CN110892056A - 用于培养细胞的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于培养细胞的装置，所述装置包含混合装置和由反应器壁界定的反应室，其中，所述反应器壁具有用于添加气体和/或液体的至少一个连接部，并且所述反应室具有内部体积，其中，所述反应室被设计为相对于最小初始内部体积，内部体积可增大至少500％，或者所述反应室的水平横截面在从底部到顶部的方向上增加。此外，本发明涉及用于培养细胞的方法。

Description

用于培养细胞的装置和方法
技术领域
本发明涉及用于培养细胞的装置，所述装饰包含混合装置和由反应器壁界定的反应室，其中，所述反应器壁具有用于添加气体和/或液体的至少一个连接部，并且所述反应室具有内部体积。此外，本发明涉及用于在该装置中培养细胞的方法。
背景技术
用于培养细胞的生物反应器通常包含具有不同但固定尺寸的玻璃、不锈钢或塑料容器作为反应室。玻璃或不锈钢容器经常用作可回收反应器，并在使用后清洗、灭菌并重复使用。特别是，由塑料制成的反应容器可旨在单次使用，也被称为一次性使用(Single-Use)。
此外，由塑料制成的生物反应器是已知的，其具有口袋(Tasche)的形状，并且在使用中通常被布置在振动器上。它们也被称为Wave生物反应器(Wave-Bioreaktoren)。
常规的反应容器(特别是用于细胞培养的反应容器)提供了一个预先给定的、固定的反应体积以供使用，这是由于不变的容器大小以及通常也由于不变的容器形状所造成的。
为了能够用细胞接种具有数升反应量、特别是在工业规模上具有超过1m3反应量的生物反应器，必须首先从mL量级的起始培养物的少量存储细胞开始，然后产生用于大反应体积的足够量的的细胞。为此，在育种过程(Anzuchtschiene)(也称为种子培养(seedtrain))中，逐步将细胞从小容器转移到下一更大容器中，在该容器中使细胞生长继续直到下一次转移至下一更大容器中。
在这一系列的预培养中，细胞总体上最佳地处于指数生长期。将细胞转移至更大的容器也称为转接、传代或转移。将细胞转移到较大的体积中是必要的，因为许多细胞需要一定的细胞密度才能进入指数生长期，这也称为对数生长期或对数期。细胞密度通常定义为每体积液体细胞培养物的细胞数。当达到最大细胞密度时，细胞生长(其被理解为每单位时间细胞数量的增加)通常降低。由于固定的容器体积，只能在有限的程度上稀释或添加其它介质。
育种过程中的细胞生长也被描述为细胞扩增。在育种过程中的扩增是为了提供接种物(Inokulums)(也称为接种体(Inokulat))，其可用于工业规模生物反应器的接种(也称为播种(Beimpfung))。因此，在细胞扩增(也称为细胞系扩增)中，意味着细胞的增殖和培养体积的逐步扩大，通常在几个过程步骤中进行。
通常，细胞存在于细胞悬浮液中，其中，所述细胞及其细胞外代谢物悬浮在通常为水性的营养介质中。
M.Howaldt等在“Kultivierung von
Figure BDA0002284523090000021
”中，Bioprozesstechnik，第三版，Spektrum Akademischer Verlag，2011，第410-413页描述了哺乳动物细胞技术的大规模使用，其中，上游处理过程由核心环节细胞库、接种物和发酵构成。为了发酵，将细胞库的等分试样解冻并在摇瓶或旋转器中培养。然后，将细胞转接到下一更大的培养容器中，例如旋转器、wave生物反应器或不锈钢生物反应器，以用作产生细胞增殖的前体。期望用种子发酵罐尽可能快地产生大量细胞，从而可以在尽可能短的时间内以高的播种密度接种生产发酵罐。
EP 2543719A1描述了一种曲流生物反应器(
Figure BDA0002284523090000022
-Bioreaktor)以及用于动态扩增、分化和收获造血细胞的方法。生物反应器由一个生物反应器容器组成，该生物反应器容器的底面设置有交错排列的隔板，这可引起层流的介质的曲流样路线。多个曲流生物反应器可通过截流阀模块化地串联连接。所引进的细胞形成几乎覆盖底面的细胞层。
T.H.Rodriguez等在“Considerations for Cell Passaging in Cell CultureSeed Trains”，BMC Proceedings，2015年，9(增刊9)：P43中描述了一种用于种子培养优化的基于软件的工具，其中，对将一个量级的细胞培养物转移至下一更大量级的最佳时间点进行计算。
B.Wright等在“A Novel Seed-Train Process”，BioProcess International 13(3)s，2015年3月，第16-25页提供了相对传统育种过程而言的一种改良的育种过程，其中，通过使用高细胞密度培养物使该改良的育种过程所需的时间以及复杂性降低。
在制造商Miltenyi Biotec GmbH的培养袋处理指南(
Figure BDA0002284523090000031
GMP细胞培养袋处理指南，2013年9月)中描述了用于细胞扩增的培养袋，该培养袋分为三个腔室，各个腔室通过熔接缝的开口彼此连接成100mL的体积。
在细胞扩增过程中将细胞逐步转移到下一更大的容器中是耗时且昂贵的操作。在转移过程中，细胞也暂时处于培养容器之外，从而增加不必要的污染或污染细胞培养物的风险。
发明内容
本发明的目的是提供在细胞扩增过程中避免将细胞转移进数个大小不同的容器的装置和方法。
所述目的通过一种用于培养细胞的装置来实现，该装置包含混合装置和由反应器壁界定的反应室，其中，所述反应器壁具有用于添加气体和/或液体的至少一个连接部，并且所述反应室具有内部体积，其中，将所述反应室设计为：相对于最小初始内部体积相比较，所述内部体积可增大至少500％、优选至少700％、更优选至少1000％、进一步优选至少1500％、尤其优选至少2000％；或者，所述反应室的水平横截面在从底部到顶部的方向上增加。优选地，相对于最小初始内部体积，所述内部体积可增大不超过10000％。
所述目的还通过用于在本发明的装置中培养细胞的方法来实现，该方法包括以下步骤：
a.任选地，在80℃-150℃的温度下或通过伽马射线对所述反应器壁进行灭菌，
b.填装所述装置，其中，在所述反应室中提供细胞和任选的第一液体介质，
c.向所述反应室中配给第二液体介质和/或气体，其中，优选地，所述第二液体介质具有与所述第一液体介质的组成相对应的组成，
以及
相对于最小初始内部体积，使所述反应室的内部体积增大至少500％、优选至少700％、更优选至少1000％，
或者
增大所述反应室中的填装高度，所述反应室的水平横截面在从底部到顶部的方向上增加，其中，相对于最小初始液体体积，所述反应室中的液相的体积增加至少500％，所述液相包含所述第二液体介质和任选的第一液体介质。
由于反应室的内部体积可增大至少500％，能够在同一容器中添加较大量的液体介质，从而使得尽管反应室中的细胞数量增加，相对于液体介质体积的细胞密度不超过最大细胞密度，并且避免了将细胞培养物向较大的容器中转移。
因此，本发明的反应室的可变内部体积也是有利的，因为除了增加的最终体积，最小初始内部体积也是可调节的。与开始时就使用大容器相比，当仅存在小量的细胞培养物(包含细胞和介质)时，这允许所述细胞培养物的表面积与体积的比例较小。特别是，在开始时，细胞培养物(即液相)与容器中同时存在的气相之间的相界面也相对小。
另一方面，在相对大的容器中仅存在少量细胞培养物，则细胞培养物的表面积与体积之比高，这会导致介质蒸发，甚至细胞脱水。当细胞培养以高于室温的温度进行时，尤其如此。
因此，在细胞扩增开始时，存在的细胞培养物的体积通常也很小，因为低于细胞培养物的最小细胞密度也会导致细胞生长减少。
本发明的反应室(在其中将细胞生长作为反应来理解)的内部体积基本上根据反应室中存在的细胞而扩大，直到达到具有所需细胞密度和所需体积的细胞培养物。在细胞培养物的扩增过程中使反应室扩大，并改变其形状(如果必要)。
通过避免将细胞从较小的容器转移到较大的容器，降低了不必要的污染的风险。这同时节省了人工以及额外的容器的清洗以及材料成本。
优选地，内部体积表现为连续的体积。在本发明的上下文中，连续的体积是指不存在细分的数个部分(例如所述数个部分简单地通过管道连接或软管连接彼此连接)。
在本发明的上下文中，将反应室的最小可调节内部体积定义为最小初始内部体积。所述最小初始内部体积优选处于2mL至1L的范围、更优选处于5mL至500mL的范围、特别优选处于5mL至100mL的范围。最小内部初始体积可增加至反应室的最大内部体积，所述最大内部体积优选处于10L至100L的范围、特别优选处于15L至50L的范围。
优选地，内部容积可连续增大。在本发明的上下文中，可连续增大(Kontinuierlich
Figure BDA0002284523090000052
)是指内部体积随时间均匀地增加，和/或内部体积至最大内部体积的任意增加量是可连续调节的。
有利地，反应器壁具有对于细胞培养物而言生物相容且无毒的壁材料。优选地，所述壁材料是液体不可渗透的并且对于通过热、照射和/或化学品进行的灭菌稳定。
所述壁材料优选在10℃至150℃的范围内，更优选在25℃至130℃的范围内热稳定(temperaturstabil)。此外，所述壁材料优选在pH为pH 5至pH 8、更优选pH 6至pH 7的液体存在下稳定。
此外，所述壁材料优选在水中表现出低溶胀性能，并对水和水性溶液具有化学和物理抗性。
此外，所述壁材料的密度优选为0.7g/cm3-1.6g/cm3，更优选为0.9g/cm3-1.6g/cm3，特别优选为0.9g/cm3-1.1g/cm3。
作为壁材料，所述反应器壁优选具有可拉伸材料，其中，所述可拉伸材料优选具有至少200％的可拉伸性(Dehnbarkeit)；和/或所述反应器壁具有第一部分和第二部分，其中，所述第一部分是可移动的并被布置成与所述第二部分密封连接。
优选地，可拉伸材料在步骤c)中被拉伸，和/或在步骤c)中所述反应器壁的第一部分相对于所述反应器壁的第二部分移动。
通常将伸长率(Dehnung)ε理解为物体在拉力下长度的相对变化，特别为长度变化Δl与原始长度l0的比：
Figure BDA0002284523090000051
可拉伸材料优选在至少两个空间方向上可拉伸，其中，指定的可拉伸性涉及该两个空间方向中的至少一个。
可拉伸性描述了可拉伸材料在力的作用下改变形状的性能，并指示了该材料在不断裂或撕裂的情况下可被拉长的程度。通常，可拉伸性(也称为断裂伸长率(Reiβdehnung))通过根据DIN 53504:2017-03的拉伸试验测定。
胡克定律描述了伸长率ε与应力σ的相关性，其中，E表示弹性模量(也称为E模量(E-Modul))：
σ＝E·ε
优选地，所述可拉伸材料具有0.1GPa-0.5GPa、更优选0.02GPa-0.1GPa、尤其优选0.03GPa-0.07Gpa的弹性模量，所述弹性模量可根据DIN 53504:2017-03测定。此外，可拉伸材料的肖氏硬度A(Shore
Figure BDA0002284523090000061
A)优选在20至100之间、更优选在30至80之间，所述肖氏硬度A可根据DIN ISO 7619-1:2012-02测定。
可拉伸材料优选具有高弹性。如果材料在应力解除(Entlastung)时返回到未变形的初始状态(该状态在施加拉力之前出现)，该材料被认为有弹性。
此外，可拉伸材料的抗拉强度(Reiβfestigkeit)优选为3.5MPa-41.4MPa，更优选为5.5MPa-35.9MPa。更优选地，可拉伸材料的可拉伸性优选为至少300％，更优选为至少330％，尤其优选为至少500％。通常，可拉伸材料的可拉伸性为至多5000％，优选至多2000％，更优选至多1500％。在DIN 53504:2017-03中描述了用于测定抗拉强度和可拉伸性的测量方法。
可拉伸材料优选包含至少一种弹性体，特别是热塑性弹性体。此外，可拉伸材料优选包括：聚合物，所述聚合物选自于由以下所组成的组：合成橡胶，例如，苯乙烯-丁二烯橡胶、氯丁二烯橡胶、聚丁二烯橡胶、乙烯-丙烯-二烯橡胶(EPDM)、硅橡胶、氟橡胶、丁腈橡胶、聚氨酯(PU)、氢化丙烯腈-丁二烯橡胶(HNBR)、聚丙烯、聚异丁烯和聚异戊二烯(PI)；天然橡胶，如胶乳；以及，它们的混合物。
特别优选地，所述可拉伸材料包括聚异戊二烯、聚丁烯和/或硅酮。所述可拉伸材料优选包含相对于可拉伸材料大于50wt％、更优选大于80wt％、特别优选大于90wt％的聚异戊二烯、聚丁烯和/或硅酮。所述可拉伸材料优选包含相对于可拉伸材料多至100wt％的聚异戊二烯、聚丁烯和/或硅酮，并且特别优选地，所述可拉伸材料由聚异戊二烯、聚丁烯和/或硅酮组成。
可拉伸材料还可包含添加剂，例如蛋白质，特别是酪蛋白和/或胶原。可拉伸材料优选包含增塑剂(Weichmacher)，例如羧酸酯类、脂肪、油类和樟脑。
天然橡胶和合成橡胶特别合适，因为它们具有高弹性。聚氨酯具有熔化温度高的优点。
优选地，面对反应室的反应器壁的表面是可增大的。优选地，在本发明的方法的步骤c)中使所述表面增大。有利地，对所述可拉伸材料进行拉伸，以增大面向所述反应室的表面。优选地，通过向所述反应室中配给第二液体介质和/或气体来拉伸所述可拉伸材料。所述第二液体介质和/或气体的配给优选通过加压传输来进行。
替代地或另外地，使所述反应器壁的第一部分相对于所述反应器壁的第二部分移动，以使得所述反应器壁的第二部分的面积变大，该反应器壁为面对反应室的反应器壁并且界定了所述反应室。在此，所述反应器壁的第二部分的一部分最初不与所述反应室直接接触，而是仅通过所述反应器壁的第一部分的移动直接地面对所述反应室并界定所述反应室。因此，第一部分和第二部分被布置成使得所述反应器壁的第一部分和第二部分之间存在密封但可移动的连接。密封连接优选包含橡胶密封件或橡胶条(Gummilippe)。
在一个实施方式中，所述反应器壁有利地具有圆柱体的壳体
Figure BDA0002284523090000071
形状，其也可称为管(Rohr)。优选地，所述壳体的一侧与底面紧密地封闭。优选地，所述壳体和任选的底面呈现所述反应器壁的第二部分。所述反应器壁的第一部分优选包括第二底面，该第二底面也可称为盖，并且被可移动地布置所述壳体的另一侧，更优选所述壳体内。
在另一实施方式中，将所述反应室设计成使得所述反应室的水平横截面在从底部到顶部的方向上增加，其中，所述从底部到顶部的方向与重力方向相反。优选地，所述反应室的水平横截面积连续增加，其中更优选地，所述反应室第一高度处的第一水平横截面是所述反应室第二高度处的第二水平横截面的至少两倍大，所述第一水平横截面位于所述第二水平横截面之上，并且特别优选地，所述第一水平横截面和所述第二水平横截面之间的距离小于所述反应室的最大垂直扩展的50％。在本发明的方法的过程中，反应室中液相的填装水平增加，使得所述反应室(其水平横截面在从底部到顶部的方向上增加)中的填装高度增加，并且所述反应室中的液相体积相对于最小初始液体体积增加至少500％、更优选至少1000％，并且优选不超过10000％，其中，所述液相包含第二液体介质和任选的第一液体介质。最小初始液体体积是指在步骤c)中配给第二液体介质之前反应室中液相的体积。优选地，最小初始液体体积处于1.5mL至800mL的范围，更优选处于3mL至400mL的范围，特别优选处于4mL至100mL的范围。填装高度涉及液相，并表明了从所述反应器壁或反应器底部到邻接气相的液体的最长垂直距离。优选地，在配给所述第二液体介质时，反应室中液相和气相之间的相界面与液相体积的比例变化小于10倍，更优选小于5倍。反应室任选由盖子封闭，所述盖优选包含柔性材料。还可将用于添加气体和/或液体的至少一个连接部布置在所述盖上。
优选地，所述反应器壁具有圆锥形的形状，其中，圆锥顶指向下，即重力方向。
替代地或另外地，所述反应器壁可至少部分地设计成风箱状(Faltenbalg)，其中，所述反应器壁至少部分地折叠成手风琴状(ziehharmonikaartig)。
该装置以及特别是反应器壁可设计成用于单次使用或重复使用。在单次使用的情况下，还可将所述反应室称为用完即弃型反应器(Einweg-Reaktor)或一次性使用反应器。在这种情况下，特别是在培养细胞的单次使用后将所述反应器壁弃置。为了可能的重复使用，在细胞培养完成之后，对至少所述反应器壁以及所述用于添加气体和/或液体的至少一个连接部、优选与细胞接触的细胞培养装置的所有表面进行清洁，灭菌并反复使用。
在本发明的方法的步骤b)中，将细胞和任选的第一液体介质引入反应室中。或者，也可首先将细胞引入所述反应室中，然后在本发明的方法的步骤c)中优选地使其悬浮于第二液体介质中；或者，可以首先引入第一液体介质，然后向其中添加细胞。
第一液体介质和第二液体介质优选具有相同的组成。相同的组成还包括第一液体介质和第二液体介质中细胞的细胞外代谢产物构成不同的情况。因此，细胞可以处于第一液体介质中的悬浮液提供，然后仅通过添加第二液体介质来稀释，以使得在步骤c)之前和之后所述细胞悬浮液基本上仅在细胞密度(而非所述介质的组成)上有所不同。
在替代的实施方式中，第一液体介质的组成可以不同于第二液体介质的组成。因此，第二液体介质的组成例如可以适应细胞后续的生长阶段。
第二液体介质和任选的第一液体介质优选含有至少50wt％的水，更优选至少75wt％，特别优选至少90wt％的水。优选地，第二液体介质和任选的第一液体介质含有多至99wt％的水。
此外，第二液体介质和任选的第一液体介质优选含有：无机盐，例如，CaCl2、Fe(NO3)3、KCl、MgSO4、NaCl、NaH2PO4和/或NaHCO3；氨基酸，例如，L-精氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和/或L-缬氨酸；维生素，例如，D-泛酸钙(Calciumpantothenat)、氯化胆碱、叶酸、i-肌醇(i-Inositol)、烟酰胺、核黄素和/或硫胺素；和/或其它成分，例如，D-葡萄糖、Phenolrot和/或丙酮酸钠。
特别优选地，第二液体介质和任选的第一液体介质包含至少50wt％的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)，更优选至少75wt％、特别优选至少90wt％的DMEM。
优选连续添加第二液体介质。或者，所述第二液体介质的添加可逐步进行(这也可被称为分批添加)。连续供应中的供应速率可以是恒定的或适于细胞生长。关于逐步添加，可以使每步骤添加的体积以及时间适应于细胞生长，或者也可以分别在固定时间间隔后以固定体积进行。
由于添加第二液体介质，根据本发明的方法也可以称为分批补料方法(Fed-Batch-Verfahren)。
此外，也可在反应室中添加额外的气体和/或额外的液体。反应器壁优选具有用于添加气体和/或液体的至少两个连接部。有利地，通过所述连接部进行步骤c)中第二液体介质和/或气体的配给，其中特别优选地，所述第二液体介质和/或气体各自分别通过连接部进行。特别是，反应器壁可包含用于供应空气和/或氧、二氧化碳、氮和/或来自反应室的废气的连接部。用于培养细胞的装置优选包含具有灭菌过滤器(Sterilfilter)的连接部。优选地，向反应室连续供应气体并且从所述反应室连续地排出气体，使得在所述反应室中发生气相的不断交换。
此外，可存在连接部(优选不具有灭菌过滤器)，所述连接部将反应室与无菌存储容器的连接，从而可得到用于添加另外的液体，特别是营养介质的连接部。还可提供用于取样的连接部。
优选地，反应器壁具有连接件，在该连接件上布置有用于添加气体和/或液体的至少一个连接部。
优选地，将细胞、第二液体介质和任选的第一液体介质在反应室中进行混合，特别是借助于混合装置。所述混合装置可以包括旋转轴混合器、振动混合器、液压混合器、气动混合器、静态混合器或振动器。
例如，将混合装置以搅拌器的形式，特别是以电磁搅拌器的形式布置在反应室中。优选地，将所述反应室布置在诸如振动板或轨道振动器的振动器上。进一步优选地，用紧固件将所述反应室固定在振动器上，其中，所述紧固件优选为可拉伸的。借助于所述混合装置，优选将包含细胞的第二液体介质和任选的第一液体介质设置成波浪式运动。
反应室优选包含气相和液相，其中，所述液相包含第二液体介质/细胞以及任选的第一液体介质，所述液相优选为悬浮液。优选地，反应室中气相和液相的体积比基本上保持不变，这可以通过由第二液体介质和/或气体的配给使内部体积增加来实现。以这种方式，液相和气相之间的相界面的大小相对于液相体积基本上保持恒定，从而培养期间的蒸发效应基本上保持不变。
优选地，在步骤c)中的配给之前，液相占内部体积的20vol.％至80vol.％，更优选30vol.％至70vol.％，特别优选40vol.％至60vol.％。此外，优选地，在步骤c)中的配给之后，液相占内部体积的10vol.％至80vol.％，更优选20vol.％至60vol.％，特别优选30vol.％至50vol.％。反应室中气相(优选含有氧)的存在在需氧细胞(aeroben Zellen)的培养中特别有利。
优选地，细胞在反应室中以悬浮培养存在。所述细胞特别包含非粘附细胞，这可理解为细胞基本上不粘附于反应器壁或反应室中的其它表面。
优选地，所述细胞包括悬浮培养的真核细胞，特别是哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞和/或真菌细胞；尤其优选哺乳动物细胞。替代地或另外地，所述细胞可包括原核细胞，例如细菌。
也可以考虑使用该装置来培养粘附细胞，从而所述反应室中存在的细胞包括粘附细胞。
在根据本发明的方法的步骤c)中，优选通过细胞生长使反应室中存在的细胞的数量增加。为此目的，所述反应室的温度优选为15℃-50℃，更优选为20℃-45℃，进一步优选为35℃-40℃，特别优选为36℃-48℃。
附图说明
在附图中示出了根据现有技术的实施方式和根据本发明的实施方式，并且在以下描述中对其进行了更详细的阐释。
图1示出了传统育种过程的示意图；
图2示出了根据本发明的用于培养细胞的装置，所述装置具有包含可拉伸材料的反应器壁；
图3示出了根据本发明的用于培养细胞的装置，所述装置具有反应器壁，所述反应器壁包含可移动布置的第一部分以及第二部分；
图4示出了根据本发明的用于培养细胞的装置，所述装置具有圆锥形反应器壁；
图5示出了反应室的侧视图，其中，所述反应室具有包含可拉伸材料的反应器壁；
图6示出了反应室的另一视图，其中，所述反应室具有包含可拉伸材料的反应器壁；
图7示出了用于培养细胞的装置的示意图，所述装置具有反应室，该反应室具有可拉伸材料的反应器壁。
图1示出了传统育种过程的程序示意图。从包含起始培养物的存储容器1中，将体积为1mL、细胞密度为2×107个细胞/mL的处于细胞悬浮液(包含细胞和培养介质)形式的细胞培养物引入第一扩增容器2.1中。总共使用四个扩增容器2.1、2.2、2.3和2.4来产生足够的细胞，以作为接种物来接种生产容器4。由于不应超过最大体积比细胞密度(maximalevolumenspezifische Zelldichte)以免阻碍细胞生长，在扩增过程中随着细胞数量的增加，向细胞悬浮液中添加新鲜培养介质。
如果在第一扩增容器2.1中达到最大填装水平，将细胞悬浮液从第一扩增容器2.1转移至第二扩增容器2.2，并根据细胞生长添加另外的新鲜培养介质。然后将细胞悬浮液相应地转移到第三扩增容器2.3中，然后转移到第四扩增容器2.4中。
从第一扩增容器2.1到第四扩增容器2.4，细胞悬浮液的体积从125mL增加到10L。用第四扩增容器2.4中的细胞悬浮液接种预生产容器3，所述预生产容器3的内部体积为50L，也被称为n-1级。在预生产容器3中，细胞数量进一步增加，以将预生产容器3中的内容物用于接种生产容器4，其内部体积为500L。此处示出的容器是批式反应器(Satzreaktoren)，也称为间歇反应器。
图2示出了根据本发明的用于培养细胞的装置10的示意图，该装置具有包含可拉伸材料的反应器壁16。示出了用于培养细胞的装置10，其可以代替根据图1的四个扩增容器2.1、2.2、2.3和2.4，因为可以在同一容器中实现所需的细胞悬浮液体积增加。
用于培养细胞的装置10包含混合装置12，在所述混合装置12上布置有反应室14。混合装置12例如为轨道振动器。具有内部体积15的反应室14由反应器壁16界定。反应器壁16包含用于添加液体的连接部18和用于添加气体的连接部20，其中，用于添加气体的连接部20具有灭菌过滤器22。另外，提供了用于取样的软管24。
反应室14既包含液相28又包含气相30。液相28包含第二液体介质26和任选的第一液体介质以及细胞29。
在初始状态32，反应室14具有最小初始内部体积，并通过用于添加液体介质的连接部18和/或通过用于添加气体的连接部20添加第二液体介质28和/或气体使反应器壁16被拉伸，以达到第一拉伸状态34。通过拉伸可膨胀材料，使反应器壁16面向反应室的表面17增加。通过进一步添加第二液体介质26或气体，反应器壁16进一步被拉伸，从而达到第二拉伸状态36。
与根据图1的器皿2.1、2.2、2.3和2.4相反，在根据图2的本发明的实施方式中，不仅液相28(即细胞悬浮液)的体积增加，而且反应室14的内部体积15也增加了，从而省略了将液相28向下一更大容器中的导入，直到达到根据本发明的反应室14的最大内部体积。因此，细胞扩增可在仅一个容器中进行。
图3示出了根据本发明的用于培养细胞的装置10，所述装置具有反应器壁16，该反应器壁16包括可移动布置的第一部分16.1以及第二部分16.2。根据本发明的用于培养细胞的装置10包含混合装置12，其中，在该实施方式中，混合装置12是搅拌器。
具有内部体积15的反应室14由反应器壁16的第一部分16.1和反应器壁16的第二部分16.2界定。第一部分16.1是可移动的并且被布置为与第二部分16.2密封连接。第二部分16.2具有管形形状或圆柱形壳体，并且反应器壁16的第一部分16.1可以在第二部分16.2内向上移动，从而使得反应室14的内部体积15增大。
图4示出了根据本发明的用于培养细胞的装置10，所述装置具有圆锥形反应器壁16。该用于培养细胞的装置10包含搅拌器形式的混合装置12。具有内部体积15的反应室14具有圆锥形形状。
在反应室14中，水平横截面42在从底部到顶部的方向上增加，同时存在液相28和气相30，所述液相28包含第二液体介质26、任选的第一液体介质和细胞29。液相28达到填装高度40。与不同形状的反应器壁16相比，圆锥形形状允许即使在小体积液相28的情况下，位于液相28和气相30之间的相界面38与液相的体积的比也足够小，从而蒸发作用不会很厉害。然而，在细胞扩增中液相28体积的必要增加是可能的。
图5示出了反应室14的侧视图，该反应室具有包含可拉伸材料的反应器壁16。反应室14具有内部体积15，其可以通过拉伸所述可拉伸材料而增大。反应器壁16具有连接件44，在连接件44上布置有用于添加液体的连接部18、用于取样的连接部19、用于添加气体的连接部20以及气体出口21。
图6示出了反应室14的另一视图，其中，反应器壁16包含根据图5的可拉伸材料。连接件44具有用于添加液体的连接部18、用于取样的连接部19、用于添加气体的连接部20以及气体出口21。
图7示意性地示出了用于培养细胞的装置，所述装置具有由可拉伸材料制成的反应室。
可将由可拉伸材料制成的反应室14构造成如图5和图6所示。然而，替代的且优选的是，反应室14完全由可拉伸材料的反应器壁16所包围，并使得用于添加液体的连接部18、用于添加气体的连接部20、气体出口21以及用于取样的连接部19直接穿过可拉伸材料形成的反应器壁。用于添加液体的连接部18、用于添加气体的连接部20、气体出口21和用于取样的连接部19的密封以本领域技术人员熟知的方式进行，例如通过黏合。
为了培养细胞，通过泵50(优选为气动泵)经由用于添加液体的连接部18将培养介质46从储存容器48运输到反应室中。泵的输送速率取决于在反应室14中培养的细胞29的生长。在此，培养介质46可以连续地或逐步地输送到反应室14中，其中，当反应室中所含的介质几乎耗竭时，补充各种培养介质。作为气动泵的替代，还可使用任何其它泵以将培养介质46无污染地运输到反应室14中。
通过用于添加气体的连接部20，将细胞培养所需的气体(通常为含氧气体，例如纯氧或空气或富氧空气)提供到反应室中。借助气泵52进行气体的添加。为了防止气体中的污染物被引入反应室，在将气体添加到反应室之前，将所述气体通过灭菌过滤器54。作为气泵52，例如隔膜泵(Membranpumpe)是合适的。但是，此处也可以使用能够泵送气体的任何其它合适泵。
多余的气体可以通过气体出口21从反应室14中排出。为了使反应室14免受气体中不想要的成分的影响，气体出口21也有灭菌过滤器54。
用于取样的连接部19连接至合适的取样系统56。因此，取样系统56必须是无菌的，从而不会将污染物引入系统，并且所采集的样品也不会受到污染。为了从反应室14中取出样品，必须在取样连接部19处施加低于反应室14的压力，从而基于压力差从反应室14中取出样品。例如可用作取样系统的注射器，拉动注射器柱塞以进行取样，从而增加了在取样期间用于接收样品的空间。
实施例
实施例1
在根据图2的用于培养细胞的装置中引入体积为10mL的液相，该装置具有可拉伸材料作为壁材料。连续添加水性介质和空气十小时，直到反应室中的液相体积达到20L。
实验用三种不同的壁材料进行。反应器壁分别基本上由天然橡胶、聚异戊二烯或聚氨酯组成，它们各自具有良好的生物相容性。在膨胀之前，反应器壁最初的壁厚度为约100μm。
使用所有三种材料，内部体积的体积膨胀达到至少2000％。聚异戊二烯反应器壁和天然橡胶反应器壁具有比聚氨酯反应器壁更高的可拉伸性。
实施例2
在根据图2的用于培养细胞的装置(该装置具有基本上由聚异戊二烯组成的反应器壁)中，首先引入500mL的含有酵母细胞(酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae)的水性悬浮液。将细胞培养14天，同时逐步添加总共4.5L的水性培养介质。在整个培养期间，观察到代谢产物的产生。
实施例3
将根据图2的用于培养细胞的装置(具有基本上由聚异戊二烯组成的反应器壁)在120℃和2bar下高压蒸汽处理2小时。于37℃下将50mL细胞培养介质(由含10wt％胎牛血清(FKS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)组成)在高压蒸汽处理后的装置中孵育7天，然后在显微镜下观察细胞培养介质样品。在10,000×的放大倍率下，未观察到细胞。因此，该装置适用于灭菌工作。
附图标记
1 存储容器
2 扩增容器
2.1 第一扩增容器
2.2 第二扩增容器
2.3 第三扩增容器
2.4 第四扩增容器
3 预生产容器
4 生产容器
10 用于培养细胞的装置
12 混合装置
14 反应室
15 内部体积
16 反应器壁
16.1 第一部分
16.2 第二部分
17 面向反应室的面
18 用于添加液体的连接部
19 用于取样的连接部
20 用于添加气体的连接部
21 气体出口
22 灭菌过滤器
24 软管
26 第二液体介质
28 液相
29 细胞
30 气相
32 初始状态
34 第一拉伸状态
36 第二拉伸状态
38 相界面
42 水平横截面
44 连接件
46 培养介质
48 储存容器
50 泵
52 气泵
54 灭菌过滤器
56 取样系统

Claims (11)

1.用于培养细胞的装置(10)，所述装置包含混合装置(12)和由反应器壁(16)界定的反应室(14)，其中，所述反应器壁(16)具有用于添加气体和/或液体的至少一个连接部(18，20)，并且所述反应室(14)具有内部体积(15)，其中，所述反应室(14)被设计为：相对最小初始内部体积，所述内部体积(15)可增大至少500％；或者所述反应室(14)的水平横截面(42)在从底部到顶部的方向上增加。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述反应器壁(16)具有可拉伸材料，其中，所述可拉伸材料具有至少200％的可拉伸性；和/或所述反应器壁(16)具有第一部分(16.1)和第二部分(16.2)，其中，所述第一部分(16.1)是可移动的并被布置成与所述第二部分(16.2)密封连接。
3.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，所述可拉伸材料包含天然橡胶、合成橡胶、聚异丁烯、硅橡胶或其混合物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的装置，其特征在于，所述最小初始内部体积在2mL至1L的范围内，并且可增大至10L至100L的最大内部体积。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的装置，其特征在于，所述用于添加气体和/或液体的至少一个连接部(18，20)穿过所述反应器壁(16)的可拉伸材料。
6.在根据权利要求1-5中任一项所述的装置中培养细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a.任选地，在80℃至150℃的温度下或通过伽马射线对所述反应器壁(16)进行灭菌；
b.填装所述装置，其中，向所述反应室(16)中提供细胞(29)和任选的第一液体介质；
c.向所述反应室(14)中配给第二液体介质(26)和/或气体，其中，优选地，所述第二液体介质具有与所述第一液体介质(26)的组成相对应的组成，
以及
相对于最小初始内部体积，使所述反应室(14)的内部体积(15)增大至少500％；
或者
增大所述反应室(14)中的填装高度，所述反应室(14)的水平横截面(42)在从底部到顶部的方向上增加，其中，相对于最小初始液体体积，所述反应室(14)中的液相(28)增加至少500％，所述液相(28)包含第二液体介质(26)和任选的第一液体介质。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反应器壁(16)具有可拉伸材料，并且在步骤c)中使所述可拉伸材料拉伸；和/或所述反应器壁(16)具有第一部分(16.1)和第二部分(16.2)并且在步骤c)中使所述第一部分相对于所述第二部分(16.1)移动。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，将所述第二液体介质(26)连续添加和/或逐步添加。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，将所述反应室(14)中的所述细胞(29)、所述第二液体介质(26)以及任选的所述第一液体介质混合。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤c)中的配给之前和之后，所述液相(28)占所述内部体积(15)的10vol.％至80vol.％。
11.根据权利要求6-10中任一项所述的方法，其特征在于，在所述反应室(14)中所述细胞(29)以悬浮培养存在。
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