CN114901803A

CN114901803A - 在生物反应器中悬浮扩增干细胞

Info

Publication number: CN114901803A
Application number: CN202080085065.4A
Authority: CN
Inventors: L·豪普特
Original assignee: Universitaetsmedizin Goettingen Georg August Universitaet
Current assignee: Universitaetsmedizin Goettingen Georg August Universitaet
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2022-08-12
Also published as: EP4073234A1; WO2021116362A1; US20230059873A1; KR20220113349A; JP2023505421A; CA3150477A1; AU2020399213A1

Abstract

本发明涉及一种在生物反应器中以悬浮培养扩增多能干细胞(PSC)的方法，所述方法包括(i)向在所述生物反应器中悬浮培养的多能干细胞中添加ROCK抑制剂(ROCKi)；(ii)加入细胞解离剂，从而解离所述多能干细胞的聚集体；(iii)通过加入过量体积的培养基来稀释步骤(ii)中加入的细胞解离剂，所述过量体积的培养基足以将细胞解离剂的浓度降低至可以再次形成细胞聚集体的浓度；以及(iv)在允许PSC扩增的合适条件下培养步骤(iii)中获得的混合物。

Description

在生物反应器中悬浮扩增干细胞

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年12月11日提交的欧洲专利申请No.19 215 091.0的优先权的权益，将其内容通过引用整体并入本文以用于所有目的。

技术领域

本发明涉及一种在生物反应器中以悬浮培养扩增多能干细胞(PSC)的方法。

背景技术

多能干细胞(PSC)是贴壁细胞，因此通常在诸如烧瓶的细胞培养容器中培养，在烧瓶中多能干细胞黏附在容器的底部。为了促进黏附，通常用细胞外基质(ECM)的蛋白质涂覆容器的底部。然而，这种细胞培养方法不能用于生产临床应用中所需的大量PSC，因为在细胞培养瓶中培养是耗时、劳动密集的并且需要大量材料(培养基和塑料器皿)。已经描述了将搅拌罐生物反应器中的悬浮培养作为贴壁培养的替代。对此，PSC并非在细胞培养容器底部的单细胞层中生长，而是形成聚集体，在该聚集体中细胞彼此附着。因此，在悬浮培养中不需要补充ECM蛋白以允许形成细胞聚集体。悬浮培养被看作是更有效的，因为还可以控制培养条件以获得更高的细胞数量且需要更少的材料和时间。

然而，在悬浮培养中PSC的连续增殖导致聚集体尺寸的连续增加。超过一定的聚集体直径，无法向聚集体内的细胞充分地提供营养物和/或生长因子或其它信号分子，于是这些细胞自发地分化或凋亡。为了连续扩增PSC，因此必须将聚集体解离，并且必须对所得单细胞再接种(“传代”)。然而，悬浮培养中的传代造成了几个问题：聚集体的解离可能导致PSC的生存力降低或导致自发分化，因为这些对外部影响敏感。此外，当存在大量细胞时，难以在封闭系统中使该步骤自动化，因为必须快速自聚集体中分离细胞培养基。

最常用于聚集体解离的方法是酶消化。对此，使PSC的黏附分子蛋白水解性地切割。由此，细胞彼此分离。已经描述了酶或包含酶的溶液，包括Accutase、Accumax、胰蛋白酶、TrypLE Select和胶原酶B。必须终止酶反应以防止过度消化，过度消化将再次导致裂解或细胞凋亡。通常通过强稀释或加入随后通过离心移除的终止试剂来实现酶反应(reagent)的终止。此外，酶消化影响PSC的增殖和聚集体形成，因为在此过程中膜结合的黏附分子被移除，其必须再次形成。此外，PSC通常彼此完全分离，这可能对其多能性和生存力产生负面影响。

在本领域中还描述了细胞聚集体的机械解离。对此，例如迫使聚集体通过具有允许较小聚集体破碎的孔径的筛网。通常，用解离试剂预处理聚集体。同样，该方法对PSC造成环境威胁(stress)，然后使PSC变得凋亡或开始分化。

酶解离以及机械解离通常手动进行，以允许控制和监察整个过程。另外，聚集体或细胞通常通过离心从细胞培养基或解离试剂中分离，这可能导致细胞“结块(clumping)”。在生产治疗性产品的GMP生产过程中，这两者都应特别避免，这不仅是因为其是劳动密集型的并因此是昂贵的，而且因为每个手动单元操作都将增加微生物污染和批次间差异的风险。

因此，仍然需要允许在封闭系统中扩增PSC的细胞解离或传代方法，在该方法中，PSC聚集体的解离和重新形成的整个过程可以重复进行，无需从系统中移出细胞或聚集体，并且无需将细胞暴露于与酶/机械消化和/或离心相关的威胁。因此，技术问题是要满足这种需求。

发明内容

该技术问题通过权利要求中限定的主题来解决。本文提供了一种在生物反应器中以悬浮培养扩增多能干细胞(PSC)的方法。

因此，本发明涉及一种在生物反应器中以悬浮培养扩增多能干细胞(PSC)的方法，所述方法包括

(i)向在所述生物反应器中悬浮培养的多能干细胞中添加ROCK抑制剂(ROCKi)；

(ii)加入细胞解离剂，从而解离所述多能干细胞的聚集体；

(iii)通过加入过量体积的培养基来稀释步骤(ii)中加入的细胞解离剂，所述过量体积的培养基足以将细胞解离剂的浓度降低至可以再次形成细胞聚集体的浓度；以及

(iv)在允许PSC扩增的合适条件下培养步骤(iii)中获得的混合物。

优选地，细胞解离剂为螯合剂，优选地所述螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(β-氨基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、聚天冬氨酸、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、柠檬酸盐、柠檬酸、1,2-双(邻-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)和甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)。

优选地，细胞解离试剂选自EDTA、柠檬酸盐、柠檬酸或它们的组合。

优选地，步骤(ii)中诸如EDTA、柠檬酸或柠檬酸盐的细胞解离剂的终浓度为至少100μM，在约100至约1000μM的范围内，在约250至约750μM的范围内，在约400至约600μM的范围内，或为约500μM，优选地为约500μM EDTA、柠檬酸或柠檬酸盐。

优选地，在加入过量体积的培养基后，步骤(iii)中诸如EDTA、柠檬酸或柠檬酸盐的细胞解离剂的浓度为约100μM或更低，约95μM或更低，约90μM或更低，约80μM或更低，约70μM或更低，在约100至约1μM EDTA柠檬酸或柠檬酸盐的范围内，或在约90至约1μM EDTA、柠檬酸或柠檬酸盐的范围内。

优选地，过量体积超过细胞解离剂的体积至少5倍。优选地通过加入至少5倍的过量体积来停止细胞解离并引发聚集体的再形成。

优选地，(iii)中的培养基包含ROCKi。

优选地，所述方法进一步包括：(v)将所述培养基更换为基本上不含ROCKi的培养基。

优选地，步骤(iv)进行约1至约3天，优选地进行约2天。

优选地，步骤(v)在步骤(iii)之后约1至约3天，优选地约2天开始。

优选地，ROCKi选自AS1892802、盐酸法舒地尔、GSK 269962、GSK 429286、H 1152、HA 1100、OXA 06、RKI 1447、SB 772077B、SR 3677、TC-S 7001、thiazovivin、Y27632和它们的组合。优选地，ROCKi为Y27632。优选地，将Y27632添加至约10μM的终浓度。

优选地，在步骤(ii)之前约2至约4小时向步骤(i)中加入ROCKi。

优选地，步骤(iii)中过量体积的培养基的加入导致培养基中的细胞数为约1×10⁵至约1×10⁶个细胞/ml、约1.5至约7.5×10⁵个细胞/ml、约2×10⁵至约5×10⁵个细胞/ml、约2×10⁵至约3×10⁵个细胞/ml或约2.5×10⁵个细胞/ml。

优选地，培养基选自IPS-Brew、E8、StemFlex、mTeSR1和PluriSTEM。优选地，培养基为iPSC--Brew。

优选地，步骤(i)和(iii)中的培养基基本上相同。

优选地，培养基的温度为约30至50℃，约35至40℃，约36至38℃或约37℃，优选地为37℃。

优选地，步骤(i)至(iv)或(i)至(v)重复1次、2次、3次、4次、5次、至少5次或至少10次。

优选地，在步骤(i)至(iv)或(v)的每次重复后PSC均维持其多能性。

优选地，多能干细胞选自诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)、孤雌生殖干细胞(pPSC)和核转移衍生的PSC(ntPSC)。最优选地，多能干细胞为iPSC。在另一更优选的实施方案中，所述多能干细胞为ESC。在又一更优选的实施方案中，多能干细胞为孤雌生殖干细胞。

优选地，多能干细胞为TC1133细胞。

优选地，步骤(ii)中的聚集体具有约180μm至约250μm，优选地约200μm至约250μm，最优选地约200μm的平均直径。

优选地，在步骤(ii)中使聚集体解离至少约1min、至少约2min、至少约3min、至少约5min、至少约10min、1至20min、约10至约20min、约10至约15min或长达约15min，优选地约15min。

附图说明

当结合非限制性实施例和附图考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明，其中：

图1示出了本发明的方法的示例性实施方案。参考图1描述的方法也在实施例1和2中实施。对此，示出了起始培养，随后是细胞传代的两次重复或循环。在转移为悬浮培养之前，在IPS-Brew中，在涂覆有biolaminin 521-MX的标准细胞培养瓶中培养诸如iPSC的PSC。为了开始悬浮培养，通过加入细胞解离剂(此处为Versene)将PSC从细胞培养瓶中解离出来，然后将其用于接种生物反应器，此处接种浓度为2.5×10⁵个细胞/ml，总体积为13ml。在培养基中培养细胞约2天的时间段，所述培养基为比如补充有10μM ROCKi(比如Y27632)的iPS-Brew。两天后，开始将培养基更换为比如不含ROCKi的iPS-Brew的培养基。在第4或5天，当聚集体优选地已经生长到约200-250μm的尺寸时，在解离步骤之前，添加ROCKi(此处为10μM Y27632)达2-4小时(在实施例1和2中为2小时)。这对应于本发明方法的步骤(i)，也可以看作细胞传代的循环1的开始。一个循环可以包括本发明方法的步骤(i)至(iv)和任选地还包括步骤(v)。

然后，进行(自动)解离(本发明方法的步骤(ii))：实施例1和2提供了这样一种示例性解离方法：首先，用Versene洗涤细胞两次，包括停止搅拌约两分钟，移除培养基至约2ml，加入Versene至10ml并开始搅拌(300rpm，向下)10秒。再次停止搅拌约2分钟，移除培养基至2ml，并加入3ml Versene。然后通过在600rpm下搅拌最多15min进行细胞聚集体的实际解离，直到解离完成。可以对细胞进行计数。然后，通过加入过量体积的新鲜iPS-Brew稀释Versene溶液。该稀释对应于本发明方法的步骤(iii)。

然后将传代的PSC(优选地稀释后的浓度为约2-5×10⁵个细胞/ml)在培养基中培养两天直至第6天(本发明方法的步骤(iv))，所述培养基为比如补充有10μM ROCKi(比如Y27632)的iPS-Brew。在第6天，开始将培养基更换为比如未补充ROCKi的IPS-Brew的培养基(本发明方法的任选步骤(v))。这可以看作传代细胞的循环1的结束。

在第8-9天，开始细胞传代的下一轮重复(循环2)：在解离步骤之前2-4小时加入ROCKi。这对应于本发明方法的步骤(i)。然后，进行自动解离(本发明方法的步骤(ii))和传代(本发明方法的步骤(iii))。然后将传代的PSC在补充有10μM ROCKi(比如Y27632)的iPS-Brew中培养两天。随后可以进行进一步的传代和培养步骤。

图2示出了在如实施例1中进行的培养中和如参考图1所述方法的示例性实施方案所述的培养中获得的各次传代的最后一天的聚集体尺寸。各个数据点代表单个容器(vessel)的值。平均值由线表示。

图3示出了实施例1中进行的培养的各次传代的扩增率，数据点描述了单个容器的值。实线表示各次传代的平均值。传代6和传代8持续三天，而其它传代持续4-5天。

图4示出了实施例1中进行的长期悬浮培养期间的累积倍数改变，累积倍数改变是采用传代期间的起始细胞数和相应的分裂比率计算的。

图5示出了如实施例1中进行的在传代结束时ROCKi处理的iPSC中多能性相关基因的表达：OCT4(左)、TRA-1-60(中)和OCT4/TRA-1-60(右)。平均值±SD。

图6示出如实施例1中进行的在传代结束时TZV处理的iPSC中多能性相关基因的表达：OCT4(左)、TRA-1-60(中)和OCT4/TRA-1-60(右)。平均值±SD。

图7示出了实施例2中进行的长期悬浮培养期间的累积倍数改变，累积倍数改变是采用传代期间的起始细胞数和相应的裂比率计算的。

图8示出如实施例2中进行的传代结束时多能性相关基因的表达：OCT4(左)、NANOG(中左)、LIN28(中)、OCT4/NANOG(中右)和OCT4/LIN28(右)。平均值±SD。

图9示出了iPSC的形态。如实施例3所进行的，将iPSC从贴壁培养(d0)转移为悬浮细胞培养(d 1-4)。在第4天，用Versene解离聚集体(d4，3-8分钟)用于传代。比例尺：200μm。

图10示出了如在实施例4中在传代0第4天(左侧柱)和传代1第3天(右侧柱)进行解离细胞前后，经过和未经过预处理的iPSC的聚集体尺寸。

图11示出了如在实施例4中在传代0第4天(左柱)、传代1第3天(中柱)和传代1第5天(右柱)进行解离细胞前后，经过和未经过ROCKi预处理的iPSC的扩增率(倍数改变)。

图12示出了在如实施例4中在传代0第4天(左柱)、传代1第3天(中柱)和传代1第5天(右柱)进行解离细胞前后，在经过和未经过ROCKi预处理的iPSC中，多能性标志物的表达率。所分析的多能性标志物为OCT4(图12A)、NANOG(图12B)和TRA-1-60(图12C)。

图13示出了如实施例5中进行的在每次传代结束时在不同时间点(p0第4天、p1第5天、p2第5天和p3第4天)的细胞聚集体的形态。

图14示出了实施例5中所示的细胞扩增的每一天的不同传代期间的聚集体尺寸。

图15示出了实施例5的所有传代结束时的扩增率(左轴，圆圈)和细胞浓度(右轴，正方形)。

图16示出在实施例5的不同传代的所示时间点期间iPSC中多能性相关基因的表达。

具体实施方式

在下文详细描述了本发明，并且还将通过所附的实施例和附图对其进一步说明。

在本发明中，成功地证明了可以将PSC从贴壁细胞培养(“起始培养”)转移为在生物反应器中的连续悬浮培养。令人惊讶地发现(a)在细胞解离之前加入Rho-相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂增加了细胞生存力和产量，并且还有助于维持PSC的多能性(参见，如实施例4)，和(b)在稀释细胞解离试剂之后，可在仍包含细胞解离剂的培养基中培养并扩增PSC(参见，如实施例1、2和3)。此外，令人惊讶地发现(c)可以将螯合剂，比如包含EDTA(乙二胺四乙酸)的溶液，用在解离多能干细胞(PSC)的聚集体中(参见实施例1和2)。实施例5强调本发明无需进一步修改即可按比例放大超过30倍。因此本发明允许在封闭系统中自动培养PSC，并因此减少了手动操作的次数，所述手动操作比如在细胞传代期间将PSC从生物反应器中转移出至离心机中。因此，本发明的方法比常规培养系统更简便、更快速且更便宜，并且允许PSC生产的进一步自动化。如上所述，由于本发明的方法可以在封闭系统中进行，因此其具有进一步的优点，即理想地适于建立符合GMP的干细胞生产方法。

在可以开始生物反应器中PSC的连续和自动化扩增之前，优选必须将PSC转移至该生物反应器(也参见图1)。在贴壁培养中培养PSC是本领域技术人员已知的。例如，可将PSC培养在涂覆有0.9μg/cm² biolaminin521-MX或其它ECM的蛋白质的T25/T75培养瓶中的适合PSC的培养基(比如iPSC-Brew培养基)中。为了开始悬浮培养，可以使用来自贴壁培养的PSC。将细胞通过诸如EDTA的细胞解离剂从烧瓶中解离出来并转移到含有ROCKi的培养基中。优选地，存在由2至10个细胞组成的细胞聚集体。然后，将这些解离的PSC用于接种生物反应器。本发明的方法开始时的优选细胞浓度为约2.5×10⁵个细胞/ml。然后将细胞在连续搅拌下悬浮培养，以避免PSC沉降和/或黏附到生物反应器的底部。

接种后，优选地将细胞在含有ROCKi的细胞培养基中培养约2天，以允许形成细胞聚集体。在形成细胞聚集体之后，可以将培养基更换为基本上不含ROCKi的细胞培养基，或者换言之，更换为未补充ROCKi或不包含ROCKi的细胞培养基。

如果细胞密度和/或细胞聚集体的尺寸不再允许适当地供应营养物(如，直径为约180至250μm，优选为200μm)，则可将PSC第一次传代：首先，优选在聚集体解离之前2至4小时，将ROCKi加入培养基中。在包含ROCKi的细胞培养基中预温育细胞聚集体之后，将细胞用细胞解离剂洗涤一次或两次。洗涤可以包括停止搅拌生物反应器中的细胞聚集体并允许它们通过重力沉降。然后，将培养基或细胞解离剂优选通过抽吸移除，并用(新鲜的)细胞解离试剂替换。加入后，再次搅拌细胞聚集体，优选以约300rpm搅拌约10秒，然后进行另一洗涤循环。在采用细胞解离试剂的两个洗涤循环后，可在连续搅拌下，优选地在增加的搅拌速度(如600rpm)下，将PSC保持在细胞解离试剂中直到形成较小聚集体(约5至50个细胞)的悬浮液。然后，通过将细胞的一部分转移至另一生物反应器而将解离的PSC用于接种另一生物反应器，其中优选地，通过加入过量体积的培养基将这些PSC稀释。可选地或另外地，可以在相同的生物反应器中稀释解离的PSC，即不需要在生物反应器的封闭系统外的任何细胞转移。可选地或另外地，可将部分PSC移出用于临床应用，并将剩余的PSC用于接种相同的生物反应器。从而完成传代。如本文所述，可以重复传代，从而允许以低成本高产量地连续扩增PSC。图1示出了包括起始培养的本发明方法的示例性实施方案。

因此，本发明涉及一种在生物反应器中以悬浮培养扩增(诱导)多能干细胞(PSC)的方法，所述方法包括

(ii)加入细胞解离剂，从而解离所述多能干细胞的聚集体；

可将本文所述的方法视为优选在如生物反应器的封闭系统中，在连续和/或自动化过程中使PSC传代的一次重复。这种传代方法减少了可能导致批次间差异或污染的手动操作的次数。如本文所用，术语“传代(passage/passaging)”指继代培养黏附细胞的过程，其中破坏细胞黏附并且通过加入新鲜培养基降低细胞密度(每单位体积或面积的细胞数目)。因此，本发明还涉及一种在生物反应器中以悬浮培养传代(诱导)多能干细胞(PSC)的方法，所述方法包括

(ii)加入细胞解离剂，从而解离所述多能干细胞的聚集体；

如本文所述，PSC的传代可重复，因此本发明的方法允许在级联样程序中扩增PSC(扩增)的连续过程。因此，步骤(i)至(iv)或(i)至(v)可以重复1次、2次、3次、4次、5次、至少5次或至少10次。如实施例1和2以及图5、6和8所示，在本发明方法的步骤(i)至(iv)或(v)的每次重复后，PSC保持其多能性达延长的时间段，即达如实施例2所示的至少49天和10次传代。因此，优选地，在步骤(i)至(iv)或(v)的每次重复后PSC保持其多能性。

如本文所用术语“多能干细胞”(PSC)是指能够分化成身体的每种细胞类型的任何细胞。因此，多能干细胞提供了分化成基本上任何组织或器官的独特机会。目前，最常用的多能细胞是胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)。Thomson及其同事(Thomson等，(1998),Science 282:1145-1147)首先建立了人ESC系。最近，人ESC研究使得一种将体细胞重编程为ESC样细胞的新技术的开发成为可能。该技术由Yamanaka及其同事在2006年开创(Takahashi&Yamanaka(2006),Cell,126:663-676)。所得到的诱导多能细胞(iPSC)显示出与ESC非常相似的行为，并且重要的是，它们还能够分化成身体的每种细胞。本发明可用的多能干细胞的另一个实例是孤雌生殖(PG)(胚胎)干细胞，可以例如在小鼠和人中，容易地从未受精卵母细胞体外活化后发育的胚泡中衍生出孤雌生殖干细胞(参见，在本上下文中，例如Espejel等，Parthenogenetic embryonic stem cells are an effective cellsource for therapeutic liver repopulation,Stem Cells.2014Jul；32(7):1983–1988或Didié等，Parthenogenetic stem cells for tissue-engineered heart repair.JClin Invest.2013Mar；123(3):1285-98)。可本文可用的合适的干细胞的又一实例是核转移衍生的PSC(ntPSC；参见Kang等，Improving Cell Survival in Injected EmbryosAllows Primed Pluripotent Stem Cells to Generate Chimeric Cynomolgus Monkeys,Cell Reports Volume 25,Issue 9,2018年11月27日，2563-2576页)。然而，在本发明的上下文中，优选地，这些多能干细胞不是使用涉及修饰人类种系遗传特性或使用涉及将人类胚胎用于工业或商业目的的过程产生的。优选地，所述多能干细胞为灵长类动物来源的，包括但不限于鼠、大鼠、猫、犬、牛、马、猿或人来源，更优选地为人类来源。

可例如从NIH人胚胎干细胞登记处(NIH human embryonic stem cellregistry)、诱导多能干细胞欧洲库(EBiSC)、德国心血管研究中心的干细胞储存库(DZHK)或ATCC获得合适的诱导PSC，仅举几种来源。诱导的多能干细胞也可自商业用途中获得，例如，自NINDS人类序列和细胞储存库(https://stemcells.nindsgenetics.org)，其由美国国立神经疾病与卒中研究院(NINDS)运营，并将人细胞资源广泛地分配给学术和工业研究人员。一个可用于本发明的合适细胞系的说明性实例是细胞系TC-1133，其是一种衍生自脐带血干细胞的诱导(未编辑)的多能干细胞。该细胞系例如可直接从美国NINDS获得。优选地，TC-1133是符合GMP的。可用于本发明的其它示例性iPSC细胞系包括但不限于，Gibco^TM的人Episomal iPSC系(订单号A18945,Thermo Fisher Scientific)，或自ATTC获得的iPSC细胞系ATCC ACS-1004、ATCC ACS-1021、ATCC ACS-1025、ATCC ACS-1027或ATCC ACS-1030。可选地，重编程领域的任何技术人员均可通过已知方案容易地产生合适的iPSC系，所述已知方案例如由Okita等，“A more efficient method to generate integration-free humaniPS cells”Nature Methods,Vol.8No.5,2011年5月,409-411页或由Lu等，“A definedxeno-free and feeder-free culture system for the derivation,expansion anddirect differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotentstem cells”,Biomaterials 35(2014)2816e2826所述的方案。

如本文所解释的，本发明中使用的(诱导)多能干细胞可以衍生自任何合适的细胞类型(例如，衍生自干细胞，比如间充质干细胞，或上皮干细胞或分化的细胞，比如成纤维细胞)和衍生自任何合适的来源(体液或组织)。这些来源(体液或组织)的实例包括脐带血、皮肤、齿龈、尿液、血液、骨髓、脐带的任何隔室(例如，脐带羊膜或Wharton’s胶)、脐带-胎盘连接处、胎盘或脂肪组织，仅举几个例子。在一个说明性实例中，是例如通过使用特异性针对CD34的抗体的磁性细胞分选从脐带血中分离CD34阳性细胞，然后如Chou等(2011),CellResearch,21:518-529所述重编程。Baghbaderani等，(2015),Stem Cell Reports,5(4):647-659表明iPSC的生产工艺可以符合生产细胞系ND50039的良好生产实践的规定。

因此，优选地，多能干细胞满足良好生产实践的要求。

如本文所述术语“扩增”PSC或iPSC或PSC或iPSC的“扩增”描述了由于细胞分裂引起的细胞数量的增加。本发明的方法可进一步包括扩增PSC的步骤。细胞扩增可以发生在本发明方法的步骤(iv)中、在本发明方法的步骤(v)中或在本发明方法的步骤(iv)中和在本发明方法的步骤(v)中，优选地发生在本发明方法的步骤(v)中。在一个实施方案中，步骤(iv)包括在允许PSC扩增的合适条件下培养步骤(iii)中获得的混合物，从而扩增PSC。在一个实施方案中，步骤(v)包括将培养基更换为基本上不含ROCKi的培养基，从而扩增PSC。所述扩增PSC的步骤可涉及向在生物反应器中悬浮培养的多能干细胞中添加ROCK抑制剂(ROCKi)(参见本发明方法的步骤(i))与通过加入过量体积的培养基来稀释步骤(ii)中加入的细胞解离剂，所述过量体积的培养基足以将细胞解离剂的浓度降低至可以再次形成细胞聚集体的浓度(参见本发明方法的步骤(iii))之间的时间，优选所述时间持续约2至约6天，优选地约3至约5天，优选地约3.5至约4.5天，或更优选地约4天。在本上下文中的“约”可涉及8小时或更少、4小时或更少、2小时或更少或1小时或更少的偏差。

如本文所用术语“悬浮培养”是一种细胞培养，其中允许单个细胞或小的细胞聚集体在搅拌的生长培养基中发挥作用并增殖，从而形成悬浮液(参见化学中的定义：“悬浮在液体中的小固体颗粒”)。悬浮培养与贴壁培养相对，在贴壁培养中，细胞附着于细胞培养容器，该细胞培养容器可以涂覆有细胞外基质(ECM)的蛋白质。在悬浮培养中，优选地，细胞和/或培养基中不添加ECM的蛋白。

如本文所用，可互换使用的术语“聚集体”和“细胞聚集体”是指多个(诱导的)多能干细胞，其中细胞之间的缔合是由细胞-细胞相互作用(如，通过彼此的生物附着)引起的。生物附着可以是例如，通过表面蛋白或其它细胞黏附分子，所述表面蛋白比如整联蛋白、免疫球蛋白、钙粘着蛋白、选择蛋白。例如，细胞可以在悬浮液中自发缔合并形成细胞-细胞附着(如，自组装)，从而形成PSC的聚集体。在一些实施方案中，细胞聚集体可以是基本上均质的(即，主要含有相同类型的细胞)。在一些实施方案中，细胞聚集体可以是异质的(即，含有一种以上类型的细胞)。

在一些实施方案中，在本发明方法的步骤(ii)中，聚集体具有约150至约800μm尺寸的平均直径。在一些实施方案中，在本发明方法的步骤(ii)中，聚集体具有至少约800μm尺寸的平均直径。在一些实施方案中，在本发明方法的步骤(ii)中，聚集体具有至少约600μm尺寸的平均直径。在一些实施方案中，在本发明方法的步骤(ii)中，聚集体具有至少约500μm尺寸的平均直径。在一些实施方案中，在本发明方法的步骤(ii)中，聚集体具有至少约400μm尺寸的平均直径。在一些实施方案中，在本发明方法的步骤(ii)中，聚集体具有至少约300μm尺寸的平均直径。在一些实施方案中，在本发明方法的步骤(ii)中，聚集体具有至少约200μm尺寸的平均直径。在一些实施方案中，在本发明方法的步骤(ii)中，聚集体具有至少约150μm尺寸的平均直径。在优选的实施方案中，在本发明方法的步骤(ii)中，聚集体具有约300至约500μm尺寸的平均直径。在优选的实施方案中，在本发明方法的步骤(ii)中，聚集体具有约150至约300μm尺寸的平均直径。

优选地，避免形成巨大的PSC聚集体尺寸，因为超过约300μm的直径可能会由于有限的营养物和气体扩散到组织/聚集体中心而导致细胞坏死。最后，也可能发生不受控制的分化-特别是在大的PSC聚集体中。因此，在每次传代时聚集体向单个细胞的常规解离是重要的。如实施例中所示，本发明的方法以方便的方式解决了这一问题。在本发明中，证明在细胞聚集体解离前约180至约250μm，优选地约200至约250μm，理想地约200μm的平均直径是细胞的多能性和产量之间的最佳折衷方案。因此，在本发明方法的步骤(ii)中，聚集体优选具有约180至约250μm，更优选地约200至约250μm，最优选地约200μm的直径。

如本文所用，可互换使用的术语“反应器”和“生物反应器”是指被配置成为细胞培养提供动态流体环境的封闭培养容器。搅拌反应器的实例包括、但不限于搅拌釜生物反应器、波浪混合/摇摆生物反应器、上下搅动生物反应器(即，包括活塞作用的搅动反应器)、转瓶、摇瓶、振荡生物反应器、桨式混合器、立轮生物反应器。可以将搅拌式反应器配置成容纳约2mL至20,000L的细胞培养体积。优选的生物反应器可具有多达50L的体积。适用于本发明方法的示例性生物反应器是

生物反应器或

生物反应器，两者均可从Sartorius Stedim Biotech获得(例如，后者可以0.5至10L体积的形式获得)。培养基的pH可由生物反应器控制，优选由CO₂供应控制，并且可保持在6.6至7.6的范围内，优选地保持在约7.4。

在一些实施方案中，生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约20,000L。在一些实施方案中，生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约2,000L。在一些实施方案中，生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约200L。在一些实施方案中，生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约100L。在一些实施方案中，生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约50L。在一些实施方案中，生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约20L。在一些实施方案中，生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约10L。在一些实施方案中，生物反应器中的培养容器的体积为约50mL至约1L。在一些实施方案中，生物反应器中的培养容器的体积为约100mL至约10L。在一些实施方案中，生物反应器中的培养容器的体积为约100mL至约5L。在一些实施方案中，生物反应器中的培养容器的体积为约150mL至约1L。在一些实施方案中，生物反应器中培养容器的体积为约1L至约1,000L。

特别优选的是其中最小和最大细胞培养体积相差5倍或甚至10倍的生物反应器，即，可以理解为允许在相同生物反应器中放大的生物反应器。此类生物反应器可以允许在相对小的体积(比如200mL)中开始PSC扩增。如果由过量体积的培养基，如加入5倍的细胞培养基，稀释细胞解离试剂，则在第一次传代后产生约1L的终体积。细胞扩增后，再次将细胞分离，随后加入过量体积的培养基，然后在细胞第二次传代后将体积增加至如5L。因此，在接受相对小和大体积的生物反应器中，细胞可以在相同的生物反应器中传代若干次而无需任何手动操作(级联样程序)，如，移除一部分细胞并使用该部分细胞接种另一生物反应器，而剩余部分的细胞用于再次接种该生物反应器(“重复分批策略”或“级联样程序”)。这允许PSC扩增约1000倍，而无需任何诸如将细胞转入和转出生物反应器的人工干预。这种无需人工干预具有使污染风险最小化冰促进在GMP条件下PSC扩增的优点。

本发明的方法可以适用于大规模(如，1L至1000L)使用。在一个优选的实施方案中，对于大规模生产，适合在第二或随后的培养期中使用的生物反应器是比用于初始培养和解离的生物反应器更大的反应器。在一个优选的实施方案中，平行接种多个生物反应器以用于第二或随后的培养期，从而便于平行系列传代。

生物反应器可以是搅动生物反应器或搅拌生物反应器。优选地，将搅拌器的速度针对每个单独的生物反应器进行优化。本领域技术人员能够选择适于PSC培养和PSC细胞聚集体解离的搅拌器速度。优选地，用于PSC培养的搅拌器的速度较低，比如在约150至约450rpm的范围内，优选地为约300rpm，与之相对地，对于适于促进细胞解离的速度，其可能需要较高的速度，比如在约450至约750rpm的范围内，优选地为约600rpm。对于洗涤，优选地搅拌速度在约150至约450rpm的范围内，优选地为约300rpm。因此，在一个实施方案中，生物反应器是Sartorius Stedim的ambr15生物反应器，细胞生长的搅拌速度为300rpm，细胞解离的搅拌速度为600rpm。

如本文所用，术语“解离”是指将聚集的细胞彼此分离的过程。例如，在解离过程中，细胞之间的细胞-细胞相互作用可被破坏，从而使聚集体中的细胞分解。

如本文所用，术语“细胞解离剂”或“细胞解离试剂”(两者可互换使用)是指包含一种或多种将细胞彼此分离的试剂的试剂或溶液，比如，例如螯合剂。例如，解离试剂可以破坏细胞之间的键，从而破坏悬浮液中细胞的聚集。例如，解离试剂可以是螯合剂，其可以引起分子的螯合作用(sequestration)以削弱或破坏细胞黏附蛋白之间的键形成，例如通过螯合以破坏钙或镁依赖性黏附分子。

因此，优选地，解离试剂为螯合剂。如本文所用的“螯合试剂”可以是螯合二价阳离子(比如Ca²⁺或Mg²⁺)的(有机)化合物、肽或蛋白质。螯合是一种离子和分子与金属离子的键合。它涉及在多齿(多键合)配体和单个中心原子之间形成或存在两个或更多个独立的配位键。

螯合剂可以选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(β-氨基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、聚天冬氨酸、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、柠檬酸盐、柠檬酸、1,2-双(邻-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)和甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)。螯合剂可以是乙二胺四乙酸(EDTA)。螯合剂可以是乙二醇-双(β-氨基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)。螯合剂可以是亚氨基二琥珀酸(IDS)。螯合剂可以是聚天冬氨酸。螯合剂可以是乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)。螯合剂可以是柠檬酸盐。螯合剂可以是柠檬酸。螯合剂可以是1,2-双(邻-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)。螯合剂可以是甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)。优选地，螯合剂是EDTA。可从ThermoFisher Scientific获得的包含EDTA的市售“Versene”溶液是示例性的且优选的解离试剂。

步骤(ii)中所用螯合剂的终浓度可为至少100μM，在约100至约1000μM的范围内，在约250至约750μM的范围内，在约400至约600μM的范围内，或为约500μM，优选地为约500μM。步骤(ii)中所用螯合剂的终浓度可以是至少100μM EDTA，在约100至约1000μM EDTA的范围内，在约250至约750μM EDTA的范围内，在约400至约600μM EDTA的范围内，或为约500μMEDTA，优选地为约500μM EDTA。

如本文所述，蛋白水解酶的使用对细胞生存力和PSC的多能性具有负面影响，并且优选地避免使用蛋白水解酶。因此，优选地，细胞解离剂基本上不含诸如蛋白水解酶的酶。在本上下文中“基本上不含酶”可以指细胞解离剂，其中没有加入酶，优选地没有加入诸如胰蛋白酶、胃蛋白酶等的蛋白水解酶。因此，“基本上不含酶”可以排除酶或包含酶的溶液，包括Accutase、Accumax、胰蛋白酶、TrypLE Select和胶原酶B。

如本文所用，术语“解离的”和“解离的聚集体”是指单个细胞，或小于原始细胞聚集体(即小于解离前聚集体，例如步骤(i))的细胞聚集体或簇。例如，相对于解离前细胞聚集体，解离的聚集体可以包含约50％或更小的表面积、体积或直径。解离的聚集体可以由具有2至10个PSC或具有1至10个PSC的细胞聚集体组成。优选地，在本发明方法的步骤(iii)之后，解离的细胞聚集体具有约25μm至约130μm，更优选地约80μm至约100μm的直径。

可以通过本发明方法的步骤(ii)中的细胞解离试剂未稀释的时间量来控制所得解离聚集体的大小。因此，优选地，在步骤(ii)中，聚集体解离至少约1min、至少约2min、至少约3min、至少约5min、至少约10min、约1至20min、约10至约20min、约10至约15min或至多约15min，优选地约15min。

如本文所概述的，本发明的一个优点是解离试剂不一定必须移除，而是可以进一步继续PSC的培养而不需要洗涤步骤，其例如包括细胞的离心或其它机械操作。因此，PSC没有受到损害，并且可以在解离后在仍含有稀释的解离试剂的培养基中培养，从而允许细胞聚集体的重新形成。因此，可以避免易于出错和易于污染的手动操作，这在GMP条件下是特别期望的。本发明方法的稀释步骤(iii)将细胞解离剂的浓度降低至可以再次形成细胞聚集体的浓度，从而停止细胞解离反应。在细胞解离剂为螯合剂的情况下，步骤(iii)中加入的培养基的过量体积可以提供足够量的离子以使螯合剂饱和，使得加入的培养基的离子可以替换步骤(ii)中螯合剂结合的离子。如果将优选地(终)浓度为约500μM的EDTA用作螯合剂，则步骤(ii)中加入的解离试剂可以用过量5体积的培养基稀释。优选地，在步骤(iii)中稀释后，所得混合物中解离剂的浓度为约100μM或更低、约95μM或更低、约90μM或更低、约80μM或更低、约70μM或更低、在约100至约1μM的范围内，或在约90至约1μM的范围内。在解离试剂为EDTA的情况下，在步骤(iii)中稀释后，所得混合物中解离剂的浓度为约100μM或更低EDTA、约95μM或更低EDTA、约90μM或更低EDTA、约80μM或更低EDTA、约70μM或更低EDTA、在约100至约1μM EDTA的范围内、或在约90至约1μMEDTA的范围内。

如本文所用的术语“过量体积”是指超过步骤(ii)中加入的解离试剂的量至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少7.5倍、至少10倍、至少20倍或至少30倍的体积。

Rho-相关蛋白激酶(ROCK)是一种属于丝氨酸-苏氨酸激酶的AGC(PKA/PKG/PKC)家族的激酶。它主要通过作用于细胞骨架来调节细胞的形状和运动。ROCK(ROCK1和ROCK2)存在于哺乳动物(人、大鼠、小鼠、牛)、斑马鱼、非洲爪蟾蜍、无脊椎动物(秀丽隐杆线虫(C.elegans)、蚊子、果蝇)和鸡中。人ROCK1具有158kDa的分子量，是小GTPase RhoA的主要下游效应物。哺乳动物ROCK由激酶结构域、卷曲螺旋区和普列克底物蛋白同源(Pleckstrinhomology,PH)结构域组成，如果不存在RhoA-GTP，则其通过自动抑制性分子内折叠来降低ROCK的激酶活性。ROCK1主要在肺、肝、脾、肾和睾丸中表达。然而，ROCK2主要分布在脑和心脏中。蛋白激酶C和Rho相关蛋白激酶参与调节钙离子摄入；这些钙离子反过来刺激肌球蛋白轻链激酶，迫使收缩。

ROCK抑制剂(ROCKi)是本领域技术人员熟知的。ROCKi的实例包括、但不限于，AS1892802、盐酸法舒地尔、GSK 269962、GSK 429286、H 1152、HA 1100、OXA 06、RKI 1447、SB 772077B、SR 3677、TC-S 7001、thiazovivin和Y27632。优选地，ROCKi为Y27632。优选地，ROCKi(比如Y27632)的浓度在1至100μM、2至80μM、5至50μM、5至25μM的范围内或为约10μM。Y27632具有以下结构1：

优选地，ROCKi为thiazovivin。优选地，ROCKi(比如thiazovivin)的浓度在1至100μM、2至80μM、5至50μM、5至25μM的范围内或为约10μM。thiazovivin具有以下结构2：

可以将ROCK抑制剂加入本发明方法的步骤(iii)中使用的培养基中，以促进细胞存活和PSC的细胞再聚集(参见如实施例4)。因此，优选地，步骤(iii)中的培养基包含ROCKi。类似地，在本发明方法的步骤(i)中，将ROCKi添加到在生物反应器中培养的PSC中。ROCKi的加入可在本发明方法的步骤(ii)之前约2小时至约4小时进行。

在聚集体(再)形成之后，向PSC悬浮培养物连续施用ROCKi将降低PSC培养物的产率。因此，在本发明的一个实施方案中，优选地在PSC再次形成聚集体之后，将培养基更换为基本上不含ROCKi的培养基。因此，本发明的方法可进一步包括步骤(v)：将所述培养基更换为基本上不含ROCKi的培养基。在悬浮培养物中再次形成PSC聚集体可能需要长达3天的时间。因此，优选地，在本发明方法的稀释步骤(iii)之后使用的培养基包含ROCKi达约1至约3天，优选2天。换言之，本发明方法的步骤(iv)进行约1至3天，优选地进行约2天。在本发明方法的步骤(iii)，即在细胞解离剂的稀释约1至3天，优选地约2天之后可开始将培养基更换为基本不含ROCKi的培养基。

在本发明的一个实施方案中，在步骤(iii)中过量体积的培养基的加入导致培养基中的细胞数为约1×10⁵至约1×10⁶个细胞/ml、约1.5至约7.5×10⁵个细胞/ml、约2×10⁵至约5×10⁵个细胞/ml、约2×10⁵至约3×10⁵个细胞/ml或约2.5×10⁵个细胞/ml。

将在生物反应器中悬浮培养的PSC在培养基中培养。允许PSC扩增的培养基是本领域技术人员已知的，包括、但不限于IPS-Brew、iPS-Brew XF、E8、StemFlex、mTeSR1、PluriSTEM、StemMACS、TeSRTM2、Corning NutriStem hPSC XF培养基、Essential 8培养基(ThermoFisher Scientific)、StemFit Basic02(Ajinomoto Co.Inc)，仅举几例。在一个说明性的实施例中，培养基为IPS-Brew，其可从德国Miltenyi Biotec以GMP等级获得。在本发明方法的步骤(i)的添加ROCKi之前在其中培养细胞的培养基可以与本发明方法的步骤(iii)中用于稀释细胞解离剂的培养基相同。因此，本发明方法的步骤(i)和(iii)中的培养基可以基本上相同。步骤(iv)和(v)中使用的培养基也可与本发明方法的步骤(i)和(iii)中使用的培养基相同。

在本发明的方法中，可以使用灌注连续更换培养基。灌注的特征在于用新鲜培养基连续替换来自反应器的培养基，同时通过特定系统将细胞保留在容器中(还参见综述文章Kropp等，“Progress and challenges in large-scale expansion of humanpluripotent stem cells”Process Biochemistry,Vol.59,Part B,2017年8月,244-254页)。灌注是能够实现最高的细胞密度和生产率的生物制药生产过程的操作模式。除了不断地向灌注中的细胞提供新鲜营养物和生长因子的优点之外，还将潜在的有毒废物洗出，从而确保反应器中更均质的条件。此外，与重复的分批程序相比，灌注程序支持程序自动化和改进的培养环境的反馈控制，包括DO、pH和营养物浓度。灌注培养可以实现相对稳定的生理环境，其还支持PSC通过其内源因子分泌的自我调节能力，并由此最终减少昂贵培养基组分的补充。因此，在步骤(iv)中，可以通过灌注连续更换培养基。在步骤(v)中，可以通过灌注连续更换培养基。在步骤(iv)和(v)中，可以通过灌注连续更换培养基。可以将通过灌注的采用基本上不含ROCKi的培养基的连续培养基更换用在步骤(iv)中，以将培养基更换为基本上不含ROCKi的培养基。因此，在一个实施方案中，本发明方法的步骤(iv)包括：在允许PSC扩增的合适条件下培养步骤(iii)中获得的混合物，其中通过灌注用基本上不含ROCKi的培养基更换所述培养基。

确定条件是否适合PSC扩增的另一条件包括温度。因此，其中培养基的温度为约30至50℃、约35至40℃、约36至38℃或约37℃，优选37℃。

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需要指出的是，除非上下文另有明确指示，本文所用的单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述/该(the)”包括所提及的复数。因此，例如，提及的“一种试剂”包括一种或多种这样不同的试剂，和提及的“所述/该方法”包括提及的本领域普通技术人员已知的可修饰或置换本文所述的方法的等效步骤和方法。

除非另有说明，一系列元素之前的术语“至少”将被理解为是指该系列中的每一元素。本领域技术人员将认识到或使用常规实验即能够确定本文所述的方法和用途的具体实施方案的许多等价方案。本发明旨在涵盖这样的等价方案。

无论在本文中何处使用，术语“和/或”均包括“和”、“或”以及“由所述术语连接的元素的全部或任何其它组合”的含义。

术语“小于”或“大于”不包括具体的数字。

例如，小于20意指小于所指示的数字。类似地，大于或高于意指大于或大于指示的数字，如大于80％意指大于或高于所指示的数字80％。

本说明书及随后的权利要求中，除非上下文另有要求，词语“包括/包含(comprise)”以及变形词语诸如“包括/包含(comprises)”和“包括/包含(comprising)”将被理解为意指包括陈述的整数或步骤、或整数或步骤的集合，但并不排除任何其它的整数或步骤、或整数或步骤的集合。当本文使用时，术语“包括/包含(comprising)”能够以术语“含有(containing)”或“包括(including)”替代，或有时在本文中使用时，以术语“具有(having)”替代。当本文使用时，“由…组成”排除了未在声称的元素中规定的任何元素、步骤或整数。

术语“包括(including)”意指“包括但不限于”。“包括(including)”和“包括但不限于”可互换使用。

本文所用术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的20％内，优选15％内，优选10％内，和更优选5％内。其还包括具体的数字，即“约20”包括数字20。

应该理解的是，本发明并不限于本文所述的具体的方法学、方案、材料、试剂和物质等，因为这些能够改变。本文所用的专有名词只用于描述特定实施方案的目的，其并不意在限定本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。

本说明书文本全文所引用的所有出版物和专利(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书等)，无论在前还是在后，其通过引用全文并入本文。本文不能被解释为承认由于在先发明本发明不早于这样的公开物。在通过引入并入的材料与本说明书矛盾或不一致的程度上，本说明书将优先于任何这样的材料。

本文引用的所有文献和专利文献的内容均通过引用全文并入。

实验实施例

从以下仅用于说明目的实验实施例中，对本发明及其优点的更好理解将是显而易见的。这些实施例不旨在以任何方式限制本发明的范围。

材料和方法

除非另有说明，否则在实施例中使用以下材料和方法。

一般培养

13ml，传代0每个容器具有2.5×10⁵个细胞/ml；在所有其它传代中每个容器具有5×10⁵个细胞/ml。

培养基更换：每天62％更换

细胞：TC1133，NINDS

培养条件：37℃，pH 7.4，dO 23.8％，300rpm向下搅拌(downstirr)。

细胞的传代

1、在解离前两小时以10μM的终浓度的Y27632处理iPSC聚集体。

2、用Versene洗涤两次：停止搅拌两分钟，移除培养基至2mL而不扰动沉降的聚集体，加入Versene至10mL，开始搅拌(300rpm，向下)10秒。

3、以与洗涤步骤中所述相同的方式移除培养基至2mL，并加入Versene至5mL。

4、以600rpm搅拌多达15分钟，直至充分解离。进行中必须用显微镜观察对照以评估正确的解离程度。

5、将搅拌降低至300rpm。

6、细胞计数。

7、将一定体积的细胞悬浮液转移至新鲜的ambr15容器中以得到2-5×10⁵个细胞/mL的接种浓度，从而通过加入过量体积(至少5倍)的iPS-Brew来稀释细胞解离试剂。

材料

·ambr15细胞培养24一次性生物反应器，低温，无喷射，零件号：001-2B81

·StemMACS iPS-Brew XF，基础培养基，订单号：130-107-086

·StemMACS^TMiPS-Brew XF 50x补充剂；订单号：130-107-087

·ROCKi Y27632；Stemolecule

·Versene溶液，目录号：15040-033

·Ambr15生物反应器，Sartorius Stedim

·Nucleocounter NC-200型号900-0201

·Cellavista细胞成像仪

·流式细胞仪：BD LSR II Special Order系统

实施例1：在悬浮培养中iPSC维持其多能性达至少8次传代和至少43天

本实施例的目的是建立8代的长期培养。由此，评价长期悬浮培养对iPSC质量的影响。此外，在iPSC悬浮传代期间，测试了使用替代ROCK抑制剂Thiazovivin并将其与Y27632比较。

结果

聚集体尺寸

除了传代0，所有传代在结束时聚集体均形成约200μm的尺寸(参见图2)。ROCKi和TZV处理的聚集体的尺寸是相当的。

细胞数目和扩增率

用TZV传代的iPSC的扩增率与ROCKi处理的细胞的扩增率相当(参见图3)。在传代0中扩增率最高，细胞数增加约14倍。在传代1-5中，扩增率为约7倍，在传代6-8中，扩增率为约8倍。

所计算的ROCKi处理的iPSC在整个培养时间内的累积扩增率证明了指数生长(参见图4)。43天后达到9.6×10⁶的累积倍数增加。

多能性

在ROCKi处理的iPSC中，在每次所分析的传代结束时多能性相关基因(OCT4、TRA-1-60)的表达均很高(参见图5)。在TZV处理的iPSC中，在传代0、2和3结束时，多能性相关基因的表达也很高(参见图6)。

分析

使用本文所述的培养/传代策略培养iPSC达43天并使其自动传代8次。在传代期间没有发现ROCKi-和TZV-处理之间的相关差异。在整个运行期间iPSC均保持良好的质量：在传代结束时的聚集体尺寸为约200μm。每次传代的扩增率为约7-8倍，并且43天后累积的倍数增加为约1×10⁷。重要的是，即使在传代8中，多能性相关基因的表达仍然很高。

小结

悬浮液中iPSC的长期培养可以令人惊讶且成功地进行43天和8次传代。直到传代8均显示出高质量的iPSC。最重要的，令人惊讶的是，无需在细胞聚集体解离后洗涤iPSC/移除细胞解离试剂来维持长时间期限(在此为8次传代和43天)的高质量的悬浮培养。

实施例2：在悬浮培养中iPSC维持其多能性达至少10次传代和至少49天

与实施例1类似地进行实施例2，但基于本发明的创造性传代/细胞解离方法的悬浮培养延长至10次传代和49天。

结果

细胞数目和扩增率

所计算的在整个培养时间内的累积扩增率证明了iPSC的指数生长(参见图7)。49天后达到2.9×10⁷的累积倍数增加。

多能性

在每次所分析的传代结束时，多能性相关基因的表达均很高(参见图8)。

分析

使用本文所述的培养策略培养iPSC 49天并使其自动传代10次。在整个运行期间iPSC均保持良好的质量：在持续4-5天的传代结束时聚集体尺寸为约所需的200μm。扩增率为约8倍，累积的倍数增加为2.9×10⁷。重要的是，即使在第10代时，多能性相关基因的表达仍然很高(＞95％)，因此，这些结果证实了该培养策略。

小结

首次在Ambr15中对悬浮液中iPSC进行达49天和10次传代的长期培养。直到传代10仍维持了高质量的iPSC。

实施例3：采用本发明的方法传代的iPSC的形态分析

与实施例1和2类似地进行实施例3。在第0天，将贴壁细胞培养转变为悬浮培养。在第4天，解离细胞聚集体。在第0天(仍为贴壁培养)、第1、2、3和4天(细胞解离之前和之后)取样。图9示出了这些包含iPSC的样品的光学显微镜图像。细胞显示正常的形态，表明在稀释的解离试剂中的连续培养对细胞的形态没有任何负面影响。

实施例4：ROCKi预处理的影响

本实施例的目的是分析ROCKi预处理对悬浮液中iPSC传代的影响。除了将ROCKi预处理进行4小时外，与实施例1-3类似地进行实施例4。

结果

聚集体尺寸

如图10所示，在传代当天(传代0的第4天)，待用ROCKi预处理的iPSC与无预处理的待传代的iPSC在聚集体尺寸方面相当(197.41±75μm，相比于200.39±64.05μm)。在传代后的第3天，用ROCKi预处理的聚集体比无ROCKi预处理的聚集体更大(162.06±53μm，相比于113.8±49.36μm)。

扩增率

如图11所示，在传代当天(传代0的第4天)，待用ROCKi预处理的iPSC与无预处理的待传代的iPSC在扩增率方面是相当的(12.34倍增加，相比于13.33倍增加)。在传代后的第3天，用ROCKi预处理的iPSC比无ROCKi预处理的聚集体具有更高的扩增率(3.14倍增加，相比于1.71倍增加)。在传代后的第5天发现相同的结果(与无预处理的5.08倍增加相比，采用ROCKi预处理具有9.2倍增加)。

多能性

如图12所示，在传代当天(传代0的第4天)，待用ROCKi预处理的iPSC与无预处理的待传代的iPSC在多能性相关标志物的表达方面是相当的(97.8％OCT4、96.9％NANOG、99.3％TRA-1-60，相比于98.4％OCT4、97％NANOG、99.2％TRA-1-60)。在传代后的第3天，用ROCKi预处理的iPSC比无ROCKi预处理的聚集体具有更高的NANOG表达，和相当的OCT4和TRA-1-60表达(在ROCKi预处理的iPSC中为95.9％OCT4、93.6％NANOG、99.1％TRA-1-60，相比于无预处理的95.4％OCT4、61.7％NANOG、95.2％TRA-1-60)。在传代后的第5天，多能性相关标志物的表达在两种条件之间是相当的(在ROCKi预处理的iPSC中为94.4％OCT4、81.8％NANOG、98.7％TRA-1-60，相比于无预处理的95.2％OCT4、92.4％NANOG、98.9％TRA-1-60)。

分析

在iPSC聚集体传代前用ROCKi预处理导致较大的聚集体尺寸以及随后传代中的较高的扩增率。此外，在随后传代的早期时间点，ROCKi预处理的细胞中的NANOG的表达较高，这表明对iPSC的多能性状态的有益效果。总之，结果表明传代前的ROCKi预处理增强了悬浮培养期间的iPSC扩增和质量。

实施例5：本发明方法的放大

实验设计和实验进展：

传代0：

细胞：TC1133 TL004，p4

接种条件：450ml，2.5×10⁵个细胞/ml。

培养基更换：从d2开始，灌注60％。

培养条件：37℃，pH 7.4，dO 23.8％，45°叶片(blade)角，120rpm向下搅拌(第0-1天)和100rpm向下搅拌(d 1-4)。

传代1-3

接种条件：320ml，2.5×10⁵个细胞/ml。

培养基更换：从d2开始，靶向灌注60％。

培养条件：37℃，pH 7.4，dO 23.8％，45°叶片角，120rpm向下搅拌(第0-1天)和100rpm向下搅拌(d 1-传代结束)。

传代程序：

·在传代前2小时，用ROCKi(10μM终浓度)处理iPSC。

·通过让聚集体沉降到容器底部(搅拌停止2-5分钟)，用0.5mM EDTA洗涤聚集体两次，将培养基抽吸至50mL并加入200mL EDTA溶液。

·使聚集体沉降到容器底部，并如洗涤步骤中所述将EDTA溶液抽吸至50mL。加入100mL EDTA溶液，通过以200rpm搅拌聚集体达15分钟而使其解离。

·当达到合适的解离度(仍然保留约20个细胞的小细胞团)时，将搅拌降低至50rpm并计数细胞。

·将容器中的细胞悬浮液减少至产生所需细胞浓度所必需的体积。加入必需体积的iPS-brew+10μM ROCKi以得到所需的细胞浓度。如上所述计数和培养细胞。

材料

试剂和材料：

·StemMACS iPS-Brew XF，基础培养基，订单号：130-107-086

·StemMACS iPS-Brew XF 50x补充剂；订单号：130-107-087

·ROCKi：Y27632二盐酸化物；TocrisCat#1254

·UltraPure 0.5M EDTA,pH 8.0；Cat#15575020

装置

·Biostat B–DCU II：型号：BB-8841212

·Tower 3：型号：BB-8840152

pH传感器：Hamilton；Easyferm Plus VP 120

氧传感器：Hamilton；Oxyferm FDA VP 120

UniVessel 0.5L

·pH计：Multi 3510IDS；Xylem Analytics Germany GmbH

·pH-电极(Elektrode)：SenTix Micro 900P；WTW

·Nucleocounter NC-200型号900-0201

·Cellavista

·流式细胞仪：CytoFlex；Beckman Coulter

结果

这里，在UniVessel中进行18天的培养，并频繁取样。iPSC传代三次。在所有传代中均观察到具有良好形态的聚集体(图13)。

在传代0的第1天，聚集体大，具有～120μm(图14)。在传代0的第4天，聚集体达到～185μm的尺寸。在传代1至3中，聚集体从第1天的～100μm增加到第4或5天的～200μm(p1和2)或180μm(p3)，这与在ambr15系统中得到的数据非常一致。

在传代0中培养4天后的扩增率非常好，并且超过期望的10倍增加(图15)。传代1和2的扩增率为约6倍。在传代3中，扩增率为约9倍。这些发现与在ambr15系统中的长期培养实验一致，即与传代0和更晚的传代相比，其在传代1和2中也显示较低的扩增率。

在接种体中，多能性相关基因的表达很高。在悬浮培养中，在所有传代结束时，在iPSC中多能性相关标志物的表达很高(图16)。有趣的是，从接种体到传代3观察到OCT4表达的轻微增加。

在该实施例中，将iPSC在0.5L UniVessel中扩增18天，同时保持高培养质量。在UniVessel中在无需手动处理的情况下iPSC成功传代三次。扩增率良好，其中在传代0和4中观察到约10倍增加。在第1天聚集体尺寸为约100μm，在所有代结束时聚集体尺寸均达到约200μm的期望尺寸。重要的是，在所有传代结束时，多能性相关基因的表达均很高。结果表明在ambr15系统中开发的扩增策略成功地适用于UniVessel系统。

在该实验中，iPSC扩增策略成功地适用于UniVessel系统，即，在没有进一步修改的情况下，放大是可能的。在具有比ambr15系统更大体积的UniVessel系统中使高质量的iPSC成功传代了三次并将其培养了18天。

在2L培养系统中也获得了类似的结果，这进一步证明本发明的扩增方法非常适合于扩大和大规模PSC生产。

参考文献

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Kropp等,“Progress and challenges in large-scale expansion of humanpluripotent stem cells”Process Biochemistry,Vol.59,Part B,August 2017,Pages244-254.

Claims

1.一种在生物反应器中以悬浮培养扩增多能干细胞(PSC)的方法，所述方法包括

(ii)加入细胞解离剂，从而解离所述多能干细胞的聚集体；

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞解离剂为螯合剂，优选地所述螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(β-氨基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、聚天冬氨酸、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、柠檬酸盐、柠檬酸、1,2-双(邻-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)和它们的组合。

3.根据权利要求2所述的方法，其中细胞解离剂为EDTA。

4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(ii)中EDTA的终浓度为至少100μM EDTA，在约100至约1000μM EDTA的范围内，在约250至约750μM EDTA的范围内，在约400至约600μMEDTA的范围内，或为约500μM EDTA，优选地为约500μM EDTA。

5.根据权利要求3或4中任一项所述的方法，其中在加入过量体积的培养基后，步骤(iii)中EDTA的浓度为约100μM或更低、约95μM或更低、约90μM或更低、约80μM或更低、约70μM或更低、在约100至约1μM EDTA的范围内或在约90至约1μM EDTA的范围内。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过量体积超过所述细胞解离剂的体积至少5倍。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，(iii)中的所述培养基包含ROCKi。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：

(v)将所述培养基更换为基本上不含ROCKi的培养基。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(iv)进行约1至约3天，优选地进行约2天。

10.根据权利要求8所述的方法，其中步骤(v)在步骤(iii)之后约1至约3天，优选地约2天开始。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ROCKi选自AS1892802、盐酸法舒地尔、GSK 269962、GSK 429286、H 1152、HA 1100、OXA 06、RKI 1447、SB 772077B、SR 3677、TC-S 7001、thiazovivin、Y27632和它们的组合。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ROCKi为Y27632。

13.根据权利要求12所述的方法，其中将Y27632添加至约10μM的终浓度。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)之前约2至约4小时向步骤(i)中加入所述ROCKi。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(iii)中过量体积的培养基的加入导致培养基中的细胞数为约1×10⁵至约1×10⁶个细胞/ml、约1.5至约7.5×10⁵个细胞/ml、约2×10⁵至约5×10⁵个细胞/ml、约2×10⁵至约3×10⁵个细胞/ml或约2.5×10⁵个细胞/ml。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基选自IPS-Brew、E8、StemFlex、mTeSR1和PluriSTEM。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述培养基为iPSC-Brew。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(i)和(iii)中的培养基基本上相同。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基的温度为约30℃至50℃、约35℃至40℃、约36℃至38℃或约37℃，优选地为37℃。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将步骤(i)至(iv)或(i)至(v)重复1次、2次、3次、4次、5次、至少5次或至少10次。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞选自诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)、孤雌生殖干细胞(pPSC)和核转移衍生的PSC(ntPSC)。

22.根据权利要求20所述的方法，其中在步骤(i)至(iv)或(v)的每次重复后，所述PSC均维持其多能性。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞为TC-1133细胞。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(ii)中的所述聚集体具有约180μm至约250μm，优选地约200μm至约250μm，最优选地约200μm的平均直径。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中使所述聚集体解离至少约1min、至少约2min、至少约3min、至少约5min、至少约10min、1至20min、约10至约20min、约10至约15min或长达约15min，优选地约15min。