CN117043313A - 使用旋转过滤器更换培养物的培养基的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在悬浮培养更换培养基中扩增培养为细胞聚集体的干细胞的方法，以及用于相同细胞的培养基更换方法，其特征在于使用旋转筛网，例如旋转过滤装置。本发明还涉及旋转筛网在干细胞悬浮培养中的培养基交换中的用途。

Description

使用旋转过滤器更换培养物的培养基的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年1月21日提交的欧洲专利申请第21152729.6号的优先权，其内容通过引用整体结合于此，以用于所有目的。

技术领域

本发明涉及一种在更换培养基的悬浮培养物中扩增作为细胞聚集体培养的干细胞的方法以及一种培养基更换的方法，其特征在于，使用旋转筛网，例如旋转过滤装置。本发明还涉及旋转筛网在干细胞悬浮培养物的培养基更换中的用途。

发明背景

在基础研究中，随着对大量细胞的需求较低，PSC、iPSC和iPSC衍生的细胞通常作为贴壁细胞培养物生长。这里，细胞附着在培养皿的表面上，并以菌落或单层形式生长。然而，iPSC的贴壁细胞培养物不适合产生临床应用所需的大量细胞。这是因为它是材料和劳动密集型的。此外，细胞生产的结果和质量高度依赖于操作者，因为该过程通常不是自动化的，并且仅被不良监测和控制。

据报道，使用生物反应器系统能够产生大量的PSC、iPSC和iPSC衍生的细胞(Kropp等人，2017)。在这些系统中，iPSC和iPSC衍生的细胞通常不附着于培养皿的表面，而是在自由漂浮的悬浮液中生长，这是因为在悬浮液中培养时PSC形成聚集体。在生物反应器系统中的悬浮培养被描述为比贴壁培养更有效，这是因为即使在高细胞数量和需要较少材料和工作量的情况下，培养也能够被监控、控制和自动化。重要的是，由于这些原因，对于GMP控制的应用，生物反应器系统的使用将优于静态培养。已经报道了不同的生物反应器系统用于PSC的悬浮培养，其中搅拌釜反应器(STR)系统是描述得最好的系统。已表明在STR系统中可成功地产生大量的iPSC和iPSC-CM(Chen等人，2012；Halloin等人，2019；Hemmi等人，2014；Jiang等人，2019；Kempf等人，2015；Kropp等人，2016)。

尽管生物反应器系统对于大规模PSC、iPSC和iPSC-CM生产具有优势，悬浮培养产生了几个新的挑战。例如，在悬浮培养中更换培养基比在贴壁细胞培养中更复杂。这是因为在除去消耗的培养基期间，PSC必须保留在培养物中以防止细胞损失。重复的分批补料策略通常在STR中描述用于培养基的更换(Kropp等人，2017)。此时，停止搅拌，细胞聚集体沉降到容器底部。随后，丢弃培养基而不干扰沉降的聚集体。加入新鲜培养基并继续搅拌。这种策略可能造成沉降的聚集体的融合，从而引起iPSC的自发分化。聚集体融合的程度取决于无搅拌的持续时间。尤其在较大的系统中，重复的分批进料策略将可能导致大量的融合聚集体，因为沉降时间随着容器的高度而增加，并且更换较大体积的培养基也可能花费更多的时间。此外，一次性更换大量培养基会引起培养参数如pH、氧浓度和代谢物浓度、营养物和信号因子的突然变化。这可能造成PSC引起额外的应激，导致增殖减少。

因此，仍然需要一种更换培养基或扩增包含干细胞的悬浮培养物的细胞的方法，特别是其中整个过程可以在不从系统中除去细胞或聚集体并且不将细胞暴露于与沉降和/或离心相关的应激中延长的时间段的情况下进行。本发明旨在解决这种需要。

发明内容

该问题通过权利要求中限定的主题来解决。本文提供了一种扩增干细胞的方法，其中所述干细胞包含在悬浮培养物中的细胞聚集体中；一种更换悬浮培养物的培养基的方法，所述悬浮培养物包含悬浮在培养基中的干细胞的细胞聚集体，以及本文所定义的旋转筛网用于悬浮培养物中培养基交换的用途，所述悬浮培养物包含悬浮在培养基中的细胞聚集体。

因此，本发明涉及一种扩增干细胞的方法，其中所述干细胞包含在悬浮培养物中的细胞聚集体中，所述方法包括：

(i)在允许所述干细胞增殖的条件下培养所述干细胞；以及

(ii)通过旋转筛网灌注进行培养基交换。

本发明还涉及一种更换悬浮培养物的培养基的方法，所述悬浮培养物包含悬浮在所述培养基中的多能干细胞的细胞聚集体，所述方法包括：

(i)通过旋转筛网灌注进行培养基交换；以及

(ii)任选地用新鲜培养基更换通过所述旋转筛网移出的培养基。

本发明还涉及如本文所定义的旋转筛网用于悬浮培养物中培养基交换的用途，所述悬浮培养物包含悬浮在所述培养基中的细胞聚集体，其中所述细胞是干细胞。

所述细胞可以在生物反应器中培养，其中所述生物反应器优选是搅拌生物反应器、摇摆运动生物反应器和/或多平行生物反应器。

所述培养基交换可以在生物反应器内部进行。

所述旋转筛网可以是旋转过滤器，任选地其中所述旋转过滤器附接到生物反应器的搅拌器或搅拌棒。

所述培养基交换可以在生物反应器外部进行，优选地其中容纳所述旋转筛网的装置与所述生物反应器流体连接以形成封闭系统。

所述旋转筛网可以具有约1μm至约50μm、约5μm至约50μm、约10μm至约50μm、约5μm至约40μm、约5μm至约30μm、约5μm至约20μm、或约5μm至约15μm，优选约10μm的孔径。

所述细胞聚集体的平均直径可以为约50至约300μm、约80至约250μm、约100至约220μm或约100至约200μm。

所述干细胞可以是多能干细胞、脐带血干细胞、间充质干细胞和/或造血干细胞；和/或源自干细胞的细胞。所述多能干细胞优选是诱导的多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)、孤雌生殖干细胞(pPSC)或核移植衍生的PSC(ntPSC)，最优选iPSC。所述干细胞优选选自TC-1133、Gibco ATCC ACS-1004的人Episomal iPSC系、ATCC ACS-1021、ATCC ACS-1025、ATCC ACS-1027、ATCC ACS-1030。

附图简要说明

当结合非限制性实施例和附图考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明，其中：

图1显示iPSC悬浮培养物和丢弃的培养基的光学显微镜图像，其中所述丢弃的培养基使用旋转筛网(此处示例性地为旋转过滤器)作为细胞保留装置吸出。图1A显示了第0代悬浮培养物的样品，而图1B显示了同代废弃培养基的样品。图1C显示了第1代聚集体悬浮培养物的样品，其中聚集体呈现可变尺寸，而图1D显示了同代废弃培养基的样品，其证明了有效的过滤能力。标尺：400微米。

图2显示在培养不同天数时，以旋转筛网灌注的两种不同UniVessel尺寸(0.5L和2L)的PSC细胞聚集体的聚集体尺寸。

图3显示在以旋转筛网灌注的UniVessel 2L(容器2)中培养的0代第4天的iPSC中多能性相关基因的表达。

图4显示在以旋转筛网灌注的UniVessel 0.5L(容器3)中培养的0代第4天的iPSC中多能性相关基因的表达。

发明详述

本发明将在下面详细描述，并且还将通过所附的实施例和附图进一步举例说明。

生物反应器中悬浮培养物，特别是干细胞聚集体的悬浮培养物的自动化培养基交换仍然是一个挑战。手动培养基更换通常涉及将悬浮培养物的至少一部分移出生物反应器，并且包括例如细胞的离心。这种机械刺激可对细胞活力或功能(例如干细胞的不期望分化)具有负面影响(Lipsitz等人，2018)。生物反应器中悬浮培养物的自动化培养基交换(“容器沉降”)的另一种可能性是停止搅拌并允许细胞沉降在生物反应器的底部。然后可以吸出上清液并用新鲜培养基替换。然而，这也导致细胞的机械刺激，这可以导致不规则的生长和多能性的丧失。这个问题通过本发明的方法来克服：

使用旋转筛网，例如旋转过滤器细胞保留装置，允许在对细胞培养物干扰最小的情况下进行灌注培养基交换，这对于GMP引导的过程是特别期望的。令人惊讶的是，可以在不干扰干细胞的情况下，以任何方式直接在培养容器中将用过的培养基与干细胞聚集体分离。相反，应用其它细胞保留装置通常需要将细胞悬浮液转移出培养容器。从培养容器中取出可能导致干细胞质量下降，这是由于剪切应力增加、聚集体融合和细胞环境的短期改变。此外，需要操作外部设备并且这是该过程期间的额外误差源。已描述了将微型喷雾器用作细胞保留装置，并已提出了如上所述的类似优点。然而，微型喷雾器不是设计成作为细胞保留装置来应用，并且可能容易堵塞，从而导致悬浮培养失败。这是因为微型喷雾器的表面较小，并且过滤器直接位于抽吸管的前面。此外，一旦将悬浮培养物中的聚集体抽吸到静态微型喷雾器上，它们就可以主动地附着到其上。另一方面，由于其高的表面积，旋转过滤器堵塞的风险很小。旋转过滤装置的旋转运动进一步降低了堵塞的风险。

如实施例1和2所示，应用旋转筛网作为细胞保留装置允许多能干细胞的细胞聚集体保持完美的形状，同时可以容易地除去碎片和死细胞。由于如上所述干细胞对剪切应力的敏感性，令人惊讶的是干细胞聚集体也可以在使用旋转筛网进行培养基交换的灌注悬浮培养中培养而不损害干细胞。

因此，本发明涉及一种扩增干细胞的方法，其中所述干细胞包含在悬浮培养物中的细胞聚集体中，所述方法包括：

(i)在允许所述干细胞增殖的条件下培养所述干细胞；以及

(ii)通过旋转筛网灌注进行培养基交换。

本发明还涉及一种更换悬浮培养物的培养基的方法，所述悬浮培养物包含悬浮在所述培养基中的干细胞的细胞聚集体，所述方法包括：

(i)通过旋转筛网灌注进行培养基交换；以及

(ii)任选地用新鲜培养基替换通过所述旋转筛网移出的培养基。

灌注的特征在于用新鲜培养基连续替换来自反应器的培养基，同时通过特定系统将细胞保留在容器中。灌注是用于能够实现最高的细胞密度和生产率的生物制药生产过程的操作模式。除了灌注中的细胞不断被提供新鲜营养物和生长因子的优点之外，潜在的有毒废物被洗出，从而确保反应器中的条件更均匀。此外，与重复的分批过程相比，灌注过程支持过程自动化和培养环境的改进的反馈控制，包括DO(溶解氧)、pH和营养物浓度。灌注培养可以实现相对稳定的生理环境，其还通过其内源因子分泌支持PSC的自我调节能力，并因此最终减少昂贵培养基组分的补充。总之，灌注培养导致更高的产量和细胞质量。

如本文所用的“旋转筛网”涉及细胞保持装置。旋转筛网的特征在于存在开口，所述开口允许包括碎片(例如死细胞)的用过的培养基流出悬浮培养物，但将细胞聚集体保持在培养容器中。这也是灌注培养的原理。因此，“用过的”培养基可以流出生物反应器。该流出可以通过流入培养基来补偿，优选以基本上等于流出的速率，从而在延长的时间段内保持悬浮培养物的最佳生长条件。旋转筛网通常为圆柱体的形式，其中通常侧面但有时顶部和/或底部也包含开口。旋转筛网可以附接到生物反应器的搅拌器或搅拌棒上。本文描述的旋转筛网的一个示例是旋转过滤器。旋转筛网可由任何合适的材料，例如塑料或金属制成。优选地，旋转筛网由不锈钢制成。旋转筛网优选是耐高压加热的，但也可以提供为(预消毒的)一次性使用的旋转筛网形式。

旋转筛网将培养容器分成两个隔室，即包含悬浮在培养基中的细胞聚集体的“内部”隔室和“外部”隔室。就生物反应器而言，其中旋转筛网置于搅拌器上，“外部”是旋转筛网的内侧隔室，从该内侧隔室中除去用过的培养基，而“内部”隔室是指培养容器的在旋转筛网外侧的部分。内部隔室有利地设计成允许用过的培养基流出。示例性的旋转筛网包括旋转过滤器。旋转过滤器是本领域技术人员已知的，例如描述于WO92/05242中。旋转筛网可以安装在生物反应器的叶轮上。在这种情况下，旋转筛网具有与生物反应器的叶轮相同的旋转速度。本领域技术人员能够确定适合干细胞生长和培养基灌注通过旋转筛网的合适旋转速度。典型的叶轮转速包括85至140rpm。

优选地，选择旋转筛网的孔径以允许保留细胞聚集体，同时所使用的包括(细胞)碎片的培养基可以穿过或“灌注”旋转筛网。最佳孔径大小可随培养的细胞类型而变化。在一些实例中，旋转筛网可以具有约1μm至约50μm、约5μm至约50μm、约10μm至约50μm、约5μm至约40μm、约5μm至约30μm、约5μm至约20μm、或约5μm至约15μm，优选约10μm的孔径。在这种情况下，值得注意的是，当开始干细胞的悬浮培养时(例如，在生物反应器中)，细胞可以作为单细胞或仅小细胞聚集体存在，所述不会被旋转筛网保留。在初始生长阶段期间，当对营养物的需求也仍然低时，可能可取的是不要使任何液体流过旋转筛网并流出培养装置如生物反应器，以避免在细胞聚集体达到通过旋转筛网保持在悬浮培养物中的尺寸之前干细胞的损失。

本文所用的术语“悬浮培养物”是一种细胞培养物，其中单细胞或细胞的小聚集体允许在优选搅拌的生长培养基中起作用和增殖，从而形成悬浮液(参见化学中的定义：“悬浮在液体中的小固体颗粒”)。这与贴壁培养相反，贴壁培养中细胞附着于细胞培养容器，细胞培养容器可以包被有细胞外基质(ECM)的蛋白质。在悬浮培养物中，在一个实施方案中，细胞和/或培养基中不加入ECM的蛋白质。悬浮培养物优选基本上不含固体颗粒，例如珠、微球、微载体颗粒等；在本文中，细胞或细胞聚集体不是固体颗粒。在一个实施方案中，细胞不在微载体(悬浮)培养中。

本文所用的“扩增”或“细胞扩增”以及“细胞增殖”涉及由于细胞生长和细胞分裂而导致的细胞数量的增加。

在本发明的方法中，可以是扩增干细胞的方法或更换悬浮培养物的培养基的方法，所述细胞可以在生物反应器中培养，或者换句话说，培养容器可以是生物反应器，其中所述生物反应器优选是搅拌生物反应器、摇摆运动生物反应器和/或多平行生物反应器。如本文所用，术语“反应器”和“生物反应器”，可以互换使用，指构造为细胞培养提供动态流体环境的封闭培养容器，生物反应器可以是搅拌的和/或搅动的，搅拌式反应器包括但不限于搅拌罐生物反应器、波浪混合/摇摆生物反应器、上下搅拌生物反应器(即，包括活塞作用的搅拌反应器)、转瓶、摇瓶、振荡生物反应器、桨式混合器，垂直轮生物反应器。搅拌反应器可以被配置成容纳约2mL-20，000L的细胞培养物体积。优选的生物反应器可以具有高达50L的体积。适合于本发明方法的示例性生物反应器是可从Sartorius Stedim Biotech获得的UniVessel生物反应器。生物反应器可以是不锈钢或一次性生物反应器。生物反应器可以由单个容器组成或者可以包括几个平行的生物反应器。一次性使用的生物反应器可以由玻璃或塑料制造。一次性使用的生物反应器可以是搅拌罐生物反应器或摇摆运动生物反应器。例如：Sartorius STR，RM，UniVessel。培养基的pH可以通过生物反应器控制，优选通过CO₂供应控制，并且可以保持在6.6至7.6的范围内，优选地为约7.4。

生物反应器可以是搅拌生物反应器(STR)。STR例如可从Sartorius StedimBiotech获得，包括但不限于A/B/B-DCU/Cplus/D-DCU。生物反应器可以是摇摆运动生物反应器(RM)。RM例如可从Sartorius Stedim Biotech获得，并且包括但不限于RM和/>RM TX。生物反应器可以是多个平行生物反应器。

在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约20,000L。在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约2,000L。在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约200L。在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约100L。在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约50L。在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约20L。在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约10L。在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约1L。在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约100mL至约10L。在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养容器的体积为约100mL至约5L。在一些实施方案中，在生物反应器中的体积为约150mL至约1L。在一些实施方案中，生物反应器中培养容器的体积为约1L至约1,000L。

本发明的一个优点是细胞可以在封闭系统中生长，即不需要在培养基外对细胞进行人工相互作用或任何相互作用或操作。因此，培养基更换可以在培养容器内部或生物反应器内部进行。因此，细胞聚集体可以保持在培养容器/生物反应器中的悬浮培养物中，同时进行连续的培养基交换，同时可以最小化或避免与悬浮培养物的人工相互作用。

然而，培养基交换也可以在(生物反应器的)培养容器外部进行，同时仍然使用不需要人工相互作用的封闭系统。这里，旋转筛网置于生物反应器外部的装置外壳中。该生物反应器的一个出口连接至所述装置外壳的“内”段，以允许包含细胞聚集体的悬浮培养物的液体流进入装置外壳。此外，装置外壳的“内”段的一个出口连接至(生物反应器的)培养容器。使用的介质通过旋转筛网被灌注并经由单独的出口被丢弃。丢弃的培养基可以在装置外壳中或在生物反应器本身中用新鲜培养基替换。因此，培养基交换可以在生物反应器外部进行，优选地其中容纳旋转筛网的装置与生物反应器流体连接以形成封闭系统。

如本文所用的“生长培养基”、“培养基”或简单的“培养基”是设计用于支持微生物、细胞或小植物生长的液体。不同类型的培养基用于生长不同类型的细胞。本领域技术人员能够确定哪种培养基对于特定的细胞类型是最佳的。在培养基中培养在悬浮液(在生物反应器中)中培养的干细胞。允许干细胞扩增的培养基，即限定一些“允许干细胞增殖的条件”的培养基是本领域技术人员已知的，包括但不限于IPS-Brew、iPS-Brew XF、E8、StemFlex、mTeSR1、PluriSTEM、StemMACS、TeSRTM2、Corning NutriStem hPSC XF Medium、Essential 8Medium(ThermoFisher Scientific)、StemFit Basic02(Ajinomoto Co.Inc)，仅举几例。在一个说明性的实施例中，培养基是IPS-Brew，其可以GMP等级从MiltenyiBiotec，Germany获得。确定条件是否适于干细胞扩增的另一条件包括温度。因此，其中培养基的温度为约30至约50℃、约30至约43℃、约35至约40℃、约36至约38℃、约30至约37℃、约32至约36℃或约37℃，优选37℃。允许干细胞增殖的其它条件可包括培养基的pH、氧供应和/或搅拌速率。

本文公开的更换培养基的方法可用于用相同(类型)培养基替换所用培养基，或者也可用于进行培养基交换至不同培养基，例如用于诱导在诱导型启动子控制下的目的蛋白质的分化或表达。

如本文所述，悬浮培养物中的细胞优选不沉淀，但分布于培养基中。因此，优选搅拌悬浮培养物。连续搅拌可导致细胞在培养基/悬浮培养物中基本上均匀分布，并且可帮助干细胞，特别是PSC，例如iPSC，维持其多能性。因此，细胞优选基本上均匀地分布在培养基中。

本发明的方法通常可用于可在细胞培养中培养的任何细胞，即，也可用于贴壁细胞培养。有利地，该方法用于更换悬浮培养物的培养基，其中细胞从培养基的分离是重要的。在此上下文中，“悬浮在培养基中”是指在悬浮液中培养的细胞，不管它们实际上是否是悬浮细胞。因此，本发明的方法也可用于贴壁细胞，如果它们悬浮在培养基中的话。因此，细胞可以是悬浮液中培养的贴壁细胞。

悬浮培养的贴壁细胞，即不能附着于培养容器，可以形成细胞聚集体。这也适用于在本文所述的用途和方法中培养的干细胞。如本文所用，术语“聚集体”和“细胞聚集体”可互换使用，是指多个细胞，例如(诱导的)多能干细胞，其中细胞之间的缔合是由细胞-细胞相互作用(例如，通过彼此的生物附着)引起的。生物附着可以是例如通过表面蛋白，如整联蛋白、免疫球蛋白、钙粘着蛋白、选择蛋白或其它细胞粘附分子。例如，细胞可以在悬浮液中自发地缔合并且形成细胞-细胞附着(例如，自组装)，从而形成聚集体。在一些实施方案中，细胞聚集体可以是基本上均质的(即，主要含有相同类型的细胞)。在其它实施方案中，细胞聚集体可以是异质的(即，含有一种以上类型的细胞)。

本发明的方法适用于细胞聚集。细胞聚集体的尺寸可以变化。在干细胞的情况下，细胞形成细胞聚集体，其通常在接种后1天具有约50至约150μm，如约100μm的平均直径(也参见实施例2)。因此，初始平均直径优选为约50至约150μm，更优选为约100μm。四天后，细胞聚集体通常具有约200至约220μm的平均直径(也参见实施例2)。因此，细胞聚集体的最终平均直径优选为约200至约200μm。在该直径下，干细胞聚集体理想地解离，因为超过约300μm的直径可能由于营养物和气体扩散到组织/聚集体中心的限制而导致细胞坏死。最终，也可能发生不受控制的分化——特别是在大的干细胞聚集体中。因此，当具有约180至约250μm，优选约200至约220μm，理想地约200μm的平均直径时，细胞聚集体优选解离。因此，细胞聚集体的平均直径可以为约50至约300μm、约80至约250μm、约100至约220μm或约100至约200μm。优选地，细胞聚集体的平均直径为约50μm至约220μm，更优选约100μm至约200μm。细胞聚集体的平均直径可以为约50至800μm、约150至800μm、至少约600μm、至少约500μm、至少约400μm、至少约300μm、至少约200μm、至少约150μm、约300至500μm、约150至300μm、约50至150μm、约80至100μm、约180至250μm或约200至250μm。

细胞可以是任何可以悬浮培养的细胞，优选地，细胞是干细胞。在多细胞生物中，干细胞是未分化的或部分分化的细胞，其可以分化成各种类型的细胞并无限增殖以产生更多的相同干细胞。它们通常与不能无限分裂的祖细胞和通常定向分化为一种细胞类型的前体或原始细胞相区别。因此，术语干细胞包括多能干细胞(pluripotent stem cells)，也包括多能(multipotent)(可分化为多种细胞类型，但仅是那些密切相关的细胞家族)、寡能干细胞(可分化为仅少数细胞类型，如淋巴或骨髓干细胞)或单能干细胞，如卫星细胞。干细胞的实例包括但不限于多能干细胞、脐带血干细胞、间充质干细胞和/或造血干细胞，优选多能干细胞。特别优选的是诱导的多能干细胞(iPSC)。在本发明的上下文中，干细胞还可以涉及源自干细胞的细胞，特别是源自(i)PSC的细胞。“源自干细胞的细胞”涉及分化的细胞或分化成特定细胞类型的细胞，其不再能够在身体的任何细胞类型中分化。所述源自干细胞的细胞涉及源自在本发明的方法和用途中使用的(多能)干细胞的细胞，因此优选不包括天然存在的分化细胞。从干细胞例如PSC开始分化成不同细胞类型的方法是本领域技术人员已知的。“源自干细胞的细胞”可以涉及心脏细胞和/或组织、肝细胞和/或组织、肾细胞和/或组织、脑细胞和/或组织、胰腺细胞和/或组织、肺细胞和/或组织、骨骼肌细胞和/或组织、胃肠细胞和/或组织、神经元细胞和/或组织、皮肤细胞和/或组织、骨细胞和/或组织、骨髓、脂肪细胞和/或组织、结缔细胞和/或组织、视网膜细胞和/或组织、血管细胞和/或组织、基质细胞或心肌细胞。WO2015/025030和WO2015/040142中公开了产生心脏组织的方法。细胞也可以在生物反应器中或生物反应器外分化，例如分化成心肌细胞或基质细胞。这些分化的细胞也可利用本发明的方法在生物反应器中培养。从组织或器官获得的细胞可以从心脏细胞和/或组织、肝细胞和/或组织、肾细胞和/或组织、脑细胞和/或组织、胰腺细胞和/或组织、肺细胞和/或组织、骨骼肌细胞和/或组织、胃肠细胞和/或组织、神经元细胞和/或组织、皮肤细胞和/或组织、骨细胞和/或组织、骨髓、脂肪细胞和/或组织、结缔细胞和/或组织、视网膜细胞和/或组织、血管细胞和/或组织、基质细胞或心肌细胞获得。

所述细胞可以是哺乳动物的细胞，例如人、狗、小鼠、大鼠、猪、非人灵长类动物，例如恒河猴、狒狒、食蟹猴或普通狨猴，仅举几个说明性实例。优选地，所述细胞是人的。

本文所用的术语“多能干细胞”(PSC)是指能够分化成身体的每种细胞类型的细胞。因此，多能干细胞提供了分化成基本上任何组织或器官的独特机会。目前，最常用的多能细胞是胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)。多能干细胞的其它实例包括孤雌干细胞(pPSC)或核移植衍生的PSC(ntPSC)。人ESC系首先由Thomson及其同事建立(Thomson等人(1998)，Science 282:1145-1147)。最近，人ESC研究使得能够开发一种新技术，将机体细胞重新编程为ES样细胞。这项技术是由Yamanaka及其同事在2006年和2007年首创的(Takahashi&Yamanaka(2006),Cell,126:663-676和Takahashi等人(2007),Cell,131(5):861-72)。由此产生的诱导多能细胞(iPSC)显示出与ESC非常相似的行为，并且重要的是，也能够分化成身体的每个细胞。因此，在一个实施方案中，术语iPSC包括ESC。然而，在本发明的上下文中，优选不使用涉及修饰人类种系遗传身份或涉及将人类胚胎用于工业或商业目的方法来产生这些多能干细胞。优选地，多能干细胞来源于灵长类，更优选人类。

合适的诱导PSC可以例如获自NIH人胚胎干细胞登记库、诱导多能干细胞欧洲库(EBiSC)、德国心血管研究中心的干细胞储存库(DZHK)、人多能干细胞登记库(hPSCCreg)或ATCC，这里仅举几个来源。诱导的多能干细胞也可用于商业用途，例如，获自NINDS人类序列和细胞库(https：//Stemcells，Nindsgenetics.org)，该库由美国国家神经障碍和中风研究所(NINDS)操作，并将人类细胞资源广泛地分配给学术和工业研究人员。可用于本发明的合适细胞系的一个说明性实例是细胞系TC-1133，一种源自脐带血干细胞的诱导(未编辑)的多能干细胞。该细胞系例如可直接从美国NINDS获得。优选地，TC-1133符合GMP。可用于本发明的其它示例性iPSC细胞系包括但不限于，Gibco^TM(订单号A18945，Thermo FisherScientific)的人Episomal iPSC细胞系，或获自ATTC的iPSC细胞系ATCC ACS-1004、ATCCACS-1021、ATCC ACS-1025、ATCC ACS-1027或ATCC ACS-1030。或者，重编程领域的任何技术人员可通过已知方案容易地产生合适的iPSC系，例如Okita等人的“A more efficientmethod to generate integration-free human iPS cells”，Nature Methods，Vol.8No.5，May 2011，第409-411页或Lu等人的“A defined xeno-free and feeder-freeculture system for the derivation,expansion and direct differentiation oftransgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells”Biomaterials35(2014)2816e2826所述的方案。

干细胞可以选自TC-1133、Gibco的人Episomal iPSC系、ATCC ACS-1004、ATCCACS-1021、ATCC ACS-1025、ATCC ACS-1027、ATCC ACS-1030。

如本文所解释的，用于本发明的(诱导)多能干细胞可以获自任何合适的细胞类型(例如，获自干细胞如间充质干细胞，或上皮干细胞或分化细胞如成纤维细胞)和获自任何合适的来源(体液或组织)。这些来源(体液或组织)的实例包括脐带血、皮肤、牙龈、尿、血液、骨髓、脐带的任何部分(例如，脐带羊膜或脐带胶质)、脐带-胎盘连接处、胎盘或脂肪组织，仅举几个例子。在一个说明性实例中，从脐带血中分离CD34阳性细胞，例如通过使用特异性针对CD34的抗体的磁性细胞分选，然后，如Chou等人(2011),Cell Research,21:518-529中所述进行重编程。Baghbaderani等人(2015),Stem Cell Reports,5(4):647-659表明iPSC的生产工艺可以符合良好生产实践的规定，以生产细胞系ND50039。

因此，干细胞优选满足良好生产实践的要求。

本发明还涉及如本文所定义的旋转筛网用于悬浮培养物中的培养基交换的用途，所述悬浮培养物包含悬浮在培养基中的细胞聚集体，其中所述细胞是干细胞。

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应当指出，除非上下文另有明确说明，如本文所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代。因此，例如，提及“一种试剂”包括一种或多种这样的不同试剂，并且提及“该方法”包括提及本领域普通技术人员已知的等同步骤和方法，其可以被修改或替代本文所述的方法。

除非另有说明，在一系列元件之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每个元件。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。这些等同方案也包括在本发明中。

本文使用的术语“和/或”无论何处都包括“和”、“或”和“由所述术语连接的元件的全部或任何其它组合”的含义。

术语“小于”或“大于”不包括具体的数字。

例如，小于20意味着小于所指示的数目。类似地，大于或多于意味着大于或多于指示的数目，例如大于80％意味着大于或多于指示的80％的数目。

在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”及其变体如“包含”和“含有”应理解为暗示包括所述的整体或步骤或整体或步骤的组，但不排除任何其它整体或步骤或整体或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以用术语“含有”或“包括”代替，或者有时当在本文中使用时用术语“具有”代替。当在本文中使用时，“由……组成”排除未指定的任何要素、步骤或成分。

术语“包括”是指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。

如本文所用，术语“约”、“大约”或“基本上”是指在给定值或范围的20％内，优选在15％内，优选在10％内，更优选在5％内。还包括具体的数字，即“约20”包括20的数字。

应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案、材料、试剂和物质等，因此可以变化。本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是要限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。

本说明书全文中引用的所有出版物(包括所有专利、专利申请、科学出版物、说明书等)，无论在上文或下文中，均全文以引用方式并入本文。本文中没有任何内容被解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于这些公开。在通过引用并入的材料与本说明书矛盾或不一致的程度上，本说明书将取代任何这样的材料。

在此引用的所有文献和专利文献的内容通过引用整体并入。

实施例

从以下仅用于说明目的的实施例，将清楚地了解本发明及其优点。这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：使用旋转过滤器允许在不改变PSC聚集体形态的情况下自动更换培养基

1根据制造商的说明书，使用下列材料和设备(参见表1)：

1表1：实施例1中使用的材料。

仅细胞聚集体悬浮培养如下所述进行。以2.5×10⁺⁶2细胞/ml的浓度接种细胞，并在SteMACS iPS-Brew XF，基础培养基中培养。在第2天开始通过旋转过滤器灌注更换培养基。下表2显示了培养参数。

2表2：实施例1的培养参数

当在90-140rpm的搅拌速度和5-100％的泵速率(相当于约0.1-2.2mL/min)下使用时，旋转过滤器成功地保留了尺寸为～70-300μm的iPSC聚集体。在300-500mL的培养体积下成功地进行了60-100％培养基更换率/天的灌注培养基更换。用旋转过滤器除去的用过的培养基不含iPSC聚集体，仅含有单个细胞和碎片(图1B和D)，而培养物中的iPSC聚集体具有典型的形态(图1A和C)。

总之，本发明人可以令人惊讶地表明，旋转筛网的应用，这里示例性地为旋转过滤器，不损害iPSC聚集体并且允许连续灌注培养。

实施例2：使用旋转过滤器对PSC聚集体的质量没有影响

本发明人用0.5L和2L UniVessel重复实施例1中所示的实验，以进一步强调旋转过滤器用于PSC细胞聚集体悬浮培养物的培养基交换的适用性，也强调聚集体尺寸、扩展率和多能性。

3材料和方法对应于实施例1，具有表3中列出的以下培养参数。iPSC在“容器2”(vessel 2)(内部命名为Sartorius UniVessel 2L)中和在“容器3”(vessel 3)(内部命名为Sartorius UniVessel 0.5L)中培养。

3表3：实施例2的培养参数。

聚集体大小(聚集体尺寸)

在第0代的第1天，UniVessel 0.5L中的聚集体较大，为129m(图2)。在第0代的第1天，UniVessel 2L中的聚集物小于0.5L容器中的聚集体。在第0代的第4天，两个容器的聚集体大小相当。

扩增率

在第0代中培养4天后，0.5L和2L UniVessel中的扩增率约为8倍(表4)。

表4：第0代的扩增率。

多能性

在两个容器的接种物中多能性相关基因的表达都很高(图3和4)。2L和0.5LUniVessel的iPSC在第0代的第4天都显示出多能性相关标记的高表达。在悬浮液中iPSC中的表达与接种物中的表达相当。

分析

在实施例2中，在两种不同大小的UniVessel(0.5L和2L)中培养iPSC。在第0代的第4天，在两个容器中都获得了良好质量的iPSC。因此，使用本发明的方法在期望的生长速率和相关的聚集体尺寸下产生了更期望的质量。

参考文献

Baghbaderani,B.A.,Tian,X.,Neo,B.H.,Burkall,A.,Dimezzo,T.,Sierra,G.,Zeng,X.,Warren,K.,Kovarcik,D.P.,Fellner,T.,et al.(2015).

cGMP-Manufactured Human Induced Pluripotent Stem Cells Are Availablefor Pre-clinical and Clinical Applications.Stem Cell Reports 5,647–659.

Baghbaderani,B.A.,Syama,A.,Sivapatham,R.,Pei,Y.,Mukherjee,O.,Fellner,T.,Zeng,X.,and Rao,M.S.(2016).Detailed Characterization of Human InducedPluripotent Stem Cells Manufactured for Therapeutic Applications.Stem CellRev and Rep 12,394–420.

Baptista,R.P.,Fluri,D.A.,and Zandstra,P.W.(2013).High densitycontinuous production of murine pluripotent cells in an acoustic perfusedbioreactor at different oxygen concentrations.Biotechnology andBioengineering110,648–655.

Chen,V.C.,Couture,S.M.,Ye,J.,Lin,Z.,Hua,G.,Huang,H.-I.P.,Wu,J.,Hsu,D.,Carpenter,M.K.,and Couture,L.A.(2012).Scalable GMP compliant suspensionculture system for human ES cells.Stem Cell Research 8,388–402.

Fernandes-Platzgummer,A.,Diogo,M.M.,Lobato da Silva,C.,and Cabral,J.M.S.(2014).Maximizing mouse embryonic stem cell production in a stirredtank reactor by controlling dissolved oxygen concentration and continuousperfusion operation.Biochemical Engineering Journal 82,81–90.

Halloin,C.,Coffee,M.,Manstein,F.,and Zweigerdt,R.(2019).Production ofCardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells by BioreactorTechnologies.In Cell-Based Assays Using IPSCs for Drug Development andTesting,C.-F.Mandenius,and J.A.Ross,eds.(New York,NY:Springer New York),pp.55–70.

Hemmi,N.,Tohyama,S.,Nakajima,K.,Kanazawa,H.,Suzuki,T.,Hattori,F.,Seki,T.,Kishino,Y.,Hirano,A.,Okada,M.,et al.(2014).A MassiveSuspensionCulture System With Metabolic Purification for Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.STEM CELLS Translational Medicine 3,1473–1483.

Jiang,Y.,Langenberg,K.,Borgdorff,V.,Duńska,M.,Post,R.,Bartulos,O.,Doornbos,M.,Braam,S.,Reijerkerk,A.,and Rasche,U.(2019).Controlled,Large-ScaleManufacturing of hiPSC-Derived Cardiomyocytes in Stirred-Tank Bioreactors.12.

Kempf,H.,Kropp,C.,Olmer,R.,Martin,U.,and Zweigerdt,R.(2015).Cardiacdifferentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspensionculture.Nature Protocols 10,1345–1361.

Kropp,C.,Kempf,H.,Halloin,C.,Robles-Diaz,D.,Franke,A.,Scheper,T.,Kinast,K.,Knorpp,T.,Joos,T.O.,Haverich,A.,et al.(2016).Impact of FeedingStrategies on the Scalable Expansion of Human Pluripotent Stem CellsinSingle-Use Stirred Tank Bioreactors.STEM CELLS Translational Medicine 5,1289–1301.

Kropp,C.,Massai,D.,and Zweigerdt,R.(2017).Progress and challenges inlarge-scale expansion of human pluripotent stem cells.Process Biochemistry59,244–254.

Lipsitz,Yonatan Y.；Tonge,Peter D.；Zandstra,Peter W.(2018):Chemicallycontrolled aggregation of pluripotent stem cells.In:Biotechnology andbioengineering 115(8),S.2061–2066.DOI:10.1002/bit.26719.

Serra,M.,Brito,C.,Sousa,M.F.Q.,Jensen,J.,R.,Clemente,J.,Strehl,R.,Hyllner,J.,Carrondo,M.J.T.,and Alves,P.M.(2010).Improving expansionof pluripotent human embryonic stem cells in perfused bioreactors throughoxygen control.Journal of Biotechnology 148,208–215.

Voisard,D.,Meuwly,F.,Ruffieux,P.-A.,Baer,G.,and Kadouri,A.(2003).Potential of cell retention techniques for large-scale high-densityperfusion culture of suspended mammalian cells.Biotechnology andBioengineering 82,751–765.

Claims (16)

1.一种扩增干细胞的方法，其中所述干细胞包含在悬浮培养物中的细胞聚集体中，所述方法包括：

(i)在允许所述干细胞增殖的条件下培养所述干细胞；以及

(ii)通过旋转筛网灌注进行培养基交换。

2.一种更换悬浮培养物的培养基的方法，所述悬浮培养物包含悬浮在所述培养基中的干细胞的细胞聚集体，所述方法包括：

(i)通过旋转筛网灌注进行培养基交换；以及

(ii)任选地用新鲜培养基替换通过旋转筛网孔移出的所述培养基。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述干细胞在生物反应器中培养，其中所述生物反应器优选为搅拌生物反应器、摇摆运动生物反应器和/或多平行生物反应器。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基交换在生物反应器内部进行。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述旋转筛网是旋转过滤器，任选地其中所述旋转过滤器附接到生物反应器的搅拌器或搅拌棒。

6.根据权利要求1-3或5中任一项所述的方法，其中所述培养基交换在生物反应器外进行，优选其中容纳所述旋转筛网的装置与所述生物反应器流体连接以形成封闭系统。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述旋转筛网具有约1μm至约50μm、约5μm至约50μm、约10μm至约50μm、约5μm至约40μm、约5μm至约30μm、约5μm至约20μm、或约5μm至约15μm，优选约10μm的孔径。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞聚集体具有约50至约300μm、约80至约250μm、约100至约220μm或约100至约200μm的平均直径。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述干细胞是多能干细胞、脐带血干细胞、间充质干细胞和/或造血干细胞；和/或源自干细胞的细胞，其中所述多能干细胞优选是诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)、孤雌生殖干细胞(pPSC)或核移植来源的PSC(ntPSC)，最优选iPSC。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述干细胞选自TC-1133、GibcoATCC ACS-1004的人Episomal iPSC系、ATCC ACS-1021、ATCC ACS-1025、ATCC ACS-1027、ATCC ACS-1030。

11.旋转筛网用于悬浮培养物中的培养基交换的用途，所述悬浮培养物包含悬浮在所述培养基中的细胞聚集体，其中所述细胞是干细胞。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述干细胞是多能干细胞、脐带血干细胞、间充质干细胞和/或造血干细胞；和/或源自干细胞的细胞，其中所述多能干细胞优选是诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)、孤雌生殖干细胞(pPSC)或核移植来源的PSC(ntPSC)，最优选iPSC。

13.根据权利要求11或12所述的用途，其中所述干细胞选自TC-1133、Gibco ATCC ACS-1004的人Episomal iPSC系、ATCC ACS-1021、ATCC ACS-1025、ATCC ACS-1027、ATCC ACS-1030。

14.根据权利要求11-13中任一项所述的用途，其中所述细胞聚集体优选具有约50至约300μm、约80至约250μm、约100至约220μm或约100至约200μm的平均直径。

15.根据权利要求11所述的用途，其中所述旋转筛网是旋转过滤器，任选地其中所述旋转过滤器附接到生物反应器的搅拌器或搅拌棒。

16.根据权利要求11或15所述的用途，其中所述旋转筛网具有约1μm至约50μm、约5μm至约50μm、约10μm至约50μm、约5μm至约40μm、约5μm至约30μm、约5μm至约20μm、或约5μm至约15μm，优选约10μm的孔径。