JP7092309B2 - 単一細胞ヒト多能性幹細胞の継代及び採取用配合物 - Google Patents

Description

[0001]本発明の分野は、細胞及び分子生物学並びに幹細胞に関する。具体的には、本開示は、単一細胞の幹細胞（例えばヒト多能性幹細胞）を採取及び継代するための配合物に関し、前記配合物は、（ｉ）１ｍＭ～約３０ｍＭのクエン酸ナトリウムと、（ｉｉ）１０ｍＭ～１７０ｍＭのＫＣｌ又はＮａＣｌを含む塩と、（ｉｉｉ）Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋不含ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）とを含み、前記配合物は、約１００ｍＯｓｍｏｌ／リットル～約３５０ｍＯｓｍｏｌ／リットルのモル浸透圧濃度を有する。

[0002]ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などのヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、複数のタイプの体細胞に分化する能力を維持しつつ、培養により無制限に増殖することができる。これらの細胞は、細胞療法及び再生医療において無制限な細胞給源となるため、高く評価されている。最近の臨床試験のＦＤＡ承認により示されるように、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）ベースの細胞療法は、実験台から診療所へとレベルが進歩している。しかしながら、現在利用可能な従来の組織培養フラスコ及びＴ型フラスコベースの培養プラットフォームでは、ｈＰＳＣ製造のスケールアップの可能性が著しく制限される。細胞療法及び再生医療におけるｈＰＳＣの可能性を開拓するため、スケールアップ可能なｈＰＳＣ製造工程を開発しなければならない。既存のフラスコベースのプロセスのスケールアップは、現在のｈＰＳＣ研究を臨床応用へと転換するための重要な足がかりとなる。最大の課題の１つは、大規模スケールの３次元懸濁培養のためのスケールアップ可能な継代方法又は、高い収率、多能性の表現型及び核型の安定性を維持する多層ベッセルを確立することである。

[0003]ヒトＰＳＣ細胞は、継代の間に個別化し、すなわち塊で存在するよりも単一細胞となることができ、そのため、均一な分布及びイメージングのための均一な処理、細胞のソーティング、及び／又は懸濁培養における同種の細胞による集塊形成が可能となる。細胞の回収率及び菌体数、並びに生存率は、これらのプロセスの成否にとり極めて重大でありうる。各種の配合物（例えば酵素的分離方法）が、単一細胞の継代を行う際の細胞生存率を最大化するために開発されてきた。しかしながら、ｈＰＳＣは、これらの細胞が処理に対する感受性が高く、細胞死を生じさせる傾向があるため、個別化した（すなわち単一細胞となった）後生存性が悪化し、このことが、汎用的な単離方法の開発を特に困難にしている。最も重要なことに、既存の単一細胞への分離法（例えば酵素的分離）の幾つかは、処理の間、細胞表面から重要な細胞接着及び細胞間相互作用メディエーターが切断されるため細胞の特徴又は細胞の遺伝的安定性に影響を与えることが公知である。培養条件の質もまた、ｈＰＳＣの維持及び増殖にとり重要である。フィーダー細胞又は動物産物に関連する培地成分は、細胞培養のコンシステンシーにしばしば大きな影響を及ぼし、それは更に、トランスレーショナルリサーチにおいて細胞が有用性を発揮しうる際に、問題となりうる。

[0004]塊を継代する従来の手法と同様、単一細胞ｈＰＳＣの継代は、しばしば細胞の生存性及び／又は感受性に基づき選択される。伝統的に、ｈＰＳＣは通常、フィーダー細胞上での培養に使用されるコラゲナーゼ（Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８２：１１４５～１１４７（１９９８）；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ＢＥら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３９９～４０４（２０００））、フィーダー不含細胞上での培養に使用されるディスパーゼ（Ｌｕｄｗｉｇ ＴＥら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．３：６３７～６４６（２００６））による酵素的に分離された集塊として継代される。例えばセルスクレーパー及び他の継代ツールなどを用いた機械的方法もまた、集塊として細胞を分離するために開発されている。これらのプロセスは労働集約的であり、接着細胞を商業的規模で生産する際に広く使用されるプラットフォームである多層細胞培養ベッセルでｈＰＳＣを培養する際には適用できない。多層細胞培養ベッセルで増殖する細胞は、スクレーピングを行うことはできない。更に、機械的なスクレーピングは細胞に大きなダメージを与えるおそれがある。スクレーピングを行わないことにより、細胞生存率は最大９０％上昇しうる。

[0005]分化又はトランスフェクション実験において、ＴｒｙｐＬＥ（商標）及びＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）を用いてｈＰＳＣを個別化することができるが、生存性が悪化することにより異常な核型がしばしば生じる（Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍ Ｃら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２５：１６９０～１６９６（２００７）、Ｂａｊｐａｉ Ｒら、Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ．７５：８１８～８２７（２００８）、Ｔｈｏｍｓｏｎ Ａら、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．１０：８９～１０６（２００８））。しばしば、例えばＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤などの小分子化学物質を用いて、このプロセスにおける細胞生存性を向上させる必要がある（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｋら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：６８１～６８６（２００７））。

[0006]これらの方法はいずれも、長期の、又は大規模な実験において高コストな特殊なツール又は試薬を必要とする。同時に、酵素法においては通常、コンシステンシーが、バッチ－バッチ間の酵素の質による影響を受ける。これらの方法における変動性を考慮すると、酵素を使用せず、細胞の遺伝的安定性に影響を与えることなく、多能性幹細胞の重要な特徴を維持できる、安全な、一貫した、再生可能な方法を見出すことが非常に望ましい。

[0007]最近、非酵素的な細胞脱離溶液、主にＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液によるｈＥＳＣの継代が、ｈＰＳＣの研究室により採用される例が幾つか存在し、またアカデミックな研究室から工業にその使用が広がっている。ＥＤＴＡを含有する市販の細胞分離溶液の１つが、ＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）ＥＤＴＡであり、それは０．５５ｍＭのＥＤＴＡを含有し、ｈＰＳＣの採取及び継代に使用されてきた。ＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）ＥＤＴＡによるｈＥＳＣを継代する典型的な手順は、Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋不含バッファー（例えばダルベッコのリン酸緩衝食塩水：ＤＰＢＳ）により培養物を洗浄することから始まり、続いてＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）ＥＤＴＡ中で培養物を４～９分間インキュベートする。次に、ＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）ＥＤＴＡを除去し、ピペッティングにより培養培地を細胞に手作業で当て、表面から細胞を塊として物理的に除去する。従来の酵素的処理－その後のスクレーピングに基づく方法（表１参照）と比較し、この方法の利点としては、（１）非酵素的な溶液を使用するため、酵素を除去するための脱離後洗浄又は遠心操作が必要ないこと、及び（２）スクレーピングを必要とせず、ＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）ＥＤＴＡで処理した細胞を表面から分離させた状態で洗浄できること。表１で説明するように、ＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）ＥＤＴＡで処理し、スクレープングをせずに脱離したｈＥＳＣは、脱離後の生存率が高く、継代したときに非常に迅速に新しい培養表面に再付着する（時間単位に対して分単位）。

[0008]しかしながら、多層ベッセルにおけるｈＥＳＣの増殖に適用しようとするとき、ＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）ＥＤＴＡ継代／採取方法は理想的ではない。ＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）ＥＤＴＡは、細胞－表面結合を破壊するよりも迅速に、細胞－細胞会合を破壊するようである。ＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）ＥＤＴＡの除去の後、６ウェルプレート又はＴ型フラスコ培養フォーマットでは、手動ピペッティングで培養培地を当てることにより生じる流体剪断力は、細胞を表面から剥離するために必要である。しかしながら、多層ベッセル内でのｈＥＳＣ培養では、ピペットをベッセル内に挿入できないため、培養培地による手動剪断はできない。その代わり、この培養フォーマットでは、ＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）ＥＤＴＡを培養培地で置換した後、激しくタッピングして細胞を剥離する操作が適用される。ＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）ＥＤＴＡを培養培地で置換した直後に機械的力（タッピング）を与えるのは、ＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）ＥＤＴＡ処理したｈＥＳＣが培養培地と接触した際、表面と迅速に再付着するからである。実際のところ、現在の技術水準では、多層細胞工場における全ての培養物の４０～７０％を採取できるに留まっており、これらの非常に高価な細胞の収率に劇的に影響を与えるものである。収率を上昇させる１つの候補となる手段は、ＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）ＥＤＴＡを培養培地に置換せず、代わりにＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）ＥＤＴＡの存在下で細胞を剥離することである。しかしながらこの場合、ＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）ＥＤＴＡに対する細胞の曝露時間が増加し、それにより核型の不安定なコロニーが生じるリスクが増大する。加えて、脱離後処理の更なる工程が、最終的な採取物からのＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）ＥＤＴＡの除去及び中和の後に行われ、それにより更に労働集約的となる。最後に、ＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）ＥＤＴＡ処理を用いた継代は、単一細胞としての２次元又は３次元のＰＳＣ連続継代が必要となるとき、ＰＳＣがＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）ＥＤＴＡへの曝露により細胞集塊又はコロニーに留まるため、現実的なオプションでない。

[0009]各種の刊行物を引用するが、それらの全開示内容を、参照により本明細書に組み込む。

[0010]本開示は、ヒト幹細胞（例えば多能性幹細胞）の採取及び継代用配合物、並びにかかる配合物の使用に関する。幾つかの実施形態では、本開示は、単一細胞の幹細胞（例えばヒト多能性幹細胞）の採取及び継代のための配合物に関し、該配合物は、（ｉ）１ｍＭ～約３０ｍＭのクエン酸ナトリウムと、（ｉｉ）１０ｍＭ～１７０ｍＭのＫＣｌ又はＮａＣｌを含む塩と、（ｉｉｉ）Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋不含ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）とを含み、前記配合物は、約１００ｍＯｓｍｏｌ／リットル～約３５０ｍＯｓｍｏｌ／リットルのモル浸透圧濃度を有する。

[0011]幾つかの実施形態では、配合物のモル浸透圧濃度は、約２００ｍＯｓｍｏｌ／リットル～約３００ｍＯｓｍｏｌ／リットルである。幾つかの実施形態では、配合物のモル浸透圧濃度は、約２５０ｍＯｓｍｏｌ／リットル～３００ｍＯｓｍｏｌ／リットルである。

[0012]幾つかの実施形態では、クエン酸ナトリウムは、約５ｍＭｏｌ／リットル～約１５ｍＭｏｌ／リットルの濃度である。

[0013]幾つかの実施形態では、塩はＫＣｌである。幾つかの実施形態では、ＫＣｌは、約４０ｍＭｏｌ／リットル～約１５０ｍＭｏｌ／リットルの濃度である。幾つかの実施形態では、ＫＣｌは、約８０ｍＭｏｌ／リットル～約１２０ｍＭｏｌ／リットルの濃度である。

[0014]幾つかの実施形態では、配合物のｐＨは約７～約８である。幾つかの実施形態では、配合物のｐＨは約７．４及び７．８である。幾つかの実施形態では、配合物は実質的に酵素不含である。

[0015]幾つかの実施形態では、配合物は、ヒト幹細胞（例えばヒト多能性幹細胞）を更に含む。幾つかの実施形態では、ヒト多能性幹細胞は、胚性幹細胞、体性幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、ヒト幹細胞は、人工多能性幹細胞である。幾つかの実施形態では、ヒト幹細胞は、表皮性幹細胞、血液幹細胞、血液幹細胞、上皮幹細胞、心臓幹細胞及び神経幹細胞からなる群から選択される組織特異的幹細胞である。

[0016]幾つかの実施形態では、本開示は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を採取し、その後継代するための方法に関し、該方法は、約２分～約２０分間、細胞培養プレート又はベッセルにおいて、本明細書に記載される配合物中でｈＰＳＣをインキュベートすることを含み、前記ｈＰＳＣは、約８５％及び約１００％の細胞生存率を有する単一細胞として、細胞培養プレート又はベッセルから脱離する。幾つかの実施形態では、細胞培養プレート又はベッセルは、ペトリ皿、マルチウェル細胞培養プレート、積層型細胞培養装置、細胞培養工場又はコニカルチューブからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、ｈＰＳＣは、バイオリアクター、３次元懸濁培養ベッセル又はコニカルチューブ内でインキュベートされる。幾つかの実施形態では、前記方法は、単一細胞の下流処理を更に含み、該下流処理は、連続逆流遠心分離技術、製剤化、自動バイアル化、凍結保存及びハイスループットスクリーニング、遺伝子編集及び指向性分化からなる群から選択される。

[0017]幾つかの実施形態では、本開示は、ヒト多能性幹細胞用の単一細胞継代溶液を最適化する方法に関し、該方法は、（ｉ）複数の単一細胞継代溶液を作り出すステップであり、各単一細胞継代溶液が、少なくとも一つのＣａ^２＋キレーター及び公知のモル浸透圧濃度を含み、複数の単一細胞継代溶液中の単一細胞継代溶液が各々異なる濃度及び異なるモル浸透圧濃度を有する、前記ステップと、（ｉｉ）前記複数の単一細胞継代溶液を各々試験し、所与の処理時間で脱離する培養物のパーセンテージ、並びに各所与のＣａ^２＋キレーター濃度及びモル浸透圧濃度における単一細胞のパーセンテージを決定するステップと、（ｉｉｉ）好適な単一細胞継代溶液を複数の単一細胞継代溶液から選抜するステップとを含む。

[0018]幾つかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される方法により得られた単一細胞継代溶液に関する。

[0019]幾つかの実施形態では、本開示は、単一細胞ｈＰＳＣを採取し、その後継代するための方法に関し、該方法は、１：５～１：６０の分割比で、本明細書に記載の配合物を用いてｈＰＳＣを継代するステップを含み、分割された後、７日以内に培養物がコンフルエントに達する。

[0020]幾つかの実施形態では、本開示は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を採取し、その後継代するための方法に関し、該方法は、（ｉ）培地中にｈＰＳＣをプレーティングするステップと、（ｉｉ）培地を吸引するステップと、（ｉｉｉ）ｈＰＳＣをＤＰＢＳで洗浄するステップと、（ｉｖ）ｈＰＳＣに本明細書に記載の配合物を添加し、１分～３０分間インキュベートするステップと、（ｖ）培養培地中にｈＰＳＣを再懸濁するステップとを含む。幾つかの実施形態では、（ｉｖ）において配合物は、ｈＰＳＣを培養培地中に再懸濁する前に除去される。

[0021]幾つかの実施形態では、本開示は、３次元懸濁バイオリアクター内で細胞集塊の形で増殖したヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を採取し、その後継代するための方法に関し、該方法は、（ｉ）懸濁培養バイオリアクターを使用して培地中でｈＰＳＣを細胞集塊の形で培養するステップと、（ｉｉ）ｈＰＳＣを培地から分離し、取り出すステップと、（ｉｉｉ）ｈＰＳＣをＤＰＢＳで洗浄するステップと、（ｉｖ）本明細書に記載の配合物を添加し、穏やかに撹拌し、１分～５０分間インキュベートするステップと、（ｖ）培養培地中にｈＰＳＣを再懸濁するステップとを含む。幾つかの実施形態では、（ｉｖ）において配合物は、ｈＰＳＣを培養培地中に再懸濁する前に除去される。

インビトロでの機能性ヒト膵臓β細胞の発生を示す概略であり（Ｐａｇｌｉｕｃａら、Ｃｅｌｌ １５９：４２８～４３９（２０１４））、図中、指向性分化プロセスの後、ステージ０の多能性幹細胞から、胚体内胚葉、膵臓前駆細胞、内分泌前駆細胞及び最終的にインスリン分泌β膵島細胞へ誘導される様子を示す。 ２次元（すなわちウェルプレート又は組織培養フラスコ）において多能性幹細胞の解凍及び増殖を行うための実験手順を示す概略図であり、該手順では、異なる細胞培養系（培地、マトリックス及び継代溶液等）を使用し、次に３次元ベッセル（Ｂｉｏｔｔ Ｓｐｉｎｎｅｒ）にｈＰＳＣを継代する。 以下の培地で培養したＷＡ２７幹細胞の平面培養の結果である：（ｉ）ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ８（登録商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）＋組換え型ビトロネクチン（ｒＶＴＮ）、（ｉｉ）ＮＵＴＲＩＳＴＥＭ（登録商標）培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）＋ラミニン及びＥ－カドヘリンＬ＆Ｅ－Ｃａｄ、（ｉｉｉ）Ｌ７（商標）Ｍｅｄｉａ（Ｌｏｎｚａ）＋Ｌ７（商標）Ｍａｔｒｉｘ（Ｌｏｎｚａ）を含むＬ７（商標）Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅシステム、（ｉｖ）ｍＴｅＳＲ（商標）１培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋Ｌ７（商標）マトリックス（Ｌｏｎｚａ）、又は（ｖ）ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ８（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）＋（ｒＶＴＮ）。次に細胞を、ＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）ＥＤＴＡ溶液（Ｌｏｎｚａ）、ＴｒｙｐＬＥ（商標）溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）又は表２に記載の配合物３（「Ｌ７Ｆ３」）を使用して継代した。１日後、細胞を倍率４倍で観察した。Ｐ２４は継代２４を意味し、Ｔ－７５は組織培養フラスコＴ－７５を意味する 以下の培地で培養したＷＡ２７幹細胞の平面培養の結果である：（ｉ）ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ８（登録商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）＋組換え型ビトロネクチン（ｒＶＴＮ）、（ｉｉ）ＮＵＴＲＩＳＴＥＭ（登録商標）培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）＋ラミニン及びＥ－カドヘリン（Ｌ＆Ｅ－Ｃａｄ）、（ｉｉｉ）Ｌ７（商標）Ｍｅｄｉａ（Ｌｏｎｚａ）＋Ｌ７（商標）Ｍａｔｒｉｘ（Ｌｏｎｚａ）を含むＬ７（商標）Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅシステム、（ｉｖ）ｍＴｅＳＲ（商標）１培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋Ｌ７（商標）マトリックス（Ｌｏｎｚａ）、又は（ｖ）ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ８（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）＋ｒＶＴＮ。次に細胞を、ＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）ＥＤＴＡ溶液（Ｌｏｎｚａ）、ＴｒｙｐＬＥ（商標）溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）又は本明細書に記載の配合物３（「Ｌ７Ｆ３」）を使用して継代した。３日後、細胞を倍率４倍で観察した。 （ｉ）ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ８（登録商標）＋ｒＶＴＮマトリックス、及びＴｒｙｐＬＥ（商標）により継代、又は、（ｉｉ）ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ８（登録商標）＋ｒＶＴＮマトリックス、及び配合物３（「Ｌ７Ｆ３」）により継代する、２次元組織培養フラスコ内での細胞の連続継代培養の後、Ｂｉｏｔｔ Ｓｐｉｎｎｅｒ培養の際、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ培地中に約０．６×１０^６細胞／ｍＬの濃度で播種したＨ１細胞の結果を表す。２次元培養における細胞増殖の間、Ｅ８培地を、１００、４０又は１０ｎｇ／ｍＬの塩基性フィブロブラスト成長因子（ｂＦＧＦ）と共に補充した。懸濁培養中の細胞を、配合物３（「Ｌ７Ｆ３」）を用いて連続的に継代培養した。４日後、細胞を観察した。 図５に記載する異なる細胞培養培地における２次元（組織培養フラスコ）及び３Ｄ懸濁培養（Ｂｉｏｔｔ Ｓｐｉｎｎｅｒ）における増殖の後の、Ｈ１細胞の指向性分化の結果を表す。細胞培養条件に応じて、細胞は、分化ステージ４で膵臓前駆細胞に似た細胞の形態を示す。この図は、懸濁液中で増殖し、配合物３「Ｌ７Ｆ３」を使用して継代された細胞が、特異的な細胞系列（この場合内胚葉）に分化する能力を維持していることを証明するものである。 図５に記載する異なる細胞培地における２次元（組織培養フラスコ）、３次元懸濁培養（Ｂｉｏｔｔ Ｓｐｉｎｎｅｒ）における増殖、及び次の膵臓前駆細胞への指向性分化の後の、Ｈ１細胞における各種転写因子（Ｏｃｔ－４、Ｓｏｘ－１７、ＰＤＸ－１及びＮＫＸ６．１）の発現に関するフローサイトメトリー分析を表す。懸濁液において増殖させ、配合物３「Ｌ７Ｆ３」を使用して継代した細胞は、高いレベルで膵臓前駆細胞に分化する能力を維持し、多能性幹細胞マーカーＯｃｔ４及び初期内胚葉マーカーＳＯＸ－１７の非存在下で、ＰＤＸ－１及びＮＫＸ６．１を二重に陽性発現する高いレベルを示す。ＰＤＸ－１及びＮＫＸ６．１の発現は、ここにおいても、懸濁液において増殖し、配合物３「Ｌ７Ｆ３」を使用して継代した細胞が、特異的な細胞系列に分化する能力を維持することを確認するものである。 撹拌を用い、手動ピペッティングをせずに、配合物３（「Ｌ７Ｆ３」）を含む３次元培養（Ｂｉｏｔｔ Ｓｐｉｎｎｅｒ）において単一細胞の懸濁培養物に分離した多能性幹細胞集塊の画像を表す。懸濁培養液中に０．６×１０^６細胞／ｍＬで最初に細胞を播種、細胞集塊の形態に増殖させた。細胞培養培地を除去した後、細胞集塊を異なるインキュベート時間（２０分、３０分及び４０分）の間Ｌ７Ｆ３継代溶液に曝露し、その際６０ｒｐｍで撹拌して懸濁液の状態を維持させた。

[0030]細胞を細胞培養ベッセルから剥離するための酵素及び／又はスクレーピングを用いずに、例えばヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）などのヒト幹細胞（ｈＳＣ）の単一細胞での継代を行うための配合物及び方法を開示する。該配合物及び方法は、ウェルプレート又は組織培養フラスコなどの各種の細胞培養ベッセルの表面並びに３次元細胞培養ベッセルにおいて増殖させたｈＰＳＣから、単一細胞として細胞を採取することを可能にする。更に、該配合物及び方法は、採取される細胞を高収率で次の継代に供し、また採取後の細胞生存率を高める。本明細書に記載される該配合物及び方法により継代される多能性幹細胞は、未分化なままで、典型的な幹細胞マーカーを発現する一方で、同時に、多数回の採取及び継代の後でさえ、それらの分化能を維持し、全部で３つの胚葉中の細胞に分化でき、テラトーマに発生しうる。長期間該配合物により継代した後、これらのｈＰＳＣはまた通常の核型を維持する。

[0031]請求項及び／又は明細書において、「含む」という用語と連動して使用される語「ａ」又は「ａｎ」の使用は、「一つ」を意味する場合もあるが、「一つ以上」、「少なくとも一つ」及び「一つ又はそれ以上」の意味を有しうる。

[0032]本願全体にわたり、用語「約」は、ある値がその値の測定に使用される方法／装置に固有の誤差範囲又は試験対象に存在する変動を含むことを示すために用いる。典型的には、該用語は、状況に応じ約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％若しくは２０％、又はそれ未満の変動を含むことを意味する。

[0033]請求項における用語「又は」の使用は、代替物に過ぎないか、又は代替物が相互に排他的であるか、を特に明記しない限り、「及び／又は」を意味するように使用されるが、本開示では、それが代替物に過ぎず、「及び／又は」を意味するという定義がサポートされている。

[0034]本明細書及び請求項において用いられる語「含む（comprising）」（また「comprise」及び「comprises」等のあらゆる変化形）、「有する（having）」（また「have」及び「has」等のあらゆる変化形）、「含む（including）」（また「includes」及び「include」等のあらゆる変化形）、又は「含む（containing）」（また「contains」及び「contain」等のあらゆる変化形）は、包括的又はオープンエンドであり、更なる、明記されない要素又は方法ステップを排除するものではない。本明細書で述べるいかなる実施形態も、本発明のいかなる方法、システム、宿主細胞、発現ベクター及び／又は組成物に関して実施できると考えられる。更に、本発明の組成物、システム、宿主細胞及び／又はベクターは、本発明の方法及びタンパク質を実現するために用いることができる。

[0035]用語「例えば」及びその対応する省略形「e.g.」（イタリック体か否かを問わない）の使用は、記載される具体的な用語が、本発明の代表的な例及び実施形態であり、明確に断りのない限り、参照又は引用されるそれらの具体例に限定されることを目的としないことを意味する。

[0036]本発明は、２次元組織培養ベッセル及び３次元懸濁培養から多能性幹細胞を、高い収率及び継代後の高い細胞生存率を有する単一細胞として採取し、その後継代するための非酵素的な継代用配合物及び方法を提供する。本開示の配合物は、スケールアップ可能な高い収率の継代及び採取用配合物、並びに当技術分野で公知の方法の欠点を解消し、又は減少させたｈＰＳＣのための方法を提供する。

[0037]本開示は、ヒト多能性幹細胞の採取及び継代用配合物、並びにかかる配合物の使用に関する。幾つかの実施形態では、本開示は、単一細胞ヒト多能性幹細胞を採取及び継代するための配合物に関し、該配合物は、（ｉ）１ｍＭ～約３０ｍＭのクエン酸ナトリウムと、（ｉｉ）１０ｍＭ～１７０ｍＭのＫＣｌ又はＮａＣｌを含む塩と、（ｉｉｉ）Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋不含ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）とを含み、前記配合物は、約１００ｍＯｓｍｏｌ／リットル～約３５０ｍＯｓｍｏｌ／リットルのモル浸透圧濃度を有する。

[0038]用語「幹細胞」は、少なくともその組織において、それらの系統の全ての細胞型に分化する能力を有する細胞を意味する。幹細胞は、それらを他のタイプの細胞と区別する２つの重要な特徴を有しうる。第１に、それらは細胞分裂を通じて長期間それ自身を複製する未分化細胞であることである。第２に、適切な条件下で、それらは特別な機能を有する細胞になるように誘導することができ、このことから分化したと考えることができることである。本明細書中で使用する「ヒト幹細胞」という用語は、自己複製でき、少なくとも一つの細胞型に分化できるヒト細胞を意味する。用語「ヒト幹細胞」には、ヒト幹細胞株、ヒト多能性細胞（ヒトの及びヒト由来の、人工多能性幹細胞及び胚性幹細胞を含む）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成人幹細胞が含まれる。「多能性幹細胞」には、３つの胚葉全て（すなわち内胚葉、中胚葉及び外胚葉）を生じさせることができる幹細胞が含まれうる。本明細書における用語「成人幹細胞」は、胚発生が終了した後の生物の組織から誘導される幹細胞、すなわち非胚性幹細胞を指し、かかる細胞は、当技術分野において「体性幹細胞」としても公知である。幾つかの実施形態では、ヒト多能性幹細胞は、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である。幾つかの実施形態では、ヒト幹細胞は、人工多能性幹細胞である。幾つかの実施形態では、ヒト幹細胞は、表皮性幹細胞、血液幹細胞、血液幹細胞、上皮幹細胞、心臓幹細胞及び神経幹細胞からなる群から選択される組織特異的幹細胞である。

[0039]幹細胞は、各種の組織から誘導することができる。例えば、幹細胞は、外胚葉（表皮、神経、神経頂上及び毛嚢）、中胚葉（心筋、骨格筋、臍帯血、間充織、造血、臍帯マトリックス及び多能性成人前駆細胞）、内胚葉（膵島及び肝オーバル）、そして、生殖（原始生殖）幹細胞に由来してもよい。幾つかの実施形態では、ヒト幹細胞はヒト間充織幹細胞である。幾つかの実施形態では、幹細胞は多能性幹細胞である。幾つかの実施形態では、幹細胞は人工多能性幹細胞である。幾つかの実施形態では、ヒト多能性幹細胞は、繊維芽細胞若しくは末梢血由来の単核細胞、又は臍帯血由来の前駆細胞、又は骨髄由来の幹若しくは前駆細胞に由来する。

[0040]幾つかの実施形態では、本開示は単一細胞のヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を継代するための配合物に関し、該細胞は、体細胞をリプログラムしてｉＰＳＣを発生させる誘導因子をヒト体細胞に接触させることにより発生させた幹細胞型である。該誘導因子には、「リプログラミング因子」（すなわち体細胞を脱分化させる因子）及び「発現可能化因子」（体細胞内でリプログラミング因子のエントリー及び／又は発現を可能にする）の少なくとも一つが含まれる。誘導因子は、遺伝子構築物又は融合タンパク質であってもよい。

[0041]誘導因子が遺伝子構築物である場合、該構築物は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ及びＮｏｔｃｈ経路分子、又はその活性断片又は誘導体から選択される一つ以上のリプログラミング因子をコードする一つ以上のヌクレオチド配列を有することができる。構築物は、複数のリプログラミング因子を、又は単一のリプログラミング因子をコードしてもよい。単一のリプログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ又はＮＡＮＯＧのうちの１つをコードすることができる。或いは、構築物は、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４及びＬＩＮ２８、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧ、又はＳＯＸ２及びＬＩＮ２８から選択される２つのリプログラミング因子を含むこともできる。構築物はまた、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、並びにＣ－ＭＹＣ及びＮｏｔｃｈ経路分子から選択される２つ以上のリプログラミング因子のいかなる組合せを更に含んでもよい。遺伝子構築物の発現可能化因子は、レンチウイルス又はエピソームベクターを基本とするものでありうる。

[0042]ヒト多能性幹細胞の培養は、標準的な哺乳動物の細胞培養プロトコルと共通する点が多い。しかしながら、未分化状態のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の連続的な培養及び維持には、細胞がそれらの鍵となる自己複製及び多能性の特徴を確実に維持するために更なる考慮が必要である。哺乳動物細胞の培養には、凍結株の解凍、培養ベッセルへの細胞のプレーティング、培地交換、採取、継代及び凍結保存などの幾つかの必須な基本技術が存在する。ヒト多能性幹細胞から機能性／特化細胞を生成させる一例として、治療的用途に使用されるヒト幹細胞の増殖及び分化の概略を、図１に見出すことができる。採取とは、幹細胞を、治療的な使用など、それらの意図された使用のために回収することを意味する。継代とは、培養ベッセルから培養中の細胞を取り出し、それらを一つ以上の新規な培養ベッセルに植え継ぐことを意味する。継代は、過密状態による有害な効果を低減させ、培養を展開させるために必要である。幾つかの実施形態では、継代は、細胞を新規なベッセルへと移す前に、ベッセルに付着した細胞を剥離することによって培養中のベッセルから除去することを含む。幾つかの実施形態では、継代は、進行中の懸濁培養（例えば３次元培養又はバイオリアクター）から、細胞培養培地を除去し、細胞集塊を継代溶液に曝露し、撹拌又は混合して、集塊を単一細胞に単離することにより、多能性幹細胞の集塊を取り出すことを含む。

[0043]異なる細胞株は、異なる増殖動態を有し、したがって、継代のための時間及び条件は、細胞株の違いにより変化する。しかしながら、ｈＰＳＣは通常、解凍後の最初の２週間は徐々に増殖し、その後急速に増殖し、やがて増殖速度がプラトーに達する。細胞を適切に培養した場合、細胞増殖速度は、多くの継代を経た後においてもプラトーに達する。幾つかの実施形態において、本発明の幹細胞の増殖を毎日観察し、培養される細胞株の増殖パターンを確立する。

[0044]幾つかの実施形態では、細胞の増殖及び質を顕微鏡観察下で評価する。幾つかの実施形態では、細胞がいつ、何度継代されたかを決定するために目視（顕微鏡観察）を用いることができる。２次元組織培養容器（例えば２次元組織培養フラスコ）において、当分野において公知のビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン又は他の細胞基質を含む一つ以上のタンパク質で予め被覆した培養ベッセルの表面に細胞を付着させる。２次元培養において、健康的な、未分化のｈＰＳＣのコロニーは通常、明確で均一な境界を有し、コロニー内の個々の細胞は類似するように見える。正確なコロニー形態は、細胞株及び培養条件（例えば使用される培養）の違いにより異なる。本明細書において用語「形態」は、ある細胞の物理的外観に関する一つ以上の特徴が、所定の細胞型又は状態とは区別されるものであるか又は同様であるかを表すために使用される。幾つかの実施形態では、懸濁培養（３次元バイオリアクター）において、細胞は互いに付着し、細胞－表面付着の非存在下で球形又は丸形の集塊を形成する。３次元培養における用語「形態」は、細胞の集塊を意味する。

[0045]ヒト多能性幹細胞は通常、個別化（すなわち単一細胞となった）後は十分に生存しないが、それは、これらの細胞が処理に対して感受性が高く、細胞死をもたらす傾向を有するからであり、それは特に、汎用的な分離方法の開発を困難にするものである。単一細胞継代を行うときと細胞生存率を最大化し、多能性幹細胞の増殖を可能にするための各種の配合物が試験されてきた。しかしながら、これらの配合物は細胞培養のコンシステンシーに影響を及ぼしうる動物産物を有することが多く、それは更に、トランスレーショナルリサーチにおいて細胞が有用性を発揮しうる際に、問題となりうる。多能性幹細胞の継代ステップにおける分離の際に使用される幾つかの方法には、コラゲナーゼ又はディスパーゼ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による酵素的分離、又は、ＴｒｙｐＬＥ（商標）及びＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）の使用（遺伝的不安定性又は異常な核型をしばしばもたらす）、セルスクレーパー及びピペットを用いた細胞分散などの機械的方法（継代後に、顕著な細胞死並びに低い生存率及び収率をしばしばもたらす）が含まれる。幾つかの実施形態では、本開示は、単一細胞ヒト多能性幹細胞を採取及び継代するための配合物に関し、該配合物は動物産物を実質的に含まない。幾つかの実施形態では、本開示は、単一細胞ヒト多能性幹細胞を採取及び継代するための配合物に関し、該配合物は酵素を実質的に含まない。幾つかの実施形態では、配合物は、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、ＴｒｙｐＬＥ（商標）及び／又はＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）を実質的に含まない。幾つかの実施形態では、本開示は、単一細胞ヒト多能性幹細胞を採取及び継代するための配合物に関し、該配合物はＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を実質的に含まない。幾つかの実施形態では、本開示は、単一細胞ヒト多能性幹細胞を採取及び継代するための配合物に関し、該配合物はＥＤＴＡを実質的に含まない。

[0046]培養条件の変化により、異なるタイプの分化細胞及び様々な増殖速度が得られる。幾つかの実施形態では、以下のいずれかが発生したときに幹細胞を継代する：（ｉ）細胞解凍後、７日、１０日、１４日、１５日、２０日又は２１日目のとき、（ｉｉ）コロニーの約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超又は約７０％超が、２０００μｍ超となったとき、（ｉｉｉ）コロニーが、約５０％超、約６０％超、約７０％超又は約８０％超のコンフルエンシーにまで高密度化したとき、（ｉｖ）懸濁培養において、細胞が、５０μｍ超、１００μｍ超、１５０μｍ超、２００μｍ超、２５０μｍ超、３００μｍ超、３５０μｍ超、４００μｍ超、４５０μｍ超、５００μｍ超の細胞の集塊を形成したとき、又は（ｖ）コロニーの分化が著しいとき。

[0047]本発明の幾つかの実施形態において、本明細書に記載される幹細胞は、継代において生存する。本明細書中で使用する「継代において生存する」という用語とは、親培養組織から本明細書に記載される配合物を使用した継代培養までの、継代を生き残る単一細胞の能力を意味する。幾つかの実施形態において、細胞の６０％超、７０％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超又は９９％超が、継代において生存し、すなわち生存したままである。

[0048]本明細書に記載されるように、単一細胞ヒト多能性幹細胞の採取及び継代を補助する配合物を見出した。本明細書に記載される配合物は、クエン酸ナトリウムを含む。用語「クエン酸ナトリウム」はクエン酸のナトリウム塩のいずれかを含むことができ、溶液中で見られる場合、一ナトリウム塩、二ナトリウム塩及び三ナトリウム塩並びにクエン酸のナトリウム及び弱酸塩が含まれる。当業者であれば、他のＩ族元素の塩（例えばリチウム及びカリウム）を使用することもでき、ナトリウム塩に対する等価物と考えられることを察知するであろう。

[0049]いかなる理論にも拘束されないが、二価のカチオンが細胞－表面及び細胞－細胞結合に必要とされるところ、クエン酸ナトリウムはＣａ^２＋をキレート化／回収することにより、細胞－表面結合及び細胞－細胞会合を破壊することができる。本明細書に記載されるクエン酸ナトリウムベースの配合物及び方法を設計し、開発することにより、ルーチン、又はｈＰＳＣのスケールアップ培養及び製造工程における固有の課題に対処する。ｈＰＳＣは通常、複数の細胞の塊／集塊として継代される。しかしながら、幾つかの実施形態では、単一細胞としてのｈＰＳＣの継代では、（ｉ）均一なサイズ分布を有する（集塊が近い粒径範囲で存在する）円形の細胞集塊を多数生じさせるのに単一細胞懸濁液が極めて重大であるときに、懸濁培養細胞を連続的に継代培養すること、（ｉｉ）単一細胞集団が、フローサイトメトリー装置又は細胞ソーティング装置などの細胞分析装置による計数又は処理のしやすさのために必要とされる場合、及び／又は（ｉｉｉ）例えば多能性幹細胞の単一細胞集団による指向性分化プロセスなどの下流処理を開始すること、が含まれる。他方で、単一細胞の継代は、ｈＰＳＣの低いクローニング効率及び高い異常核型のリスクのため、しばしば回避される。本明細書に記載される配合物及び方法は、例えば生存率、収率、脱離後の塊サイズ、継代可能性及び多能性の表現型を維持する能力などの幾つかの鍵となる品質パラメータに関して単一細胞ｈＰＳＣを採取し、継代するために最適化される。本明細書に記載される配合物及び方法を、実験室におけるルーチン作業に使用することにより、ｈＰＳＣ培養組織の増殖に要する労働力及び工程時間を節約することができる。例えば、本明細書に記載される配合物及び方法は、機械的スクレーピングを少なくしつつ（又はスクレーピングを行わずに）細胞をベッセル表面から取り出すことができ、また細胞の採取では、培養物の脱離に用いた薬剤を除去するための洗浄及び遠心分離を行う必要がない。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される配合物及び方法は、スクレーピングが適用できない多層型の細胞培養ベッセルにおいて細胞を増殖させる場合の、大規模なｈＰＳＣの製造に適する。幾つかの実施形態では、多層型細胞培養ベッセルにおいて増殖するｈＰＳＣの９０％超が、９０％超の生存率で採取できる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される配合物及び方法は、スケールアップ可能な３次元懸濁培養で細胞集塊の形で増殖させ、単一細胞懸濁液に分離させる場合に、ｈＰＳＣを連続的に継代培養するのに適する。幾つかの実施形態では、３次元培養において増殖するｈＰＳＣの９０％超が、９０％超の生存率で採取できる。

[0050]幾つかの実施形態では、ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡを含む配合物、クエン酸ナトリウム以外の他のＣａ^２＋キレーター又は各種のＣａ^２＋キレーターの組合せを含む更なる継代及び採取用配合物が提供される。これらの試薬（ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及びクエン酸ナトリウム）はいずれもＣａ^２＋キレーターであり、培養において付着細胞を脱離させるために従来使用されてきた。上記したように、ＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）ＥＤＴＡは、幾つかの研究室においてｈＥＳＣｓの採取／継代のためにルーチン的に使用され、２００８年、スコットランドのＲｏｓｌｉｎ研究所でＴｈｏｍｓｏｎらにより発表された研究において、ｈＥＳＣｓを継代するためにＥＤＴＡ及びＥＧＴＡ（トリプシンとの組合せ）が用いられている（Ｔｈｏｍｓｏｎら（２００８）、「Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｐａｓｓａｇｅｄ Ｕｓｉｎｇ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｒｅｔａｉｎ ａ Ｎｏｒｍａｌ Ｋａｒｙｏｔｙｐｅ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＣＤ３０」、Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、１０（１）、１～１７）。しかしながら、幾つかの実施形態では、継代用配合物は、ＥＤＴＡ（又はＥＧＴＡ）を含むことから、核型の不安定なコロニーを生じさせるリスクが増大する。幾つかの実施形態では、脱離後処理の余分な工程が、最終的な採取物からＥＤＴＡ（又はＥＧＴＡ）を含む継代用配合物の除去及び中和の後に続き、それにより労働集約性が増加する。幾つかの実施形態では、本開示は、ＥＤＴＡ及び／又はＥＧＴＡを含まない採取及び継代用配合物を提供する。幾つかの実施形態では、本開示は、ＥＤＴＡ及び／又はＥＧＴＡの量が非常に少ない採取及び継代用配合物を提供し、例えば該配合物は、０．０５ｍＭ未満のＥＤＴＡ、０．０１ｍＭ未満のＥＤＴＡ、０．００５ｍＭ未満のＥＤＴＡ又は０．００１ｍＭ未満のＥＤＴＡを有する。

[0051]継代のために有用な単一細胞ｈＰＳＣを提供するのに適することが本明細書において明らかとなった配合物は、クエン酸ナトリウムを１ｍＭ～約３０ｍＭ、２ｍＭ～約２５ｍＭ、３ｍＭ～約２０ｍＭ又は５ｍＭ～約１５ｍＭの濃度で含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される配合物は、約５ｍＭ、約１０ｍＭ又は約１５ｍＭの濃度を有する。幾つかの実施形態では、前記配合物は、約５ｍＭｏｌ／リットル～約１５ｍＭｏｌ／リットルの濃度でクエン酸ナトリウムを含む。

[0052]本明細書に記載される配合物は塩を含む。幾つかの実施形態では、塩は、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）塩又はそれらの組合せである。幾つかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣ１、ＬｉＣｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_３、ＮａＨ_２ＰＯ_３、Ｋ_２ＨＰＯ_３、ＫＨ_２ＰＯ_３及び／又はＮａＨＣＯ_３を含む。

[0053]継代のために有用な単一細胞ｈＰＳＣを提供するのに適することが本明細書において明らかとなった配合物は、１０ｍＭ～１７０ｍＭ、２０ｍＭ～１５０ｍＭ、３０ｍＭ～１３０ｍＭ又は４０ｍＭ～１２０ｍＭの濃度でＮａＣｌ又はＫＣｌを含む。幾つかの実施形態では、塩はＫＣｌである。幾つかの実施形態では、ＫＣｌは、約４０ｍＭｏｌ／リットル～約１５０ｍＭｏｌ／リットルの濃度である。幾つかの実施形態では、ＫＣｌは、約８０ｍＭｏｌ／リットル～約１２０ｍＭｏｌ／リットルの濃度である。幾つかの実施形態では、塩はＮａＣｌである。幾つかの実施形態では、ＮａＣｌは、約４０ｍＭｏｌ／リットル～約１５０ｍＭｏｌ／リットルの濃度である。幾つかの実施形態では、ＮａＣｌは、約８０ｍＭｏｌ／リットル～約１２０ｍＭｏｌ／リットルの濃度である。当業者は、所望のモル浸透圧濃度となるように塩の濃度を調整できることを察知できる。例えば、クエン酸ナトリウム（又は他の成分）の濃度が減少する場合、所望のモル浸透圧濃度とするために塩の量を増加させることができる。同様に、クエン酸ナトリウム（又は他の成分）の濃度が増加する場合、所望のモル浸透圧濃度とするために塩の量を減少させることができる。

[0054]各種のモル浸透圧濃度を、本発明の配合物において採用することができる。本明細書に記載されるように、クエン酸ナトリウム及び塩濃度を調整し、約１００ｍＯｓｍｏｌ／リットル～約３５０ｍＯｓｍｏｌ／リットルまで配合物のモル浸透圧濃度を変化させることにより、幹細胞の塊ではなくむしろ単一細胞の多能性幹細胞を継代するために使用できる継代溶液が提供される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるようにモル浸透圧濃度を減少させることにより、例えば機械的スクレーピングを行わずに、ｈＰＳＣを容易にベッセルから分離できる。幾つかの実施形態では、配合物は、約１００ｍＯｓｍｏｌ／リットル～約３５０ｍＯｓｍｏｌ／リットル、約１２５ｍＯｓｍｏｌ／リットル～約３２０ｍＯｓｍｏｌ／リットル、約１５０ｍＯｓｍｏｌ／リットル～約３００ｍＯｓｍｏｌ／リットル、約１７５ｍＯｓｍｏｌ／リットル～約２７５ｍＯｓｍｏｌ／リットル、又は約２００ｍＯｓｍｏｌ／リットル～約２５０ｍＯｓｍｏｌ／リットルのモル浸透圧濃度を有する。幾つかの実施形態では、配合物は、約２５０ｍＯｓｍｏｌ／リットル、約２６０ｍＯｓｍｏｌ／リットル、約２７０ｍＯｓｍｏｌ／リットル、約２８０ｍＯｓｍｏｌ／リットル、約２９０ｍＯｓｍｏｌ／リットル又は約３００ｍＯｓｍｏｌ／リットルのモル浸透圧濃度を有する。幾つかの実施形態では、配合物のモル浸透圧濃度は、約２００ｍＯｓｍｏｌ／リットル～約３００ｍＯｓｍｏｌ／リットルである。幾つかの実施形態では、配合物のモル浸透圧濃度は、約２５０ｍＯｓｍｏｌ／リットル～３００ｍＯｓｍｏｌ／リットルである。

[0055]幾つかの実施形態では、本発明の配合物は、Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋不含ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）を含む。ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）は、カルシウム又はマグネシウム塩を含まない平衡塩溶液であり、例えば、分離前の細胞の洗浄、細胞又は組織サンプルの輸送、計数する細胞の希釈、及び試薬の調製など、様々な細胞培養用途で使用される。細胞を分離する前に培養液からキレーターをリンスするため、カルシウム及びマグネシウムを含まない配合物が必要とされる。ＤＰＢＳは、塩化カリウム（０．２ｇ／ｌ）、リン酸カリウム一塩基無水物（０．２ｇ／ｌ）、塩化ナトリウム（８．０ｇ／ｌ）及び二塩基性リン酸ナトリウム７水和物（２．１６０ｇ／ｌ）を含む。

[0056]本発明の配合物は、各種のｐＨレベルを有しうる。幾つかの実施形態では、配合物のｐＨは約７～約８である。幾つかの実施形態では、配合物のｐＨは約７．４及び７．８である。

[0057]幾つかの実施形態では、本開示は、単一細胞ヒト多能性幹細胞を採取及び継代するための配合物に関し、該配合物は動物産物を実質的に含まない。幾つかの実施形態では、本開示は、単一細胞ヒト多能性幹細胞を採取及び継代するための配合物に関し、該配合物は酵素を実質的に含まない。幾つかの実施形態では、配合物は、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、ＴｒｙＰＬＥ（商標）及び／又はＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）を実質的に含まない。幾つかの実施形態では、本開示は、単一細胞ヒト多能性幹細胞を採取及び継代するための配合物に関し、該配合物はＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を実質的に含まない。幾つかの実施形態では、配合物は実質的に酵素不含有である。

[0058]本明細書に記載される配合物は、単一細胞ヒト多能性幹細胞の採取及び継代に適する。すなわち、幾つかの実施形態では、該配合物はヒト多能性幹細胞を含む。幾つかの実施形態では、該配合物はヒト間充織幹細胞を更に含む。幾つかの実施形態では、ヒト多能性幹細胞は、胚性幹細胞及び人口多能性幹細胞からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、本明細書における開示は、前記配合物（約１ｍＭ～約３０ｍＭの濃度のクエン酸ナトリウム、約１０ｍＭｏｌ／リットル～約１７０ｍＭｏｌ／リットルの濃度のＫＣｌ及びＣａ^２＋／Ｍｇ^２＋不含ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ））及びヒト多能性幹細胞を含む組成物を提供する。

[0059]哺乳動物細胞の培養には、凍結株の解凍、培養ベッセルへの細胞のプレーティング、培地交換、継代及び凍結保存などの様々な技術及びプロトコルが用いられる。培養及び採取プロセスの一般的な概略を図２に示す。幾つかの実施形態では、本開示は、２次元でヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を採取し、次に継代する方法に関し、該方法は、細胞培養プレート又はベッセルにおいて、本明細書に記載される採取及び継代用配合物中でｈＰＳＣを約２分～約２０分間インキュベートすることを含み、それにより、ｈＰＳＣは、約８５％及び約１００％の細胞生存率を有する単一細胞として、細胞培養プレート又はベッセルから脱離する。幾つかの実施形態では、ｈＰＳＣは、採取及び継代用配合物中で約５分～約１５分間、又は約８～約１２分間インキュベートされる。幾つかの実施形態では、本開示は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を採取し、次に継代する方法に関し、該方法は、継代は、進行中の懸濁培養（すなわち３次元培養又はバイオリアクター）から、細胞培養培地を除去し、細胞集塊を継代溶液に約１０分～約４０分間曝露し、撹拌又は混合して、集塊を単一細胞に単離することにより行われる。

[0060]幾つかの実施形態では、約０．２ｍＬ～約１０ｍＬの採取及び継代用配合物が、細胞培養プレート又はベッセルに添加される。幾つかの実施形態では、約０．５ｍＬ～約５ｍＬの採取及び継代用配合物が、細胞培養プレート又はベッセルに添加される。幾つかの実施形態では、約１ｍＬ～約２ｍＬの採取及び継代用配合物が、細胞培養プレート又はベッセルに添加される。幾つかの実施形態では、約５ｍＬ～約１０ｍＬの採取及び継代用配合物が、懸濁培養ベッセル又はバイオリアクターに添加される。幾つかの実施形態では、約１５ｍＬ～約４０ｍＬの採取及び継代用配合物が、懸濁培養ベッセル又はバイオリアクターに添加される。幾つかの実施形態では、約５０ｍＬ～約１００ｍＬの採取及び継代用配合物が、懸濁培養ベッセル又はバイオリアクターに添加される。幾つかの実施形態では、約１５０ｍＬ～約５００ｍＬの採取及び継代用配合物が、懸濁培養ベッセル又はバイオリアクターに添加される。幾つかの実施形態では、約５００ｍＬ～約２０００ｍＬの採取及び継代用配合物が、懸濁培養ベッセル又はバイオリアクターに添加される。採取及び継代用配合物の量は、ベッセルのタイプ及びサイズに応じて調整することができる。

[0061]幾つかの実施形態では、細胞培養プレート又はベッセルをタッピングするか又は揺らすことにより、細胞を表面から剥離させるのを補助する。幾つかの実施形態では、３次元懸濁培養において形成される細胞集塊を沈殿させ、増殖培地をアスピレーター又は培地採取ラインを用いて吸引する。幾つかの実施形態では、細胞の表面からの剥離の際、機械的ピペッティング又はスクレーピングを用いない。幾つかの実施形態では、継代用配合物の存在下で懸濁培養において撹拌を行い、細胞集塊を単一細胞に分離させる。幾つかの実施形態では、バイオリアクターの撹拌速度は、４０ｒｐｍ、５０ｒｐｍ、６０ｒｐｍ、７０ｒｐｍ、８０ｒｐｍ又は９０ｒｐｍである。幾つかの実施形態において、懸濁液バイオリアクターにおける継代溶液と細胞集塊とのインキュベート時間は、１０、２０、３０、４０又は５０分間である。幾つかの実施形態では、増殖培地を、培養期間の後、採取及び継代用の溶液に添加する。幾つかの実施形態では、増殖培地を添加する前に、本明細書に記載される採取及び継代用配合物を除去しない。幾つかの実施形態では、採取及び継代用配合物中のｈＰＳＣを、インキュベート期間の後遠心分離し、採取及び継代用配合物を含む上清を吸引し、ペレットを、Ｙ－２７６２３（Ｙ化合物）（Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）で補充した増殖培地を適切な量用いて再懸濁する。幾つかの実施形態では、採取及び継代用の溶液中のｈＰＳＣを、１００ｇ～３００ｇ（例えば２００ｇ）で約１分～約１０分間（例えば約２分～５分間、又は約３分間）遠心分離する。

[0062]ｈＰＳＣの培養及び継代に有用な、各種のベッセル及びコンテナー（例えば細胞培養プレート又はベッセル）が、当業者に公知である。幾つかの実施形態では、細胞培養プレート又はベッセルは、ペトリ皿、マルチウェル細胞培養プレート、積層型細胞培養装置、細胞培養工場、コニカルチューブ、アジテーター又はインペラーを備える様々なタイプのスピナーフラスコ、又はインペラーを備える懸濁培養バイオリアクターからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、ｈＰＳＣはコニカルチューブにおいてインキュベートされる。

[0063]幾つかの実施形態では、前記方法は、単一細胞の下流処理を更に含み、該下流処理は、連続逆流遠心分離技術、イメージング、細胞ソーティング、配合物化、自動バイアル化、凍結保存、ハイスループットスクリーニング、遺伝子編集、指向性分化、からなる群から選択され、また懸濁培養の場合、細胞の回復及び菌体数が、例えばクローン選択のための比較基準として、成否に極めて重大である。

[0064]本開示は、クエン酸ナトリウムなどのＣａ^２＋キレーター配合物の、細胞の採取及び継代に適する特定のモル浸透圧濃度での使用を提供する。本発明の開示は、本発明を最適化して、特異的な細胞型又は特異的な培養条件におけるヒト多能性幹細胞用の単一細胞継代溶液を見出すのに適する。幾つかの実施形態では、本開示は、ヒト多能性幹細胞用の単一細胞継代溶液を最適化する方法に関し、該方法は、（ｉ）複数の単一細胞継代溶液を作り出すステップであり、各単一細胞継代溶液が、少なくとも一つのＣａ^２＋キレーター及び公知のモル浸透圧濃度を含み、複数の単一細胞継代溶液中の単一細胞継代溶液が各々異なる濃度及び異なるモル浸透圧濃度を有する、前記ステップと、（ｉｉ）前記複数の単一細胞継代溶液を各々試験し、所与の処理時間で脱離する培養物のパーセンテージ、並びに各所与のＣａ^２＋キレーター濃度及びモル浸透圧濃度における単一細胞のパーセンテージを決定するステップと、（ｉｉｉ）好適な単一細胞継代溶液を複数の単一細胞継代溶液から選抜するステップとを含む。幾つかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される方法により得られた単一細胞継代溶液に関する。

[0065]幾つかの実施形態では、本開示は、単一細胞ｈＰＳＣの採取及び継代のために、例えば高生存率、高収率、大型の脱離後集塊サイズ、連続継代の可能性などのパラメータ、並びに多能性の表現型の維持（例えば典型的にはＯＣＴ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ－１－６０及びＴＲＡ－１－８１などの幹細胞関連マーカーの発現）及び核型の安定性に基づき最適化された配合物及び方法を提供する。

[0066]幾つかの実施形態では、本開示は、単一細胞ｈＰＳＣの採取及びその次の継代のための方法に関し、該方法は、１：５～１：６０の分割比で、本明細書に記載される配合物によりｈＰＳＣを継代することを含み、分割後、培養物は３～１０日以内にコンフルエントに達する。幾つかの実施形態では、本開示は、単一細胞ｈＰＳＣの採取及びその次の継代のための方法に関し、該方法は、２×１０^５細胞／ｍＬ～２×１０^６細胞／ｍＬの細胞播種密度で、本明細書に記載される配合物によりｈＰＳＣを継代することを含み、分割後、培養物は３～６日以内に所望の菌体密度に達する。

[0067]幾つかの実施形態では、本開示は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を採取し、その後継代するための方法に関し、該方法は、（ｉ）培地中にｈＰＳＣをプレーティングするステップと、（ｉｉ）培地を吸引するステップと、（ｉｉｉ）ｈＰＳＣをＤＰＢＳで洗浄するステップと、（ｉｖ）ｈＰＳＣに本明細書に記載される配合物を添加し、１分～３０分間インキュベートするステップと、（ｖ）ｈＰＳＣを培養培地に添加し、例えば再懸濁するステップとを含む。幾つかの実施形態では、（ｉｖ）の配合物は、培養培地中にｈＰＳＣを再懸濁する前に（例えば濾過又は遠心分離により）除去される。

[0068]幾つかの実施形態では、本開示は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を採取し、その後継代するための方法に関し、該方法は、（ｉ）懸濁培養バイオリアクターを使用して培地中でｈＰＳＣを培養するステップと、（ｉｉ）ｈＰＳＣを培地から分離し、取り出すステップと、（ｉｉｉ）ｈＰＳＣをＤＰＢで洗浄するステップと、（ｉｖ）本明細書に記載される配合物を添加し、（例えば３０～７０ｒｐｍの範囲で）穏やかに撹拌し、１分～５０分間インキュベートするステップと、（ｖ）ｈＰＳＣを培養培地に添加し、例えば再懸濁するステップとを含む。幾つかの実施形態では、（ｉｖ）の配合物は、培養培地中にｈＰＳＣを再懸濁する前に（例えば濾過又は遠心分離により）除去される。幾つかの実施形態では、（ｉｖ）の配合物は、培養培地中にｈＰＳＣを添加する前に除去されない。

[0069]幾つかの実施形態では、本開示は、実験室におけるルーチン作業に使用することにより、ｈＰＳＣ培養組織の増殖に要する労働力及び工程時間を節約することができる配合物及び使用方法を提供する。

[0070]幾つかの実施形態では、本開示は、培養ベッセルの表面から細胞を取り出し、単一細胞のｈＰＳＣを継代に提供するための機械的スクレーピングを必要としない配合物及び使用方法を提供する。幾つかの実施形態では、本開示は、培養ベッセルの表面から細胞を取り出し、単一細胞のｈＰＳＣを継代に提供するための必要となる機械的スクレーピングを５０％、８０％、９０％又は９５％低減する配合物及び使用方法を提供する。

[0071]幾つかの実施形態において、本開示は、培養ベッセルの表面から細胞を脱離するために用いた継代用配合物を除去するために採取された細胞を洗浄し、遠心分離する必要がない、配合物及び方法を提供する。

[0072]幾つかの実施形態では、本開示は、平面又は多層細胞培養ベッセルにおいて増殖したｈＰＳＣの９０％以上が、９０％以上の生存率で採取できる配合物及び使用方法を提供する。幾つかの実施形態では、本開示は、平面又は多層細胞培養ベッセルにおいて増殖したｈＰＳＣの９２％超、９４％超、９６％超又は９８％超が、９０％以上の生存率で採取できる配合物及び使用方法を提供する。幾つかの実施形態では、本開示は、平面又は多層細胞培養ベッセルにおいて増殖したｈＰＳＣｓの９０％超が、９０％超、９２％超、９４％超、９６％超、９８％超又は９９％超の生存率で採取できる配合物及び使用方法を提供する。実施形態の幾つかの態様において、該方法により、培養ベッセルの表面から細胞が例えば少なくとも９０％、少なくとも９０％の細胞生存率で採取される。

[0073]幾つかの実施形態では、本開示は、ｈＰＳＣを増殖させ、いかなる酵素も利用しない採取及び継代によりＴ型フラスコから多層細胞工場へ継代するプロセスと、それに続く連続逆流遠心技術（例えばｋＳｅｐ（登録商標）技術）による下流処理における配合物及び使用方法を提供する。

[0074]幾つかの実施形態では、本開示は、ｈＰＳＣの細胞脱離及び細胞分離配合物を開発するための配合物及び使用方法を提供し、該配合物及び使用方法では、継代される細胞は単一細胞であり、所定の処理時間で分離され単数化される培養物のパーセンテージを、モル浸透圧濃度及びＣａ^２＋キレーター濃度により制御することができる。細胞の脱離及び細胞の個別化に関する２つの因子として、Ｃａ^２＋キレーター濃度及びモル浸透圧濃度が同定される。

[0075]幾つかの実施形態では、本開示は、懸濁培養（３次元バイオリアクター）内で増殖したｈＰＳＣを、本明細書に開示される配合物又は本明細書に開示される方法により同定される配合物中、細胞培養ベッセルで２～５０分間、約８０％～１００％の細胞生存率でいずれのｈＰＳＣ集塊も単数化させ、又はｈＰＳＣを表面又はマイクロキャリアから脱離させて、採取し、次に継代するための配合物及び使用方法を提供する。

[0076]幾つかの実施形態では、本開示は、ｈＰＳＣの採取及び次の継代のための配合物及び使用方法を提供し、該配合物及び使用方法では、ｈＰＳＣは高い分割比（１：５～最大１：６０、又は約１００×１０^３／ｃｍ^２～５×１０^３／ｃｍ^２の播種細胞密度）によって継代され、分割された後、培養物は１０日以内にコンフルエントに達する。幾つかの実施形態では、本開示は、懸濁培養におけるｈＰＳＣの採取及び次の継代のための配合物及び使用方法を提供し、該配合物及び使用方法では、ｈＰＳＣは２×１０^５細胞／ｍＬ～２×１０^６細胞／ｍＬの播種密度で継代され、培養物は６日以内に最大細胞数に達する。

[0077]幾つかの実施形態では、本開示は、ｈＰＳＣの採取及び次の継代のための配合物及び使用方法を提供し、該配合物及び使用方法では、ｈＰＳＣが多能性及び通常のＧバンド形成核型を５０回以上の継代後も維持する。

[0078]幾つかの実施形態では、本開示は、単一細胞の未分化ｈＰＳＣを選択的に脱離し、継代するための配合物及び方法を提供する。

[0079]幾つかの実施形態では、本開示は、単一細胞のｈＰＳＣを高い解凍後回復率及び再プレーティング効率で採取し、次に低温保存するための配合物及び方法を提供する。

[0080]幾つかの実施形態では、本開示は、連続逆流、遠心分離、配合物化、自動バイアル化及び速度制御されたフリーザーによる凍結保存を含む閉鎖系において採取された単一細胞ｈＰＳＣを下流処理に供するための配合物及び使用方法を提供する。

[0081]幾つかの実施形態では、本開示は、スクレーピング及び生存率の顕著な損失のない、ヒト多能性幹細胞の採取及び次の継代のための配合物及び使用方法を提供する。実施形態の一態様において、配合物は、例えばクエン酸ナトリウム、塩及びリン酸緩衝食塩水を、約１０～１７０ｍＯｓｍｏｌ／リットルのモル浸透圧濃度で含む。

[0082]こうして、続く詳細な説明がより良好に理解され、当技術分野への技術的貢献がより良好に察知されるように、本発明の重要な特徴をやや概説的に述べてきた。当然ながら、以下に本発明の更なる特徴を更に説明する。

[0083]この点、本発明の少なくとも一実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明に記載されるか、又は図面に図示される構成の詳細及び成分の組合せの適用に限定されないことを理解すべきである。本発明は、他の実施形態であってもよく、また種々の態様で実践及び実施されてもよい。また、本明細書において使用される語法及び用語が、説明のためのものであり、限定的なものと解釈されないことを理解すべきである。

[0084]したがって、当業者は、本発明の幾つかの目的を果たすため、その他の構造、方法、及びシステムを設計するための基礎として、本開示の基礎を成す概念を容易に利用できることを察知するであろう。したがって、本発明の趣旨及び範囲から逸脱しない、その均等な構成は、本発明に含まれるという点が重要である。

[0085]本発明、その操作の利点及びその適用により解決される具体的課題をより良好に理解するため、本発明の好ましい実施形態を例示する添付の図面及び説明事項を参照すべきである。

実施例１：各種の非酵素的な細胞脱離のための配合物溶液及び方法の、予備的スクリーニング及び特徴解析
[0086]単一細胞状態の細胞壁からｈＰＳＣを分離する際の補助となる溶液を見出すために、一連の新規な継代溶液を設計した。以前は、１ｍＭのクエン酸ナトリウム（５７０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ）溶液を用いていた。しかしながら、従来の配合物では、細胞が脱離するとき塊を形成し、及び／又は継代用配合物を除去するための更なる処理を必要とするものであった。新規な継代用配合物のシリーズを表２で概説する。

[0087]各配合物について、高い生存率を維持しつつ、単一細胞状態のｈＰＳＣを脱離させる能力を試験した（データ示さず）。配合物３が、単一細胞の集団をより多く発生させる能力、分離／継代の後に生じる集塊のパーセンテージが低いこと（Ｌ７配合物３は一貫して、Ｌ７配合物１及び２と比較し、細胞集塊の発生が５％未満）、高い生存率（Ｌ７配合物３は一貫して、Ｌ７配合物１及び２と比較し、９０％以上の高い生存率）、培養物中において多能性幹細胞の形態が維持されること、及び２つの異なるＰＳＣ系統（Ｈ１及びＨＥＵＳ８）により評価した結果の安定性、に基づき、配合物１及び２より優れていることが解った。全細胞数、全生細胞数、生存率及びサンプル中に存在する細胞集塊／クラスターのパーセンテージを評価するよう設計されたセルカウンター装置である、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００に、脱離後の細胞懸濁液から採取したサンプルを注入し、分離後の細胞集塊の生存率及び数を評価した。

実施例２：平面培養における、他の分離処理に対する配合物３の比較
[0088]配合物３の継代溶液を、異なる多能性幹細胞株、並びに各種の培地及びマトリックスを含む細胞培養系を用いて、酵素的、及び代替的な非酵素的細胞脱離溶液と比較した。一つの目標は、従来の採取／継代方法の単純性を維持しつつ、平面ベッセルから採取される単一細胞ｈＰＳＣの収率を改善することである。このスクリーニングでは、３つの異なる細胞株（Ｈ１、ＷＡ２７及びＨＡＤ１０６）４つの異なる細胞増殖培地（ＮＵＴＲＩＳＴＥＭ（登録商標）、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ８（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ（「Ｅ８ Ｍｅｄｉｕｍ」）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ｍＴｅＳＲ（商標）１ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｌ７（商標）Ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｏｎｚａ）、及び４つの異なるマトリックス（ラミニン及びＥカドヘリン；組換え型ＶＴＮ；Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）マトリックス、Ｃｏｒｎｉｎｇ；及びＬ７（商標）Ｍａｔｒｉｘ、Ｌｏｎｚａ）を用いた。各種の組合せを下記の表３で概説する：

[0089]ＷＡ２７細胞を、示す培地を含むプレートで培養した。次に遠心分離及び培養ベッセルからの使用後の培地の吸引により、細胞を培養培地から取り出した。次に細胞を、Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋不含バッファー（例えばＤＰＢＳ）で、１０ｃｍ^２当たり１ｍＬのＤＰＢＳで一度洗浄した。予熱された継代溶液を、１ｍＬ／１０ｃｍ^２で添加し、３７℃で５～１５分間インキュベートした。細胞を５分間隔でチェックした。次にベッセルを軽く叩き／揺らし、細胞を表面から剥離させた。次に細胞溶液を、１０ｍＬピペットを用いて５回、上下にピペッティングした。Ｙ化合物を補充した等量の増殖培地を添加し、分離をクエンチした。次に細胞を室温で３分間、２００ｇで遠心分離した。上清を吸引し、適切な量の、Ｙ化合物で補充した示す増殖培地中に、細胞を再懸濁した。

[0090]図３は、示す培地及びマトリックスで増殖させ、実施例１の配合物３を含む示す継代用配合物を使用して継代したＷＡ２７細胞の結果を示す。継代後１日目に得た画像から解るように、継代用配合物である配合物３を用いて継代したＷＡ２７細胞は、細胞培養培地（Ｌ７培地、ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ８（登録商標）（Ｅ８）、ＮＵＴＲＩＳＴＥＭ（登録商標）及びｍＴｅＳＲ（商標）－１）又はマトリックス（ラミニン及びＥカドヘリン；組換え型ＶＴＮ；Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）マトリックス又はＬ７（商標）Ｍａｔｒｉｘ）に関係なく、酵素的な継代溶液ＴｒｙｐＬＥと比較し、同等の細胞の個別化及び同等又は高い細胞の付着を示した。ｖｅｒｓｅｎｅ継代溶液は、細胞塊の形でＰＳＣを継代するよう設計されているため、継代後に単一細胞の懸濁液を生じさせることができなかった（図３に示す）。本実験により、配合物３のクエン酸ナトリウム溶液は驚くべきことに、ＴｒｙｐＬＥ（商標）及びＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）配合物と比較し優れた試薬であることが解った。

[0091]図４は、継代の３日後における細胞増殖を示す。継代用配合物としての配合物３の使用は、ＴｒｙｐＬＥ（商標）及びＶＥＲＳＥＮＥ（登録商標）継代用配合物の使用と比較し、継代後、（Ｌ７細胞培養系及びＥ８＋Ｌ７（商標）Ｍａｔｒｉｘによる高いコンフルエンシーによる評価により）著しく高い細胞増殖をもたらした。

[0092]異なる細胞培養系における異なる継代方法間の定量的比較を表４に示す。配合物３は、酵素的継代溶液ＴｒｙｐＬＥと比較し、分離／継代の後の生存率、全細胞数又は集塊の発生率（パーセンテージ）が優れているか、又は同等であることが解った。予想されるように、Ｖｅｒｓｅｎｅによる継代では単一細胞懸濁液が得られなかった。生存率、分離後の細胞集塊数及び全生細胞数は、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００カウント（１カセット法）を用いて得た。異常な核型を生じさせる酵素的継代における懸念を考慮すると、配合物３は、許容できる定量的結果をもたらしうる、より安全な非酵素的継代溶液であると考えられる。

[0093]複数の培養条件及び細胞の評価、Ｈ１細胞株から得られた類似のデータ（データ示さず）に基づき、ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ８（登録商標）又はＮＵＴＲＩＳＴＥＭ（登録商標）と組み合わせた配合物３の継代用配合物を懸濁培養研究における更なる分析のために選択した。

実施例３：懸濁培養（３次元、Ｂｉｏｔｔ Ｓｐｉｎｎｅｒ）における、他の分離処理に対する配合物３の比較
[0094]Ｈ１細胞を、異なるレベルのｂＦＧＦで補充した細胞培養培地中、２次元培養で増殖させ、次にＬ７配合物３を用いた懸濁培養（Ｂｉｏｔｔスピナー）に移行させ、同じ細胞培養培地中、３次元で増殖させた。２次元培養における細胞増殖の間、Ｅ８培地を、１００、４０又は１０ｎｇ／ｍＬの塩基性フィブロブラスト成長因子（ｂＦＧＦ）と共に補充した。次に細胞を細胞培養培地から取り出し、５０ｍＬコニカルチューブに添加した。Ｂｉｏｔｔスピナーベッセルを１０ｍＬのＤＰＢＳで洗浄し、それを同じコニカルチューブへ移して残留するあらゆる細胞を移した。次にチューブを室温で１分間、１００ｇで遠心分離し、細胞を沈殿させた。上清を吸引し、細胞を３０ｍＬのＤＰＢＳに再懸濁した。細胞を室温で１分間、１００ｇで再び遠心分離し、上清を吸引して再び除去した。

[0095]６ｍＬの予熱された配合物３を添加し、細胞を１５～２０分間、３７℃の湯浴でインキュベートした。チューブを３分毎に振とうした。チューブをＢＳＣ内に移し、１０ｍｌピペットを用い、細胞を全量にわたり５回ピペッティングした。２０ｍＬの増殖培地（Ｙ化合物含有）を添加し、クエンチした。次に細胞を室温で５分間、２００ｇで遠心分離し、吸引して上清を除去し、Ｙ化合物を補充した２０ｍＬの増殖培地中に細胞を再懸濁した。ピペットで全最終量が２５ｍＬとなるよう調整した。次に細胞をＮＣ－２００（１カセット法）を使用して計数した。１０倍希釈（Ｙ化合物で補充した増殖培地４５０μＬ及び細胞懸濁液５０μＬ）を行った。Ｂｉｏｔｔスピナー培養における細胞増殖及び生存率を測定した結果、播種後４日目において０．６×１０^６細胞／ｍｌであり、表５に示す。結果は、Ｌ７配合物３を使用した細胞の継代後の、許容できるレベルの細胞の増殖倍数（約４～５倍）、培養液中に残存する集塊のパーセンテージ（６～１２％）、集塊のサイズ（直径約１５０～２００μ）を示す。処理の相違に応じて、Ｌ７配合物３で処理した細胞では８０～８４％の生存率であった。生存率を改善し、培養液中に残存する集塊のパーセンテージを減少させるため、Ｌ７配合物３による処理の更なる最適化を行ったが、その際、インキュベート時間を増加させ（１５分から２０、３０及び４０分）、スピナーフラスコ内部での撹拌を行った結果を実施例５及び図８にまとめる。

[0096]図５は、Ｂｉｏｔｔ Ｓｐｉｎｎｅｒ培養における、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ培地中約０．６×１０^６細胞／ｍＬの濃度で播種した後の懸濁培養で増殖させたＨ１細胞の結果を示す。３次元Ｂｉｏｔｔスピナーへの播種前に、細胞を２次元組織培養フラスコで、（ｉ）ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ８（登録商標）＋ｒＶＴＮマトリックス及びＴｒｙｐＬＥ（商標）による継代、又は（ｉｉ）ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ８（登録商標）＋ｒＶＴＮマトリックス及び配合物３（「Ｌ７Ｆ３」）による継代、により連続的に継代培養した。２次元培養における細胞増殖の間、Ｅ８培地を、１００、４０又は１０ｎｇ／ｍＬの塩基性フィブロブラスト成長因子（ｂＦＧＦ）と共に補充した。懸濁培養の細胞を配合物３（「Ｌ７Ｆ３」）により連続的に継代培養し、図は４日目のＨ１細胞集塊を示す。これらの画像は、配合物３を用いたＨ１細胞の継代の後、細胞が丸形及び球状の集塊が懸濁液において生じうることを示すものである。集塊のサイズ分布は、２次元培養において処理及びｂＦＧＦ濃度に応じて変化する。これらの結果は、３次元懸濁培養における、細胞の増殖又は形態に影響を与えることのない、Ｌ７Ｆ３を用いるｈＰＳＣの連続継代の実現可能性を確認するものである。

実施例４：Ｈ１ Ｅ８平面上部ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ ｂｉｏｔｔ ＤＤ１
[0097]図６は、図１に示すプロセスに基づく、内皮系列へのＨ１細胞の指向性分化の結果を示す。異なる細胞培地を用いた２次元（組織培養フラスコ）及び３次元懸濁培養（Ｂｉｏｔｔ Ｓｐｉｎｎｅｒ）における増殖の後、Ｌ７配合物３により連続的に継代培養したＨ１細胞を、分化ステージ４で膵臓前駆細胞に類似する細胞形態により示される、この指向性分化プロセス（すなわち内皮細胞株への分化）で使用した。

[0098]表６は、Ｌ７配合物３を使用して３次元増殖及び連続的継代培養の後、Ｈ１細胞の細胞数、生存率、集塊サイズ及び指向性分化のための各種転写因子（Ｏｃｔ－４、Ｓｏｘ－１７、ＰＤＸ－１及びＮＫＸ６．１）の発現に関するフローサイトメトリー分析の結果を示す。これらの細胞は、ＰＤＸ－１及びＮＫＸ６．１（膵臓前駆細胞において陽性発現を示すために用いる２つのマーカー）のレベルが高く、多能性幹細胞マーカーＯｃｔ４及び初期内胚葉マーカーＳＯＸ－１７のレベルが非常に低かった。

[0099]図７、表７及び表８は、図５に記載する異なる細胞培養培地における２次元（組織培養フラスコ）、３次元懸濁培養（例えばＢｉｏｔｔ Ｓｐｉｎｎｅｒ）における増殖、及び次の膵臓前駆細胞への指向性分化の後の、Ｈ１細胞の各種転写因子（Ｏｃｔ－４、Ｓｏｘ－１７、ＰＤＸ－１及びＮＫＸ６．１）の発現に関するフローサイトメトリー分析を表す。懸濁液において増殖させ、配合物３「Ｌ７Ｆ３」を使用して継代した細胞は、高いレベルで膵臓前駆細胞に分化する能力を維持し、多能性幹細胞マーカーＯｃｔ４及び初期内胚葉マーカーＳＯＸ－１７の非存在下で、ＰＤＸ－１及びＮＫＸ６．１を二重に陽性発現する高いレベルを示す。ＰＤＸ－１及びＮＫＸ６．１の発現は、ここにおいても、懸濁液において増殖し、配合物３「Ｌ７Ｆ３」を使用して継代した細胞が、特異的な細胞系列に分化する能力を維持することを確認するものである。

[0100]通常の核型が５０回以上の継代においても存在すると考えられる。

実施例５：手動ピペッティングのない、多能性幹細胞の３次元単一細胞懸濁液培養への継代
[0101]上記（実施例３を参照）のように、生存率を改善し、Ｌ７配合物３による分離後に残存して凝集する細胞のパーセンテージを減少させるために、Ｌ７配合物３による処理の更なる最適化を行う必要があった。この目的は、インキュベート時間を増加（１５分から２０、３０及び４０分）させ、別のチューブ内で分離させる代わりに、スピナーフラスコ内で撹拌することにより達成された。この場合、３次元培養（５００ｍＬのスピナーフラスコ）において細胞集塊の形で増殖した細胞は、撹拌を停止することにより安定化した。次に培地をアスピレーターを使用して吸引し、細胞を２０分、３０分又は４０分間、３７℃のインキュベーター内で、１００ｍＬの配合物３と共にスピナーフラスコにおいてインキュベートした。細胞を配合物３と共に７０ｒｐｍで撹拌してインキュベートした。各培養物からサンプルを採取し、細胞懸濁液を倒立顕微鏡を使用して観察した。異なる処理レベル（配合物３処理後 対 配合物３、スピン及び再懸濁後）並びに異なるインキュベート時間毎に画像を取得した。図８は、異なるインキュベート時間及び異なる処理レベルにおける、Ｌ７配合物３を使用した分離後に生じた単一細胞懸濁液を示す。これらの結果は、４０分間のインキュベート時間を用いた培養において見られる集塊数が減少し、Ｌ７配合物３が更に最適化できることを示す。表９は、異なるインキュベート時間で観察される集塊のレベルの質的なランキングを提供するものであり、４０分間のインキュベートが、Ｌ７配合物３により生じる単一細胞のパーセンテージを改善したことを示唆するものである。

[0102]データは、継代溶液の配合物３を使用した３次元懸濁培養において多能性幹細胞集塊の分離が可能であり、大規模スケールのバイオリアクタシステムに適用できることを示唆する。

Claims (18)

1. 単一細胞ヒト幹細胞を採取及び継代するための配合物であって、
   （ｉ）１ｍＭ～約３０ｍＭのクエン酸ナトリウムと、
   （ｉｉ）３０ｍＭ～１３０ｍＭのＫＣｌ又はＮａＣｌを含む塩と、
   （ｉｉｉ）Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋不含ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）と
   を含み、約１００ｍＯｓｍｏｌ／リットル～約３５０ｍＯｓｍｏｌ／リットルのモル浸透圧濃度を有する、配合物。
2. モル浸透圧濃度が、約２５０ｍＯｓｍｏｌ／リットル～３００ｍＯｓｍｏｌ／リットルである、請求項１に記載の配合物。
3. クエン酸ナトリウムが、約５ｍＭｏｌ／リットル～約１５ｍＭｏｌ／リットルの濃度である、請求項１に記載の配合物。
4. 塩が、約８０ｍＭｏｌ／リットル～約１２０ｍＭｏｌ／リットルの濃度のＫＣｌである、請求項１に記載の配合物。
5. ｐＨが約７～約８である、請求項１に記載の配合物。
6. ｐＨが約７．４～約７．８である、請求項１に記載の配合物。
7. ヒト幹細胞を更に含む、請求項１に記載の配合物。
8. ヒト幹細胞が、胚性幹細胞、体性幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群から選択される、請求項７に記載の配合物。
9. ヒト幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項７に記載の配合物。
10. ヒト幹細胞が、表皮幹細胞、血液幹細胞、造血幹細胞、上皮幹細胞、心臓幹細胞及び神経幹細胞からなる群から選択される組織特異的幹細胞である、請求項７に記載の配合物。
11. ヒト幹細胞（ｈＳＣ）を採取し、その後継代するための方法であって、細胞培養プレート又はベッセルにて、請求項１～８のいずれか一項に記載の配合物中でｈＳＣを約２分～約２０分間インキュベートすることを含み、前記ｈＳＣが、約８５％～約１００％の細胞生存率を有する単一細胞として、細胞培養プレート又はベッセルから分離される、方法。
12. 細胞培養プレート又はベッセルが、ペトリ皿、マルチウェル細胞培養プレート、積層型細胞培養装置、細胞培養工場又はコニカルチューブからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
13. ｈＳＣが、バイオリアクター、３次元懸濁培養ベッセル又はコニカルチューブにおいてインキュベートされる、請求項１２に記載の方法。
14. 単一細胞の下流処理を更に含み、下流処理が、連続逆流遠心分離技術、製剤化、自動バイアル化、凍結保存及びハイスループットスクリーニング、遺伝子編集及び指向性分化からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
15. ヒト幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. ２次元組織培養ベッセル内の単一細胞ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を採取し、その後継代するための方法であって、１：５～１：６０の分割比で、請求項１～１０のいずれか一項に記載の配合物を用いてｈＰＳＣを継代するステップを含み、分割された後、１０日以内に培養物がコンフルエントに達する、方法。
17. ２次元組織培養ベッセル内のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を採取し、その後継代するための方法であって、
    ｉ）培地中にｈＰＳＣをプレーティングするステップと、
    ｉｉ）培地を吸引するステップと、
    ｉｉｉ）ｈＰＳＣをＤＰＢＳで洗浄するステップと、
    ｉｖ）ｈＰＳＣに請求項１～８のいずれか一項に記載の配合物を添加し、１分～３０分間インキュベートするステップと、
    ｖ）培養培地中にｈＰＳＣを再懸濁するステップと、
    を含む、方法。
18. ３次元懸濁バイオリアクター内で細胞塊の形で増殖したヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を採取し、その後継代するための方法であって、
    ｉ）懸濁培養バイオリアクターを使用して培地中でｈＰＳＣを細胞塊の形で培養するステップと、
    ｉｉ）ｈＰＳＣを培地から分離し、取り出すステップと、
    ｉｉｉ）ｈＰＳＣをＤＰＢＳで洗浄するステップと、
    ｉｖ）ｈＰＳＣに請求項１～８のいずれか一項に記載の配合物を添加し、穏やかに撹拌し、１分～５０分間インキュベートするステップと、
    ｖ）培養培地中にｈＰＳＣを再懸濁するステップと
    を含む、方法。

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