JP2022504764A - 細胞培養のための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
培地組成物の実施形態において、インビトロまたはエクスビボで少なくとも1つの哺乳類細胞を支持するように構成される成分は、緩衝液、無機塩、必須アミノ酸、炭水化物、脂肪酸、脂質、ビタミン、微量元素のうちの1つ以上を含み得る。培地組成物の実施形態は、使用される前に溶解されるように配合された液体または固体の培養培地濃縮物を包含する。培地組成物の実施形態はまた、さらなる希釈なしで使用されるように配合された培養培地などの培地を包含する。培地組成物の複数の実施形態は、液体、半固体、固体培地を包含する。培地組成物の複数の実施形態は、規定培地および非規定培地を含む。培地組成物の複数の実施形態は、胚性幹細胞、非胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、多分化能幹細胞、成体幹細胞、始原細胞、分化細胞、単離された初代細胞、二次細胞、不死化細胞、細胞株細胞、生殖細胞、体細胞、改変細胞(遺伝的に改変された細胞を含む)、ヒト細胞またはヒト由来の細胞のうちの1つ以上の培養または保存のために構成され得る。培地組成物の複数の実施形態は、複数の細胞、細胞培養物、組織培養物、組織、器官、器官部分、胞胚葉、胚様体または胚のうちの1つ以上の培養または保存のために構成され得る。
いくつかの用語および概念が以下に説明される。それらは、本文書の残りの部分および添付の図面と併せて、本発明の様々な実施形態の理解を容易にするように意図される。これらの用語および概念は、本発明の分野において受け入れられている慣習、および、本文書および/または添付の図面にわたって提供される説明に基づいて、さらに明らかになり、理解され得る。いくつかの他の用語は、本文書の他のセクションおよび添付の図面において明示的または暗黙的に定義され得、本発明の分野において受け入れられている慣習、および、本文書および/または添付の図面にわたって提供される説明に基づいて使用され得、かつ理解され得る。明示的に定義されていない用語はまた、本発明の分野において受け入れられている慣習に基づいて定義され得、かつ、理解され得、本文書および/または添付の図面の文脈内で解釈され得る。
値を決定するために用いられる装置、方法のエラーの固有の変動、または研究対象間に存在する変動を値が含むことを示すために、用語「約」は、本明細書に使用される。例えば、用語「約」は、所定値からの±1%、±5%、±10%、±15%または±20%の変動を意味し得る。
「体性幹細胞」とも名付けられ得る「成体幹細胞」は、有機体において、組織または器官内の分化細胞間で見られる幹細胞であり、分化して、組織または器官中の分化した細胞タイムのうちのいくつかまたはすべてを生じ得る。体性幹細胞は培養中で増殖し得る。分化した細胞に分化するとき、通常、体性幹細胞は「前駆」または「始原」細胞と呼ばれる中間細胞を生じる。体性幹細胞および始原細胞は、その分化能の程度に応じて「多分化能」または「少能性」として記載され得る。体性幹細胞のいくつかの例:すべてのタイプの血液細胞(赤血液細胞、Bリンパ球、Tリンパ球、ナチュラルキラー細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、およびマクロファージ)を生じる造血幹細胞、骨髄間質幹細胞および骨格幹細胞を含み、骨の細胞(骨芽細胞および骨細胞)、軟骨の細胞(軟骨細胞)、脂肪細胞(脂肪細胞)、および血液形成をサポートする間質細胞を生じ得る間葉系幹細胞;神経細胞(ニューロン)、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトを生じ得る神経幹細胞;吸収細胞、杯細胞、パネート細胞、および腸内分泌細胞を生じ得る消化管の内面の上皮幹細胞;表皮の基底層(およびケラチノサイトを生じ得る)および毛包の基部(および毛包と表皮の両方を生じ得る)で生じる皮膚幹細胞。組織特異的な始原細胞は、特定の器官または組織の細胞への分化に関する自己複製能のない細胞である。ある体性幹細胞タイプは、体性幹細胞の起源から予期されない器官または組織にみられる細胞タイプに分化し得る。この現象は、「トランス分化」と呼ばれる。
用語「クロマン1」は図1に示される構造を有する(3S)-N-{2-[2-(ジメチルアミノ)エトキシ]-4-(1H-ピラゾール-4-イル)フェニル}-6-メトキシ-3,4-ジヒドロ-2H-1-ベンゾピラン-3-カルボキサミドを表す。クロマン関連化合物または誘導体は、構造的に関連した化合物(クロマン部分含有ROCK阻害剤)である、そのうちのいくつかは、Chenら「Chroman-3-amides as potent Rho kinase inhibitors」Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18:6406-6409(2008)およびLoGrassoら「Rho Kinase(ROCK) Inhibitors and Their Application to Inflammatory Disorders」Current Topics in Medicinal Chemistry 9:704-723(2009)に記載される。クロマン1およびその誘導体または関連化合物は塩として、または溶液中に供給され得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、様々なタイプの哺乳類細胞の培養に使用することができる組成物を提供する。本組成物は、ROCK阻害剤(Rhoキナーゼ(ROCK)の活性を阻害する化合物)を含み得る。例えば、本発明の実施形態による組成物は、本文書の「小分子」セクションにおいて記載されるようにクロマン1または関連分子を含み得る。別の例において、本発明の実施形態による組成物はクロマン1を含み得る。本組成物は、カスパーゼ阻害剤(アポトーシスの開始および実行に関与する1つ以上の細胞質のアスパラギン酸特異的システインプロテアーゼの活性を阻害する化合物)をさらに含み得る。カスパーゼ阻害剤は、本文書の「小分子」セクションにおいて記載されるように、エミリカサンまたは関連分子、または、任意のカスパーゼ阻害剤であり得る。組成物の実施形態の一例は、ROCK阻害剤およびカスパーゼ阻害剤を含む。いくつかの他の例は、クロマン1または関連分子およびエミリカサンを含む組成物、クロマン1およびエミリカサンまたは関連分子を含む組成物、クロマン1およびエミリカサンを含む組成物、ROCK阻害剤およびエミリカサンまたは関連分子を含む組成物、またはROCK阻害剤およびエミリカサンを含む組成物である。ROCK阻害剤(クロマン1または関連分子など)に加えて、またはROCK阻害剤およびカスパーゼ阻害剤(エミリカサンまたは関連分子など)に加えて、本発明の実施形態による本組成物は、トランス-ISRIBおよびポリアミンのうちの1つまたは両方をさらに含み得る。本発明の実施形態の文脈において、上記したように、それらの成分のそれぞれが別個にまたは成分の組み合わせは、「活性剤(“active agent”または“active agents”)」として言及され得る。
別の例において、1つ以上の本発明の実施形態による培地は、約5nM~約100μM、約5nM~約80μM、約200nM~約30μM、約300nM~約20μM、例えば、約100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、550nM、600nM、650nM、700nM、750nM、800nM、850nM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM、5.5μM、6μM、6.5μM、7μM、7.5μM、8μM、8.5μM、9μM、9.5μM、10μM、10.5μM、11μM、11.5μM、12μM、12.5μM、13μM、13.5μM、14μM、14.5μM、15μM、15.5μM、16μM、16.5μM、17μM、17.5μM、18μM、18.5μM、19μM、19.5μM、20μM、21μM、22μM、23μM、24μM、25μM、26μM、27μM、28μM、29μM、30μM、31μM、32μM、33μM、34μM、35μM、36μM、37μM、38μM、39μM、40μM、45μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μMまたは100μMなどの濃度でエミリカサン(またはその活性誘導体または関連化合物)を含み得る。
もう1つの例において、1つ以上の本発明の実施形態による培地は、約5nM~約80μM、約5nM~約50μM、約100nM~約6.25μM、または約200nM~約6.25μM、例えば、約50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、550nM、600nM、650nM、700nM、750nM、800nM、850nM、1μM、1.25μM、1.5μM、1.75μM、2μM、2.25μM、2.5μM、2.75μM、3μM、3.25μM、3.5μM、3.75μM、4μM、4.25μM、4.5μM、4.75μM、5μM、5.25μM、5.5μM、5.75μM、6μM、6.25μM、6.5μM、7μM、7.5μM、8μM、8.5μM、9μM、9.5μM、10μM、10.5μM、11μM、11.5μM、12μM、12.5μM、13μM、13.5μM、14μM、14.5μM、15μM、15.5μM、16μM、16.5μM、17μM、17.5μM、18μM、18.5μM、19μM、19.5μM、20μM、21μM、22μM、23μM、24μM、25μM、26μM、27μM、28μM、29μM、30μM、31μM、32μM、33μM、34μM、35μM、36μM、37μM、38μM、39μM、40μM、45μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μMまたは80μMの濃度でトランス-ISRIBを含み得る。
さらにもう1つの例において、1つ以上の本発明の実施形態による培地は、約0.5nM~1mM、例えば、約0.5nM、20.5nM、40.5nM、60.5nM、80.5nM、100.5nM、120.5nM、140.5nM、160.5nM、180.5nM、200.5nM、220.5nM、240.5nM、260.5nM、280.5nM、300.5nM、320.5nM、340.5nM、360.5nM、380.5nM、400.5nM、420.5nM、440.5nM、460.5nM、480.5nM、0.5μM、20.5μM、40.5μM、60.5μM、80.5μM、100.5μM、120.5μM、140.5μM、160.5μM、180.5μM、200.5μM、220.5μM、240.5μM、260.5μM、280.5μM、300.5μM、320.5μM、340.5μM、360.5μM、380.5μM、400.5μM、420.5μM、440.5μM、460.5μM、480.5μM、500.5μM、520.5μM、540.5μM、560.5μM、580.5μM、600.5μM、620.5μM、640.5μM、660.5μM、680.5μM、700.5μM、720.5μM、740.5μM、760.5μM、780.5μM、800.5μM、820.5μM、840.5μM、860.5μM、880.5μM、900.5μM、920.5μM、940.5μM、960.5μM、980.5μMまたは1mMの濃度のスペルミンを培地中に生じるようにポリアミンを含み得る。
さらにもう1つの例において、1つ以上の本発明の実施形態による培地は、約0.5nM~1mM、例えば、おおよそ0.5nM、20.5nM、40.5nM、60.5nM、80.5nM、100.5nM、120.5nM、140.5nM、160.5nM、180.5nM、200.5nM、220.5nM、240.5nM、260.5nM、280.5nM、300.5nM、320.5nM、340.5nM、360.5nM、380.5nM、400.5nM、420.5nM、440.5nM、460.5nM、480.5nM、0.5μM、20.5μM、40.5μM、60.5μM、80.5μM、100.5μM、120.5μM、140.5μM、160.5μM、180.5μM、200.5μM、220.5μM、240.5μM、260.5μM、280.5μM、300.5μM、320.5μM、340.5μM、360.5μM、380.5μM、400.5μM、420.5μM、440.5μM、460.5μM、480.5μM、500.5μM、520.5μM、540.5μM、560.5μM、580.5μM、600.5μM、620.5μM、640.5μM、660.5μM、680.5μM、700.5μM、720.5μM、740.5μM、760.5μM、780.5μM、800.5μM、820.5μM、840.5μM、860.5μM、880.5μM、900.5μM、920.5μM、940.5μM、960.5μM、980.5Mまたは1mMの濃度のスペルミジンを培地中に生じるようにポリアミンを含み得る。
さらにもう1つの例において、1つ以上の本発明の実施形態による培地は、約0.5nM~1mM、例えば、おおよそ0.5nM、20.5nM、40.5nM、60.5nM、80.5nM、100.5nM、120.5nM、140.5nM、160.5nM、180.5nM、200.5nM、220.5nM、240.5nM、260.5nM、280.5nM、300.5nM、320.5nM、340.5nM、360.5nM、380.5nM、400.5nM、420.5nM、440.5nM、460.5nM、480.5nM、0.5μM、20.5μM、40.5μM、60.5μM、80.5μM、100.5μM、120.5μM、140.5μM、160.5μM、180.5μM、200.5μM、220.5μM、240.5μM、260.5μM、280.5μM、300.5μM、320.5μM、340.5μM、360.5μM、380.5μM、400.5μM、420.5μM、440.5μM、460.5μM、480.5μM、500.5μM、520.5μM、540.5μM、560.5μM、580.5μM、600.5μM、620.5μM、640.5μM、660.5μM、680.5μM、700.5μM、720.5μM、740.5μM、760.5μM、780.5μM、800.5μM、820.5μM、840.5μM、860.5μM、880.5μM、900.5μM、920.5μM、940.5μM、960.5μM、980.5μMまたは1mMの濃度のプトレシンを培地中に生じるようにポリアミンを含み得る。
細胞、組織または器官の培養、維持および/または保存のためのキットは、本発明の実施形態に含まれる。キットは、細胞(単一細胞および細胞群を含む)、組織または器官の培養、維持、または保存のための少なくともいくつかの構成要素を含む、一組の構成要素である。そのようなキットは、本文書の「小分子」セクションにおいて記載される1つ以上の活性剤を含む。キットは、1つ以上の以下のものをさらに含み得る:インビトロまたはエクスビボで少なくとも1つの哺乳類細胞を支持するように構成された培地、1つ以上の培養培地成分;培地を保持するための容器;フラスコ、ディッシュ、プレート(マルチウェルプレートを含む)またはリアクタなどの培養容器;細胞、組織または器官培養のための支持部または足場。キットは、1つ以上の哺乳類細胞を含み得る。キットに含まれる哺乳類細胞または細胞は、胚性細胞、非胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、多分化能幹細胞、成体幹細胞、始原細胞、分化細胞、単離された初代細胞、二次細胞、不死化細胞、細胞株細胞、生殖細胞、体細胞または改変された細胞のうちの1つ以上であり得る。1つ以上の哺乳類細胞は、冷凍形態または非冷凍形態において提供され得る。キットに含まれ得る他の成分の例は、小分子(例えば、WNT経路活性化のためのCHIR99021)または組換えタンパク質(例えば、WNT3A、ソニック・ヘッジホッグ、骨形成タンパク質またはアクチビンA)を含む生物学的シグナリング経路のモジュレータを含み得る。いくつかのキットは、本文書の「組成物」セクションにおいて記載される1つ以上の組成物を含み得る。
本文書にわたって記述された組成物およびキットの使用について、様々な使用法および方法(プロセス)が本発明の実施形態で想定され、含まれる。例えば、本文書の「小分子」セクションにおいて記載される化合物、「活性剤」とも表されるが、これらの様々な組み合わせは、限定するものではないが、幹細胞(例えば、胚性幹細胞、非胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、多分化能幹細胞および成体幹細胞)、始原細胞、分化細胞、単離された初代細胞、二次細胞、不死化細胞、細胞株細胞、生殖細胞、細胞および様々なタイプの改変細胞(iPSCおよび遺伝的に改変された細胞または遺伝子操作された細胞を含む)を含む動物細胞の培養方法、維持方法、または保存方法において有利に使用され得る。本発明の実施形態による哺乳類細胞の培養方法、維持方法、または保存方法は、限定するものではないが、細胞の成長、細胞の増殖、細胞の分化、細胞の脱分化、細胞における分化能(多能性を含む)の誘導、培養中の細胞の単一細胞クローニング(培養)、凍結保存、および維持のうちの1つ以上を含む方法を含む。細胞、細胞群、組織、器官部分、器官または胚のエクスビボ保存は、本発明の実施形態による方法に含まれる。本発明の実施形態による哺乳類細胞の培養方法は、出発材料、プロセス中間体または最終産物のうちの1つ以上として単一細胞または複数の細胞を使用し得る。複数の哺乳類細胞は、複数の細胞(例えば、解離された細胞の懸濁液または懸濁細胞培養液)、細胞培養物(接着または非接着細胞培養など)、凝集した細胞、組織培養物、組織(人工的に操作された培養組織を含む)、器官、胞胚葉、胚様体、またはヒト胚および非ヒト胚を含む胚であり得る。上に列挙した細胞および複数の細胞のカテゴリはオーバーラップし得る。本発明の方法の複数の実施形態は、非幹細胞および幹細胞(ESC、iPSC、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞および他の器官由来の幹細胞を含む成体幹細胞、または人工的に改変された幹細胞など)の両方の培養の適切なエンドポイント(例えば、細胞生存、細胞分化、または脱分化、細胞増殖など)によって測定される改善された結果につながり得る。
本発明の方法を実行するためのシステムは、本発明の実施形態に含まれる。これらのシステムは、様々なステーションおよび/または構成要素を含む。本明細書に使用されるとき、用語「ステーション」は、広く定義され、任意の好適な装置またはアセンブリ、本発明の実施形態による方法を実行するために好適な装置または構成要素の集合体または集まりを含む。ステーションは、何らかの特定の方法で互いに一体的に接続または配置する必要はない。本発明の実施形態によるシステムは、互いに好適な配置のステーションを含み得る。例えば、ステーションは同じ部屋内にある必要さえない。しかし、いくつかの実施形態において、ステーションは互いに接続された一体的なユニットである。
本文書に記載される方法は、コンピュータ・ベースの計算およびツールを含み得る。ツールは、有利には、従来設計の汎用のコンピュータシステム(「ホストコンピュータ」と呼ばれ得る)によって実行可能なコンピュータプログラムの形態において提供され得る。ホストコンピュータは、多くの異なるハードウェア構成要素で構成され得、多くの寸法およびスタイル(例えば、デスクトップPC、ラップトップ、タブレットPC、ハンドヘルドコンピュータ、サーバ、ワークステーション、メインフレーム)において作られ得る。モニタ、キーボード、ディスクドライブ、CDドライブおよび/またはDVDドライブなどの標準構成要素が含まれてよい。ホストコンピュータがネットワークに接続されている場合、接続は任意の好適な輸送媒体(例えば、有線メディア、光学メディアおよび/または無線メディア)および任意の好適な通信プロトコル(例えば、TCP/IP)を介して提供され得る。ホストコンピュータは、好適なネットワーキングハードウェア(例えば、モデム、イーサネット(登録商標)カード、WiFiカード)を含み得る。ホストコンピュータは、UNIX(登録商標)、Linux(登録商標)、Microsoft Windows(登録商標)、MacOS、または任意の他のオペレーティング・システムを含む、任意の様々なオペレーティング・システムを実装し得る。
本明細書に記載される組成物、キットおよび方法は、以前の既知の組成物、キットおよび方法に対するいくつかの大幅な改善を提供する。利点のうちの1つは、ROCKキナーゼ阻害剤として使用したとき、クロマン1の予期しない分化能および特異性である。別の利点は、クロマン1およびカスパーゼ阻害剤エミリカサンまたはその誘導体Q-VD-OPhによって示される、ルーチン的な細胞培養中の細胞の生存、正常な核型の維持しながらの細胞拡大培養、解凍した凍結保存細胞の培養、および単層培養、胚様体、ニューロスフェアまたはオルガノイドの細胞分化を含む細胞培養の結果の改善の予期しない相乗効果である。もう1つの利点は、細胞培養結果、特に細胞選別、単一細胞クローニング、細胞リプログラミング、凍結保存および細胞解凍中に対する、クロマン1、エミリカサン、トランス-ISRIBおよびポリアミンの組み合わせの予期しない優れた効果である。本発明の実施形態による活性剤の上記の予期しない利点は、細胞、組織および器官培養に使用する様々なプロセスおよび方法においてそれらの活性剤が有益に用いられることを可能にする。例えば、培養物の投薬は、低濃度の1つ以上の活性剤で実施することができ、したがって、とりわけ、大幅な経済的節約につながる。別の例において、本明細書に記載される組成物、方法およびキットは培養中の長期細胞株拡大培養の大幅な改善結果を達成し、培養細胞の細胞機構に対する細胞培養添加剤のオフターゲット効果を最小限にする。ヒトプロテインキナーゼのセットに対するクロマン1の阻害活性のプロファイリングによって、Y-27632、チアゾビビン、ピリンテグリンおよびRevitacell(登録商標)(Thermo Fisher Scientific、Frederick、MD)およびCloneR(登録商標)(StemCell Technologies、バンクーバー、カナダ)などの現在使用されている添加物と比較して、培養培地添加物としての本化合物の優れた特性が実証された。本明細書に記載される組成物、キット、および方法はまた、単一細胞クローニングの大いに改善された結果を達成する。
単一細胞解離後のヒト多能性幹細胞の生存を促進する化合物の定量的ハイスループットスクリーニング
定量的ハイスループットスクリーニング(qHTS)を行い、単一細胞解離後の胚性幹細胞の生存を促進する化合物を同定した。図2にqHTS手順の概略図を示す。H9細胞(公式名称WA09、WiCell、Wisconsin)をAccutase(Thermo Fisher Scientific)で酵素的に解離し、組換えビトロネクチンでコーティングされ、様々な濃度で15,333個の小分子化合物を含有する1536ウェルプレートに分配した。小分子化合物は、NCATS Pharmacologically Active Chemical Toolbox(NPACT)、NCATS Pharmaceutical Collection(NPC)、Mechanism Interrogation PlatE(MIPE)、および、市販のライブラリであるTocris(Minneapolis、MN)のTocriscreen(登録商標)PlusおよびSigma-Aldrich(St.Louis、MI)のLOPAC1280(登録商標)を含む小分子ライブラリを元にしている。ジメチルスルホキシド(DMSO;最終濃度0.4%)および10μM Y-27632をそれぞれ陰性対照および陽性対照としてスクリーニングに使用した。播種後24時間で、生存している細胞の代わりに、細胞内のアデノシン三リン酸(ATP)レベルを計測するCellTiter-Glo(登録商標)発光細胞生存率アッセイ(Promega Corporation、Madison、WI)で細胞生存率を評価した。qHTS手順はIngleseら(2006)「Quantitative high-throughput screening: A titration-based approach that efficiently identifies biological activities in large chemical libraries」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(31):11473-11478(2006)において一般的に記載されている。
クロマン1は、Y-27632より効力があり、かつ、より特異的なROCK阻害剤である
実験的研究が行われ、クロマン1は、Y-27632より効力があり、かつ、より特異的なROCK阻害剤であることが実証された。Y-27632およびクロマン1それぞれの半数阻害濃度(IC50)は、Reaction Biology Corporation(Malvern、PA)によって行われたHotSpotキナーゼアッセイを使用して、主な標的であるROCK1およびROCK2に対するキナーゼアッセイで決定された。結果を図6(Y-27632)および図7(クロマン1)に示す折れ線グラフによって示す。クロマン1は、Y-27632より効力があるROCK阻害剤であることが決定された。
組み合わせ論的マトリックススクリーニングおよびクロマン1およびエミリカサンでの改善された細胞生存
細胞生存における相乗効果のある化合物を同定するために、組み合わせ論的マトリックススクリーニングを行った。異なる作用機序を有する化合物に焦点を合わせ、29個の化合物を組み合わせ的なマトリックススクリーニングのために選択し、812セットの10×10チェッカーボードマトリックス実験(データは示していない)となり、そのうちの4つを図9に示す。組み合わせ的なマトリックススクリーニングのための化合物の濃度を、単剤qHTS用量反応曲線に由来する傾きおよび効力(AC50)に基づいて最適化し、マトリクススクリーニングが細胞生存率アッセイにおいて幅広い範囲の生物学的効果をカバーするようにした。単独で使用した10μM Y-27632によって達成された細胞生存率を、100%細胞生存率の基準として設定し、全ての細胞生存値を正規化するために使用した。組み合わせ論的マトリックススクリーニングにより、カスパーゼ阻害剤エミリカサンおよびその誘導体Q-VD-Ophがクロマン1と相乗効果があるとして同定された。図9は、クロマン1とカスパーゼ阻害剤エミリカサンとの組み合わせ、およびクロマン1と(-)-ブレビスタチンとの組み合わせの組み合わせ論的マトリックススクリーニングの結果を示す。ブレビスタチンは非筋肉ミオシンIIATPaseの阻害剤であり、相乗効果のある化合物ペア(クロマン1およびエミリカサン)と相乗効果のない化合物ペア(クロマン1およびブレビスタチン)との違いを実証するために含められた。図9の上段に示される2つのマトリックスは10μM Y-27632で達成された生存率(100%とみなす)に対して正規化された実際の細胞生存率データを示す。10×10マトリックス内の数字は、示された組み合わせまたは単剤で達成された最大生存率を示す。化合物の各ペアで達成された最大生存率は、各10×10マトリックスにおいて最大数で表され、その例を図9に示す。下段の2つのマトリックスは、最大単剤(highest-single agent(HSA))モデルを使用して計算された相乗効果マトリックスを示す。HAS相乗効果は、単剤単独と比較した化合物の組み合わせの生存促進効果を評価し、これは、組み合わせ外の細胞生存率と、試験した各濃度での最良の単剤からの生存率の差として計算された。相乗効果は、組み合わせと単剤の最大応答との差として定義される(相乗効果=組み合わせ 最大(単剤A、単剤B))。
ルーチン的な継代および凍結保存細胞の解凍のクロマン1とエミリカサンとの組み合わせの処理後の改善された細胞生存率
以下に説明される実験的研究により、クロマン1およびエミリカサンの組み合わせで処理された細胞の改善された細胞生存率が示された。一連の実験で、H9細胞が単一細胞に解離され、100,000細胞/cm2でビトロネクチンコーティングされたプレートに播種された。顕微鏡イメージング(IncuCyte Zoom(登録商標)、データは示していない)によって経時的にカスパーゼ活性化とアポトーシスを継続的に監視するためにカスパーゼ3/7 green detection reagent(商品名)を使用した。大部分の細胞は、0.0001% v/v DMSOの存在下で、アポトーシスを起こした。10μM Y-27632の添加は効果があったが、50nM クロマン1の使用は、細胞生存率をさらに改善した。50nM クロマン1および5μM エミリカサンの組み合わせた使用は細胞生存率の効果を最大化した。CellTiter-Glo(登録商標)アッセイ(CTG)を使用し、播種24時間後に生存している細胞を計測した(データは示していない)。上述の解離されたH9細胞の実験的研究によって、クロマン1およびエミリカサンの組み合わせは、陽性対照Y-27362または単独で使用されたクロマン1と比較して優れた細胞生存率につながったことが示された。
クロマン1およびエミリカサンの存在下で改善された細胞分化
胚様体形成アッセイによって、クロマン1およびエミリカサンの存在下で改善された細胞分化が実証された。一連の実験で、H9細胞をAccutaseで解離した。試験する異なる条件に、確実に同数の細胞を使用するために細胞をカウントした後、細胞を0.0001% v/v DMSO(陰性対照)、10μM Y-27632(陽性対照)、50nM クロマン1、5μM エミリカサンまたは50nM クロマン1および5μM エミリカサンの組み合わせの存在下で超低接着6ウェルプレートにプレーティングする。胚様体(EB)形成を細胞播種後24時間で調べた。プレートの顕微鏡検査によって、クロマン1およびエミリカサンの組み合わせは劇的にEB形成を改善し、かつ、DMSO、Y-27632、およびクロマン1と比較して死細胞の数および破片が減少する(データは示していない)ことが示された。
多能性細胞の改善された多系譜分化
50nM クロマン1および5μM エミリカサンの存在下の多能性細胞の改善された多系譜分化が実験的に実証された(データは示していない)。Accutaseで解離された能性幹細胞(WiCellからのH9)を96ウェル超低接着プレートに播種し、EBを生成させ、Essential 6 Medium(Thermo-Fisher Scientific、Frederick、MD)中で培養し、自発的な分化を誘導させた。播種後7日目に個々に成長したEBに対して、外胚葉マーカーPAX6、中胚葉マーカーBrachyuryおよび内胚葉マーカーSox17のmRNA発現をqPCRを使用して定量した。アクチンmRNA発現をEB間の細胞数の変動を正規化するために使用した。50nM クロマン1および5μM エミリカサンの組み合わせ(クロマン1+Emri)を使用したとき、全ての系譜固有のマーカーがより高いレベルで発現されていた。
追加の細胞生存促進因子としてのトランス-ISRIBおよびポリアミンの同定
低細胞播種密度条件および単一細胞クローニングのためのクロマン1およびエミリカサンの使用の拡張および最大化のために、発明者らは、別の組み合わせ論的スクリーニング戦略を開発した。実験的研究が行われ、追加の細胞生存促進因子としてトランス-ISRIBおよびポリアミンを同定した。低細胞播種密度に付随する細胞ストレスを克服することができる化合物をスクリーニングするためにアッセイを開発した。本実験は、ウェルごとの単一細胞を検出するために、CTGアッセイの検出限界およびシグナル強度を定義することを目的とした。H9細胞(WiCellから入手)を使用した。実験の結果により、1536ウェルプレートの各ウェルに50個未満の細胞が播種されたとき、低播種密度に付随する細胞ストレスが明らかであることが示された(データをここに示す)。
CEPTの有益な効果
培養中、および、胚様体およびオルガノイド形成、および、組織分化などの様々な関連するプロセス中においてhPSCの生存に対するCEPTの有益な効果を示す様々な実験が行われた。代表的な実験を以下に記載し、図16~28に結果を示す。
Claims (56)
- クロマン1(Chroman1)および/またはその誘導体とエミリカサン(Emricasan)および/またはその誘導体とを含む組成物。
- トランス-ISRIBおよびポリアミンのうちの1つまたは両方をさらに含む請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物は培地に取り込まれたとき、約4nM~約80μM、4nM~約40μM、約10nM~約20μM、約20nM~約10μMまたは約30nM~約500nMの濃度のクロマン1および/または前記その誘導体を提供するように配合される、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記組成物は、培地に取り込まれたとき、約100nM~約80μM、約100nM~約40μM、約200nM~約30μM、約300nM~約20μMの濃度のエミリカサンおよび/または前記その誘導体を提供するように配合される請求項1~3のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物は、培地に取り込まれたとき、約50nM~約80μM、約50nM~約40μM、約50nM~約20μM、約50nM~約10μM、約50nM~約6.25μM、約100nM~約6.25μM、または約200nM~約6.25μMの濃度のトランス-ISRIBを提供するように配合される請求項2~4のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物はスペルミンおよびスペルミジンを含むポリアミンを含み、前記組成物は、培地に取り込まれたとき、約0.5nM~1mMの濃度のスペルミン、および/または約0.5nM~1mMの濃度のスペルミジンを提供するように配合される請求項2~4のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ポリアミンは、プトレシンをさらに含み、前記組成物は、前記培地に取り込まれたとき、約0.5nM~1mMの濃度のプトレシンを提供するように配合される、請求項6に記載の組成物。
- インビトロまたはエクスビボで少なくとも1つの哺乳類細胞を支持するように構成される成分とクロマン1および/またはその誘導体とを含む培地組成物。
- 約4nM~80μM、4nM~40μM、10nM~20μM、20nM~10μMまたは30nM~500nMの有効濃度のクロマン1および/または前記その誘導体を含み、クロマン1および/または前記その誘導体の前記有効濃度は、さらなる希釈なしで使用される作業培地中のクロマン1および/または前記その誘導体の濃度である、請求項8に記載の培地組成物。
- エミリカサンおよび/またはその誘導体をさらに含む、請求項8または9に記載の培地組成物。
- 約100nM~80μM、100nM~40μM、200nM~300μM、300nM~20μMの有効濃度でエミリカサンを含み、エミリカサンおよび/または前記その誘導体の前記有効濃度は、さらなる希釈なしで使用される作業培地中のエミリカサンおよび/または前記誘導体の濃度である、請求項8~10のいずれか1項に記載の培地組成物。
- トランス-ISRIBをさらに含む、請求項8~11のいずれか1項に記載の培地組成物。
- 約50nM~約80μM、約50nM~約40μM、約50nM~約20μM、約50nM~約10μM、約50nM~6.25μM、100nM~6.25μM、または200nM~6.25 6.25μMの有効濃度においてトランス-ISRIBを含み、トランス-ISRIBの前記有効濃度は、さらなる希釈なしで使用される作業培地中のトランス-ISRIB濃度ある請求項8~12のいずれか1項に記載の培地組成物。
- スペルミンおよびスペルミジンを含むポリアミンをさらに含む請求項8~13のいずれか1項に記載の培地組成物。
- 前記培地組成物は、約0.5nM~1mMの有効濃度のスペルミン、および/または約0.5nM~1mMの有効濃度のスペルミジンを含み、前記有効濃度のスペルミンおよびスペルミジンのそれぞれは、さらなる希釈なしで使用される作業培地中の濃度である請求項8~14のいずれか1項に記載の培地組成物。
- ポリアミンは、プトレシンをさらに含む請求項14または15に記載の培地。
- 前記培地組成物は約0.5nM~1mMの有効濃度のプトレシンを含み、前記有効濃度のプトレシンはさらなる希釈なしで使用される作業培地中の濃度である請求項16に記載の培地。
- インビトロまたはエクスビボで前記少なくとも1つの哺乳類細胞を支持するように構成された前記成分は、1つ以上の緩衝液、無機塩、必須アミノ酸、炭水化物、脂肪酸、脂質、ビタミン、微量元素を含む請求項8~17のいずれか1項に記載の培地組成物。
- 前記培地組成物は、使用される前に溶解されるように配合された液体または固体の培地濃縮物である請求項8~18のいずれか1項に記載の培地組成物。
- 前記培地組成物は、さらなる希釈なしで使用されるように配合された培地である請求項8~18のいずれか1項に記載の培地組成物。
- 前記培地組成物は、液体、半固体または固体である請求項8~18のいずれか1項に記載の培地組成物。
- 前記培地組成物は、規定培地組成物または非規定培地組成物請求項8~21のいずれか1項に記載の培地組成物。
- 前記少なくとも1つの哺乳類細胞は、胚性幹細胞、非胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、多分化能幹細胞、成体幹細胞、始原細胞、分化細胞、単離された初代細胞、二次細胞、不死化細胞、細胞株細胞、生殖細胞、体細胞、または改変された細胞である請求項8~22のいずれか1項に記載の培地組成物。
- 前記少なくとも1つの哺乳類細胞は、複数の細胞、細胞培養物、組織培養物、組織、器官、器官部分、胞胚葉、胚様体または胚である請求項8~23のいずれか1項に記載の培地組成物。
- 前記少なくとも1つの哺乳類細胞は、ヒト細胞またはヒト由来の細胞である請求項8~24のいずれか1項に記載の培地組成物。
- 請求項1~7のうちのいずれか1項に記載の前記組成物とインビトロまたはエクスビボで少なくとも1つの哺乳類細胞を支持するように構成された培地成分とを含むキット。
- インビトロまたはエクスビボで前記少なくとも1つの哺乳類細胞の増殖のための培養容器、支持部または足場のうちの少なくとも1つをさらに含む請求項26に記載のキット。
- 請求項8~25のいずれか1項に記載の培地組成物、少なくとも1つの培養容器、インビトロまたはエクスビボで前記少なくとも1つの哺乳類細胞の増殖のための支持部または足場を含むキット。
- 前記少なくとも1つの哺乳類細胞と請求項8~25のうちのいずれか1項に記載の培地とを含む組成物。
- 前記培地は、液体、半固体または固体である請求項29に記載の組成物。
- 前記培地は、規定培地または非規定培地である請求項29または30に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの哺乳類細胞は、胚性幹細胞、非胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、多分化能幹細胞、成体幹細胞、始原細胞、分化細胞、単離された初代細胞、二次細胞、不死化細胞、細胞株細胞、生殖細胞、体細胞、または改変された細胞である請求項29~31のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの哺乳類細胞は、複数の細胞、細胞培養物、組織培養物、組織、器官、器官部分、胞胚葉、胚様体または胚である請求項29~32のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの哺乳類細胞は、ヒト細胞またはヒト由来の細胞である請求項29~33のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記培地を含む容器をさらに含む請求項29~34のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの哺乳類細胞のための固体支持部または足場をさらに含む請求項29~35のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの哺乳類細胞は解凍される請求項29~36のうちのいずれか1項に記載される組成物。
- 培地のうちの1つ以上の成分を請求項1~6のうちのいずれか1項に記載される前記組成物と組み合わせることを含む培地を調製する方法。
- 請求項20に記載の前記培地中、インビトロまたはエクスビボで前記少なくとも1つの哺乳類細胞をインキュベートすることを含む少なくとも1つの哺乳類細胞を培養する方法。
- 前記インキュベートすることは、少なくとも細胞または組織培養物が確立されるまで行われる、請求項39に記載の方法。
- 請求項20に記載の前記培地中、解離された哺乳類細胞を、前記解離された哺乳類細胞から細胞のコロニーが確立されるまでインキュベートすることを含む哺乳類細胞のクローン集団を得る方法。
- 請求項20に記載の前記培地中、1つ以上の哺乳類細胞を、胚様体が確立されるまでインキュベートすることを含む胚様体を得る方法。
- 請求項20に記載の前記培地中、器官の少なくとも一部が確立されるまで1つ以上の哺乳類細胞をインキュベートすることを含むインビトロまたはエクスビボで前記器官の少なくとも一部を成長させる方法。
- 前記培地は液体、半固体または固体である請求項39~43のいずれか1項に記載の方法。
- 前記培地は規定培地または非規定培地である請求項39~44のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの哺乳類細胞は、胚性幹細胞、非胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、多分化能幹細胞、成体幹細胞、始原細胞、分化細胞、単離された初代細胞、二次細胞、不死化細胞、細胞株細胞、生殖細胞、体細胞、または改変された細胞である請求項39~45のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの哺乳類細胞は、複数の細胞、細胞培養物、組織培養物、組織、器官、器官部分、胞胚葉、胚様体または胚である請求項39~45のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの哺乳類細胞はヒトまたはヒト由来である請求項39~47のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの哺乳類細胞は解凍される請求項39~48のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インキュベートすることは、前記培地を含む容器内で行われる請求項39~49のいずれか1項に記載の方法。
- 容器は、前記少なくとも1つの哺乳類細胞のための固体支持部および/または足場を含む請求項49に記載の方法。
- 請求項20に記載の前記培地中、インビトロまたはエクスビボで前記少なくとも1つの哺乳類細胞をインキュベートすることを含む少なくとも1つの哺乳類細胞の維持または保存の方法。
- 前記少なくとも1つの哺乳類細胞は、胚性幹細胞、非胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、多分化能幹細胞、成体幹細胞、始原細胞、分化細胞、単離された初代細胞、二次細胞、不死化細胞、細胞株細胞、生殖細胞、体細胞、改変された細胞、複数の細胞、細胞培養物、組織培養物、組織、器官、器官部分、胞胚葉、胚様体または胚である請求項52に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの哺乳類細胞は、ヒトまたはヒト由来である請求項52または53に記載の方法。
- 記少なくとも1つの哺乳類細胞は解凍される請求項52~54のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの哺乳類細胞は凍結される請求項52~54のいずれか1項に記載の方法。
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