングされた細胞懸濁液を用いて常法により細胞核を液中に放出させ、この核数を血球計算板と顕微鏡を用いてカウントして細胞濃度を算出する。そして、オペレータは、予め定めた所定の細胞濃度に達していないときには、入力操作部５６を操作して継代培養を選択入力すると共に今回の細胞濃度を入力し、所定の細胞濃度に達したときには、入力操作部５６を操作して培養終了を入力する。

続いて、制御部５０は、入力操作部５６から継代培養が入力されたか培養終了が入力されたかを判定する（ステップＳ１３２）。そして、継代培養が選択入力されたときには、同時に入力された今回の細胞濃度に基づいて次回継代培養を行う際に必要なマイクロディスクの総量を算出し、その総量から既に投入済みのマイクロディスクの量を差し引いて追加すべきマイクロディスクの量を求め、その量に基づいてマイクロディスク浮遊液の投入量を算出したあと、第２供給ポンプ３０ａを駆動させることによって第２供給槽３４ｂからチャンバ１０の細胞培養部１８内にマイクロディスク浮遊液を先に求めた投入量だけ投入する（ステップＳ１３４）。これにより、チャンバ１０内の細胞懸濁液の濃度に見合ったマイクロディスクがチャンバ１０の細胞培養部１８内に存在することになり、継代培養の準備が整ったことになるので、ステップＳ１０４以降の処理を実行して再び接着工程、増殖工程、洗浄工程、剥離工程、懸濁工程を繰り返す。一方、ステップＳ１３２で培養終了が選択されたときつまり細胞濃度が所定の細胞濃度に達したときには、第４排出ポンプ４０ｄを駆動させることによってチャンバ１０内の細胞懸濁液をすべて第４排出管４２ｄを通じて第４回収槽４４ｄに回収する（ステップＳ１３６）。このとき、第４排出管４２ｄの吸引口には前出の規制キャップが取り付けられているので、マイクロディスク５が吸引されることなく、細胞懸濁液のみが選択的に吸引され回収される。このステップＳ１３６が回収工程に相当する。細胞懸濁液の回収の終点は、例えば第４排出ポンプ４０ｄの吐出量と吐出時間に基づいて予め設定された液量が排出された時点としてもよいし、第４排出ポンプ４０ｄが気体を吸引し始めたことを検知した時点としてもよい。第４回収槽４４ｄに回収された細胞懸濁液は、細胞濃度を調整したあと又は調整せずそのままの状態で流通することが可能である。以上のステップをもって本プログラムは終了する。

そして、細胞培養処理のプログラムが終了した後、第４供給ポンプ３０ｄを駆動させて第４供給槽３４ｄから第４供給管３２ｄを介して洗浄液をチャンバ１０内に供給したあと、モータ２０を回転駆動して洗浄液を撹拌することにより細胞培養部１８内のマイクロディスク５を洗浄液に浮遊させ、その後第５排出ポンプ４０ｅを駆動させてチャンバ１０内のマイクロディスク浮遊液を第５排出管４２ｅを介して第５回収槽４４ｅへ排出し回収する。ここで、第５排出管４２ｅの吸引口には、規制キャップが取り付けられていないため、マイクロディスク５を吸引することができる。このようにマイクロディスク５を回収することで、チャンバ１０内を一掃することができ、次回新たな継代培養を行うことが可能となる。あるいは、このようにマイクロディスク５を回収しなくても、チャンバ１０をモータ２０の回転軸２２に取り付けた受け台２４から取り外し可能とすることにより、チャンバ１０ごとマイクロディスク５を回収することができる。このとき、チャンバ１０やマイクロディスク５を洗浄・滅菌することによって再使用してもよいし、洗浄・滅菌することなくディスポーザブル（使い捨て）とし毎回新品を使用するようにしてもよい。

ここで、本実施形態の構成要素と本発明の構成要素との対応関係を明らかにする。本実施形態のモータ２０が渦流発生手段に相当し、第１〜第６供給ポンプ３０ａ〜３０ｄが流動体供給手段に相当し、そのうち第２供給ポンプ３０ｂがマイクロキャリア供給手段に相当し、第１〜第５排出ポンプ４０ａ〜４０ｅが流動体排出手段に相当し、そのうち第４排出ポンプ４０ｄが細胞排出手段に相当する。

以上詳述した本実施形態の細胞培養装置１によれば、同じチャンバ１０内で接着工程、増殖工程、剥離工程、懸濁工程を実施することにより増殖した細胞数に応じてそのチャンバ１０内へマイクロディスク５を追加し、再びそのチャンバ１０内で接着工程、増殖工程、剥離工程、懸濁工程を繰り返し実施するので、一つのチャンバ１０内で継代培養を行うことができる。つまり、コンパクトな構成で接着依存性細胞の継代培養を行うことができ、細胞を大量に増殖させることができる。

また、マイクロディスク５の追加投入という簡易な操作によって接着依存性細胞の足場面積を増加させることができ、且つマイクロディスク５による浮遊培養によって細胞増殖を行うので、小スペースであっても、大量の細胞を増殖させることができる。

更に、直径が１〜３ｍｍのマイクロディスク５を用いたため、効率よく細胞増殖を行うことができるとともに、マイクロディスクと細胞の分離が容易である。すなわち、マイクロディスクは細胞接着面が比較的平坦であるので、細胞の接着が容易であるとともに、効率よく増殖させることができる。また、マイクロディスクの大きさが細胞の大きさに対して十分に大きいので、仕切り壁１６や規制キャップによる細胞とマイクロキャリアとの選別が容易に行える。

更にまた、剥離工程では、マイクロディスク５から剥離した細胞は遠心力により細胞培養部１８から仕切り壁１６の外側領域である細胞集積部１７へ移動するが、マイクロディスク５は細胞培養部１８に残ったままとなるため、剥離後の細胞がマイクロディスク５によってダメージを受けることがない。

そしてまた、細胞培養装置１では、継代培養操作を収容容器３の密閉空間内で自動的に行うことができるので、人間の介在が極力少なくなり、コンタミネーションを有効に防止することができる。特に、収容容器３については、密閉状態として開閉弁４６を閉じ開閉弁３６を開いて滅菌ガス供給管３８から滅菌ガスを充填したあと開閉弁３６を閉じ、その後開閉弁４６を開いて滅菌ガス排出管４８から滅菌ガスを排出することにより滅菌処理が可能なため、この点でコンタミネーションを抑制することができる。

なお、本発明は上述した実施形態に何ら限定されることはなく、本発明の技術的範囲に属する限り種々の態様で実施し得ることはいうまでもない。

例えば、上述した実施形態では、チャンバ１０内にフィルタとして仕切り壁１６を設けたが、仕切り壁１６の代わりに、図３に示すようにカゴ部材６０をチャンバ１０内に設け、接着依存性細胞は通過するがマイクロディスク５は通過しないフィルタをこのカゴ部材６０の周面に形成してもよい。あるいは、カゴ部材６０の周面ばかりでなく底面にもフィルタを形成してもよい。この場合も、マイクロディスク５から剥離した細胞は遠心力によりカゴ部材６０の内側からフィルタである周面を通って外側領域である細胞集積部１７へ移動するが、マイクロディスク５は細胞培養部１８に残ったままとなるため、剥離後の細胞がマイクロディスク５によってダメージを受けることがない。さらに、カゴ部材６０の底面を貫通するように排出管を設けておけば、排出管の吸引孔に規制キャップを設ける必要がなくなる。あるいは、仕切り壁１６やカゴ部材６０の代わりに、図４に示すようにチャンバ１０の外端部に尖頭形状の細胞集積部７７を形成し、この細胞集積部７７の入口７７ａの大きさをマイクロディスク５は入り込めないが細胞は入り込める大きさにしてもよい。この場合も、マイクロディスク５から剥離した細胞は遠心力により細胞集積部７７へ入り込むが、マイクロディスク５は細胞集積部７７に入り込めないため、剥離後の細胞がマイクロディスク５によってダメージを受けることがない。

また、上述した実施形態では、モータ２０の回転に伴ってチャンバ１０を回転させることによりチャンバ１０内の流動体に渦流を発生させたが、図５に示すようにモータ２０の回転軸２２をチャンバ１０の底面に液密状態を保って貫通させ、この回転軸２２の上端に撹拌羽根２６を設けてもよい。この場合には、チャンバ１０を回転させることなくチャンバ１０内の流動体に渦流を発生させることができる。

また、上述した実施形態では、マイクロキャリアとしてポリスチレン製のマイクロディスク５を採用したが、材質はポリスチレン以外に接着依存性細胞が接着可能なもの、例えばゼラチン、コラーゲン、ガラス、セルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド又はＤＥＡＥであってもよく、また、マイクロディスクのような平面形状物の代わりに三次元形状物（球体など）であってもよい。更に、マイクロキャリアの表面に温度に応じて細胞接着性能が変化する温度感応性ポリマーをコーティングしてもよく、この場合には細胞剥離液を用いることなく温度調節によりマイクロキャリアから細胞を剥離することができる。このような温度感応性ポリマーとしては、例えばＮ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミドなどが挙げられる。

また、上述した実施形態において、各管３２ａ〜３２ｆ，４２ａ〜４２ｅのうちポンプ３０ａ〜３０ｆ，４０ａ〜４０ｅとチャンバ１０との間に小型電磁弁であるピンチバルブを取り付けておき、ポンプを駆動又は駆動停止するときにはそのポンプに連動してピンチバルブを開放又は閉鎖してもよい。

また、上述した実施形態では、制御部５０により細胞培養処理プログラムを自動制御したが、制御部５０を設けずにオペレータが手動で同様の細胞培養処理を実施してもよい。

更に、上述した実施形態では、増殖工程において培地交換を行わなかったが、必要に応じて（例えば、培養液中のｐＨの低下に応じて、あるいは予め定めた時間が経過するたびに）、培地交換を行うようにしてもよい。培地交換を行う場合には、モータ２０を停止させたあと第１排出ポンプ４０ａを駆動させて第１排出管４２ａを介してチャンバ１０内の古い液体培地を第１回収槽４４ａへ回収し、その後第３供給ポンプ３０ｃを駆動させて第３供給管３２ｃを介してチャンバ１０内に第３供給槽３４ｃから新しい液体培地を投入すればよい。

更にまた、上述した実施形態では、第１〜第４排出管４２ａ〜４２ｄの吸引口にはマイクロディスク５は通過しないが細胞は通過する規制キャップを取り付けたが、これに代えて、第１〜第４排出管４２ａ〜４２ｄの吸引口の径をマイクロディスク５は通過しないが細胞は通過する大きさに設計してもよい。

そしてまた、上述の実施形態では、第１〜第６供給管３２ａ〜３２ｆをチャンバ１０にアクセスするようにしたが、チャンバ１０にアクセスする供給管を１本（又は数本）とし、その供給管への接続を切替可能な接続切替部を介して第１〜第６供給槽３４ａ〜３４ｆに接続してもよい。排出管についても、これと同様にして本数を減らしてもよい。

そして更に、上述した実施形態では、接着依存性細胞としてヒト表皮細胞を例に挙げて説明したが、他の接着依存性細胞についてもこれと同様に適用することができる。

本発明は、接着依存性細胞を大量培養する際に利用可能である。

本実施形態の細胞培養装置の概略構成を表す説明図である。 細胞培養処理プログラムのフローチャートである。 チャンバの変形例の説明図である。 チャンバの変形例の説明図である。 チャンバの変形例の説明図である。

符号の説明

１…細胞培養装置、３…収容容器、５…マイクロディスク、１０…チャンバ、１２…開口、１４…フィン、１６…仕切り壁、１７…細胞集積部、１８…細胞培養部、２０…モータ、２２…回転軸、２４…受け台、２６…撹拌羽根、３０…供給ポンプ群、３０ａ〜３０ｆ…第１〜第６供給ポンプ、３２ａ〜３２ｆ…第１〜第６供給管、３４ａ〜３４ｆ…第１〜第６供給槽、３６…開閉弁、３８…滅菌ガス供給管、４０…排出ポンプ群、４０ａ〜４０ｅ…第１〜第５排出ポンプ、４２ａ〜４２ｅ…第１〜第５排出管、４４ａ〜４４ｅ…第１〜第５回収槽、４６…開閉弁、４８…滅菌ガス排出管、５０…制御部、５２…メモリ、５４…内蔵タイマ、５６…入力操作部、６０…カゴ部材、７７…細胞集積部。

Claims (11)

1. 接着依存性細胞を培養する細胞培養方法であって、
   チャンバ内に存在するマイクロキャリアに接着依存性細胞を接着させる接着工程と、
   前記接着依存性細胞を前記マイクロキャリアに接着させた状態で前記チャンバ内の液体培地中で培養し増殖させる増殖工程と、
   該増殖工程で増殖した前記接着依存性細胞を前記チャンバ内で前記マイクロキャリアから剥離させる剥離工程と、
   該剥離工程のあと前記チャンバ内に前記接着依存性細胞及び前記マイクロキャリアを残して該チャンバ内の液状物の少なくとも一部を排出し該チャンバ内に新たな液体培地を入れて前記接着依存性細胞を懸濁させる懸濁工程と、
   前記マイクロキャリアが前記増殖工程時に前記チャンバ内に存在していた量より多くなるように該チャンバ内へ前記マイクロキャリアを追加する担体追加工程と、
   を繰り返し実行する、細胞培養方法。
2. 前記接着工程では、前記接着依存性細胞は通過するがマイクロキャリアは通過しないフィルタによってフィルタ内部とフィルタ外部とに仕切られたチャンバを用意し該フィルタ内部に投入したマイクロキャリアに接着依存性細胞を接着させ、
   前記剥離工程では、前記マイクロキャリアから剥離した前記接着依存性細胞を遠心力により前記フィルタ内部から前記フィルタ外部へ通過させ、
   前記担体追加工程では、前記フィルタ内部へ前記マイクロキャリアを追加する、
   請求項１記載の細胞培養方法。
3. 前記接着工程では、前記接着依存性細胞は入り込めるがマイクロキャリアは入り込めない大きさの細胞集積部を外周に備えたチャンバを用意し該チャンバに投入したマイクロキャリアに接着依存性細胞を接着させ、
   前記剥離工程では、前記接着依存性細胞を前記マイクロキャリアから剥離させ遠心力により前記細胞集積部に集積させる、
   請求項１記載の細胞培養方法。
4. 請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養方法であって、
   前記接着依存性細胞が所定の細胞数に到達したときには該接着依存性細胞を回収する回収工程、を含む細胞培養方法。
5. 前記マイクロキャリアは、直径が０．５〜５ｍｍのマイクロディスクである、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養方法。
6. 接着依存性細胞の培養に利用されるチャンバであって、
   前記接着依存性細胞は通過するがマイクロキャリアは通過しないフィルタと、
   前記フィルタが内部空間を仕切ることにより略中央に形成されたフィルタ内部と、
   前記フィルタが前記内部空間を仕切ることにより前記フィルタ内部の外側に形成されたフィルタ外部と、
   を備えたチャンバ。
7. 前記フィルタは、カゴ部材の少なくとも外周面に形成されているか又は仕切り壁として形成されている、請求項６記載のチャンバ。
8. 接着依存性細胞の培養に利用されるチャンバであって、
   外端に設けられ前記接着依存性細胞は入り込めるがマイクロキャリアは入り込めない大きさの細胞集積部、を備えたチャンバ。
9. ２本の遠心沈降管の開口を接着した形状を呈する、請求項６〜８のいずれか記載のチャンバ。
10. 請求項６〜９のいずれか記載のチャンバと、
    前記チャンバ内の流動体に渦流を発生させる渦流発生手段と、
    前記チャンバ内へ流動体を供給可能な流動体供給手段と、
    前記流動体供給手段の一つであって前記チャンバ内へ前記マイクロキャリアを供給可能なマイクロキャリア供給手段と、
    前記チャンバ内から流動体を排出可能な流動体排出手段と、
    を備えた細胞培養装置。
11. 請求項１０記載の細胞培養装置であって、
    前記流動体排出手段の一つであって前記接着依存性細胞及び前記マイクロキャリアが存在する前記チャンバ内から前記接着依存性細胞を選択的に排出する細胞排出手段、を備えた細胞培養装置。

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