CN114107189A - 一种大鼠间充质干细胞的分离培养方法 - Google Patents

一种大鼠间充质干细胞的分离培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种大鼠脐带来源间充质干细胞的分离培养方法，使用胶原酶Ⅰ溶液进行消化后分离培养得脐带来源间充质干细胞。本发明的方法缩短了原代细胞培养的时间，获得的脐带来源间充质干细胞纯度高，活性好，分化潜能高，可用于大鼠间充质干细胞的体内研究，并进一步应用于细胞药物的作用机制、组织分布、衰老、免疫和移植等研究。

Description

一种大鼠间充质干细胞的分离培养方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体来说，涉及一种大鼠脐带来源间充质干细胞的分离培养方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，具有免疫调控、再生各种组织器官等生物学功能。依据所处的发育阶段不同分为胚胎干细胞和成体干细胞，成体干细胞主要包括脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、血液干细胞、脂肪干细胞、神经干细胞和表皮干细胞等。利用干细胞的自我更新能力、多分化潜能及增殖能力而逐渐发展成熟的干细胞治疗技术，是将人自体或异体来源的干细胞作为“药物制剂”植入或输入人体，用以修复受损的组织或器官，从而达到治疗疾病的目的。
目前，干细胞药物的临床前评价都是将人的干细胞注射进动物体内，进行有效性/安全性/药代/归巢等临床前研究。由于不同种属间存在的种属差异及免疫原性，得到的数据并不能真正反应或代表细胞在人体内的作用机制。通过动物模型进行临床研究时应尽可能的模拟临床实践，因此在动物模型中使用动物同种干细胞进行研究才能更真实的反应细胞在体内的作用机制。大鼠模型是进行临床前研究时最常用的模型之一。目前，大鼠间充质干细胞主要来源于骨髓和脂肪，相较于骨髓和脂肪来源的间充质干细胞，脐带间充质干细胞具有更高的增殖活性，更低的免疫原性，更利于临床前应用。经检索，对于大鼠脐带间充质干细胞的报道仅有一篇。该文献中使用组织贴块法和多步酶消化法进行大鼠脐带间充质干细胞的分离(刘奎利,石炳毅,刘德忠等.大鼠脐带源间充质干细胞的分离及生物学性状[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,014(010):1743-1748.)，采用组织贴块法，分离速度慢，耗费人力，使用多步酶消化法，对原代细胞伤害较大，获得的细胞形态不均一。因此，目前尚无简单快速，同时保证原代细胞生长活力和细胞纯度的大鼠脐带来源间充质干细胞的分离培养方法。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种大鼠脐带来源间充质干细胞的分离培养方法，高效、简便地获取最多的原代细胞，同时保证原代细胞的生长活力和细胞纯度。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：
第一方面，本发明提供了一种大鼠脐带来源间充质干细胞的分离培养方法，包括如下步骤：
(1)先用消毒液对新鲜离体的大鼠脐带组织进行快速消毒；再用清洗液对大鼠的脐带组织表面进行清洗；然后将脐带除去血液，再用清洗液清洗；将充分控干后的脐带放入离心管，剪成均匀脐带块；
(2)将步骤(1)得到的脐带块放入浓度为0.5-2.5mg/ml的胶原酶I溶液中，置于37℃恒温震荡仪中消化0.5-2小时，加入间充质干细胞培养基以终止消化，过滤，离心得大鼠脐带来源间充质干细胞；
(3)将步骤(2)得到的大鼠脐带来源间充质干细胞用培养基悬起得细胞悬液；
(4)将步骤(3)得到的细胞悬液放入培养容器中，加入适量培养基，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第2-4天时将培养容器从培养箱中取出，补加适量培养基，继续培养；
(5)当步骤(4)中培养容器中的贴壁细胞融合率达到50％-80％后，利用消化酶消化，离心，弃去上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行培养，直至融合率达到70-90％后，消化即得P1代脐带来源间充质干细胞；
(6)接照上述培养方法进行必要传代培养。
优选地，步骤(1)中所述消毒液为75％乙醇。
优选地，步骤(1)中所述清洗液为无菌生理盐水。
优选地，步骤(1)中所述脐带块为1-4平方厘米的脐带组织块，更优选2平方厘米的脐带组织块。
优选地，步骤(2)中所述的胶原酶I溶液的浓度为1mg/ml。
优选地，步骤(2)中消化的时间为0.75小时。
优选地，步骤(2)中震荡仪的转速为40-100转/分钟，更优选60转/分钟。
优选地，步骤(2)中所述的间充质干细胞培养基为含10％FBS的DMEM/F12Basic培养基。
优选地，步骤(2)中所述的过滤为使用100μm细胞滤网进行过滤。
优选地，步骤(3)中所述的培养基为含10％FBS的DMEM/F12 Basic培养基。
优选地，步骤(3)中所述的细胞悬液为细胞浓度为1×105cells/ml的细胞悬液。
优选地，步骤(4)中所述的细胞悬液为密度为0.4-2×104cells/cm2的细胞悬液，更优选密度为1×104cells/cm2的细胞悬液。
优选地，步骤(4)中所述培养基为含20％FBS的DMEM/F12 Basic培养基。
优选地，步骤(5)中所述消化为使用TrypLETMExpress酶消化3分钟。
优选地，步骤(5)中所述的间充质干细胞培养基为含10％FBS的DMEM/F12Basic培养基。
本发明提供的培养方法所得细胞形态均一，原代细胞培养时间短。开始培养后，细胞多于12h内贴壁，通过倒置显微镜可见贴壁细胞呈梭形、多角形，约1-3天以后增长速度较快，通过显微镜可见成为形态相对均一的梭形细胞，呈平行排列或旋涡状集落生长，见图1。培养7天所得的原代间充质干细胞即可用于传代。
在第二方面，本发明提供了一种大鼠脐带来源间充质干细胞的冻存方法，包括如下步骤：
将步骤(5)或步骤(6)所得脐带来源间充质干细胞消化离心后，用体积比为FBS：DMSO＝9:1的细胞冻存液悬起，按2.5×106cells/ml浓度分装入细胞冻存管，放于程序降温盒于-80℃超低温冰箱冷冻，24h-72h后转移入液氮罐备用。
第三方面，本发明提供了由本发明所述的分离培养方法获得的大鼠脐带来源间充质干细胞。
第四方面，本发明提供了由本发明所述的分离培养方法获得的大鼠脐带来源间充质干细胞用于大鼠间充质干细胞的体内研究的用途。
与现有技术相比，本发明提供的大鼠脐带来源间充质干细胞的分离和培养方法操作更为简便，重复性好。仅使用单步酶消化法，对原代细胞伤害小，缩短了原代细胞培养的时间，获得的脐带来源间充质干细胞形态单一，纯度高，活性好，分化潜能高，可用于大鼠间充质干细胞的体内研究。
附图说明
图1为大鼠脐带来源间充质干细胞形态图
图2为大鼠脐带来源间充质干细胞流式表型图
图3为大鼠脐带来源间充质干细胞表面抗原表达图
图4为大鼠脐带来源间充质干细胞的成脂诱导分化图
图5为大鼠脐带来源间充质干细胞的成骨诱导分化图
图6为大鼠脐带来源间充质干细胞的成软骨诱导分化图
图7为大鼠脐带来源间充质干细胞的诱导成脂、成骨、成软骨的相关基因表达图
图8为大鼠脐带来源间充质干细胞其它方式获取的形态图
图9为大鼠脐带来源间充质干细胞其它方式获取的形态图
图10为大鼠脐带来源间充质干细胞的分离条件对比获取的细胞形态图
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。
实施例1大鼠脐带来源间充质干细胞的分离、培养及冻存
材料与方法：
试剂：DMEM/F12 Basic培养基、TrypLETM酶(Gibco公司)，胶原酶I(solarbio公司)，培养皿、离心管、冻存管、移液管(corning公司)，100μm细胞滤网(biosharp公司)；
仪器：AC2-4S8-CN生物安全柜：ESCO公司；CCL-170B-8二氧化碳培养箱：ESCO公司；CKX53SF倒置相差显微镜：OLYMPUS公司；Cellometer K2全自动荧光分析仪：Nexcelom公司；SorVall ST 16R台式低速冷冻离心机：Thermo公司；IS-AX恒温振荡摇床：苏州捷美公司；905GP超低温冰箱：Thermo公司。
SD大鼠：购自北京维通利华公司。
方法：
(1)先用75％乙醇对新鲜离体的大鼠脐带组织进行快速消毒，再用无菌生理盐水清洗大鼠的脐带组织表面，然后将脐带在培养皿内除去血液，再用无菌生理盐水清洗，将充分控干盐水后的脐带放入50ml离心管，用无菌剪刀把脐带剪成约2平方厘米的均匀脐带块；
(2)将步骤(1)得到的脐带组织块放入10ml的1mg/ml胶原酶I溶液中，于37℃恒温震荡仪中60转/分钟消化0.75小时，加入10ml含10％FBS的DMEM/F12Basic培养基以终止消化，100μm细胞滤网过滤，离心机转速为1000rpm离心4min，获得大鼠脐带来源间充质干细胞；
(3)将步骤(2)获得的大鼠脐带来源间充质干细胞用10ml含10％FBS的DMEM/F12Basic培养基悬起，计数，加入适量10％FBS的DMEM/F12 Basic培养基，调整得到细胞浓度为1×105cells/ml的细胞悬液；
(4)取7.5ml细胞悬液加入到一次性T75无菌培养瓶中(细胞密度为1×104cells/cm2)，加入10ml含20％FBS的DMEM/F12 Basic培养基，放进培养箱中进行培养，培养至第3天将培养容器从培养箱中取出，补加5ml培养基，继续培养；
(5)当步骤(4)中的贴壁细胞融合率达到75％，用1ml TrypLETM酶消化3min，离心，弃去上清液，加入10ml 10％FBS的DMEM/F12 Basic重新悬浮细胞，计数，以1×104cells/cm2的密度接种于新的培养瓶进行培养，直至融合率达到80％后，用1ml TrypLETM酶消化即得P1代脐带来源间充质干细胞；
(6)接照上述培养方法进行必要的传代；
(7)将步骤(5)或步骤(6)所得脐带来源间充质干细胞消化离心后，用体积比为FBS：DMSO＝9:1的细胞冻存液悬起，按2.5×106cells/ml分装入细胞冻存管，放于程序降温盒于超低温冰箱(-80℃)冷冻，24h后转移入液氮罐备用。
结果：本发明获得的大鼠脐带来源间充质干细胞为形态均一的长梭形，细胞生长达融合状态时呈束状密集平行排列或漩涡样(图1)。
实施例2大鼠脐带来源间充质干细胞表面标志物流式检测
材料与方法：
试剂：DMEM/F12 Basic培养基、TrypLETM酶(Gibco公司)，培养皿、离心管、移液管(corning公司)，间充质干细胞(大鼠)表面标记检测试剂盒(cyagen公司)；
仪器：AC2-4S8-CN生物安全柜：ESCO公司；CCL-170B-8二氧化碳培养箱：ESCO公司；CKX53SF倒置相差显微镜：OLYMPUS公司；Cellometer K2全自动荧光分析仪：Nexcelom公司；SorVall ST 16R台式低速冷冻离心机：Thermo公司；FACS AriaⅡ型流式细胞仪：BD公司。
方法：
(1)取P4代大鼠脐带来源间充质干细胞，用流式细胞缓冲液重悬细胞，调节细胞浓度为3×106cells/mL；
(2)取1.5mL EP管，标记一抗名称，取100μL细胞悬液至EP管中，每管(约3×105cells)加入2μL与标记名称对应的一抗，混匀。其中，同型对照用于消除抗体与细胞非特异性结合产生的背景染色，为阴性对照。
(3)2-8℃孵育30min，孵育后，用1mL流式细胞缓冲液清洗样品两次；250×g，离心5min。弃去上清。每组各加入100μL流式细胞缓冲液，每组各加入2μL抗一抗的荧光二抗，重悬细胞。各抗体均选择PE标记的羊抗鼠lgG抗体。
(4)2-8℃，避光孵育30min；孵育后，用1mL流式细胞缓冲液清洗样品两次；250×g，离心5min，弃去上清；用400μL流式细胞缓冲液重悬细胞后，立即上机检测。检测633nm红色激光。
结果：使用本发明方法获得的大鼠脐带来源间充质干细胞，经过表面抗原检测，阳性细胞标记物CD90、CD44、CD73表达大于70％，阴性细胞表面标记物CD34、CD45、CD11b/c表达小于5％，纯度符合要求。数据见图2及表1。
表1.大鼠脐带来源间充质干细胞流式检测结果
Figure BDA0003387013170000061
Figure BDA0003387013170000071
实施例3大鼠脐带来源间充质干细胞表面标志物实时定量PCR检测
试剂：DMEM/F12 Basic培养基、TrypLETM酶、DEPC水(PCR-grade，Gibco公司)，培养皿、离心管、移液管(corning公司)，Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche公司)，TRIzol总RNA提取试剂盒(天根公司)，逆转录试剂盒(Roche公司)，引物从生工订购，并按标签说明以DEPC水溶解至10μM.；
仪器：AC2-4S8-CN生物安全柜：ESCO公司；CCL-170B-8二氧化碳培养箱：ESCO公司；CKX53SF倒置相差显微镜：OLYMPUS公司；Cellometer K2全自动荧光分析仪：Nexcelom公司；SorVall ST 16R台式低速冷冻离心机：Thermo公司；LightCycler480Ⅱ实时荧光定量PCR仪：Roche公司。
方法：
(1)取P4代大鼠脐带来源间充质干细胞，取细胞1×106cells，用TRIzol总RNA提取试剂盒收获细胞，提取RNA，并逆转录为cDNA，用qRT-PCR进行扩增检测，检测表面抗原R-CD90、R-CD44、R-CD73、R-CD34、R-CD45、R-CD11b/c的相对表达量；
(2)以逆转录的cDNA为模板，qRT-PCR反应体系为Fast Start Universal SYBRGreen Master(Rox)12.5μL、上游引物(10μmol/L)0.75μL、下游引物(10μmol/L)0.75μL、水(PCR-grade)9μL、cDNA模板2μL，总体积25μL。反应条件为95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火1min，40个循环，60～95℃熔解曲线分析。引物序列见表2。
结果：经过实时定量PCR检测，阳性细胞标记物表达量与阴性表达量差8个循环以上，相对表达量之比＞28(256倍)，结果与流式检测结果一致，结果见图3。
表2.qRT-PCR引物序列
Figure BDA0003387013170000072
Figure BDA0003387013170000081
实施例4大鼠脐带来源间充质干细胞诱导成脂成骨成软骨分化
试剂：DMEM/F12 Basic培养基、TrypLETM酶、DEPC水(PCR-grade，Gibco公司)，培养皿、离心管、移液管(corning公司)，Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche公司)，TRIzol总RNA提取试剂盒(天根公司)，逆转录试剂盒(Roche公司)，诱导成脂、成骨、成软骨培养基(cyagen公司)，红O染料、改良茜素红染料、阿利新蓝染料(solarbio公司)，引物从生工订购，并按标签说明以DEPC水溶解至10μM.；
仪器：AC2-4S8-CN生物安全柜：ESCO公司；CCL-170B-8二氧化碳培养箱：ESCO公司；CKX53SF倒置相差显微镜：OLYMPUS公司；Cellometer K2全自动荧光分析仪：Nexcelom公司；SorVall ST 16R台式低速冷冻离心机：Thermo公司；LightCycler480Ⅱ实时荧光定量PCR仪：Roche公司。
方法：
(1)成脂分化检测：选取第4代大鼠脐带来源间充质干细胞，常规消化离心后制成单细胞悬液，按1×105/孔接种于6孔板，待细胞融合达90％时更换诱导成脂培养基，然后每2-3天换液1次，在第7、14、21天，用TRIzol总RNA提取试剂盒收获细胞，提取RNA，并逆转录为cDNA，用qRT-PCR进行成脂相关基因(R-PPAR-γ、R-LPL)的检测；3孔用油红O染料染色检测成脂情况，用倒置显微镜进行拍照。
(2)成骨分化检测：选取第4代大鼠脐带来源间充质干细胞，常规消化离心后制成单细胞悬液，按1×105/孔接种于用明胶包被的6孔板中，待细胞融合达70％时更换诱导成骨培养基，然后每2-3天换液1次，在第7、14、21天，用TRIzol总RNA提取试剂盒收获细胞，提取RNA，并逆转录为cDNA，用qRT-PCR进行成骨相关基因(R-RUNX2、R-BGLAP)的检测；3孔用改良茜素红染色检测成骨情况，用倒置显微镜进行拍照。
(2)成软骨分化检测：选取第4代大鼠脐带来源间充质干细胞，常规消化离心后制成单细胞悬液，按1×105/孔接种于用明胶包被的6孔板中，待细胞融合达70％时更换诱导成软骨培养基，然后每2-3天换液1次，在第7、14、21天，用TRIzol总RNA提取试剂盒收获细胞，提取RNA，并逆转录为cDNA，用qRT-PCR进行成软骨相关基因(R-SOX9、R-COL2a1)的检测；3孔用阿利新蓝染色检测成软骨情况，用倒置显微镜进行拍照。诱导成脂、成骨、成软骨相关引物序列见表2。
结果：经基因检测及染色分析，使用本发明方法获得的大鼠脐带来源间充质干细胞具有良好的成脂、成骨、成软骨能力，结果见图4、图5、图6、图7。
对比例1通过胰酶消化获得的大鼠脐带来源间充质干细胞
材料与方法：
试剂：DMEM/F12 Basic培养基、0.25％胰酶(Gibco公司)，培养皿、离心管、冻存管、移液管(corning公司)，100um细胞滤网(biosharp公司)；
仪器：AC2-4S8-CN生物安全柜：ESCO公司；CCL-170B-8二氧化碳培养箱：ESCO公司；CKX53SF倒置相差显微镜：OLYMPUS公司；Cellometer K2全自动荧光分析仪：Nexcelom公司；SorVall ST 16R台式低速冷冻离心机：Thermo公司；IS-AX恒温振荡摇床：苏州捷美公司；905GP超低温冰箱：Thermo公司。
SD大鼠：购自北京维通利华公司。
方法：
(1)先用75％乙醇对大鼠的脐带组织进行快速消毒，再用无菌生理盐水清洗，然后将脐带在培养皿内除去血液，再用无菌生理盐水清洗，将充分控干盐水后的脐带放入50ml离心管剪碎，用无菌剪刀把脐带剪成约2平方厘米的均匀脐带块；
(2)将步骤(1)得到的脐带组织块放入10ml的0.25％胰酶中，于37℃恒温震荡仪中60转/分钟消化1小时，加入10ml含10％FBS的DMEM/F12 Basic培养基以终止消化，100μm细胞滤网过滤后离心；用10ml含10％FBS的DMEM/F12Basic培养基悬起，细胞计数、用适量10％FBS的DMEM/F12 Basic培养基调整浓度为1×105cells/ml，将获得的细胞按照1×104cells/cm2加入到一次性无菌培养瓶中，加入10ml含20％FBS的培养基，放进培养箱中进行培养，培养至第3天将培养容器从培养箱中取出，补加5ml间充质干细胞培养基，继续培养。
结果：使用胰酶消化获得的细胞形态并不均一，也无明显的长梭形，细胞生长达融合状态时无漩涡样(图8)。
对比例2通过胶原酶Ⅱ及胰酶共同消化获得的大鼠脐带来源间充质干细胞材料与方法：
试剂：DMEM/F12 Basic培养基、0.25％胰酶(Gibco公司)，培养皿、离心管、冻存管、移液管(corning公司)，胶原酶Ⅱ(solarbio公司)，100μm细胞滤网(biosharp公司)；
仪器：AC2-4S8-CN生物安全柜：ESCO公司；CCL-170B-8二氧化碳培养箱：ESCO公司；CKX53SF倒置相差显微镜：OLYMPUS公司；Cellometer K2全自动荧光分析仪：Nexcelom公司；SorVall ST 16R台式低速冷冻离心机：Thermo公司；IS-AX恒温振荡摇床：苏州捷美公司；905GP超低温冰箱：Thermo公司。
SD大鼠：购自北京维通利华公司。
方法：
(1)先用75％乙醇对大鼠的脐带组织进行快速消毒，再用无菌生理盐水清洗，然后将脐带在培养皿内除去血液，再用无菌生理盐水清洗，将充分控干盐水后的脐带放入50ml离心管剪碎，用无菌剪刀把脐带剪成小于约2平方厘米的均匀脐带块；
(2)将步骤(1)得到的组织块放入5ml的1mg/ml胶原酶Ⅱ中，于37℃恒温震荡仪中60转/分钟消化0.5小时，放入5ml的0.25％胰酶溶液中，于37℃恒温震荡仪中消化0.5小时，加入10ml含10％FBS的DMEM/F12 Basic培养基以终止消化，100μm细胞滤网过滤后离心；用10ml含10％FBS的DMEM/F12 Basic培养基悬起，细胞计数、用适量10％FBS的DMEM/F12Basic培养基调整浓度为1×105cells/ml，将获得的细胞按照1×104cells/cm2加入到一次性无菌培养瓶中，加入10ml含20％FBS的DMEM/F12 Basic培养基，放进培养箱中进行培养，培养至第3天将培养容器从培养箱中取出，补加5ml间充质干细胞培养基，继续培养。
结果：使用胶原酶II及胰酶共同消化获得的细胞形态不均一，有明显的的杂细胞，无明显的长梭形，细胞生长达融合状态时无漩涡样(图9)。
对比例3大鼠脐带来源间充质干细胞的分离条件对比
材料与方法：
试剂：DMEM/F12 Basic培养基、TrypLETM酶(Gibco公司)，胶原酶I(solarbio公司)，培养皿、离心管、冻存管、移液管(corning公司)，100μm细胞滤网(biosharp公司)；
仪器：AC2-4S8-CN生物安全柜：ESCO公司；CCL-170B-8二氧化碳培养箱：ESCO公司；CKX53SF倒置相差显微镜：OLYMPUS公司；Cellometer K2全自动荧光分析仪：Nexcelom公司；SorVall ST 16R台式低速冷冻离心机：Thermo公司；IS-AX恒温振荡摇床：苏州捷美公司；905GP超低温冰箱：Thermo公司。
SD大鼠：购自北京维通利华公司。
方法：
(1)先用75％乙醇对新鲜离体的大鼠脐带组织进行快速消毒，再用无菌生理盐水清洗大鼠的脐带组织表面，然后将脐带在培养皿内除去血液，再用无菌生理盐水清洗，将充分控干盐水后的脐带放入50ml离心管，用无菌剪刀把脐带剪成约2平方厘米的均匀脐带块；
(2)将步骤(1)得到的组织块分别放入10ml的不同浓度的胶原酶I溶液中(分别为0.5、1、2、2.5mg/ml)，分别于37℃恒温震荡仪中60转/分钟消化1小时，加入10ml含10％FBS的DMEM/F12 Basic培养基以终止消化，100μm细胞滤网过滤，离心机转速为1000rpm离心4min，获得大鼠脐带来源间充质干细胞；
(3)将上述获得的大鼠脐带来源间充质干细胞用10ml含10％FBS的DMEM/F12Basic培养基悬起，计数，加入适量含10％FBS的DMEM/F12 Basic培养基，调整细胞浓度为1×105cells/ml，取7.5ml细胞悬液加入到一次性T75无菌培养瓶中(细胞密度为1×104cells/cm2)，加入10ml含20％FBS的DMEM/F12Basic培养基，放进培养箱中进行培养，培养至第3天将培养容器从培养箱中取出，补加5ml培养基，继续培养。
将步骤(1)得到的组织块分别放入四份10ml的1mg/ml的胶原酶I溶液中，于37℃恒温震荡仪中60转/分钟分别消化0.5、0.75、1、2小时，并按步骤(2)、步骤(3)中所述方法进行分离和培养。
结果：使用1mg/ml胶原酶I于37℃恒温震荡仪中60转/分钟消化0.75小时获得的大鼠脐带来源间充质干细胞细胞状态、形态、均一性为最佳，且没有明显的杂细胞(图10)。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (17)

1.一种大鼠脐带来源间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
(1)先用消毒液对新鲜离体的大鼠脐带组织进行快速消毒；再用清洗液对大鼠的脐带组织表面进行清洗；然后将脐带除去血液，再用清洗液清洗；将充分控干后的脐带放入离心管，剪成均匀脐带块；
(2)将步骤(1)得到的脐带块放入浓度为0.5-2.5mg/ml的胶原酶I溶液中，置于37℃恒温震荡仪中消化0.5-2小时，加入间充质干细胞培养基以终止消化，过滤，离心得大鼠脐带来源间充质干细胞；
(3)将步骤(2)得到的大鼠脐带来源间充质干细胞用培养基悬起得细胞悬液；
(4)将步骤(3)得到的细胞悬液放入培养容器中，加入适量培养基，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第2-4天时将培养容器从培养箱中取出，补加适量培养基，继续培养；
(5)当步骤(4)中培养容器中的贴壁细胞融合率达到50％-80％后，利用消化酶消化，离心，弃去上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行培养，直至融合率达到70-90％后，消化即得P1代脐带来源间充质干细胞；
(6)接照上述培养方法进行必要传代培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述消毒液为75％乙醇。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述清洗液为无菌生理盐水。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述脐带块为1-4平方厘米的脐带组织块，更优选2平方厘米的脐带组织块。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的胶原酶I溶液的浓度为1mg/ml。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中消化的时间为0.75小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中震荡仪的转速为40-100转/分钟，更优选60转/分钟。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的过滤为使用100μm细胞滤网进行过滤。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)和步骤(3)中所述的培养基为含10％FBS的DMEM/F12 Basic培养基。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的细胞悬液为细胞浓度为1×105cells/ml的细胞悬液。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的细胞悬液为密度为0.4-2×104cells/cm2的细胞悬液，更优选密度为1×104cells/cm2的细胞悬液。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述培养基为含20％FBS的DMEM/F12 Basic培养基。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中所述消化为使用TrypLETMExpress酶消化3分钟。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的间充质干细胞培养基为含10％FBS的DMEM/F12 Basic培养基。
15.一种大鼠脐带来源间充质干细胞的冻存方法，包括如下步骤：将权利要求1中步骤(5)或步骤(6)所得脐带来源间充质干细胞消化离心后，用体积比为FBS：DMSO＝9:1的细胞冻存液悬起，按2.5×106cells/ml浓度分装入细胞冻存管，放于程序降温盒于-80℃超低温冰箱冷冻，24h-72h后转移入液氮罐备用。
16.一种大鼠脐带来源间充质干细胞，其是由权利要求1-14任一项所述方法获得的。
17.权利要求1-14任一项所述方法获得的大鼠脐带来源间充质干细胞用于大鼠间充质干细胞的体内研究的用途。
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