BRPI0616924A2

BRPI0616924A2 - método de cultura de células e dispositivo para implementar o mesmo

Info

Publication number: BRPI0616924A2
Application number: BRPI0616924-4A
Authority: BR
Inventors: Fernandez Jose Antonio Castillo
Original assignee: Artelis
Priority date: 2005-10-04
Filing date: 2006-10-03
Publication date: 2012-04-17
Also published as: EP1931761A1; JP2009509559A; US20120171764A1; CN101316925B; AU2006298724B2; US8137959B2; CN102994384A; AU2006298724A1; BE1016793A4; CA2624729A1; IL190546A0; CN101316925A; EP1931761B1; MY157374A; IL190546A; KR20080071980A; BRPI0616924B1; US20140162363A1; WO2007039600A1; KR101353633B1

Abstract

MéTODO DE CULTURA DE CéLULAS E DISPOSITIVO PARA IMPLEMENTAR O MESMO. A presente invenção refere-se a um dispositivo de cultura (1) que compreende um frasco de cultura (2) proporcionado com uma cobertura (19) em que se encontra uma primeira zona (3) para transferir meio de cultura essencialmente livre de células internas a uma segunda zona de cultura (5), uma terceira (4) e uma quarta (6) zona para transferir o meio de cultura essencialmente livre de células. A terceira zona (4) é interna à segunda zona (5) e externa à primeira zona (4) e a quarta zona (6) sendo uma zona externa à referida segunda zona (5). Todas as referidas zonas estão em um meio de comunicação. O dispositivo compreende também um meio de circulação de meio de cultura, que permite a circulação do meio de cultura através da zona de cultura (5) a partir do fundo para o topo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE CULTURA DE CÉLULAS E DISPOSITIVO PARA IMPLEMENTAR O MES- MO".

A presente invenção referese à cultura de células por meio de um dispositivo compreendendo:

- um recipiente de cultura proporcionado com um invólucro, em que está situado pelo menos uma primeira zona e pelo menos uma segunda zona, a referida primeira zona sendo uma zona de transferência para o meio de cultura essencialmente livre de células e a referida segunda zona sendo uma zona de cultura de células, a referida primeira zona estando externa à segunda,

- meios de circular o meio de cultura, permitindo a circulação do meio de cultura através da zona de cultura, a referida zona de cultura com- preendendo uma parede inferior e uma parede superior, cada parede sendo proporcionada com orifícios permitindo uma transferência de meio de cultura essencialmente livre de células.

O referido dispositivo de cultura é conhecido, por exemplo, a partir da patente U.S. 5.501.971, a qual descreve um recipiente de cultura em que está situada uma zona de cultura externa a um dueto interno de meio de transferência. As células estão situadas na zona de cultura externa, a qual é uma espécie de cesta compreendendo veículos, e o meio de cultura flui do topo para a base através da referida zona de cultura. A seguir, o meio é revestido na parte inferior da zona de cultura, é utilizado por meio de um dispositivo de circulação de meio de cultura através do acima mencionado dueto em uma porção superior do recipiente de cultura e então passa nova- mente através da zona de cultura. A patente U.S. 5.507.971 descreve várias alternativas, mas o meio de cultura sempre passa através da zona de cultura do topo para a base.

Um inconveniente dos referidos dispositivos é que ele não está adaptado a todos os tipos de cultura de células. Na verdade, o referido dis- positivo é projetado apenas para a cultura de células em microveículo s em um leito fixo ou compactado, e não é adequado, em absoluto, para a cultura de células em suspensão ou em microveículo s em um leito fluidizado. Na verdade, no dispositivo da patente U.S. 5.501.971, as células em suspensão sem veículos, ou microveículo s ou em veículos não imobilizados, possuem a tendência a sedimentar e a acumular na base da zona de cultura uma vez que estão sujeitas à gravidade, enquanto o fluxo do meio de cultura através da referida zona de cultura ocorre do topo para a base, a referida acumula- ção de células na base da zona de cultura é a maior. Conseqüentemente, as células são acondicionadas uma sobre a outra e estão em contato uma com a outra e os nutrimentos dentro da referida zona não estão muito acessíveis para as células.

No reator da patente U.S. 5.501.971, no caso das culturas, em veículos não imobilizados ou microveículo s, de células as quais são espé- cies frágeis que suportam poucos esforços, as células são submetidas ao efeito da gravidade, ao fluxo descendente do meio de cultura e ao peso dos veículos, o qual danifica enormemente a sobrevivência da cultura. Além do mais, uma aplicação para a cultura em suspensão é inconcebível no biorrea- tor da patente U.S. 5.501.971 uma vez que as células em suspensão não podem, sob nenhuma circunstância, serem submetidas ao contato célula a célula. Na verdade, se o referido contato estiver presente, as células criam ligações protéicas entre si e se agregam. A referida agregação causa a mor- te das células pela falta de oxigênio e de nutrimento.

O objetivo da presente invenção é abrandar os inconvenientes do método anterior pela obtenção de um dispositivo de cultura tornando pos- sível cultivar ambas as células em suspensão, as células que dependem de ancoragem em veículos ou microveículo s enquanto assegura um esforço mínimo sobre as células e previne a referida acumulação de células na base da zona de cultura.

Para resolver o referido problema, um dispositivo como o indica- do no início do referido texto, é proporcionado de acordo com a presente invenção, caracterizado pelo fato de que o mesmo também compreende pe- lo menos uma terceira e pelo menos uma quarta zona, ambas sendo zonas de transferência de meio de cultura essencialmente livres de células, a refe- rida terceira zona sendo a zona interna à referida segunda zona e externa à referida primeira zona e a referida quarta zona sendo a zona externa à refe- rida segunda zona, a referida terceira zona sendo em uma comunicação de meio com a primeira e a segunda zona, e a referida quarta zona estando em comunicação de meio com a segunda zona (a zona de cultura) e com a pri- meira zona (o zona de transferência de meio de cultura) via os meios de cir- culação do meio de cultura, e de modo que os meios de circulação do meio de cultura permitem a circulação do meio de cultura de baixo para cima na referida segunda zona de cultura.

A referida quarta zona mais particularmente encerra um volume de gás consistindo na atmosfera ambiente do biorreator e pode também constituir uma zona de oxigenação para o referido meio de cultura.

Conseqüentemente, o meio de cultura, o qual passa através da primeira zona de transferência de meio de cultura de baixo para cima, alcan- ça o topo da primeira zona de transferência de meio de cultura e se descar- rega na terceira zona, a qual está em comunicação de meio com a primeira zona, o meio de cultura flui para baixo, sujeita ao fluxo imposto pelos meios de circulação, aos efeitos da gravidade e dos recipientes comunicantes, passa através do orifício de passagem do meio de cultura na parede inferior da segunda zona de cultura, a seguir sobe novamente pelo trajeto na dire- ção do topo da zona de cultura pelos efeitos dos recipientes comunicantes ou pelos efeitos dos meios de circulação do meio de cultura, ou por ambos, e então se descarrega na quarta zona de transferência do meio de cultura, a qual está em comunicação com a primeira zona de transferência do meio de cultura pela via dos meios de circulação. Os meios de circulação do meio de cultura então tomam novamente o meio de cultura o topo da primeira zona de transferência de meio de cultura e o ciclo recomeça. Conseqüentemente, as células que estavam situadas na zona de cultura se deslocaram de baixo para cima pelo meio de cultura se beneficiam dos efeitos da gravidade, neu- tralizada em parte pelo fluxo do meio de cultura. O fluxo permite uma melhor dispersão de células sozinhas ou em microveículo s na zona de cultura e os esforços prejudiciais para elas são reduzidos. Quando os termos células em veículos ou em microveículo s são usados, deve ser entendido que os veículos podem estar em um leito fixo ou compactado ou em um leito fluidizado.

Do mesmo modo, quando os termos "cultura de células" ou "cé- lulas" são usados, deve ser entendido em particular que se faz referência a células de animais, quer seja para a produção viral, de proteínas ou de ou- tros produtos de recombinação, metabolitos celulares, uma cultura de célu- las de tecidos (possivelmente em veículos de três dimensões), células de haste ou bactérias ou fermentos.

Será mais facilmente compreendido por aqueles versados na técnica que células em veículos ou microveículo s sofrem menos na com- pactação, em particular no caso de um leito fixo, do que células em suspen- são sem veículos ou sem microveículo s, mas não obstante verão facilmente a vantagem na oxigenação da cultura e em na nutrição da referida direção de fluxo dentro da zona de cultura. Na verdade, é sabido que o projeto do recipiente de culturas é uma etapa chave na cultura de células. O projeto dos referidos recipientes deve ser tal que não haja áreas mortas, não supri- das por meio de cultura fresco, ou em que as células se acumulem; é tam- bém muito vantajoso para as células estarem em contato direto com o meio de cultura ao invés de estar em contato uma com a outra para a sua repro- dução e/ou metabolismo de produção.

A presente invenção fornece um dispositivo flexível adaptado às culturas de suspensão e às culturas sobre veículos ou em microveículo s, as quais permitem uma redução no esforço aplicado às células e previnem a acumulação de células em uma zona particular da zona de cultura, pela re- dução do efeito da gravidade que é exercido nas células e prevenindo a pre- sença de zonas mortas não fornecidas com meios de cultura frescos ou nos quais as células podem acumular. Além do mais, para a aplicação em cultu- ras em suspensão, o dispositivo de acordo com a presente invenção permite uma boa dispersão de células por virtude de, por um lado, o fluxo de baixo para cima e, por outro lado, a gravidade que é ainda parcialmente aplicada às células. Os termos "parede inferior proporcionada com orifícios para a passagem de um meio de cultura essencialmente livre de células" devem ser tomados como significando uma parede situada na base da zona de cultura, a qual pode estar situada na parte de baixo da zona de cultura ou na parte mais baixa da parede vertical delimitando a referida zona de cultura e que permite o meio de cultura passe e não as células em microveículo s ou veí- culos ou mesmo em suspensão. De modo similar, a parede superior propor- cionada com orifícios para a passagem de um meio de cultura essencial- mente livre de células pode ser uma parede situada no topo da zona de cul- tura ou na porção superior da parede vertical delimitando a zona de cultura com características idênticas àquele descrito acima.

Naturalmente o meio de cultura que se descarrega da primeira zona para a terceira zona pode se descarregar sobre o topo das paredes da primeira zona e no referido caminho alcança a terceira zona ou pode se des- carregar via um orifício ou tubo instalado no topo ou porção da base da pri- meira zona de transferência de meio de cultura. O mesmo se aplica ao meio de cultura que se descarrega da segunda zona dentro da quarta zona.

De forma vantajosa, os meios de circulação do meio de cultura consistem em uma bomba de centrifugação situada em uma porção da base do referido dispositivo de cultura, compreendendo pelo menos um dispositivo magnético girando sobre uma linha central de rotação substancialmente cen- tral (real ou virtual), pelo menos uma entrada e pelo menos uma saída para o meio de cultura, os referidos meios de circulação sendo proporcionado para sugar o meio de cultura em um sifão criado por uma rotação do disposi- tivo magnético e para propelir o meio de cultura na direção da descarga do meio de cultura localizada na zona externa ao referida dispositivo magnético e na referida bomba de centrifugação é conduzido por um motor magnético giratório proporcionado para efetuar a circulação de meio de cultura sem comunicação com o exterior do dispositivo, e pelo menos um dispositivo de guia, projetado para guiar o meio de cultura propelido através da referida saída na direção do topo do recipiente.

Um inconveniente do biorreator convencional existente é que eles são proporcionados com um sistema de agitação de lâmina ou de para- fuso para fornecer a homogeneização do meio de cultura dentro do recipien- te de cultura sem necessariamente proporcionar a circulação adequada. No referido caso, o biorreator compreende um eixo proporcionado com forros mecânicos frágeis duplos, por exemplo, fabricado com dispendioso carbone- to de silício e que passa através do revestimento do biorreator. A referida passagem através do revestimento do biorreator é um sério risco para a con- taminação e um risco significativo de avaria.

Outros tipos de biorreator compreendem uma circulação externa do meio de cultura. O meio de cultura passa através uma tubulação através uma bomba peristáltica ou um sistema semelhante. Obviamente, a referida solução, embora em parte impedindo contaminações diretas, tem um outro inconveniente. Não é aplicável para culturas de longo prazo. Na verdade, as tubulações usadas no referido tipo de bomba sejam sujeitas ao desgaste durante culturas de longa vida, a qual também envolve problemas de sela- gem e contaminação.

A circulação do meio de cultura como descrito acima também causa uma dificuldade técnica de conseguir um efeito de "fonte". Conse- qüentemente, não basta fazer o líquido fluir através da zona de cultura em uma gota de pressão muito baixa, é também necessário manter uma dife- rença de nível dentro do recipiente de cultura simultaneamente. Na verdade, trazendo o líquido na direção do topo da primeira zona de transferência de meio de cultura é uma etapa chave, mas também assegura que o meio de cultura não se acumule excessivamente na base da quarta zona também. Se o meio de cultura se acumula na base da quarta zona de cultura, o efeito de descarga será reduzido e a circulação cíclica do meio de cultura da primeira zona de transferência de meio de cultura para a terceira zona de transferên- cia do meio de cultura e então à segunda zona de cultura e finalmente den- tro da quarta zona de transferência do meio de cultura não será a melhor.

Conseqüentemente, os meios de circulação de acordo com a presente invenção irão compreender um dispositivo magnético girando em torno de um eixo de rotação substancialmente central, e uma entrada de meio de cultura e saída.

Para culturas de pequena escala, o dispositivo magnético irá, por exemplo, seja uma barra magnética simples, conduzida por um ímã ex- terno, tendo recursos para taxas de fluxo de 0,6 a 6 L/min (quer dizer, 1 a 10 mL/seg). Por causa do referido, não há risco de contaminação uma vez que a circulação do sistema do meio de cultura não se comunica com o exterior, mas é conduzido por um dispositivo externo ao recipiente de cultura. Uma bomba peristáltica pode também ser prevista de acordo com a presente in- venção, mas preferencialmente para culturas de curta duração.

Para culturas de larga escala, o dispositivo magnético-será um rotor magnetizado com uma taxa de fluxo de entre, por exemplo, 10 e 200 L/min, em particular de 20 a 150 L/min e preferivelmente de 25 a 100 L/min.

Em uma modalidade particular, o dispositivo de acordo com a presente invenção compreende uma série de módulos, cada módulo com- preendendo a referida primeira zona, a referida segunda zona, a referida terceira zona e a referida quarta zona, e em que os módulos adjacentes na referida série de módulos estão em comunicação de meio, a referida primei- ra zona e a referida quarta zona de cada módulo estando em comunicação com os referidos meios de circulação, direta ou indiretamente.

A referida modalidade torna possível obter um dispositivo parti- cularmente flexível e permite um aumento na escala até um volume de 100 litros.

De modo geral, o aumento de escala é uma etapa complexa na produção de produtos de recombinação, vírus, metabólitos de células ou outros ou na cultura de células uma vez que o referido aumento de escala de modo geral causa problemas com zonas supridas de maneira medíocre, quer seja com oxigênio ou com nutrimentos. Na modalidade descrita acima, o dispositivo de cultura compreende uma série de módulos adjacentes, por exemplo, empilhados ou justapostos. Da quarta zona do primeiro módulo de cultura, o meio de cultura alcança os meios de circulação do meio de cultura passando através dos outros módulos de cultura. A invenção prevê vários tipos de módulo de volume pré-determinado. Por exemplo, módulos de 500 mL ou de 5 litros, dotados de um volume de 500 mL a 5 litros, incluindo to- dos os volumes compreendidos dentro da faixa ou limitando a faixa. Conse- qüentemente, para uma cultura de 3 litros, 6 módulos de 500 mL serão usa- dos. Por exemplo, seis módulos serão empilhados tanto em um recipiente suficientemente largo ou por meio de módulos que podem ser interconecta- dos de modo a formar o referido recipiente.

No caso do reator do documento dos E.U.A. 5.501.971, se um volume de cultura de 3 litros é necessário, uma altura H da zona de cultura será necessária. O meio de cultura que alcança a base da zona de cultura na referida patente está praticamente esgotado,-em particular com relação ao oxigênio. Além disso, os autores da patente U.S. 5.501.971, contemplam colocar um sensor de oxigênio no topo da zona de cultura e na base deste último e sobreprover o ambiente do reator com oxigênio. Infelizmente, o refe- rido tipo de superoxigenação não é recomendado, em absoluto, uma vez que o referido produz uma oxidação de componentes celulares das células no topo da zona de cultura e a morte da célula se segue. Além do mais, quando os autores da patente 5.501.971, contemplaram o aumento da esca- la, é nos termos da largura que o referido é realizado uma vez que em ter- mos de altura não é mais possível. Naturalmente, o espaço ocupado no as- soalho torna-se rapidamente incontrolável. Como é conhecido para aqueles versados na técnica, o espaço é um parâmetro crítico, especial nos espaços brancos onde as eficiências são calculadas de acordo com o volume de ar a ser tratado de modo a obter ar estéril, o referido tipo de tratamento de ar sendo muito caro. O volume de ar a ser tratado é obtido pela multiplicação pela altura do "espaço branco" a superfície no assoalho ocupado pelo o bior- reator, seu equipamento, e pessoas manuseando o dispositivo de cultura.

Conseqüentemente, através o uso de módulos empilhados ou justapostos, de acordo com rendimentos a ser conseguidos, o espaço é re- duzido. Além do mais, o volume de cultura através do qual o meio de cultura deve filtrar-se antes de uma vez novamente estar em contacto com o ar am- biente do biorreator é apreciavelmente reduzido. No caso de nosso exemplo anterior, o volume é dividido por 6. De acordo com uma modalidade vantajosa, a provisão conse- qüentemente é feita para projetar um recipiente autoclávico, vazio, de cultura com uma altura predeterminada (feita de vidro ou de aço inoxidável) ou reci- piente de cultura vazio ou descartável, compreendendo os meios de circula- ção do meio de cultura na base do recipiente. Bastará então posicionar o número N de módulos exigidos no recipiente acima dos meios de circulação do meio de cultura e fechar o recipiente novamente por meio de um revesti- mento adaptado. No referido caso, seja para uma cultura de 5 litros ou de 50 litros, o tamanho do recipiente permanece o mesmo.

A referida modalidade pode ser particularmente vantajosa para laboratórios dotados de poucos meios uma vez que é particularmente bara- ta. Na verdade, se o recipiente fornecido é projetado para uma cultura de 35 litros e a cultura necessária é de apenas 5 litros ou 10 litros, é o bastante colocar, por exemplo, sobre os meios de circulação do meio de cultura, um ou dois módulos de culturas de 5 litros. O referido particularmente reduz a quantidade de investimento uma vez que a parte dispendiosa sempre per- manece a mesmo para qualquer cultura de 5 a 35 litros.

Além do mais, seja para uma cultura de 5 litros ou de 35 litros ou mesmo mais, a superfície do assoalho será a mesma, e o aumento da esca- a não envolve qualquer volume de ar maior a ser tratado. Além do mais, pe- lo fato do meio de cultura estar, entre cada passagem em um módulo, em contato com o ar ambiente no reator, os problemas de aumento da escala são grandemente reduzidos.

Como mencionado previamente, os meios de circulação do meio de cultura são particularmente eficazes, cobrindo escalas dos valores parti- cularmente adaptados ao dispositivo de acordo com a presente invenção. Conseqüentemente, a taxa de fluxo em cada módulo é idêntica e, no nível em que se dá a saída, o aumento na escala também não é um problema de acordo com a presente invenção.

Em uma modalidade particularmente vantajosa, os meios de cir- culação são confinados em um módulo de base, o referido módulo de base estando em comunicação de meio com pelo menos uma primeira zona de transferência de meio de cultura e pelo menos uma quarta zona de transfe- rência do meio de cultura, direta ou indiretamente.

Uma vez que os meios de circulação do meio de cultura estão freqüentemente em zonas que apresentam riscos de contaminação cruzada ou contaminação externa, através da presença de algumas zonas que não estão acessíveis para a limpeza, obter um módulo de base que pode, por exemplo, sem, no entanto, estar sendo limitado a isso, ser inserido em um simples recipiente de vidro é particularmente vantajoso. O referido módulo de base é adaptado aos módulos de cultura, permitindo a comunicação de meio de cultura entre a primeira área de transferência do meio de cultura de todos os módulos presentes e a saída do meio de cultura dos meios de cir- culação do meio de cultura e permitindo a comunicação do meio de cultura entre todas as quartas zonas de todos os módulos de cultura presentes e a entrada do meio de cultura nos meios de circulação do meio de cultura, dire- ta ou indiretamente, ou seja, passando através de outro módulo ou não.

O dispositivo preferivelmente também compreende um módulo principal, o referido módulo principal compreendendo pelo menos o revesti- mento. O referido módulo principal sendo capaz de ser projetado interromper a superimposição mencionada acima.

Em uma modalidade vantajosa, pelo menos uma quarta zona compreende pelo menos uma parede de fluxo substancialmente vertical ou inclinada.

A presença da referida parede de fluxo reduz a formação de es- puma, a qual pode aparecer durante a descarga da segunda zona de cultura para a quarta zona de transferência do meio de cultura. Na verdade, sem a referida parede de fluxo, o fluxo de meio de cultura da segunda para a quar- ta zona seria um fluxo turbulento, o qual teria necessariamente como sua conseqüência uma indesejável formação de espuma. Deve ser apontado que a formação de espuma é um problema grave em muitos métodos da cultura uma vez que o meio de cultura é rico em proteínas. Agitar um fluido rico em proteína sempre causa o aparecimento de espuma. Conseqüente- mente, um fluxo turbulento teria o referido mesmo efeito, e é por isso que, de forma vantajosa, a invenção compreende a referida parede de fluxo para reduzir o a turbulência do fluxo.

Além do mais, a referido quarta zona de transferência do meio de cultura é também a zona em que o meio de cultura está em contato com a atmosfera ambiente do dispositivo de acordo com a presente invenção. A presença da parede de fluxo melhora o referido contato e em conseqüência as trocas de oxigênio entre a atmosfera ambiente e o meio de cultura, pelo aumento da área de superfície do contato entre gás e líquido.

De forma vantajosa, a fim estabilizar a película, é também possí- vel adicionar aditivos ao meio de cultura com o objetivo de modificar as pro- priedades reológicas da água, os referidos aditivos incluídos no grupo con- sistindo de surfactantes, Pluronic F68, glicerina, cátions quaternários de a- mônio e qualquer outro aditivo para modificar as propriedades reológicas do meio de cultura.

Em uma modalidade particularmente preferida, a parede de fluxo essencialmente vertical ou inclinada compreende uma membrana hidrófila.

Na verdade, se a parede de fluxo não é ou não compreende a superfície hidrófila, pode ser muito difícil obter uma película de meio de cul- tura na referida superfície. Além do mais, a película, quando é formada em uma parede convencional, é instável. Conseqüentemente, revestindo-se a parede de fluxo com a membrana hidrófila, a qual desempenha a função de uma esponja, o meio de cultura é naturalmente espalhado e flui de maneira uniforme. Conseqüentemente, o contato superfície entre a película de meio de cultura e a atmosfera ambiente é melhorado extremamente, o que permi- te uma oxigenação compatível com densidades altas de célula. Os coeficien- tes totais de transferência de oxigênio obtidos estão em torno de 10^-3 a em torno de 10^-2 s^-1.

Se, na modalidade com módulos de cultura, algumas ou todas as quartas zonas compreendem uma parede de fluxo com uma membrana hidrófila, as trocas de gás-líquido são melhoradas ainda mais. Conseqüen- temente, mesmo o último módulo na série é fornecido com um meio de cultu- ra oxigenado. Em alguns casos do método anterior com circulação de meio de cultura, quando a cultura é produzida, por exemplo, com um volume de 200 litros, as células no final da circulação do meio de cultura estão relati- vamente mal supridas e o crescimento da célula não é homogêneo no bior- reator.

No dispositivo de acordo com a presente invenção, o referido não ocorre; não existem zonas mal supridas ou mortas.

Em uma modalidade vantajosa, o dispositivo de acordo com a presente invenção compreende pelo menos um orifício de entrada de gás e um orifício de saída de gás.

O recipiente de cultura preferivelmente compreende pelo menos um orifício de entrada de gás e um orifício de saída de gás. Da referida for- ma, é possível enriquecer a atmosfera ambiente do dispositivo de acordo com a presente invenção com oxigênio, por exemplo, enquanto o oxigênio é consumido pelas células. É possível também suprir a atmosfera ambiente com outros gases, por exemplo, adicionando CO2 com o objetivo de modifi- car o pH, ou qualquer outro gás de modo geral usado em cultura de células.

O orifício de saída torna possível prever pressões excessivas e descarregar o gás com o baixo conteúdo de oxigênio ou simplesmente parte do gás da atmosfera ambiente com o objetivo de reduzir a pressão ambiente do dispo- sitivo de acordo com a presente invenção. Também, a provisão é feita para que se possa bloquear ou "estrangular" a referida saída de gás no caso de um pequeno aumento de pressão ser desejável.

A entrada de gás pode ser situada ou conectada à primeira, à segunda, à terceira ou à quarta zona do recipiente de cultura. A primeira e quarta sendo zonas preferenciais. A terceira zona de transferência do meio de cultura não é muito acessível para o contato entre gás e líquido e a se- gunda zona do recipiente de cultura é o recipiente de cultura da célula, em que o contato direto entre gás e líquido pode apresentar um risco de oxida- ção dos componentes da célula, o que não é desejável.

De forma vantajosa, o orifício de entrada de gás is conectado a pelo menos uma quarta zona de transferência do meio de cultura.

Pelo fato da quarta zona de transferência do meio de cultura também servir como uma zona de oxigenação, uma vez que é nessa última que se dá o contato entre gás e líquido da melhor forma, com ou sem a pa- rede de fluxo, é vantajosa que seja essa última a receber a adição de gás fresco com o objetivo de promover a oxigenação do meio de cultura. Além do mais, o meio de cultura que se descarrega na referida quarta zona é o meio de cultura usado pelas células, e em conseqüência parte do oxigênio é con- sumido, pode também ser necessária a modificação para o pH e é em con- seqüência uma vantagem para o gás (oxigênio, ar, CO2 ou outro) entrar atra- vés a referida quarta zona de cultura com o objetivo de aumentar a eficiência de qualquer regulação ou oxigenação ou-modificação de pH.

Em uma modalidade particular, a entrada de gás está conectada a um tubo pulverizador.

A invenção, em uma modalidade particular, proporciona a dis- persão das bolhas gasosas a ser efetuada dentro do dispositivo de acordo com a presente invenção. A dispersão de bolhas pode ser efetuada por um pulverizador imerso no meio de cultura na primeira, segunda, terceira e quar- ta zona de transferência do meio de cultura (bolhas grandes ou microbolhas, de acordo com a aplicação). A dispersão de bolhas será preferivelmente efe- tuada por um pulverizador imerso no meio de cultura na primeira ou quarta zona de transferência do meio de cultura.

Em uma modalidade particular, o revestimento do recipiente de cultura é conectado a pelo menos parte da referida parede superior de pelo menos uma segunda zona de cultura.

A referida modalidade particularmente preferida permite a coleta simplificada de amostras, o que minimiza o risco de contaminação. Particu- larmente durante culturas em microveículo s, a coleta de amostras não é, de modo geral uma etapa sem qualquer risco. Para medir a densidade da célu- la, existem atualmente poucos meios, os quais também são muito fastidiosos e não muito confiáveis. Conseqüentemente, o melhor meio de medir a den- sidade da célula tirando amostras de veículos e as observando sob o mi- croscópio, possivelmente após a coloração.

Na verdade, em biorreatores convencionais, e em particular no biorreator da patente U.S. 5.501.971, a coleta de amostras é do mesmo mo- do impossível pelo fato da parede superior da zona de cultura não puder ser simplesmente aberta ou isso representar um sério risco de contaminação. Na verdade, o usuário deve abrir o revestimento do recipiente de cultura, que é freqüentemente volumoso e pesado e em conseqüência difícil de mo- ver em um fluxo estéril, e então segurar o revestimento, de modo geral fixa- do a uma lâmina ou outros dispositivos para erguer o meio de cultura e em conseqüência é pesado e volumoso, e ele deve assegurar-se de que não tocou em nada e deve segurar em uma das mãos apenas para que não haja contaminação. A seguir, com a outra mão, ele deve abrir a parede superior da zona de cultura e segurá-la coma outra mão. Então, por meio de uma braçadeira em uma terceira mão, deve retirar amostras de um ou vários veí- culos a fim poder avaliar a densidade da célula. Isto exige a presença de um segundo usuário ou uma destreza impressionante.

A presente invenção em muito simplifica a referida etapa da cole- ta de amostras pela obtenção de um invólucro fixo a parede superior da zo- na de cultura; tudo que deve ser feito a seguir é suspender ligeiramente o revestimento, a parede superior da zona de cultura se levanta simultanea- mente, e introduzir uma braçadeira estéril ou uma ferramenta da amostra- gem tal como uma pipeta ou um similar para um ou várias preparação de amostras de veículos com o objetivo de avaliar a densidade da célula. Os riscos de tocar em um objeto que não esteja esterilizado e os riscos de con- taminação são grandemente reduzidos.

De forma vantajosa, em certas modalidades, o dispositivo de acordo com a presente invenção também compreende um meio de aqueci- mento, projetado para aquecer o meio de cultura transferido. O referido meio de aquecimento pode, de forma vantajosa, estar situado na quarta área de transferência do meio de cultura ou nos meios de circulação do meio de cul- tura. Naturalmente, a primeira zona pode também compreender o referido meio de aquecimento.

O meio de aquecimento pode ser um elemento elétrico, uma bo- bina elétrica ou qualquer outro meio de aquecimento de modo geral usado no campo de cultura de células, tal como, por exemplo, um revestimento du- plo termostaticamente controlado.

Na verdade, durante culturas de larga ou muito larga escala, não é sempre fácil colocar o dispositivo de acordo com a presente invenção em um dispositivo ou espaço termicamente controlado. Conseqüentemente, a presente invenção resolve o referido problema através da colocação direta do meio de aquecimento com o objetivo de controlar o meio de cultura ter- mostaticamente e para suportar uma temperatura por igual no recipiente de cultura. Preferivelmente, o dispositivo de acordo com a presente invenção proporciona um aquecimento do meio de cultura sem qualquer ponto de so- breaquecimento.

Em certas modalidades, o dispositivo de acordo com a presente invenção compreende sensores para medir os parâmetros da cultura, os re- feridos sensores estando em contato com o meio de cultura. Os parâmetros da cultura significam, entre outras coisas, a pressão parcial do oxigênio dis- solvido, o pH, a temperatura, a densidade óptica, certas concentrações de nutrimentos, os referidos lactato, amônio, cabonatos, glicose ou qualquer produto metabólico ou produto a ser metabolizado que possa, por exemplo, refletir a densidade da célula.

Pode também ser contemplado, de acordo com a presente in- venção, o uso de circuitos de regulagem de acordo com os referidos parâ- metros. Os referidos circuitos de regulagem iriam, por exemplo, modular a quantidade de oxigênio a ser injetada dentro da atmosfera gasosa de acordo com o valor da pressão parcial de oxigênio dissolvido presente ou a quanti- dade de oxigênio dissolvido consumido pelas células. É possível injetar C02 de acordo com o valor de pH obtido pelos sensores ou qualquer outro tipo de regulação de modo geral usada no referido tipo de cultura.

Os sensores são preferivelmente arranjados na porção da base de pelo menos uma quarta zona. A quarta zona de transferência do meio de cultura é uma zona preferencial para o posicionamento dos sensores uma vez que os valores obtidos por esse último são claramente representativos do consumo da célula, uma vez que a referida zona é dotada de um meio de cultura vindo da zona de cultura passando através de si.

De forma vantajosa, os referidos sensores são sensores óticos descartáveis, proporcionados para a transmissão de sinais óticos represen- tando os parâmetros a serem medidos através do referido recipiente de cul- tura para um receptor de sinal ótico, externo ao referido dispositivo.

Em uma modalidade particularmente preferida, o dispositivo de acordo com a presente invenção compreende uma série de módulos, cada módulo de cultura compreende em sua porção superior um primeiro meio de fixação e em sua porção da base um segundo meio de fixação, em que o referido módulo de base também compreende, na porção superior,-um pri- meiro meio de fixação e o referido módulo principal também compreende em sua porção da base um segundo meio de fixação, o referido primeiro meio de fixação e o referido segundo meio de fixação sendo complementares para a produção de uma seqüência de empilhamento da parte inferior para o topo de um módulo de base, pelo menos um módulo de cultura e um módulo principal.

De forma vantajosa, os referidos primeiro e segundo meios de fixação compreendem meios para a produção da referida seqüência de em- pilhamento de modo justo entre gás e líquido.

Na verdade, de acordo com a presente invenção, é possível pro- jetar uma série de módulos onde a parede de cada módulo irá constituir par- te da parede do recipiente de cultura. A seguir, é suficiente montar as referi- das séries de módulos de cultura com um módulo de base compreendendo os meios de circulação e um módulo principal compreendendo o revestimen- to. O conjunto formado pelos referidos módulos irá então constituir o disposi- tivo de cultura. De acordo com o volume de cultura necessário, um número N de módulos seria ajustado junto para construir seu próprio dispositivo de cultura com a altura H.

Em uma modalidade muito particular, o dispositivo de acordo com a presente invenção é um dispositivo descartável.

Existe hoje em dia uma quantidade de biorreatores que forne- cem excelentes resultados de cultura de células em pequena e grande esca- la. Infelizmente, os referidos biorreatores são dispendiosos em termos de limpeza, esterilização, trabalho, locação e espaço ocupado. Na verdade, em particular para a produção de conjuntos clínicos ou produtos de interesse farmacêutico, é essencial que os biorreatores sejam colocados em espaços brancos estéreis. Um biorreator de 500 litros ocupa mais de vinte vezes o seu volume em um espaço branco. O critério do espaço branco é o volume usado por uma instalação, ou seja, se a instalação ocupa 1 m2 de superfície do piso, o volume de ar a ser tratado será de (1 m2 mais a área de superfície necessária para o usuário) multiplicada pela altura do espaço branco uma vez que o volume de ar acima da superfície do assoalho também deve ser tratado. Além do mais, a esterilização, assepsia, lavagem, sanitização, etc., protocolos que são etapas exigidas tanto para um biorreator quanto para o espaço ocupado, são protocolos demorados e fastiosos impõem enormes custos tanto com relação ao trabalho quanto em relação à instalação de pro- dutos. Por essa razão é que, principalmente em laboratórios farmacêuticos, biológicos e bioquímicos e em espaços brancos, os equipamentos descartá- veis, de modo geral menos volumosos, e que não exigem limpeza, sanitiza- ção, esterilização e assepsia, estão cada vez mais em uso.

Existem soluções alternativas para reutilizar biorreatores con- vencionais, por exemplo, a cultura é disposta em um recipiente estéril des- cartável que seja agitado por uma placa de agitação que reproduz um movi- mento de onda, por exemplo, o biorreator WAVE®. Infelizmente, o referido biorreator apresenta um problema de aumento da escala, uma vez que um recipiente de 500 litros, tanto que a placa de agitação pode ser feita sob me- dida, tem uma superfície enorme de assoalho que demanda um tratamento de ar do quarto branco cujo custo é impossível supor, sem mencionar a difi- culdade de manusear os referidos recipientes, a coleta de amostras e a co- locação dos sensores de parâmetros da cultura.

Outras soluções existem, como garrafas descartáveis agitadas chamadas de "giradores". O aumento de escala destas garrafas é igualmen- te impossível e as garrafas têm baixa transferência do oxigênio assim como causam esforço das células durante a agitação. Também existem culturas em sistemas como CELLCUBE® ou CELLFACTORY®. O referido sistema é difícil de regular e é volumoso. Além do mais, as transferências de oxigênio são deficientes e exigem incubadoras de grande tamanho. Mais uma vez, o aumento da escala é fastioso.

O sistema BELLOCELL® é também conhecido. O referido sis- tema é baseado na imobilização de células em matrizes porosas, que são embaladas na zona de cultura. O meio de cultura está em uma zona mais baixa proporcionada com foles compressíveis. O meio de cultura sobe e desce alternadamente com o objetivo de submergir as matrizes no meio de cultura e então expo-las ao ar ambiente.

Infelizmente, o aumento da escala do referido sistema também é difícil. É difícil regular e medir os parâmetros da cultura. Além do mais, as células estão submetidas a esforços de tensão em sua superfície, sendo expostas antes de mais nada a um limite médio em queda, à secagem, e então a uma limite média em aumento, que é prejudicial a seu crescimento.

Em suma, não existem no presente momento sistemas descar- táveis de cultura de células adaptados para a cultura em larga e pequena escala que são mais fáceis de usar, ambas em um espaço branco e em la- boratório.

A presente invenção, em conseqüência, obtém uma solução muito inovadora, a qual resolve uma maior parte destes inconvenientes ob- tendo um sistema inesperado, aplicável em pequena e em larga escala, a- dequado para cultura em suspensão, em veículos ou em microveículo s, cuja agitação sustenta a homogeneidade do meio de cultura sem zonas mortas ou zonas de acumulação de células. Além do mais, os riscos de contamina- ção por causa da ausência de um eixo central são particularmente baixos, ou mesmo não-existentes.

Na verdade, o dispositivo de acordo com a presente invenção é um dispositivo que apresenta todas as vantagens dos biorreatores conven- cionais, como mencionado aqui previamente, enquanto é descartável. O dis- positivo de acordo com a presente invenção é agitado magneticamente por meios de circulação de meio de cultura baseados em uma bomba de centri- fugação, que não é dotada de qualquer contato com o exterior. O meio de aquecimento, por exemplo, uma bobina elétrica, também tem recursos para o aquecimento homogêneo do meio de cultura sem ser dotado de contato com o exterior.

Adicionalmente, como mencionado acima, de modo particular- mente preferencial, o dispositivo de cultura de acordo com a presente inven- ção compreende sensores óticos descartáveis, projetados para transmitir um sinal ótico representando o parâmetro a ser medido através do recipiente de cultura para o receptor de sinal ótico, externo ao referido dispositivo.

Conseqüentemente, os parâmetros da cultura são também me- didos através de uma parede do dispositivo de acordo com a presente in- venção e o referido não envolve qualquer contato com o exterior, ao contrá- rio das sondas de oxigênio dissolvido ou de pH que passam através do re- vestimento de biorreatores clássicos, apresentando um risco de limpeza de- ficiente nas referidas sondas e orifício de passagem e de contaminação a- través falta de um selo.

Os sensores podem ser situados na base do dispositivo de a- cordo com a presente invenção ou na porção superior ou em ambas. Quan- do os sensores estão presentes no topo e nas bases, o referido torna possí- vel, por uma simples operação de diferença matemática, referente ou não a um número de células, fazer a medição contínua da respiração celular.

Outras modalidades do dispositivo estão indicadas nas reivindi- cações dependentes.

Outro objetivo da invenção é o uso do dispositivo de cultura de acordo com a presente invenção para a cultura de células em suspensão em microveículo s ou em veículos. Na verdade, quando o dispositivo de acordo com a presente invenção é usado em cultura em veículos ou microveículo s, os veículos ou microveículo s são confinados na referida segunda zona de cultura. Quando o dispositivo é usado para a suspensão de cultura de célu- las e, em conseqüência sem veículos ou microveículo s, a parede proporcio- nada com um orifício é uma membrana permeável ao meio de cultura, mas não permeável para as células. O tamanho dos poros da referida membrana é em função de todos os tamanhos. A presente invenção também se refere ao uso do dispositivo de cultura de acordo com a presente invenção para a produção de produtos recombinados, vírus, metabolitos e que tais.

Os produtos de recombinação significam proteínas do interesse para a pesquisa no setor farmacêutico, as moléculas terapêuticas ou profilá- ticas, os anticorpos, os plasmídeos ou toda e qualquer outra molécula capaz de ser produzida por células em cultura, seja a produção pela secreção ou pela produção intracelular.

A presente invenção também se refere a um método de cultivo de células em um recipiente de cultura com circulação do meio de cultura, compreendendo:

- introdução de meio de cultura em meios de circulação do meio de cultura,

- descarga de meio de cultura dos referidos meios de circulação de meio de cultura,

- pelo menos uma primeira transferência de meio de cultura em um primeiro meio de cultura acima da zona de transferência,

- pelo menos uma segunda transferência de meio de cultura em uma segunda zona de cultura de células.

O referido método é caracterizado pelo fato de que ele também compreende:

- pelo menos uma terceira transferência de meio de cultura sub- seqüente à referida primeira transferência de meio de cultura em uma tercei- ra zona de transferência de meio de cultura, pelo transbordamento da pri- meira zona de transferência de meio de cultura para a terceira zona de transferência de meio de cultura,

- pelo menos uma quarta transferência de meio de cultura sub- seqüente à referida segunda transferência de meio de cultura em uma quar- ta zona de transferência de meio de cultura, pelo transbordamento da se- gunda zona de cultura dentro da quarta zona de transferência de meio de cultura, e assim a referida segunda transferência de meio de cultura é uma transferência de meio de cultura de cima para baixo. Como mencionado acima, ao contrário do método de cultura da patente U.S. 5.501.971, o meio de cultura se desloca através da zona de cultura de baixo para cima, o que previne a acumulação de células na base da zona de cultura e reduz as forças de pressão nas células. O método de cultura de acordo com a presente invenção é, em conseqüência, um método particularmente inovador que permite o cultivo sem uma zona morta e sem qualquer lugar onde as células se acumulam enquanto permite o cultivo com alta eficiência.

De forma vantajosa, o método também compreende uma oxige- nação do meio de cultura durante uma ou mais das referidas transferências.

A referida oxigenação preferivelmente ocorre através de contato direto entre gás e líquido durante uma ou mais das referidas transferências.

Em uma modalidade particular, a oxigenação é realizada durante a quarta transferência de meio de cultura, a referida quarta transferência de meio de cultura sendo um fluxo do referido meio de cultura ao longo da pa- rede de fluxo.

Em uma modalidade vantajosa, o método, com o objetivo de es- tabilizar a película, proporciona a adição de aditivos ao meio de cultura com o objetivo de modificar as propriedades reológicas da água, tais como os aditivos incluídos no grupo que consiste em surfactantes, Pluronic F68, Qli- cerina, cátions quaternários de amônio e qualquer outro aditivo para modifi- car as propriedades reológicas do meio de cultura.

Também de forma vantajosa, o fluxo do meio de cultura é um fluxo ao longo de uma parede hidrófila. Outras modalidades do método de acordo com a presente invenção estão indicadas nas reivindicações depen- dentes.

Outras características, detalhes e vantagens da presente inven- ção irão aparecer mais claramente à luz das descrições a seguir, em particu- lar de modalidade não-limitantes da invenção, ao referir os desenhos de a- companhamento.

Afigura 1 é um diagrama traçado de um dispositivo de cultura de acordo com a presente invenção. A figura 2 é um diagrama traçado de uma variação dos meios de circulação do meio de cultura.

A figura 3 é um diagrama traçado de um dispositivo de cultura de acordo com a presente invenção compreendendo várias e sucessivas zonas de cultura, particularmente adaptadas para o aumento da escala.

A figura 4 ilustra de modo altamente esquemático uma variação da figura 3.

A figura 5 é uma seção transversal de uma porção da base do módulo de base que confina os meios de circulação do meio de cultura da modalidade preferida do dispositivo de acordo com a presente invenção. .

A figura 6 é uma vista superior da porção da base do módulo de base que confina os meios de circulação do meio de cultura como ilustrado na figura 5.

A figura 7 é uma seção transversal da porção superior do módu- lo de base que confina a circulação dos meios da mesma modalidade prefe- rida do dispositivo de acordo com a presente invenção.

A figura 8 é uma vista superior da porção superior do módulo de base que confina a circulação dos meios do dispositivo como ilustrado na figura 7.

A figura 9 é uma seção transversal do dispositivo de cultura de acordo com a presente invenção produzido por um conjunto de módulos, em particular módulos descartáveis.

A figura 10 é uma vista explodida da figura 9.

Nos desenhos, um símbolo de referência igual ou similar é usa- do para um elemento igual ou análogo.

Como pode ser visto na figura 1, o dispositivo de cultura 1 com- preende um recipiente de cultura substancialmente vertical e cilíndrico 2, apesar de outras formas também serem previstas de acordo com a presente invenção, por exemplo, qualquer forma de prisma, preferivelmente regular. O recipiente de cultura compreende pelo menos quatro zonas em comunicação uma com a outra. Do centro do recipiente na direção do exterior, o recipiente compreende uma primeira zona 3, uma terceira zona 4a, 4b, uma segunda zona 5 e uma quarta zona 6.

A zona compreendendo células foi esboçada e compreende a letra C enquanto o meio de cultura é mostrado pela letra M.

O recipiente de cultura 2 compreende meios de circulação de meio de cultura em sua porção da base. Os meios de circulação do meio de cultura são, na referida modalidade preferencial, compostos de um dispositi- vo magnético 7, por exemplo, uma barra magnética 7 em rotação em torno de um eixo de rotação central 8, real ou virtual, a primeira terminação da qual está abrigada em meios de engate superiores 9 e a segunda termina- ção está abrigada em meios de engate inferiores 10. A barra magnética é conduzida por um motor de movimentação magnética giratório externo ao recipiente de cultura 2 e o qual não está mostrado aqui. Os meios de circula- ção compreendem pelo menos uma entrada de meio de cultura 11. A entrada de meio de cultura 11 compreende pelo menos uma primeira terminação a qual termina em um defletor de desvio 12 para o fluxo de meio de cultura. A barra magnética funciona como uma bomba de centrifugação, ou seja, o meio de cultura é sugado em uma zona relativamente central pelo movimen- to do meio de cultura criado pela barra e o meio de cultura é propelido para fora com relação a um ponto central. O defletor de desvio de meio de cultura 12 guia o meio de cultura na zona relativamente central da barra de modo que o meio de cultura é sugado e propelido então para fora.

De forma vantajosa, as entradas estão no mesmo plano (confi- guração estrela) e o número de entradas 11 será um número tal que seu po- sicionamento irá exibir simetria. Mais particularmente, se 3 entradas são consideradas, é vantajoso que cada uma esteja separada da outra por um ângulo de aproximadamente 120°, se o número de entradas for igual a 4, as entradas serão separadas uma da outra por um ângulo substancialmente equivalente a 90°, se o número de entradas for igual a 10, as entradas serão dispostas com um ângulo de separação aproximadamente igual a 36°.

Os meios de circulação do meio de cultura também compreen- dem pelo menos uma saída de meio de cultura 13. A saída de meio de cultu- ra 13 é de forma vantajosa situada no ponto onde o meio de cultura é prope- lido pelo efeito de centrifugação da barra magnética.

De forma vantajosa, o número de saídas 13 será um número tal que seu posicionamento irá exibir simetria. Mais particularmente, se 3 saídas são consideradas, é vantajoso que cada uma esteja separada da outra por um ângulo de aproximadamente 120°, se o número de saídas for igual a 4, as saídas serão separadas uma da outra por um ângulo substancialmente equivalente a 90°, se o número de saídas for igual a 10, as saídas serão dispostas com um ângulo de separação aproximadamente igual a 36°.

Preferivelmente, as saídas não estão situadas no mesmo plano horizontal que as entradas. A porção, da base do recipiente de cultura com- preende pelo menos um meio de guia do meio de cultura 14, adjacente à referida pelo menos uma saída 13, o qual guia o meio de cultura propelido na direção do topo do recipiente de cultura 2.

A primeira zona 3 do recipiente de cultura 2 é a substancialmen- te central zona e é a zona de transferência do meio de cultura. A primeira zona 3 compreende uma parte básica 3a e uma parte cilíndrica 3b. O diâme- tro da parte básica 3a é menor do que o diâmetro do recipiente de cultura 2. A parte básica 3a está em comunicação de meio com a referida pelo menos uma saída de meio de cultura 13 dos meios de circulação do meio de cultu- ra. A parte básica 3a é reduzida na porção superior da primeira zona 3 a um cilindro 3b com um diâmetro menor do que a parte básica 3a. O topo da par- te cilíndrica 3b compreende uma parede externa e está em direta comunica- ção do meio de cultura com a parte básica 3a da referida primeira zona de transferência de meio de cultura.

A terceira zona 4 é a zona de transferência do meio de cultura, externa para a primeira zona de transferência de meio de cultura 3. A tercei- ra zona também compreende substancialmente uma parte básica 4a (na forma de uma bucha) e uma porção superior cilíndrica 4b.

A parte substancialmente cilíndrica 4b da terceira zona de trans- ferência do meio de cultura 4 é essencialmente concêntrica com a parte substancialmente cilíndrica 3b da primeira zona de transferência de meio de cultura 3 e as referidos duas partes estão em comunicação de meio. A co- municação do meio de cultura é alcançada por meio de um orifício ou um tubo, pelo transbordamento (como mostrado na figura) ou quaisquer outros meios possíveis para alcançar a referida comunicação.

A segunda zona 5 é uma zona de cultura de células, com ou sem veículos ou microveículo s. A segunda zona 5 é também em forma de bucha, no centro da qual estão a primeira e terceira zonas de transferência dos meios de cultura 3 e 4.

A segunda zona 5 compreende uma parede inferior 15 e uma parede superior 16, cada parede 15 e 16 sendo proporcionada com orifícios 17 permitindo uma transferência de meio de cultura essencialmente livre de células. A segunda zona de cultura 5 está em comunicação de meio com a parte relativamente básica 4a da terceira zona de transferência do meio de cultura 4 por meio de orifícios 17 na parede inferior 15 permitindo que o meio de cultura atravesse.

A quarta zona 6 é a zona de transferência do meio de cultura, externa à segunda zona de cultura 5, mas interna ao recipiente de cultura 2. A quarta zona 6 está em comunicação de meio com a segunda zona de cul- tura 5. Está também em comunicação de meio com os meios de circulação do meio de cultura, pela via da referida pelo menos uma entrada 11. A co- municação do meio de cultura é alcançada por meio de um orifício ou um tubo, pelo transbordamento ou por quaisquer outros meios possíveis para alcançar a referida comunicação.

A modalidade particular descrita aqui compreende um recipiente de cultura substancialmente cilíndrico, mas outras modalidades podem tam- bém ser previstas, como mencionado previamente, por exemplo, um recipi- ente substancialmente prismático, preferivelmente regular. Obviamente, o referido também ocorre com os vários meios de cultura e zona de transfe- rências de cultura. Eles podem também ser prismático, preferivelmente regu- lares, qualquer combinação de formatos sendo possível. No referido caso, o termo bucha deve ser previsto como um envelope com uma seção transver- sal similar para uma seção transversal do prisma previsto.

Quando os meios de circulação do meio de cultura estão em o- peração, o meio de cultura os deixa através da referida pelo menos uma sa- ída 13, quando não há várias delas, através das várias saídas 13, e é desvi- ado pelos meios de guia 14, termina na parte substancialmente básica 3a da primeira zona de transferência de meio de cultura 3. A estrutura da primeira zona de transferência de meio de cultura 3 e a saída da bomba requer que o meio de cultura esteja direcionado na direção a parte substancialmente cilín- drica 3b da primeira zona de transferência de meio de cultura 3. Quando ela alcança o topo da parede da parte substancialmente cilíndrica 3b, ela se descarrega dentro da terceira zona de transferência do meio de cultura 4.

A direção de circulação do meio de cultura M é mostrada pelas setas nas figuras.

É evidente para aqueles versados na técnica, na referida moda- lidade particular, que a parede da parte substancialmente cilíndrica 3b da primeira zona de transferência de meio de cultura 3 é mais baixa do que a parede da terceira zona de transferência do meio de cultura 4 por razões de eficiência d de taxa de fluxo, mas será facilmente entendido que a parede de a parte substancialmente cilíndrica 3b da primeira zona de transferência de meio de cultura 3 pode também ser mais alta do que a parede da parte subs- tancialmente cilíndrica 4b da terceira zona de transferência do meio de cultu- ra 4.

O meio de cultura está, em conseqüência, sujeito à taxa de fluxo imposta pela bomba e pela gravidade, está direcionado de cima para baixo a partir da terceira zona de transferência do meio de cultura 4 correndo a parte substancialmente cilíndrica 4a e alcança a parte substancialmente básica 4b da terceira zona de transferência do meio de cultura 4. A seguir o fluxo de meio de cultura é dotado de uma direção de subida através do efeito dos recipientes comunicantes pela taxa de fluxo imposta pela bomba e alcança o topo da segunda zona de cultura 5. O meio de cultura alcança a segunda zona de cultura 5 a partir da terceira zona de transferência do meio de cultu- ra 4 pela via dos orifícios para a passagem de meio de cultura substancial- mente livre de células 17 na parede inferior 15 da segunda zona de cultura 5. Como já foi mencionado acima, os orifícios de passagem do meio de cultura 17 são dimensionados de acordo com o tipo de cultura. Se a cultura é uma cultura sem veículo, a parede 15 ou 16 compreendendo os orifícios 17 será uma membrana porosa onde o tamanho do poro é menor do que o diâmetro das células. Se a cultura está em um microveículo ou em veículos, o tamanho dos orifícios 17 será menor do que o tamanho dos mi- croveículo s ou veículos.

Quando o meio de limite de fluxo da cultura alcança o topo da parede da segunda zona de cultura 5, ele se descarrega dentro da quarta zona de transferência do meio de cultura 6. Naturalmente, se existem orifí- cios presentes ou se há um tubo, deve ser entendido que, quando o limite de fluxo do meio de cultura alcança o orifício ou o tubo, ele flui dentro da quarta zona 6.

Na modalidade particularmente preferencial da invenção, a quar- ta zona de transferência do meio de cultura 6 compreende uma parede incli- nada 18 em que o meio de cultura flui quando ele passa da segunda zona 5 para a quarta zona 6. A parede inclinada preferivelmente compreende uma membrana hidrófila com o objetivo de melhorar a formação da película na referida parede inclinada 18. A película deve, preferivelmente, ser laminar com o objetivo de prevenir, tanto quanto for possível, a formação de espuma. Com o objetivo de estabilizar a película, é possível também adicionar aditi- vos ao meio de cultura com o objetivo de modificar as propriedades reológi- cas da água, particularmente do meio de cultura, tais aditivos incluindo o grupo consistindo de surfactantes, Pluronic F68, glicerina, cátions quaterná- rios de amônio e qualquer outro aditivo para modificar as propriedades reo- lógicas do meio de cultura.

A membrana hidrófila irá, por exemplo, ser uma membrana con- sistindo de polioxietileno.

A formação da película na parede inclinada é uma etapa impor- tante uma vez que ela permite a oxigenação em "película fina". Na verdade, o volume de gás em relação à quantidade de meio de cultura na referida quarta zona de transferência do meio de cultura é maior e melhora as trocas. Além do mais, a formação da película em uma parede inclinada aumenta a área de superfície de contato entre gás e líquido.

Como pode ser visto na figura 1, o recipiente de cultura preferi- velmente compreende um invólucro 19 através do qual passam pelo menos um orifício de entrada de gás 20 e pelo menos um orifício de saída de gás 21. O orifício de entrada de gás 20 está preferivelmente situado de modo a se comunicar diretamente com a quarta zona de transferência do meio de cultura 6. Em algumas variações, pode ser preferível que o orifício de entra- da de gás 20 esteja presente na parede vertical do recipiente de cultura 2 ou na base do recipiente de cultura 2, ou seja, o. gás passa pelo meio de um orifício 20 através da parede do recipiente de cultura 2 oposta ao revesti- mento 19, e pelo o referido orifício 20 para proporcionar um tubo com o obje- tivo de terminar acima do nível de líquido (vide a figura 9).

Na referida modalidade, o revestimento 19 é afixado por meios de fixação 22 para a parede superior 16 da segunda zona de cultura 5. Em algumas variações, o revestimento 19 pode ser feito como parte integral da parede superior 16 da segunda zona de cultura 5, a referida parte se abrindo quando o revestimento 19 do recipiente de cultura 2 é erguido. Da referida forma, é mais fácil retirar uma amostra com ou sem veículos para, por e- xemplo, avaliar a densidade da célula, a estrutura das células e outras ca- racterísticas físicas da célula que refletem a qualidade da cultura. Na verda- de, conectando os dois juntos é possível abrir o compartimento da cultura 5 simplesmente levantando o revestimento 19 do recipiente de cultura 2.

No caso de cultura em suspensão, pode ser vantajosa conectar uma membrana porosa para a parede superior 16 proporcionada com orifí- cios 17 da segunda zona de cultura 5, o referido conjunto pode melhorar a rigidez do conjunto revestimento/membrana para a coleta de amostras.

A figura 2 ilustra uma variação do dispositivo magnético dos meios de circulação do meio de cultura. Aqui, a barra magnética 7 possui a forma de uma hélice. O projeto do dispositivo magnético 7 com um eixo de rotação substancialmente central 8 irá depender, essencialmente, do volume da cultura. Na verdade, para culturas menores, a invenção é capaz de fazer uso de uma simples barra tal como uma placa magnética para circular o meio de cultura. Para volumes maiores, a invenção prevê um rotacionador magnético, também guiado por um motor externo, por exemplo, os rotores como esses usados nos aquários que mantém elevada a taxa de circulação média.

Também é possível, de acordo com a presente invenção, ser prevista usando dispositivos de produção de bolhas (não mostrado), mais conhecidos como "pulverizadores" ou "micropulverizadores" de acordo com o tamanho de bolha produzida.

De forma vantajosa, quando as bolhas serão usadas, a termina- ção perfurada do dispositivo de produção de bolhas, por exemplo, do tubo, será imersa no meio de cultura na base da quarta zona de transferência do meio de cultura ou na primeira zona de transferência do meio de cultura. Quando o referido tipo de oxigenação é escolhido, é sempre também possí- vel continuar a oxigenação em película fina, a qual torna possível reduzir o fluxo de gás e formar menos bolhas e, em conseqüência, reduzir a formação de espuma. No referido caso, Neste caso, a provisão é feita igualmente para ter duas entradas do gás na tampa do recipiente de cultura ou na parede vertical desse último. Além do mais, é igualmente possível prever que o dis- positivo da produção de bolha esteja presente unicamente como um proce- dimento de SOS, e usado unicamente quando necessário.

O dispositivo de cultura também compreende uma série de sen- sores de parâmetro de cultura 23, por exemplo, para a pressão parcial do oxigênio dissolvido pÜ2, acidez pH, temperatura, opacidade, densidade óti- ca, glicose, C02, lactato, amônio e quaisquer outros parâmetros normalmen- te usados para monitorar as culturas celulares. Os referidos sensores são preferivelmente sensores óticos que não exigem conexões entre o interior do recipiente de cultura e o seu exterior. A posição preferencial dos referidos sensores 23 é uma posição crítica em que é vantajoso estar situada perto da parede do recipiente de cultura 2, para que estejam em contato com o meio de cultura M e preferivelmente em posições estratégicas, como na zona a- través da qual o meio de cultura M passa antes - ou logo após - de passar através das células.

De fato, a invenção contempla particularmente obter biorreator descartável para todas as razões de simplicidade e economia mencionadas previamente. Conseqüentemente, é por isso que as conexões entre o interior e o exterior do recipiente de cultura foram reduzidas. Além disso, o biorreator de acordo com a presente invenção também prevê obter um biorreator parti- cularmente confiável em que os riscos de contaminação são particularmente baixos por ser descartável.

Como pode ser visto na figura 3, o dispositivo de acordo com a presente invenção também prevê um projeto modular que compreende uma série de módulos para culturas em volumes maiores. Por exemplo, com o referido tipo de projeto modular, volumes de cultura de em torno de 500 mL a 100 litros são, por exemplo, previstos, através do uso de um número muito limitado dos módulos padrão.

De acordo com a presente invenção é previsto proporcionar uma série de módulos que podem ser "deslizados" em torno da primeira zona de transferência do meio de cultura 3 para ser colocada em um recipiente de cultura padrão 2 compreendendo meios de circulação de meio de cultura e um invólucro 19.

Em uma variação particularmente flexível, a invenção busca ob- ter um sistema de montagem em que compreenda vários módulos padrão. Os referidos módulos padrão são, por exemplo, um módulo de meio de cir- culação a ser localizado na base do conjunto, um ou mais módulos de cultu- ra e um módulo de invólucro. De acordo com a presente invenção, apesar de outros meios de fixação, os referidos módulos podem ser previstos, os mó- dulos serão presos um no outro, por exemplo, por meio de conectores rápi- dos perfeitamente impermeáveis a líquido e gás.

Conseqüentemente, de acordo com o tipo de cultura e o volume desejado, o usuário será capaz de retirar de sua pilha um módulo de base compreendendo os meios de circulação do meio de cultura, ele também tem que retirar daí o número de módulos de cultura que ele precisa de acordo com o volume necessário de cultura e então retirar um módulo principal cor- respondente ao revestimento. A seguir, todos os referidos módulos são em- balados de modo estéril, ele precisará apenas desembalar e unir uns com os outros. A célula pode formar o "biorreator descartável" ou pode ser colocada em um recipiente adequado.

A figura 3 em conseqüência ilustra uma modalidade do dispositi- vo de cultura modular de acordo com a presente invenção.

O dispositivo de cultura 1 compreende um recipiente de cultura 2 a qual compreende os meios de circulação de meio de cultura como aqueles explicados em detalhes na figura 1. O módulo de base m0 compreendendo os meios de circulação pode ser fixado para a parte de baixo do recipiente, de cultura 2 ou pode também ser deslocado dentro do recipiente de cultura 2 (a modalidade descrita) com o objetivo de ser capaz de descartá-lo e usar um ao outro para a cultura e assim prevenir contaminações cruzadas.

O módulo de base m0 compreende os meios de circulação. Co- mo na figura 1, os referidos meios de circulação compreendem um dispositi- vo magnético 7, girando em torno de um eixo de rotação central 8, a primeira terminação é abrigada em meios de encaixe superiores 9 e a segunda ter- minação é abrigada em meios encaixe inferiores 10. Os meios de circulação compreendem pelo menos uma entrada de meio de cultura 11. Os meios de circulação do meio de cultura também compreendem pelo menos uma saída de meio de cultura 13.

O módulo de base m0 do recipiente de cultura compreende pelo menos um meio de guia do meio de cultura 14 adjacente à referida pelo me- nos uma saída 13, a qual guia o meio de cultura propelido na direção do to- po do recipiente de cultura 2.

O recipiente de cultura 2 compreende uma série de módulos de cultura (m1, m2, ..., mn) que são, na referida modalidade, empilhados um so- bre o outro. Também pode ser previsto que sejam simplesmente adjacentes um ao outro, ou seja, colocados lado a lado. Na modalidade ilustrada na fi- gura 3, os módulos unidos um ao outro por meio de conectores rápidos 24 ou clipes.

Cada módulo de cultura m1, m2, ..., mn, compreende a primeira 3, a segunda 4, a terceira 5 e a quarta zona 6. As referidas zonas 3, 4, 5, 6 possuem as mesmas funções mencionadas na figura 1.

Além do mais, pode ser vantajosa para cada módulo compreen- der uma entrada de gás ou de mistura de gases (não ilustrado) em comuni- cação com a quarta zona 6 de cada módulo de cultura. O recipiente pode também compreender para sua parte uma saída para o excesso de gás ou mistura de gases (não ilustrado). Por exemplo, o orifício de entrada de gás pode estar presente na base do recipiente de cultura 2, ou seja o gás passa por meio de um orifício através da parede do recipiente de cultura 2 oposta ao revestimento 3 e o referido orifício 20 é proporcionado com um tubo de modo a terminar acima do nível de líquido (vide a figura 9) do módulo mn. Conseqüentemente, a mistura gasosa alcança a quarta zona de transferên- cia do meio de cultura 6 do referido módulo. O módulo m2 localizado acima do módulo mn pode também compreender um tubo que permite que a mistu- ra gasosa presente na quarta zona 6 do módulo de cultura mn se comunique com a quarta zona 6 do módulo m2. O referido tubo, em conseqüência, de forma vantajosa passa através da parede inferior do módulo m2.

Em certas modalidades, para culturas de longa duração, pode ser vantajoso substituir parte do meio de cultura com meios de cultura fres- cos ou adicionar nutrimentos. Conseqüentemente, o módulo de base m0 po- de então compreender uma entrada de nutrimento (não ilustrado). Também de forma vantajosa, o recipiente de cultura pode compreender, nos meios de circulação do meio de cultura, uma saída de meio de cultura (não ilustrado) com o objetivo de prevenir o transbordamento.

De modo similar, o recipiente de cultura 2 compreende um mó- dulo principal compreendendo um invólucro 19, de forma vantajosa conecta- do a uma parede superior 16 proporcionado com orifícios de passagem de meio de cultura 17 por meio da fixação 22 com o objetivo de simplificar a coleta de amostras no módulo mn, situado acima, como na figura 1.

Além do mais, de forma vantajosa sensores de parâmetro de cultura pode também ser proporcionados em cada módulo de cultura. É pos- sível também proporcionar sensores em apenas um ou diversos módulos de cultura em todas as zonas ou no módulo de base.

Na modalidade ilustrada na figura 3, o meio de cultura circula da seguinte maneira. Para simplificar a explicação, vamos usar apenas dois módulos de cultura mi, e m2. e um módulo de base m0, mas é certo que o dispositivo de cultura de acordo com a presente invenção pode compreender um grande número deles.

No módulo de base m0, o meio de cultura é propelido dos meios de circulação do meio de cultura M via a referida pelo menos uma saída 13, quando há várias delas, através das várias saídas 13 e é desviado pelos meios de-guia 14. Termina em uma parte substancialmente básica 3a da primeira zona de transferência de meio de cultura 3. A parte substancialmen- te básica 3a da referida modalidade é uma a zona comum a todos os módu- los de cultura e, na modalidade ilustrada, está situada no módulo de base. O referido é valido sejam os módulos de cultura empilhados ou justapostos.

A estrutura da primeira zona de transferência de meio de cultura 3 do dispositivo de acordo com a presente invenção e a saída da bomba re- querem que o meio de cultura esteja direcionado na direção da parte subs- tancialmente cilíndrica 3b da primeira zona de transferência de meio de cul- tura 3 do primeiro módulo m^ na direção da parte substancialmente cilíndri- ca 3b da primeira zona de transferência de meio de cultura 3 do segundo módulo m2.

Na referida modalidade, é a montagem dos módulos que cria uma grande primeira zona de transferência de meio de cultura 3 compreen- dendo a parte substancialmente cilíndrica 3b.

Quando o meio de cultura alcança o topo da parede da parte substancialmente cilíndrica 3b do segundo módulo de cultura m2, ele se des- carrega dentro da terceira zona de transferência do meio de cultura 4 do se- gundo módulo de cultura m2.

A direção de circulação do meio de cultura M é mostrada por setas.

O meio de cultura está, em conseqüência, sujeito à taxa de fluxo imposta pela bomba e pela gravidade, está direcionado na direção da base da terceira zona de transferência do meio de cultura 4 do segundo módulo de cultura m2, fluido para baixo na parte substancialmente cilíndrica 4a do segundo módulo de cultura rri2, e alcança a parte substancialmente básica 4b da terceira zona de transferência do meio de cultura do segundo módulo de cultura m2. A seguir, o fluxo de meio de cultura sobe pelo efeito dos reci- pientes comunicantes e pela taxa de fluxo imposta pela bomba e alcança o topo da segunda zona de cultura 5 do segundo módulo de cultura mn. O meio de cultura alcança a segunda zona 5 do segundo módulo de cultura m2 da terceira zona de transferência do meio de cultura 4 do segundo módulo de cultura m2 via os orifícios para a passagem de meio de cultura substanci- almente livre de células 17 da parede inferior 15 do segundo módulo de cul- tura m2.

Quando o meio de limite de fluxo da cultura alcança o topo da parede externa da segunda zona de cultura 5 do segundo módulo de cultura m2, ele se descarrega dentro da quarta zona de transferência do meio de cultura 6 do segundo módulo de cultura m2. Naturalmente, se orifícios ou tubos estiverem presentes na referida parede da zona de cultura 5, torna-se necessário entender que, quando o meio de limite de fluxo da cultura alcan- ça o orifício ou o tubo, ele flui dentro da quarta zona 6 do segundo módulo de cultura m2.

Na modalidade particularmente preferencial da invenção, a quar- ta zona de transferência do meio de cultura 6 do segundo módulo de cultura m2 compreende uma parede inclinada 18 em que o meio de cultura flui quando passa da segunda zona 5 do segundo módulo de cultura m2 para a quarta zona 6 do segundo módulo de cultura m2. A parede inclinada preferi- velmente compreende uma membrana hidrófila com o objetivo de melhorar a formação de uma película na referida parede inclinada 18. A película deve preferivelmente ser laminar com o objetivo de prevenir tanto quanto for pos- sível a formação de espuma. Com o objetivo de estabilizar a película, é pos- sível também adicionar aditivos ao meio de cultura com o objetivo de modifi- car as propriedades reológicas da água, como mencionado antes.

A seguir, o meio de cultura presente na quarta zona de transfe- rência do meio de cultura 6 do segundo módulo de cultura m2 se descarrega através a tubo ou sobre o topo (D) da parede da quarta zona de transferên- cia do meio de cultura 6 do segundo módulo de cultura m2 dentro da terceira zona de transferência do meio de cultura 4 do primeiro módulo de cultura mi.

O meio de cultura está, em conseqüência, sujeito a uma taxa de fluxo imposta pela bomba e pela gravidade, está direcionado de cima para baixo a partir da terceira zona de transferência do meio de cultura 4 do pri- meiro módulo de cultura m-ι, descendo a parte substancialmente cilíndrica 4a do primeiro módulo de cultura m-i, e alcança a parte substancialmente básica 4b da terceira zona de transferência do meio de cultura-do primeiro módulo de cultura mi. A seguir, o fluxo de meio de cultura sobe pelo efeito dos reci- pientes comunicantes e pela taxa de fluxo imposta pela bomba e alcança o topo da segunda zona de cultura 5 do primeiro módulo de cultura mi. O meio de cultura alcança a segunda zona 5 do primeiro módulo de cultura m1 da terceira zona de transferência do meio de cultura 4 do primeiro módulo de cultura m1 via os orifícios para a passagem de meio de cultura substancial- mente livre de células 17 na parede inferior 15 do primeiro módulo de cultura m1.

Quando o meio de limite de fluxo da cultura alcança o topo da parede da segunda zona de cultura 5 do primeiro módulo de cultura m1, ele se descarrega dentro da quarta zona de transferência do meio de cultura 6 do primeiro módulo de cultura In1. Obviamente, se existem orifícios ou um tubo presente na referida parede, deve ser entendido que, quando o meio de limite de fluxo da cultura alcança o orifício ou o tubo, ele flui dentro da quarta zona de transferência do meio de cultura 6 do primeiro módulo de cultura m1.

A quarta zona de transferência do meio de cultura 6 do primeiro módulo de cultura Ni1 pode também compreender uma parede inclinada 18 em que o meio de cultura flui quando passa da segunda zona de cultura 5 do primeiro módulo de cultura mi para a quarta zona de transferência do meio de cultura 6 do primeiro módulo de cultura m1. A parede inclinada é possi- velmente proporcionada com uma membrana hidrófila como acima.

A seguir, o meio de cultura retorna para um módulo de base m0 e para os meios de circulação do meio de cultura através da entrada (tubula- ção) 11, ou seja, o meio de cultura presente na quarta zona de transferência do meio de cultura 6 do primeiro módulo de cultura m-\ se descarrega via um tubo ou sobre o topo da parede da quarta zona de transferência do meio de cultura 6 do primeiro módulo de cultura mi em uma tubulação 11 que termina em uma zona substancialmente central de um sifão criado pela referida bomba de centrifugação que constitui os meios de circulação do meio de cultura de acordo com a presente invenção do módulo de base m0.

Em uma variação da referida modalidade, ilustrada de modo al- tamente esquemático na figura 4 e em detalhes na figura 9, o empilhamento de módulos m constitui o recipiente de cultura. Na referida variação da figura 4, pode existir, por exemplo, três tipos de módulo, módulo de bases m0, mó- dulos m1, m2, ..., η compreendendo as quatro zonas e um módulo principal mx, (não mostrado). O módulo de base m0 ou basal m0 compreende os mei- os de circulação de meio de cultura e o conjunto de meios, é projetado para encaixar o primeiro conjunto de meios 24a de um módulo de quatro zonas m1, 2, ···, η como explicado acima, e para constituir a base do recipiente. O módulo principal mx é projetado para encaixar o segundo conjunto de meios 24b de módulo de quatro zonas m1, 2, ..., n. O módulo de quatro zonas m1, 2, ...,n encaixado pelo módulo de base mO pode ser o mesmo que aquele en- caixado pelo módulo principal mx, ou pelo módulo de quatro zonas m1, 2, ..., η encaixado pelo módulo de base m0 pode ser o primeiro em uma série de módulos de quatro zonas m1, 2, ..., n e o módulo encaixado pelo módulo prin- cipal mt é conseqüentemente, o segundo módulo de quatro zonas na referi- da série de módulos de quatro zonas m1, 2, ..., n.

A referida variante funciona da mesma forma que aquela expli- cada acima em detalhes para a figura 3.

As figuras 5 e 6 ilustram a metade da parte básica do módulo de base m0. A figura 5 é uma seção transversal e a figura 6 é uma vista superi- or. Como pode ser visto, o meio de cultura é projetado para entrar no módulo de base através da pelo menos uma entrada em uma área substancialmente central representada pela letra χ nas figuras. O eixo de rotação do dispositi- vo magnético 7 passa através do referido centro x, seja ele real ou virtual. Quando os meios de circulação estão em operação, o dispositivo magnético 7 está em rotação em torno de seu eixo de rotação, a rotação cria um sifão que suga o meio de cultura dentro dos meios de circulação do meio de cultu- ra. A zona em que o dispositivo magnético está em rotação é confinada pe- los defletores ou paredes 25. Na referida modalidade, dois defletores foram mostrados, mas seu número pode ser muito maior, por exemplo 3, 4, 5, 6, 8, 10, etc. Os defletores serão preferivelmente dispostos simetricamente na circunferência definida por sua totalidade.

Os espaços 13 entre os defletores 25 são saídas de meio de cultura. Na verdade, o meio de cultura é sugado pelo sifão criado pela rota- ção do dispositivo magnético e o meio de cultura é expelido na direção do exterior da zona delimitada pelos defletores 25, através dos orifícios 13 entre os defletores. Uma vez que dois defletores 25 foram mostrados, há duas saídas de meio de cultura na referida modalidade mas seu número pode ser muito maior, por exemplo 3, 4, 5, 6, 8, 10, etc. Como os defletores estão pre- ferivelmente dispostos simetricamente, as localizações do meio de cultura saídas 13 são também de forma vantajosa dispostas simetricamente. Quan- do o meio de cultura é expelido pelas saídas 13, ele termina na zona essen- cialmente circular 27.

Na referida modalidade, a parte básica do módulo de base mO é dotada de orifícios 20, substancialmente tubulares em formato, que são orifí- cios permitindo, por exemplo, a introdução de gás ou de mistura de gases, meios de cultura frescos, descarga de gás ou mistura de gás, retirados do meio de cultura, etc.

Além do mais, um recesso 31 é proporcionado para acessar os referidos orifícios 20 do exterior, o que torna possível conectar os referidos orifícios a suprimentos de gás ou de mistura de gases, meios de cultura frescos, etc.

A figura 7 é uma vista em seção da porção superior do módulo de base m0 de acordo com a presente invenção e a figura 8 é uma vista su- perior da mesma parte. A porção superior compreende substancialmente orifício de entrada em formato tubular de meio de cultura 11. Os orifícios 11 guiam o meio de cultura vindo da quarta zona de transferência do meio de cultura 6 do dispositivo de acordo com a presente invenção 1 no sifão criado pela rotação do dispositivo magnético. Quando o dispositivo magnético está em rotação, o meio de cultura situado na zona essencialmente circunferen- cial 27 descrita nas figuras 5 e 6 entra na perfuração 26, a referida perfura- ção 26 estando em comunicação com os dutos 28 permitindo que o meio de cultura expelido alcance a zona 30 em comunicação de meio com a primeira zona de transferência do meio de cultura 3 do dispositivo de acordo com a presente invenção, em particular com a parte essencialmente tubular da pri- meira zona de transferência de meio de cultura.

A porção superior descrita na figura 7 é um elemento projetado para ser disposto na porção da base descrita na figura 5. Naturalmente, o referido módulo de base m0 pode também ser obtido de outro modo, mas para simplificar a produção ele foi produzido para a referida modalidade em duas partes que podem ser conectadas. Como pode ser visto mais adiante, a porção superior e a porção da base estão conectado de modo preferenci- almente selado nos recessos 29 ilustrados nas figuras 5 e 7.

Todas as ilustrações de meios de circulação de meio de cultura da presente aplicação podem também ser produzidos de várias formas. Não é preciso dizer que todas as formas para a produção das várias modalidades dos meios de circulação do meio de cultura, confinados ou não no módulo de base, estão incluídas no âmbito de proteção reivindicado.

A figura 9 é uma seção transversal de uma modalidade particu- larmente vantajosa do dispositivo de acordo com a presente invenção, en- quanto a figura 10 é uma vista de seção explodida da mesma modalidade. A vista explodida proporciona um claro entendimento dos aspectos práticos e inventivos da presente invenção.

Conseqüentemente, as dois figuras serão comentadas ao mes- mo tempo. Como pode ser visto, o dispositivo de acordo com a presente in- venção consiste, de baixo para cima, de uma pilha compactada de

• a porção da base do módulo de base m0 (m0a) compreendendo a zona em que o dispositivo magnético está rotação, o qual está confinado pelos defletores 25. O espaço 13 entre os defletores 25 visíveis na figura é um orifício de saída de meio de cultura. Isso se dá porque o meio de cultura é sugado pelo sifão criado pela rotação do dispositivo magnético e o meio de cultura é expelido na direção do exterior 27 (zona essencialmente circular) da zona delimitada pelos defletores 25 através dos orifícios 13 entre os de- fletores 25,

• a porção superior do módulo de base mo(m0b) compreendendo uma entrada substancialmente tubular de meio de cultura 11. As entradas 11 guiam o meio .de cultura vindo da quarta zona de transferência de meio de cultura 6 do dispositivo de acordo com a presente invenção 1 no sifão criado pela rotação do dispositivo magnético 7. Quando o dispositivo magnético está em rotação, o meio de cultura situado na zona essencialmente circular 27 entra na perfuração 26, a referida perfuração 26 estando em comunica- ção com os dutos 28 permitindo que o meio de cultura expelido alcance a zona 30 em comunicação de meio com a primeira zona de transferência de meio de cultura 3 do dispositivo de acordo com a presente invenção, em par- ticular com a parte essencialmente tubular da primeira zona de transferência de meio de cultura,

• um primeiro módulo de cultura mi como explicado em detalhes na explanação da figura 3,

• um segundo módulo de cultura m2 (vide a figura 3),

• um módulo principal compreendendo um recesso 33 proporcio- nado com um sensor ótico 23 imerso no meio de cultura, um invólucro 19 compreendendo um meio de fixação 22 conectado a uma parte 16a da pare- de superior 16 da segunda zona de cultura 5 do segundo módulo de cultura m2.

Todos os módulos compreendem um meio de fixação 24a e 24b como ilustrado esquematicamente nas figuras 4, 9 e 10. Cada módulo com- preende vários desses, que, de acordo com conjunto exigido, serão usados ou não, mas o referido torna possível obter um módulo de cultura único que pode ser montado tanto com outro módulo de cultura e quanto com o módulo de base ou o módulo principal. Os referidos meios de fixação são, por e- xemplo, dois círculos concêntricos proporcionados com um selo circular, co- nectores rápidos bem conhecidos no método de cultura de células, um para- fuso e uma serração ou quaisquer outros dispositivo para a montagem dos referidos módulos de acordo com a presente invenção.

Na referida modalidade, a parte básica do módulo de base m0 é ligada com orifícios 20 substancialmente tubulares que são orifícios permi- tindo no referido caso a introdução de gás ou mistura de gases. O orifício de entrada de gás 20 está conectado a um tubo 32 que termina acima do nível do meio de cultura, permitindo que o gás ou a mistura de gases alcance pelo menos a quarta zona de transferência do meio de cultura 6 do dispositivo de cultura 1 de acordo com a presente invenção. Todas as atmosferas ambien- tes da quarta zona de transferência do meio de cultura 6 do dispositivo 1 de acordo com a presente invenção são conectadas por tubos similares 32 de modo que a mistura de gases pode alcançar o topo. É particularmente vanta- joso em um dispositivo com módulos empilháveis que a altura que pode ser alcançada seja bem alta para proporciona o suprimento de gás através da base do reator.

Em uma variação, a parte básica compreende um tubo de ali- mentação de gás ou mistura de gases para trazer a substancia gasosa para dentro da zona em que o dispositivo magnético está situado. Da referida forma, o gás que entra é agitado pela rotação do dispositivo magnético e a dissolução de oxigênio é melhorada pelo movimento do meio de cultura. O excesso de gás é também agitado se move de baixo para cima novamente na forma de pequenas bolhas. A referida variante é também aplicável para a modalidade ilustrada na figura 1.

Além do mais, um recesso 31 é proporcionado para acessar os referidos orifícios 20 a partir do exterior, o que torna possível conectar os referidos orifícios ao suprimento de gás, mistura de gases, meios de cultura frescos, etc.

A porção superior m0b do módulo m0 e um elemento projetado para ser agarrado pelo meio de fixação 28 e selado por um selo circular 34 na porção da base mOa do módulo de base mo.

Naturalmente, a presente invenção não está de nenhum modo limitada às modalidades descritas acima e muitas modificações podem ser feitas sem prejuízo do âmbito das reivindicações dependentes.

Por exemplo, o dispositivo de acordo com a presente invenção descrito na figura 1 pode também compreender um alimentador de nutrimen- to, tanto em um tubo através do revestimento, ou um tubo através das pare- des do dispositivo de acordo com a presente invenção. Da mesma forma, o meio de aquecimento pode também estar presente na primeira ou na quarta zona do dispositivo, de acordo com a presente invenção, ou de um módulo ou cada em módulo de quatro zonas. Possivelmente, o dispositivo de acordo com a presente invenção pode também compreender vários meios de circu- lação de meio de cultura, por exemplo várias bombas de centrifugação.

Lista de componentes:

1. dispositivo de cultura

2. recipiente de cultura

3. primeira zona de transferência de meio de cultura

3a. parte básica da primeira zona de transferência de meio de cultura

3b. parte superior cilíndrica da primeira zona de transferência de meio de cultura

4. terceira zona de transferência de meio de cultura

4a. parte básica da terceira zona de transferência de meio de cultura

4b. porção cilíndrica superior da terceira zona de transferência de meio de cultura

5. segunda zona de cultura

6. quarta zona de transferência de meio de cultura

7. dispositivo magnético

8. eixo central rotação

9. meios superiores de encaixe

10. meios inferiores de encaixe

11. entrada de meio de cultura

12. defletor de desvio 13. saída de meio de cultura

14. meios de guia do meio de cultura

15. parede inferior da segunda zona de cultura

16. parede superior da segunda zona de cultura

17. orifícios no topo e na parede inferior da segunda zona de cultura

18. parede inclinada

19. revestimento do recipiente de cultura

20. orifício de entrada de gás

21. orifício de saída de gás

22. meios de fixação do revestimento para a parede superior da segunda zona de cultura

23. sensores

24. meios de montagem

24a. primeiro conjunto de meios de montagem

24b. segundo conjunto de meios de montagem

25. defletores ou paredes do módulo de base

26. passagem no módulo de base

27. zona essencialmente circular

28. dutos

29. recessos para o selo circular

30. zona em comunicação de meio com a primeira zona de transferência de meio de cultura

31. acesso para os orifícios 20

32. tubo de alimentação de gás

33. recesso no revestimento para os sensores

34. selo circular

mO = módulo de base

m1 ... a mn = módulos de cultura

mt, = módulo principal

M = meio de cultura

C = células

D = topo da parede da quarta zona de cultura

Claims

1. Dispositivo de cultura de células (1) compreendendo: - um frasco de cultura (2) proporcionado com uma cobertura (19), em que se encontra situado pelo menos uma primeira zona (3) e pelo menos uma segunda zona (5), onde a referida primeira zona (3) é uma zona de transferência para o meio de cultura essencialmente não contendo célu- las e a referida segunda zona (5) é uma zona de cultura de células, - meios de circulação do meio de cultura, permitindo a circulação do meio de cultura através da zona de cultura (5), a referida zona de cultura (5) compreendendo uma parede de fundo (15) uma parede de topo (16), ca- da parede (15, 16) sendo proporcionada com orifícios (17) permitindo a transferência do meio de cultura essencialmente livre de células; CARAC- TERIZADO pelo fato de que: o mesmo também compreende pelo menos uma terceira (4) e pelo menos uma quarta (6) zona, onde ambas as zonas são zonas de trans- ferência de meio de cultura essencialmente livre de células, onde a referida terceira zona (4) está em comunicação de meio com a primeira zona (3) e a segunda zona (5), e onde a referida quarta zona (6) está em comunicação de meio com a segunda zona (5) (a zona de cultura (5)) e com a primeira zona (3) (a zona de meio de transferência (3)) via o meio de circulação de meio de cultura, e em que - o meio de circulação de meio de cultura permite a circulação do meio de cultura a partir do fundo para o topo na referida segunda zona de cultura (5).

2. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, em que a referi- da terceira zona (4), é adaptada de modo que o meio de cultura sobreflui a partir da primeira zona de transferência de meio de cultura (3) para a terceira zona de transferência de meio de cultura (4).

3. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, onde a re- ferida terceira zona (4) é uma zona interna à referida segunda zona (5) e externa à referida primeira zona (3) e a referida quarta zona (6) é uma zona externa à referida segunda zona (5).

4. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1 a 3, compreen- dendo uma série de módulos de cultura (mi...... mn), cada módulo compre- endendo a referida primeira zona (3), a referida segunda zona (5), a referida terceira zona (4) e a referida quarta zona (6), e em que os módulos adjacen- tes na referida série de módulos de cultura estão em um meio de comunica- ção, e a referida primeira zona (3) e a referida quarta zona (6) de cada mó- dulo estando em comunicação com o referido meio de circulação, direta ou indiretamente.

5. Dispositivo (1), de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 4, em que o meio de circulação é confinado em um módulo base - (m0), e onde o referido módulo base (m0) estando em um meio de comunica- ção com pelo menos uma primeira zona de transferência de meio (3) e pelo menos uma quarta zona de transferência de meio (6), direta ou indiretamen- te.

6. Dispositivo (1), de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, em que ainda compreende um módulo dianteiro (mt), o referido módulo dianteiro (mt) compreendendo pelo menos uma cobertura (19).

7. Dispositivo (1), de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, em que a referida pelo menos uma quarta zona (6) compreende pelo menos uma parede essencialmente vertical ou de fluxo inclinado (18).

8. Dispositivo (1), de acordo com a reivindicação 7, em que a referida parede de fluxo essencialmente vertical ou inclinada (18) compreen- de uma membrana hidrófila.

9. Dispositivo (1), de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 8, em que ainda compreende pelo menos um orifício de entrada de gás (20) e um orifício de saída de gás (21).

10. Dispositivo (1), de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, em que a cobertura (19) do frasco de cultura (2) é conectada a pelo menos parte da referida parede de topo (16) de pelo menos uma se- gunda zona de cultura (5).

11. Dispositivo (1), de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 4 a 10, onde cada módulo de cultura (m0...... mn), compreende em sua parte de topo um primeiro meio de fixação (24a) e em sua parte de fundo um segundo meio de fixação (24b) em que o referido módulo de base (mo) ainda compreende em uma parte de topo (mob) um primeiro meio de fixação (24a) e o referido módulo dianteiro (mt) compreende ainda em sua parte de fundo um segundo meio de fixação (24b), onde o referido primeiro meio de fixação (24a) e o referido segundo meio de fixação (24b) são meios de fixação com- plementares para produzir uma seqüência de empilhamento a partir do fundo para o topo de um módulo de base (m0), pelo menos um módulo de cultura (m0......mn) e um módulo dianteiro (mt).

12. Uso do dispositivo (1), como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, para a cultura de células.

13. Método de cultura de células em um frasco de cultura (2) com uma circulação de meio de cultura, compreendendo: - introduzir o meio de cultura (M) no meio de circulação de meio de cultura, - descarregar o meio de cultura (M) a partir do referido meio de circulação de meio de cultura, - pelo menos uma primeira transferência de meio de cultura (M) para dentro do primeiro meio de cultura a montante à zona de transferência (3), - pelo menos uma segunda transferência de meio de cultura (M) para dentro da segunda zona de cultura de células (5), caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende: - pelo menos uma terceira transferência de meio de cultura subseqüente à referida primeira transferência de meio de cultura em uma terceira zona de transferência de meio de cultura (4) ao sobrefluir a partir da primeira zona de transferência de meio de cultura (3) para a terceira zona de transferência de meio de cultura (4), - pelo menos uma quarta transferência de meio de cultura subseqüente à referida segunda transferência de meio de cultura em uma quarta zona de transferência de meio de cultura (6), ao sobrefluir a partir da segunda zona de cultura (5) para dentro da quarta zona de transferência de meio de cultura (6), e caracterizado pelo fato de que na referida segunda transferência de meio de cultura é uma transferência de meio de cultura descendente.

14. Método de cultura de células, de acordo com a reivindicação 13, onde ainda compreende a oxigenação do meio de cultura durante uma ou mais das referidas transferências.

15. Método de cultura, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, em que a oxigenação é realizada durante a quarta transferência de meio de cultura, e onde a referida quarta transferência de meio de cultura sendo um fluxo do referido meio de cultura (M) ao longo da parede de fluxo (18).