WO2018069169A1 - Mikrobioreaktor-modul - Google Patents

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WO2018069169A1 PCT/EP2017/075442 EP2017075442W WO2018069169A1 WO 2018069169 A1 WO2018069169 A1 WO 2018069169A1 EP 2017075442 W EP2017075442 W EP 2017075442W WO 2018069169 A1 WO2018069169 A1 WO 2018069169A1
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cultivation
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multimicrobioreactor
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Yoen Ok ROTH
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Roth Yoen Ok
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Definitions

  • stem cells in medical research, especially in the field of regenerative medicine, an ever-increasing importance. Also in the pharmaceutical research and in the cosmetics industry in some areas the cultivation of stem cells is used, for example, to carry out ADME / Tox studies, ie to test new potential active substances on their properties in terms of absorption, distribution, metabolism, excretion and toxicity.
  • Embryonic and so-called induced pluripotent stem cells are characterized by their almost infinite potential for self-renewal, proliferation and differentiation, even in cell culture.
  • tailor-made methods and devices for cultivation play a crucial role in reliably directing differentiation towards a specific tissue type and at the same time preventing undesired malignant tumor formation (see Lutolf, MP, Gilbert, PM, Blue, HM, Designing Materials to Direct stem cell fate, Nature 2009, 462 (7272), 433-441).
  • organ chips which enable the cultivation of, for example, lung, liver, heart, skin or bronchial tissue (compare Lang, Q., Ren, Y., Wu, Y., Guo, Y. Zhao, X .; Tao, Y., Liu, J .; Zhao, H. Lei, L .; Jiang, H., A multifunctional resealable perfusion chip for cell culture and tissue engineering. RSC Advances 2016, 6 (32), 27183-27190).
  • stem cells can be found in tissue-specific stem cell niches of the body.
  • the stem cells are not only physically bound, but the niche's specific micro-nomenclature is determined by its regulatory network of biochemical processes and signals induced by chemokines, cytokines, growth factors, transmembrane receptors, and the like extracellular matrix the evolution of stem cells.
  • chemokines chemokines
  • cytokines cytokines
  • growth factors growth factors
  • transmembrane receptors and the like extracellular matrix the evolution of stem cells.
  • EP 2 181 188 B1 discloses a microbioreactor which is arranged as a microfluidic system and is suitable for culturing advanced cell cultures, in particular 3D cell cultures and stem cell cultures.
  • a special feature is the construction of a media circuit for perfusing the microbioreactor.
  • the sample carrier on which cell growth takes place is one or more stacked 3D cell chips.
  • the arrangement of several mutually independent microbioreactors on a microtiter plate gives the possibility of a multimicrobioreactor, in particular for high-throughput screening.
  • an artificial stem cell niche which comprises a rotating culture chamber in which a scaffold with mesenchymal connective tissue stem cells is attached, on which umbilical cord blood stem cells are cultured.
  • the culture chamber is supplied via a fluid supply system in which the nutrient supply and the gas and waste exchange takes place through a dialysis membrane and a second fluid system allows a cell harvest from the suspension in the interior of the culture chamber.
  • US 201 1/0207166 A1 discloses an artificial microenvironment corresponding to a replication of a niche in the bone marrow microenvironment consisting of a scaffold coated with mesenchymal stem cells and a culture medium allowing for proliferation of the stem cells into the culture.
  • the artificial niche is suitable for the cultivation of hematopoietic and leukemic cells.
  • the framework here consists of a net-like, expandable matrix of an elastomeric material, e.g. Polycarbonate or polyurethane.
  • a device for the cultivation of adherent cells is known, operated as a disposable system in a continuous process becomes.
  • a special feature of this device is the homogenization of the culture medium in the reactor vessel by a horizontal and a vertical, pillow-shaped pumping element, which is operated in each case by compressed air.
  • Corresponding flow distributors ensure uniform mixing.
  • the gassing of the culture medium takes place by semipermeable membrane tubing.
  • this device has the disadvantage that it is designed only for the cultivation of adherent cells, but not of stem cells with their special requirements.
  • a reactor which can be used as a fermenter for the cultivation of cells, wherein a particularly shear force-free mixing is achieved in that the reactor consists of an inner and an outer chamber and a gentle gas flow is introduced centrally from below ,
  • this reactor is not suitable for the cultivation of adherent cells or stem cells, since no corresponding growth areas are provided.
  • the present invention has the object to take advantage of the known devices to overcome the disadvantages and to provide a simpler, flexible solution for the problem of stem cell culture.
  • the microbioreactor module according to the invention is advantageous to use as a disposable system. A parallel arrangement of several modules in a common or in separate culture spaces allows the use as a multi-microbioreactor. In an arrangement as a multi-microbioreactor, the microbioreactor module according to the invention, due to its defined and controllable microenvironment, is particularly suitable for the screening and selection of optimal cultivation conditions.
  • Figure 1 is a schematic representation of the microbioreactor module, wherein the cultivation of the stem cells takes place in a cultivation container (1).
  • Figure 2 is a schematic representation of a multi-microbioreactor, in which a plurality of microbioreactor modules are introduced into a cultivation room according to DE 10 2014 001 615.3.
  • Figure 3 is a schematic representation of a plan view of the lid (1 1), in which next to an upwardly open number of module slots (17) also various connection options for probes (18) are the online process control at various positions in the reactor vessel (12).
  • Figure 4 is a schematic representation of a microbioreactor module, wherein the mixing of the medium in the reactor vessel (12) is ensured by an arrangement corresponding to a bubble column or a loop reactor.
  • FIG. 5 is a schematic representation of a scale-up bioreactor containing the modules of the invention.
  • Figure 6 is a schematic representation of a side view of a scale-up bioreactor, wherein a gas-permeable air bag is located in the interior of the cultivation container.
  • Figure 7 is a schematic representation of the front view and the side view of a scale-up bioreactor.
  • Figure 8 is a schematic representation of a scale-up bioreactor, wherein the left figure represents the state without active air supply (overpressure in the reactor), and the right figure shows the state with active air supply, which u.a. for imitation of blood pressure (systole and diastole) can be applied.
  • Figure 9 is a schematic representation of a scale-up cultivation unit with a large growth surface.
  • a microbioreactor module wherein the cultivation of the stem cells takes place in a cultivation container (1), which mimics the microenvironment of a stem cell niche.
  • the cultivation container (1) of the microbioreactor module consists of a bag made of a semipermeable natural or synthetic membrane material, so that an exchange of small molecules, such as. Amino acids or glucose, with the environment possible, the cell culture is physically fixed.
  • the cultivation container (1) is equipped with a biocompatible carrier material or framework (preferably organic or inorganic polymer materials) and can also be used for co-cultivation with, for example, mesenchymal stem cells by appropriately populated carriers.
  • the cultivation container (1) is attached to a gas-permeable support tube (2), preferably made of plastic, which at the other end in a plug (3) made of plastic, rubber or silicone ends.
  • the plug (3) is asymmetrical in its thickness.
  • the gas-permeable support tube (2) is made of an elastic or semi-elastic material.
  • the discharge and supply line (4) Inside the support tube (2) runs a discharge and supply line (4), which allows the inoculation of cells, the supply of bioactive molecules and nutrients, and the removal of samples.
  • the discharge and supply line (4) made of an elastic or semi-elastic material.
  • the line (4) terminates on the top of the plug (3) in a connecting piece (5) with a thread, which serves as an adapter for placing, for example, a syringe (6) via which the supply and removal of substances, medium and Cells is regulated.
  • the opening of the conduit (4) in the connector (5) is provided by an elastic closure material which allows piercing with the attached syringe (6) and closes when removing the syringe (6).
  • the core piece is introduced with the stopper in a sheath (7) which is open in the lower direction.
  • the sheath (7) has a total of three openings on the side walls. Two of the openings are located at the level of the plug (3), another in the lower third of the casing (7).
  • the flow openings (8) are provided with a flap (9) which opens or closes depending on the flow direction of the outer medium. The third opening has no such flap and serves as a discharge (10) for resulting waste, for example. Unwanted metabolites.
  • the asymmetrical thickness of the plug (3) and its nature allow by turning the plug (3) in the casing (7) a targeted opening or closing either the flow-through opening (8) or the waste discharge (10).
  • the sheath (7) preferably consists of a semi-elastic plastic material.
  • the harvesting of the cultivated cells can take place either by partial removal via the removal and supply line (4) for continuous process control, or else by separation of the cultivation container (1) from the support tube (2).
  • the microbioreactor unit of the invention can be used in a variety of cultivation systems.
  • the unit is in each case introduced parallel to the respective main flow direction of the device in order to ensure a function according to the invention of the flow-through openings (8).
  • FIG. 2 shows a multi-microbioreactor in which a plurality of microbioreactor modules are introduced into a cultivation space according to DE 10 2014 001 615.3.
  • one or more different microbioreactor modules according to the invention in a plastic lid (1 1) in with Seals provided openings fixed in parallel and placed in an exchangeable reactor vessel (12).
  • the reactor vessel (12) filled with a medium, uniform, gentle and shear-free homogenization is achieved by means of a compressed-air-driven pumping element (13) located at the bottom.
  • the flow direction of the homogenization which is reinforced by perforated plates functioning as a flow distributor (14), runs parallel to the orientation of the microbioreactor modules.
  • Bubble-free gassing of the medium in the reactor vessel is made possible by semipermeable membrane tubes (15).
  • a temperature control can be achieved by incorporating the reactor vessel (12) into a heating element (16), the heating element (16) preferably covering only the lower end of the reactor vessel (12) so that a minimal vertical temperature gradient is created inside the reactor vessel (12) ,
  • the growth conditions in the individual microbioreactor modules can be adjusted individually.
  • the composition of nutrients in the individual, optionally equipped with different carrier materials and cell cultures, cultivation containers (1) can be adjusted.
  • the length of the microbioreactor modules can vary and thus a different immersion depth into the medium in the reactor vessel (12) can be achieved. Thereby, the growth conditions with respect to the temperature (corresponding to the vertical temperature gradient) and the pressure (corresponding to the hydrostatic pressure) with the probe can be measured and individualized.
  • FIG. 3 shows a plan view of the lid (11), in which, in addition to an upwardly open number of module slots (17), there are also various connection possibilities for probes (18) which carry out an online process control at various positions in the reactor vessel (FIG. 12).
  • the number of individual microbioreactor modules in a single reactor vessel (12) is limited only by the size of the reactor vessel, wherein the volume of a single module can also vary from microliter to milliliter scale.
  • FIG. 4 shows a further possible embodiment of a reactor vessel for the use according to the invention of the microbioreactor module, the mixing of the medium in the reactor vessel (12) being ensured by an arrangement corresponding to a bubble column or a loop reactor.
  • An upwardly open plate with small, grid-like arranged openings serves as a bubble generator (19), which is traversed by a compressed air supply (20) pulsating with compressed air.
  • the lid (1 1) is connected to the gaskets (24) with the reactor vessel (12) corresponds to the arrangement of Figures 1 -3, However, it also contains a pressure relief valve (23).
  • the bubbles produced by the bubble generator (19) cause upward mixing flow within an upwardly and downwardly open inner reactor shell (21) fixed to the reactor vessel by brackets (22).
  • the microbioreactor module serves to screen a suitable microenvironment for the particular cell type to be cultured. It will optimize the composition and concentration of various growth factors, the presence of extracellular matrix factors, dissolved oxygen concentration, pH, osmolarity, and the continuous supply of nutrients and removal of metabolites.
  • FIG. 5-9 show schematic representations of a scale-up bioreactor.
  • the scale-up bioreactor contains one or more modules according to the invention, which contain a larger volume, and thus enable a high cell yield under optimized, controlled, and reproducible conditions.
  • the three-dimensional culture in a microbioreactor allows rapid implementation into production and a simple scale-up process. Furthermore, the controllable parameters during cultivation allow a simple and gentle cell harvest.
  • the scale-up bioreactor allows continuous fermentation through the controllable culture conditions.
  • the scale-up bioreactor has a bubble generator (19) above and below the culture container (1).
  • microbioreactor module in general, and of the scale-up bioreactor in particular, is the ability to vary the pressure in the culture vessel to achieve e.g. As the blood pressure, which varies in the body of an individual with systole and diastole, to recreate (blood pressure 120/60 mmHg, ie 1 160/60 mbar). In the microbioreactor module this is made possible by the compressed air supply (20) and the bubble generator (19).
  • the scale-up bioreactor is located in the Cultivation container, a gas-permeable air bag (25), which nachniclet by a change in the volume and pressure in the air bag, the pulsating physical property of the pulsating blood in the culture vessel.
  • the air bag also has the advantage that it allows the gas exchange of carbon dioxide (CO 2 ) and ammonium (NH4).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mikrobioreaktor-Modul für die dreidimensionale Kultivierung von Zellen, insbesondere Stammzellen. Der Mikrobioreaktor ist für den einmaligen Gebrauch bestimmt und kann in erfindungsgemäßer Ausführung als Multimikrobioreaktor genutzt werden.

Description

Mikrobioreaktor-Modul
Beschreibung
Die Nutzung von Stammzellen nimmt in der medizinischen Forschung, insbesondere im Bereich der Regenerativen Medizin, einen immer größer werdenden Stellenwert ein. Auch in der Pharmaforschung und in der Kosmetikindustrie wird in einigen Gebieten die Kultivierung von Stammzellen genutzt, um bspw. ADME/Tox-Studien durchzuführen, also neue potentielle Wirksubstanzen auf Ihre Eigenschaften in Bezug auf Absorption, Distribution, Metabolisierung, Exkretion und Toxizität zu testen.
Embryonale und sog. induzierte pluripotente Stammzellen zeichnen sich dabei durch ihr nahezu unendliches Potential zur Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung, auch in Zellkultur, aus. Maßgeschneiderte Methoden und Vorrichtungen zur Kultivierung spielen jedoch eine entscheidende Rolle dabei die Differenzierung zuverlässig hin zu einer bestimmten Gewebeart zu lenken und gleichzeitig unerwünschte bösartige Ausbildung von Tumoren zu verhindern (vgl. Lutolf, M. P.; Gilbert, P. M.; Blau, H. M., Designing materials to direct stem-cell fate. Nature 2009, 462 (7272), 433-441 ).
Speziell für den Einsatz in der Regenerativen Medizin besteht ein hohes Interesse an in vitro gewonnenem zellulärem Material, das in hohem Maße eine gleichbleibende Qualität aufweist, sodass ein großer Bedarf an standardisierten Zellkultur-Methoden besteht, die eine Langzeitkultivierung und Langzeitdifferenzierung von Stammzellen unter kontrollierten Bedingungen gewährleisten und optimalerweise eine Prozessautomatisierung oder zumindest eine Prozessparallelisierung ermöglichen.
Es wird deshalb intensiv nach Lösungen für die gezielte Kultivierung verschiedener Zelltypen aus pluripotenten Stammzellen gesucht. Erste, teils sehr komplexe Möglichkeiten und Vorrichtungen wurden für die Gewebeherstellung entwickelt. Dabei kommen insbesondere sogenannte Organ-Chips zur Anwendung, die die Kultivierung von bspw. Lungen-, Leber-, Herz-, Haut- oder Bronchialgewebe ermöglichen (vgl. Lang, Q.; Ren, Y.; Wu, Y.; Guo, Y.; Zhao, X.; Tao, Y.; Liu, J.; Zhao, H.; Lei, L.; Jiang, H., A multifunctional resealable perfusion chip for cell culture and tissue engineering. RSC Advances 2016, 6 (32), 27183-27190).
In vivo sind Stammzellen in gewebespezifischen Stammzellnischen des Körpers zu finden. In einer solchen Nische werden die Stammzellen nicht nur physikalisch gebunden, sondern die spezielle Mikrourngebung der Nische bestimmt durch ihr regulatorisches Netzwerk an biochemischen Prozessen und Signalen, induziert durch Chemokine, Cytokine, Wachstumsfaktoren, Transmembran-Rezeptoren, sowie die extrazelluläre Matrix die Entwicklung der Stammzellen. Für die Kultivierung von Stammzellen in vitro wird deshalb versucht, die Mikrourngebung der Stammzellnischen künstlich zu imitieren (vgl. Lutolf, M. P.; Gilbert, P. M.; Blau, H. M., Designing materials to direct stem-cell fate. Nature 2009, 462 (7272), 433-441 ).
Bei der Nachahmung der natürlichen Umgebung von Stammzellnischen spielen neben der zellulären Mikrourngebung auch andere Zelltypen, sowie Gradienten und Konzentrationsgefälle im Medium eine übergeordnete Rolle bzgl. der Effektivität des Prozesses.
Aus der EP 2 181 188 B1 ist ein Mikrobioreaktor bekannt, der als mikrofluidisches System angeordnet und zur Kultivierung von fortgeschrittenen Zellkulturen, insbesondere 3D-Zellkulturen und Stammzellkulturen geeignet ist. Besonderes Merkmal ist der Aufbau eines Medienkreislaufs zur Perfusion des Mikrobioreaktors. Der Probenträger, auf dem das Zellwachstum stattfindet sind hierbei ein oder mehrere aufeinander gestapelte 3D-CellChips. Durch die Anordnung mehrerer voneinander unabhängiger Mikrobioreaktoren auf einer Mikrotiterplatte wird die Möglichkeit eines Multimikrobioreaktors, insbesondere für das High-Throughput- Screening gegeben.
Aus der US 201 1/0136226 A1 ist eine künstliche Stammzell-Nische bekannt, die eine rotierende Kultur-Kammer umfasst, in der ein Gerüst mit mesenchymalen Bindegewebs-Stammzellen angebracht ist, auf dem Nabelschnurblut-Stammzellen kultiviert werden. Hierbei wird die Kulturkammer über ein Fluidzuleitungssystem versorgt, bei dem die Nährstoffzufuhr und der Gas- und Abfallaustausch durch eine Dialysemembran stattfindet und ein zweites Fluidsystem eine Zellernte aus der Suspension im Inneren der Kulturkammer ermöglicht.
Aus der US 201 1/0207166 A1 ist eine künstliche Mikrourngebung bekannt, die einer Nachbildung einer Nische in der Knochenmarks-Mikroumgebung entspricht, die aus einem mit mesenchymalen Stammzellen überzogenen Gerüst und einem Kulturmedium besteht, das eine Proliferation der Stammzellen in die Kultur ermöglicht. Die künstliche Nische ist die Kultivierung von hematopoietischen und leukämischen Zellen geeignet. Das Gerüst besteht hierbei aus einer netzartigen, dehnbaren Matrix aus einem elastomeren Material, z.B. Polycarbonat oder Polyurethan.
Die vorgenannten bekannten Bioreaktoren haben jedoch allesamt den Nachteil, dass ihr Aufbau sehr komplex und somit eine einfache Handhabung, Produktion und insbesondere der Einsatz als Einweg-System limitiert ist.
Aus der DE 10 2014 001 615.3 ist eine Vorrichtung für die Kultivierung adhärenter Zellen bekannt, die als Einweg-System in einem kontinuierlichen Verfahren betrieben wird. Besonderes Kennzeichen dieser Vorrichtung ist die Homogenisierung des Kulturmediums im Reaktorgefäß durch ein horizontales und ein vertikales, kissenförmiges Pumpelement, dass jeweils durch Druckluft betrieben wird. Entsprechende Strömungsverteiler sorgen für eine gleichmäßige Durchmischung. Die Begasung des Kulturmediums erfolgt dabei durch semipermeable Membranschläuche. Diese Vorrichtung hat jedoch den Nachteil, dass sie nur für die Kultivierung adhärenter Zellen, nicht jedoch von Stammzellen mit ihren speziellen Anforderungen ausgelegt ist.
Aus der US46491 17A ist ein Reaktor bekannt, der als Fermenter für die Kultivierung von Zellen genutzt werden kann, wobei eine besonders scherkraftfreie Durchmischung dadurch erreicht wird, dass der Reaktor aus einer inneren und einer äußeren Kammer besteht und ein sanfter Gasstrom zentral von unten eingeleitet wird. Dieser Reaktor ist jedoch nicht für die Kultivierung adhärenter Zellen bzw. von Stammzellen geeignet, da keine entsprechenden Wachstumsflächen vorgesehen sind.
Die vorliegende Erfindung hat die Aufgabe, die Vorteile der bekannten Vorrichtungen zu nutzen, die Nachteile zu umgehen und eine einfachere, flexibel einsetzbare Lösung für die Problemstellung der Stammzellkultur zu liefern. Das erfindungsgemäße Mikrobioreaktor-Modul ist dabei vorteilhaft als Einwegsystem einzusetzen. Eine parallele Anordnung mehrerer Module in einem gemeinsamen oder in getrennten Kulturräumen ermöglicht den Einsatz als Multimikrobioreaktor. In einer Anordnung als Multimikrobioreaktor ist das erfindungsgemäße Mikrobioreaktor- Modul aufgrund seiner definierten und kontrollierbaren Mikroumgebung besonders für das Screening und die Selektion optimaler Kultivierungsbedingungen geeignet.
A usführungsbeispiele
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung wird diese anhand der in den nachfolgenden Figuren dargestellten Ausführungsbeispiele näher erläutert. Dabei werden gleiche Teile mit gleichen Bezugszeichen und gleichen Bauteilbezeichnungen versehen. Weiterhin können auch einige Merkmale oder Merkmalskombinationen aus den gezeigten und beschriebenen unterschiedlichen Ausführungsformen für sich eigenständige, erfinderische oder erfindungsgemäße Lösungen darstellen.
Die dazugehörigen Zeichnungen zeigen in
Figur 1 eine schematische Darstellung des Mikrobioreaktor-Moduls, wobei die Kultivierung der Stammzellen in einem Kultivierungsbehälter (1 ) stattfindet. Figur 2 eine schematische Darstellung einen Multimikrobioreaktors, bei dem mehrere Mikrobioreaktor-Module in einen Kultivierungsraum gemäß DE 10 2014 001 615.3 eingebracht werden.
Figur 3 eine schematische Darstellung einer Draufsicht des Deckels (1 1 ), in dem sich neben einer nach oben offenen Anzahl von Modul-Steckplätzen (17) ebenfalls diverse Anschlussmöglichkeiten für Sonden (18) befinden, die eine Online- Prozesskontrolle an verschiedenen Positionen im Reaktorgefäß (12) ermöglichen.
Figur 4 eine schematische Darstellung eines Mikrobioreaktor-Moduls, wobei die Durchmischung des Mediums im Reaktorgefäß (12) durch eine Anordnung entsprechend einer Blasensäule bzw. eines Schlaufenreaktors gewährleistet wird.
Figur 5 eine schematische Darstellung eines scale-up Bioreaktors, der die erfindungsgemäßen Module enthält.
Figur 6 eine schematische Darstellung einer Seitenansicht eines scale-up Bioreaktors, wobei sich ein gasdurchlässiger Luftbeutel im Inneren des Kultivierungsbehälters befindet.
Figur 7 eine schematische Darstellung der Frontansicht und der Seitenansicht eines scale-up Bioreaktors.
Figur 8 eine schematische Darstellung eines scale-up Bioreaktors, wobei die linke Abbildung den Zustand ohne aktive Luftzufuhr (Überdruck im Reaktor) darstellt, und die rechte Abbildung den Zustand bei aktiver Luftzufuhr darstellt, was u.a. zur Nachahmung des Blutdrucks (Systole und Diastole) angewendet werden kann.
Figur 9 eine schematische Darstellung einer scale-up Kultivierungseinheit mit einer großen Wachstumsoberfläche.
In Fig. 1 ist ein Mikrobioreaktor-Modul abgebildet, wobei die Kultivierung der Stammzellen in einem Kultivierungsbehälter (1 ) stattfindet, der die Mikroumgebung einer Stammzellnische imitiert. Der Kultivierungsbehälter (1 ) des Mikrobioreaktor- Moduls besteht dabei aus einem Beutel aus einem semipermeablen natürlichen oder synthetischen Membranmaterial, sodass ein Austausch von Kleinmolekülen, wie bspw. Aminosäuren oder Glucose, mit der Umgebung möglich, die Zellkultur jedoch physikalisch fixiert ist. Der Kultivierungsbehälter (1 ) ist mit einem biokompatiblen Trägermaterial oder Gerüst bestückt (vorzugsweise organische oder anorganische Polymermaterialien) und kann auch für eine Co-Kultivierung mit beispielsweise mesenchymalen Stammzellen durch entsprechend besiedelte Träger genutzt werden.
Der Kultivierungsbehälter (1 ) ist an einem gasdurchlässigen Halterungsrohr (2), bevorzugt aus Kunststoff, befestigt, welches am anderen Ende in einem Stopfen (3) aus Kunststoff, Gummi oder Silikon endet. Der Stopfen (3) ist dabei asymmetrisch in seiner Dicke. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das gasdurchlässige Halterungsrohr (2) aus einem elastischen oder semielastischen Material.
Im Inneren des Halterungsrohrs (2) verläuft eine Ab- und Zufuhrleitung (4), welche die Einimpfung von Zellen, die Zufuhr von bioaktiven Molekülen und Nähstoffen, sowie die Entnahme von Proben ermöglicht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Ab- und Zufuhrleitung (4) aus einem elastischen oder semielastischen Material.
Die Leitung (4) endet auf der Oberseite des Stopfens (3) in einem Verbindungsstück (5) mit einem Gewinde, das als Adapter für das Aufsetzen bspw. einer Spritze (6), über die die Zu- und Abfuhr von Substanzen, Medium und Zellen geregelt wird. Die Öffnung der Leitung (4) im Verbindungsstück (5) ist dabei von einem elastischen Verschlussmaterial versehen, das ein Durchstechen mit der aufgesetzten Spritze (6) ermöglicht und sich bei Entfernen der Spritze (6) verschließt.
Das Kernstück wird mit dem Stopfen in eine nach untern geöffnete Ummantelung (7) eingebracht. Die Ummantelung (7) weist dabei insgesamt drei Öffnungen an den Seitenwänden auf. Zwei der Öffnungen befinden sich dabei auf Höhe des Stopfens (3), eine weitere im unteren Drittel der Ummantelung (7). Die Durchströmungsöffnungen (8) sind dabei mit einer Klappe (9) versehen, die sich je nach Strömungsrichtung des äußeren Mediums öffnet oder schließt. Die dritte Öffnung weist keine solche Klappe auf und dient als Ableitung (10) für entstehende Abfälle, bspw. unerwünschte Metaboliten. Die asymmetrische Dicke des Stopfens (3) und seine Beschaffenheit ermöglichen durch Drehen des Stopfens (3) in der Ummantelung (7) eine gezielte Öffnung bzw. Schließung entweder der Durchströmungs-Öffnung (8) oder der Abfallableitung (10). Die Ummantelung (7) besteht dabei vorzugsweise aus einem semielastischen Kunststoffmaterial.
Die Ernte der kultivierten Zellen kann entweder durch partielle Entnahme über die Ab- und Zufuhrleitung (4) für eine kontinuierliche Prozessführung, oder aber durch Abtrennung des Kultivierungsbehälters (1 ) vom Halterungsrohr (2) erfolgen.
Die erfindungsgemäße Mikrobioreaktor-Einheit kann in einer Vielzahl von Kultivierungssystemen zum Einsatz kommen. Die Einheit wird jeweils parallel zur jeweiligen Hauptströmungsrichtung der Vorrichtung eingebracht, um eine erfindungsgemäße Funktion der Durchströmungs-Öffnungen (8) zu gewährleisten.
Fig. 2 zeigt einen Multimikrobioreaktor, bei dem mehrere Mikrobioreaktor-Module in einen Kultivierungsraum gemäß DE 10 2014 001 615.3 eingebracht werden. In dieser bevorzugten Ausführungsform werden einer oder mehrere verschiedene erfindungsgemäße Mikrobioreaktor-Module in einem Kunststoffdeckel (1 1 ) in mit Dichtungen versehenen Öffnungen parallel fixiert und in ein auswechselbares Reaktorgefäß (12) eingebracht. Im mit einem Medium gefüllten Reaktorgefäß (12) wird eine gleichmäßige, schonende und scherkraftfreie Homogenisierung durch ein am Boden befindliches druckluftgetriebenes Pumpelement (13) erreicht. Die Strömungsrichtung der Homogenisierung, die durch als Strömungsverteiler (14) fungierende Lochplatten verstärkt wird, verläuft dabei parallel zur Ausrichtung der Mikrobioreaktor-Module. Eine blasenfreie Begasung des Mediums im Reaktorgefäß wird durch semipermeable Membranschläuche (15) ermöglicht. Eine Temperaturregelung kann durch Einbringung des Reaktorgefäßes (12) in ein Heizelement (16) erreicht werden, wobei das Heizelement (16) bevorzugt nur das untere Ende des Reaktorgefäßes (12) bedeckt, sodass ein minimaler vertikaler Temperaturgradient im Inneren des Reaktorgefäßes (12) entsteht.
Die Wachstumsbedingungen in den einzelnen Mikrobioreaktor-Modulen können individuell angepasst werden. Durch separate Ab- und Zuleitungen (4) der einzelnen Module kann die Zusammensetzung an Nährstoffen in den individuellen, gegebenenfalls mit unterschiedlichen Trägermaterialen und Zellkulturen bestückten, Kultivierungsbehältern (1 ) angepasst werden. Die Länge der Mikrobioreaktor-Module kann variieren und damit eine unterschiedliche Eintauchtiefe in das Medium im Reaktorgefäß (12) erreicht werden. Dadurch können die Wachstumsbedingungen bezüglich der Temperatur (entsprechend des vertikalen Temperaturgradienten) und des Drucks (entsprechend des hydrostatischen Drucks) mit der Sonde gemessen und individualisiert werden.
Fig. 3 zeigt eine Draufsicht des Deckels (1 1 ), in dem sich neben einer nach oben offenen Anzahl von Modul-Steckplätzen (17) ebenfalls diverse Anschlussmöglichkeiten für Sonden (18) befinden, die eine Online-Prozesskontrolle an verschiedenen Positionen im Reaktorgefäß (12) ermöglichen.
Die Anzahl der individuellen Mikrobioreaktor-Module in einem einzelnen Reaktorgefäß (12) ist dabei nur durch die Größe des Reaktorgefäßes limitiert, wobei das Volumen eines einzelnen Moduls ebenfalls vom Mikroliter-bis Milliliter-Maßstab variieren kann.
Fig. 4 zeigt eine weitere mögliche Ausführungsform eines Reaktorgefäßes für die erfindungsgemäße Anwendung des Mikrobioreaktor-Moduls, wobei die Durchmischung des Mediums im Reaktorgefäß (12) durch eine Anordnung entsprechend einer Blasensäule bzw. eines Schlaufenreaktors gewährleistet wird. Eine nach oben geöffnete Platte mit kleinen, gitternetzartig angeordneten Öffnungen dient als Blasengenerator (19), der über eine Druckluftzufuhr (20) pulsierend mit Druckluft durchströmt wird. Der Deckel (1 1 ) wird an den Dichtungen (24) mit dem Reaktorgefäß (12) verbunden uns entspricht der Anordnung aus den Figuren 1 -3, enthält jedoch zusätzlich ein Überdruckventil (23). Die durch den Blasengenerator (19) erzeugten Blasen bewirken eine Durchmischungsströmung in vertikaler Richtung, die innerhalb einer nach oben und unten offenen inneren Reaktorhülle (21 ), die durch Halterungen (22) am Reaktorgefäß fixiert ist, nach oben. Im Zwischenraum zwischen innerer Reaktorhülle (21 ) und Reaktorgefäß (12) entsteht dabei eine entsprechende Gegenströmung. Durch das Überdruckventil (23) wird überschüssige Luft nach außen geleitet. Das Öffnen und Schließen des Überdruckventils (23) geht dabei mit der pulsierenden Druckluftzufuhr einher, sodass der bei Luftzufuhr erhöhte Druck von einer Phase der Entspannung abgelöst wird. Ein oder mehrere Mikrobioreaktormodule werden im Deckel (1 1 ) in Analogie zu der in den Figuren 1 -3 dargestellten bevorzugten Ausführungsform parallel zur Strömungsrichtung eingebracht.
In einer bevorzugten Ausführungsform dient das Mikrobioreaktor-Modul zum Screening eines geeigneten Mikromilieus für den jeweiligen zu kultivierenden Zelltyp. Hierbei wird die Zusammenstellung und die Konzentration verschiedener Wachstumsfaktoren, die Präsenz von Faktoren der Extrazellulärmatrix, die Gelöstsauerstoff-Konzentration, der pH-Wert, die Osmolarität und die kontinuierliche Zufuhr von Nährstoffen sowie Entfernung von Metaboliten optimiert.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist die scale-up Version des Bioreaktors, die eine Kultivierung des gewünschten Zelltyps unter optimierten Bedingungen im großen Maßstab ermöglicht. Figs. 5-9 zeigen schematische Darstellungen eines scale-up Bioreaktors. Der scale-up Bioreaktor enthält dabei ein oder mehrere erfindungsgemäße Module, die ein größeres Volumen beinhalten, und damit eine hohe Zellausbeute unter optimierten, kontrollierten, und reproduzierbaren Bedingungen ermöglichen. Die dreidimensionale Kultur in einem Mikrobioreaktor erlaubt eine schnelle Umsetzung in die Produktion und einem einfachen scale-up Prozess. Desweiteren ermöglichen die kontrollierbaren Parameter während der Kultivierung eine einfache und schonende Zellernte.
In einer weiteren Ausführungsform ermöglicht der scale-up Bioreaktor durch die kontrollierbaren Kultivierungsbedingungen eine kontinuierliche Fermentation. In einer Ausführungsform hat der scale-up Bioreaktor einen Blasengenerator (19) oberhalb als auch unterhalb der Kultivierungsbehälter (1 ).
Ein weiterer Vorteil des Mikrobioreaktor-Moduls im Allgemeinen, und des scale-up Bioreaktors im Speziellen ist die Möglichkeit, den Druck im Kultivierungsbehälter durch zu variieren, um damit z. B. den Blutdruck, der im Körper eines Individuums mit Systole und Diastole variiert, nachzuempfinden (Blutdruck 120/60 mmHg, d.h. 1 160/60 mbar). Im Mikrobioreaktormodul wird dies durch die Druckluftzufuhr (20) und den Blasengenerator (19) ermöglicht. Im scale-up Bioreaktor befindet sich im Kultivierungsbehälter ein gasdurchlässiger Luftbeutel (25), der durch eine Änderung des Volumens und Drucks im Luftbeutel die pulsierende physikalische Eigenschaft des pulsierenden Blutes im Kultivierungsbehälter nachempfindet. Dies geht mit der Homogenisierung innerhalb des Kultivierungsbehälters einher. Desweiteren wird der Stoffaustausch als auch der Sauerstoffaustausch durch den erzeugten Druckgradienten auf der Oberfläche des Kultivierungsbehälters gefördert. Der Luftbeutel hat desweitern den Vorteil, dass er den Gasaustausch von Kohlenstoffdioxid (CO2) und Ammonium (NH4) ermöglicht.
Bezuaszeichenliste
1 : Kultivierungsbehälter
2: Halterungsrohr
3: Stopfen
4: Ab- und Zufuhrleitung
5: Verbindungsstück
6: Spritze
7: Ummantelung
8: Durchströmungs-Öffnung
9: Klappe
10: Ableitung
1 1 : Deckel
12: Reaktorgefäß
13: Pumpelement
14: Strömungsverteiler
15: Membranschlauch
16: Heizelement
17: Modul-Steckplätze
18: Sonden
19: Blasengenerator
20: Druckluftzufuhr
21 : innere Reaktorhülle
22: Halterung
23: Überdruckventil
24: Dichtung
25: Gasdurchlässiger Luftbeutel

Claims

Patentansprüche:
1 . Mikrobioreaktor-Modul, umfassend einen Kultivierungsbehälter (1 ), ein Halterungsrohr (2), einen asymmetrischen Stopfen (3), und eine Ummantelung (7), wobei das Mikrobioreaktor-Modul dadurch gekennzeichnet ist, dass
• der Kultivierungsbehälter (1 ) eine Außenhülle aus einem semipermeablen Membranmaterial besitzt, die ein biokompatibles Trägermaterial oder Gerüst umschließt,
• das Halterungsrohr (2) an den Kultivierungsbehälter angebracht ist und eine Ab-und Zufuhrleitung umschließt, die eine Entnahme von Proben als auch eine Zufuhr von Zellen oder bioaktiven Molekülen und Nährstoffen in den Kultivierungsbehälter ermöglicht,
• der asymmetrische Stopfen (3) eine asymmetrische Länge aufweist, in das Innere des Mikrobioreaktor-Moduls ragt, das Halterungsrohr (2) in einer Öffnung fixiert, und das Mikrobioreaktor-Modul durch Kontakt mit der Ummantelung (7) nach außen abdichtet, und je nach Positionierung Öffnungen in der Wandung der Ummantelung öffnet oder verschließt.
2. Mikrobioreaktor-Modul nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Außenhülle des Kultivierungsbehälters (1 ) einem Beutel aus einem semipermeablen organischen oder anorganischen Membranmaterial mit einer Ausschlussgröße von 1 -50 kDa besteht, beispielsweise einem Dialyseschlauch- Material.
3. Mikrobioreaktor-Modul nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial im Kultivierungsbehälter (1 ) aus natürlichen oder synthetischen Polymeren oder anorganischen Materialen oder einer Kombination derer, oder einem entsprechenden Gerüst besteht. Geeignete Trägermaterialien können dabei beispielsweise Kollagen, Elastin, Fibrin, Alginat, Seide, Glykoaminoglucan, Hyaluronsäure, Chitosan, Cellulose, Fucoidan oder Silaffin sein.
4. Mikrobioreaktor-Modul nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Halterungsrohr (2), die Ab- und Zufuhrleitung (4) und die Ummantelung (7) aus einem elastischen, gasdurchlässigen Material bestehen, bspw. Silikon oder einem vergleichbaren Kunststoff und dass die Ummantelung mehrere durch Klappen (9) verschließbare Durchströmungsöffnungen (8) aufweist.
5. Mikrobioreaktor-Modul nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial oder das Gerüst mit Stammzellen, bspw. mesenchymalen Stammzellen, beschichtet ist.
6. Mikrobioreaktor-Modul nach einem der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, dass der Kultivierungsbehälter einen gasdurchlässigen Luftbeutel beinhaltet.
7. Multimikrobioreaktor, bestehend aus einem oder mehreren Mikrobioreaktor- Modulen nach einem der Ansprüche 1 -6, die parallel angeordnet sind und in einen gemeinsamen Kultivierungsraum eingebracht werden. Die Wachstumsbedingungen in den einzelnen Mikrobioreaktormodulen können individuell durch die Zusammensetzung und Versorgung im Kultivierungsbehälter, sowie die Länge und damit verbundene Eintauchtiefe der Module angepasst werden.
8. Multimikrobioreaktor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere Mikrobioreaktor-Module in einem gemeinsamen Kunststoffdeckel (1 1 ) fixiert sind, in dem ebenfalls Anschlussmöglichkeiten für Messsonden (18) sowie wahlweise Überdruckventile (23) vorgesehen sind.
9. Multimikrobioreaktor nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der gemeinsame Kultivierungsraum ein mit Medium gefülltes Reaktorgefäß (12) ist, in dem die Homogenisierung durch ein druckluftbetriebenes Pumpelement (13) in Kombination mit einem Strömungsverteiler (14) gewährleistet wird.
10. Multimikrobioreaktor nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der gemeinsame Kultivierungsraum ein mit Medium gefülltes Reaktorgefäß ist, in dem die Homogenisierung durch einen Blasengenerator (19) erreicht wird, indem pulsierende Druckluft durch eine nach oben durch gitternetzartig angeordnete Löcher geöffnete Platte geleitet wird.
1 1 . Multimikrobioreaktor nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass im inneren des Reaktorgefäß (12) eine nach oben und unten geöffnete innere Reaktorhülle (21 ) über Halterungen (22) fixiert ist und dadurch eine Strömungszirkulation im Medium erreicht wird.
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