ES2873836T3

ES2873836T3 - Dispositivo y procedimiento para el cultivo de células

Info

Publication number: ES2873836T3
Application number: ES18728553T
Authority: ES
Inventors: Valentin Kramer
Original assignee: Aucteq Biosystems
Current assignee: Aucteq Biosystems
Priority date: 2017-05-23
Filing date: 2018-05-23
Publication date: 2021-11-04
Anticipated expiration: 2038-05-23
Also published as: DE102017208758A1; JP2020520657A; US20200224143A1; CN110892056B; DK3630936T3; EP3630936A1; EP3630936B1; WO2018215521A1; JP6942201B2; CN110892056A

Abstract

Dispositivo para el cultivo de células (10), que comprende un dispositivo de mezcla (12) y un espacio de reacción (14) que se delimita por una pared del reactor (16), donde la pared del reactor (16) presenta al menos una conexión (18, 20) para la adición de gas y/o líquido y el espacio de reacción (14) presenta un volumen interior (15), donde el espacio de reacción (14) está configurado de modo que el volumen interior (15) se pueda agrandar en al menos un 500%, referido a un volumen inicial interior mínimo, y donde la pared del reactor (16) presenta un material extensible, donde el material extensible presenta una capacidad de extensión de al menos el 200%.

Description

DESCRIPCIÓN

Dispositivo y procedimiento para el cultivo de células

La invención se refiere a un dispositivo para el cultivo de células, que comprende un dispositivo de mezcla y un espacio de reacción que se delimita por una pared del reactor, donde la pared del reactor presenta al menos una conexión para la adición de gas y/o líquido y el espacio de reacción presenta un volumen interior. La invención también se refiere a un procedimiento para el cultivo de células en el dispositivo.

Los biorreactores para el cultivo de células a menudo comprenden como espacio de reacción recipientes de vidrio, acero inoxidable o plástico, que presentan tamaños diferentes pero fijos. Los recipientes de vidrio o acero inoxidable se utilizan habitualmente como reactores reutilizables y se limpian, esterilizan y reutilizan después del uso. En particular, los recipientes de reacción de plástico pueden estar destinados a un solo uso, lo que también se conoce como single-use.

Además, se conocen biorreactores de plástico que presentan la forma de una bolsa y durante el uso están dispuestos habitualmente en agitadores. También se designan como biorreactores de ondas.

Los recipientes de reacción habituales, en particular para el cultivo de células, ponen a disposición un volumen de reacción fijo predeterminado, que está condicionado por el tamaño inflexible de los recipientes y, por regla general, también por una forma inflexible de los recipientes.

Para poder inocular un biorreactor con un volumen de reacción de varios litros y en particular a escala industrial con un volumen de reacción de más de 1 m3 con células, en primer lugar, partiendo de una pequeña cantidad de células almacenadas de un cultivo de partida en la escala de ml, se debe producir una cantidad suficiente de células para el gran volumen de reacción. Para ello, en el marco de una extensión en serie del cultivo, que también se conoce como seed train, las células se transfieren gradualmente de un recipiente pequeño al siguiente recipiente más grande, en el que el crecimiento celular continúa hasta la siguiente transferencia al siguiente recipiente más grande.

En esta serie de precultivos, las células se encuentran de manera óptima en conjunto en una fase de crecimiento exponencial. La transferencia de las células a recipientes más grandes también se designa como transmisión, paso o traslado. La transferencia de las células a volúmenes más grandes es necesaria porque muchas células requieren una cierta densidad celular para entrar en la fase de crecimiento exponencial, que también se designa como fase de crecimiento logarítmico o fase logarítmica. La densidad celular se define habitualmente como el número de células por volumen de cultivo celular líquido. Al alcanzar una densidad celular máxima con frecuencia disminuye el crecimiento celular, bajo el que se entiende el aumento del número de células por unidad de tiempo. Una dilución o una adición de más medio solo es posible de forma limitada debido al volumen fijo de los recipientes.

El crecimiento celular en la extensión en serie del cultivo también se describe como la expansión de las células. El objetivo de la expansión en la extensión en serie del cultivo es proporcionar un inóculo, que también se designa como inoculado, que puede servir para la inoculación, que también se designa infición o inyección, de un biorreactor a escala industrial. Bajo la expansión celular, que también se describe como expansión lineal celular, se entiende así el agrandamiento gradual del volumen de cultivo y la multiplicación de las células, habitualmente en varias etapas del proceso.

Las células se encuentran con frecuencia en suspensión celular, donde las células y sus productos metabólicos extracelulares están suspendidos en un medio nutritivo habitualmente acuoso.

M. Howaldt et al., en "Kultivierung von Saugetierzellen", Bioprozesstechnik, 3a edición, Spektrum Akademischer Verlag, 2011, páginas 410 a 413 describen el uso a gran escala de la tecnología de células de mamíferos, donde el procesamiento ascendente se compone de las áreas nucleares del banco de células, el inóculo y la fermentación. Para la fermentación, se descongela una parte alícuota del banco de células y se cultiva en un matraz agitador o en una centrifugadora. Luego, las células se transfieren a los siguientes recipientes de cultivo más grandes, como centrifugadoras, biorreactores de ondas o de acero inoxidable, que sirven como etapas preliminares en la producción de la reproducción celular. Con los fermentadores de cultivo se deben generar números altos de células lo más rápido posible para que el fermentador de producción pueda inocularse con una alta densidad de siembra en el menor tiempo posible.

El documento DE 102013 002091 da a conocer un dispositivo para el cultivo de células, un recipiente de biorreactor con pared flexible, por ejemplo de una o más láminas de polímero (p. ej.: PE, PP). El documento EP 2 543 719 A1 describe un biorreactor de meandro y un procedimiento para la expansión, diferenciación y recolección dinámica de células hematopoyéticas. El biorreactor se compone de un recipiente de biorreactor, cuya superficie de fondo está provista de paredes divisorias dispuestas desplazadas, que provocan un guiado tipo meandro de los medios con un flujo laminar. Varios biorreactores de meandro se pueden conectar en serie de forma modular a través de válvulas de cierre. Las células suministradas forman una capa de células que casi cubre la superficie de fondo.

T. H. Rodríguez et al. describen en "Considerations for Cell Passaging in Cell Culture Seed Trains", BMC Proceedings, 2015, 9 (Supl 9): P43, una herramienta basada en software para la optimización de seed trains, donde se calcula un instante óptimo en el que el cultivo celular se transfiere de una escala a la siguiente más grande.

B. Wright et al. en "A Novel Seed-Train Process", BioProcess International 13(3)s, marzo de 2015, páginas 16 a 25 contraponen una extensión en serie del cultivo mejorada con una extensión en serie del cultivo convencional, donde el tiempo necesario y la complejidad de la extensión en serie del cultivo mejorada se reducen mediante el uso de un cultivo de alta densidad celular.

En las directivas para el manejo de bolsas de cultivo del fabricante Miltenyi Biotec GmbH, Handling guidelines MACS® GMP Cell Culture Bags, septiembre de 2013, se describen las bolsas de cultivo para expansión celular, que están divididas en tres cámaras que al abrir los cordones de soldadura se pueden conectar entre sí formando un volumen de 100 ml.

La transferencia gradual de las células a los siguientes recipientes más grandes durante la expansión de las células representa una etapa de trabajo costosa y que requiere mucho tiempo. Durante la transferencia, las células se encuentran temporalmente fuera de los recipientes de cultivo, de modo que existe un elevado riesgo de contaminación no deseada o ensuciamiento del cultivo celular.

El objetivo de la presente invención es proporcionar un dispositivo y un procedimiento, con los que se evite la transferencia de células a varios recipientes de distintos tamaños durante la expansión celular.

El objetivo se consigue mediante un dispositivo para el cultivo de células de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un dispositivo de mezcla y un espacio de reacción que se delimita por una pared del reactor, donde la pared del reactor presenta al menos una conexión para la adición de gas y/o líquido y el espacio de reacción presenta un volumen interior, donde el espacio de reacción está configurado de modo que el volumen interior se pueda agrandar en al menos un 500%, preferiblemente en al menos un 700%, más preferiblemente en al menos un 1000%, más preferiblemente en al menos un 1500% y en particular preferiblemente en al menos un 2000%, referido a un volumen inicial interior mínimo y en donde la pared del reactor presenta un material extensible, en donde el material extensible presenta una capacidad de extensión de al menos el 200%.

Además, el objetivo se consigue mediante un procedimiento de cultivo de células en el dispositivo según la invención de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas:

a. eventualmente, esterilización de la pared del reactor a una temperatura de 80 °C a 150 °C o mediante radiación gamma,

b. llenado del dispositivo, donde células y eventualmente un primer medio líquido se agrega en el espacio de reacción,

c. dosificación de un segundo medio líquido y/o un gas en el espacio de reacción, donde el segundo medio líquido presenta preferiblemente una composición que corresponde a la del primer medio líquido, y

agrandamiento del volumen interior del espacio de reacción en al menos un 500%, preferiblemente en al menos un 700% y más preferiblemente en al menos un 1000% referido al volumen inicial interior mínimo y donde la pared del reactor (16) presenta un material extensible, donde el material extensible presenta una capacidad de extensión de al menos el 200%.

Debido al volumen interior agrandable del espacio de reacción en al menos un 500% se pueden agregar mayores cantidades de medio líquido en el mismo recipiente, de modo que a pesar del número creciente de células en el espacio de reacción, la densidad celular referido a un volumen de medio líquido no supera una densidad celular máxima y se evita una transferencia del cultivo celular a un recipiente más grande.

Por lo tanto, también es ventajoso un volumen interior variable del espacio de reacción según la invención dado que junto a un volumen final agrandado también se puede ajustar el volumen inicial interior mínimo. En comparación con el uso de recipientes grandes al principio, esto permite una relación más pequeña de superficie respecto a volumen del cultivo celular cuando solo hay una pequeña cantidad de cultivo celular, que comprende células y medio. En particular, al principio también es relativamente pequeña una interfaz de fase entre el cultivo celular, es decir la fase líquida, y una fase gaseosa presente igualmente en el recipiente.

Si, por otro lado, solo está presente una pequeña cantidad de cultivo celular en un recipiente comparativamente grande, entonces la relación de superficie respecto a volumen del cultivo celular es alta y se produce una evaporación del medio hasta un secado de las células. Este es el caso en particular cuando se realiza el cultivo de las células a una temperatura por encima de la temperatura ambiente.

Al comienzo de la expansión celular, el volumen existente del cultivo celular también es habitualmente pequeño, dado que quedar por debajo de una densidad celular mínima en el cultivo celular también puede conducir a un crecimiento celular disminuido.

El volumen interior del espacio de reacción según la invención, donde el crecimiento celular ya se interpreta como una reacción, crece esencialmente conforme al número de células presentes en el espacio de reacción, hasta que se alcanza un volumen deseado de cultivo celular con la densidad celular deseada. El espacio de reacción se ensancha durante la expansión del cultivo celular y eventualmente cambia su forma.

Al evitar la transferencia de células de un recipiente más pequeño a un recipiente más grande se reduce el riesgo de contaminación no deseada. Asimismo se ahorra cantidad de trabajo, así como el coste del material y la limpieza de otros recipientes.

El volumen interior representa preferiblemente un volumen continuo. En el marco de la invención, un volumen continuo significa que no hay una subdivisión en varias secciones que están conectadas entre sí, por ejemplo, solo mediante conexiones de tubo o conexiones de manguera.

En el marco de la invención, un volumen interior ajustable más pequeño del espacio de reacción se designa como volumen inicial interior mínimo. El volumen inicial interior mínimo se sitúa preferiblemente en un rango de 2 ml a 1 l, más preferiblemente en un rango de 5 ml a 500 ml y en particular preferiblemente en un rango de 5 ml a 100 ml. El volumen inicial interior mínimo se puede agrandar hasta un volumen interior máximo del espacio de reacción y el volumen interior máximo se sitúa preferiblemente en un rango de 10 l a 100 l, en particular preferiblemente en un rango de 15 l a 50 l.

Preferiblemente, el volumen interior se puede agrandar de forma continua. En el marco de la invención, continuamente agrandable significa que el volumen interior aumenta uniformemente con el tiempo y/o que cada grado de aumento del volumen interior hasta el volumen interior máximo se puede ajustar sin escalones.

Ventajosamente, la pared del reactor presenta un material de pared que es biocompatible y no tóxico para los cultivos celulares. El material de la pared es preferiblemente impermeable a los líquidos y estable a la esterilización por calor, radiación y/o productos químicos.

El material de la pared es preferiblemente estable a la temperatura en un rango de 10 °C a 150 °C, más preferiblemente en un rango de 25 °C a 130 °C. Además, el material de la pared es preferiblemente estable en presencia de líquidos con un valor de pH en un rango de pH 5 a pH 8, más preferiblemente en un rango de pH 6 a pH 7. El material de la pared también muestra preferiblemente un pequeño comportamiento de hinchamiento en agua y es química y físicamente resistente al agua y soluciones acuosas.

Además, el material de la pared presenta preferiblemente una densidad en un rango de 0,7 a 1,6 g/cm3, más preferiblemente en un rango de 0,9 a 1,6 g/cm3 y en particular preferiblemente en un rango de 0,9 a 1,1 g/cm3.

La pared del reactor presenta un material extensible como material de la pared, donde el material extensible presenta una capacidad de extensión de al menos el 200%. Según la invención, el material extensible se extiende en la etapa c).

Un alargamiento £ se entiende habitualmente como un cambio de longitud relativo de un cuerpo bajo carga, en particular como la relación entre un cambio en la longitud Al respecto a una longitud original h:

A /

s ^{= —}

El material extensible se puede estirar preferiblemente en al menos dos direcciones espaciales, donde la capacidad de extensión especificada está referida a al menos una de las dos direcciones espaciales. La capacidad de extensión describe la propiedad del material extensible de cambiar su forma bajo la acción de la fuerza e indica hasta dónde se puede extender el material sin que se rompa o rasgue. La capacidad de extensión, que también se designa como alargamiento a la rotura, se determina habitualmente mediante un ensayo de tracción de acuerdo con la norma DIN 53504:2017-03.

La ley de Hooke describe la dependencia del alargamiento £ por una tensión a, donde E representa el módulo de elasticidad, que también se designa como módulo de elasticidad:

a ~ E -s

El material extensible presenta preferiblemente un módulo de elasticidad, que se puede determinar conforme a la norma DIN 53504:2017-03, en un rango de 0,1 a 0,5 GPa, más preferiblemente de 0,02 a 0,1 GPa y en particular preferiblemente de 0,03 a 0,07 GPa. Además, la dureza Shore A del material extensible, que se puede determinar de acuerdo con la norma DIN ISO 7619-1:2012-02, está preferiblemente entre 20 y 100, más preferiblemente entre 30 y 80.

El material extensible presenta preferiblemente una alta elasticidad. Un material se designa como elástico cuando en el caso de descarga vuelve al estado inicial no deformado que estaba presente antes de la solicitación.

Además, el material extensible presenta preferiblemente una resistencia al desgarro en un rango de 3,5 a 41,4 MPa, más preferiblemente de 5,5 a 35,9 MPa. El material extensible presenta más preferiblemente una capacidad de extensión de al menos un 300%, más preferiblemente de al menos un 330% y particularmente preferiblemente de al menos un 500%. Preferiblemente, el material extensible presenta una capacidad de extensión de hasta el 5000%, preferiblemente hasta el 2000% y más preferiblemente hasta el 1500%. Un método de medición para determinar la resistencia al desgarro y la capacidad de extensión se describe en la norma DIN 53504:2017-03.

El material extensible comprende preferiblemente al menos un elastómero, en particular un elastómero termoplástico. Además, el material extensible contiene preferiblemente un polímero seleccionado del grupo que consiste en caucho sintético como caucho de estireno-butadieno, caucho de cloropreno, caucho de polibutadieno, caucho de etileno-propileno-dieno (EPDM), caucho de silicona, caucho de flúor, caucho de nitrilo, poliuretano. (PU), caucho de acrilonitrilo-butadieno hidrogenado (HNBR), polipropileno, poliisobutileno y poliisopropeno (PI), caucho natural como látex y mezclas de los mismos.

El material extensible contiene de forma especialmente preferida poliisopropeno, polibutileno y/o silicona. El material extensible contiene preferiblemente más del 50% en peso, referido al material extensible, de forma especialmente preferida más del 80% en peso y en particular preferiblemente más del 90% en peso de poliisopropeno, polibutileno y/o silicona. El material extensible contiene preferiblemente hasta un 100% en peso, referido al material extensible, poliisopropeno, polibutileno y/o silicona, y en particular preferiblemente el material extensible está hecho de poliisopropeno, polibutileno y/o silicona.

Además, el material extensible puede contener aditivos como proteínas, en particular caseína y/o colágeno. El material extensible contiene preferiblemente plastificantes tales como ésteres de ácido carboxílico, grasas, aceites y alcanfor.

Los cauchos naturales y sintéticos son adecuados en particular dado que presentan una alta elasticidad. El poliuretano posee la ventaja de una alta temperatura de fusión.

Preferiblemente, se puede agrandar una superficie de la pared del reactor que está dirigida hacia el espacio de reacción. Preferiblemente, la superficie se agranda en la etapa c) del procedimiento según la invención. El material extensible se extiende ventajosamente para agrandar la superficie dirigida hacia el espacio de reacción. El material extensible se extiende preferiblemente mediante dosificación del segundo medio líquido y/o del gas en el espacio de reacción. La dosificación del segundo medio líquido y/o del gas se realiza preferiblemente por medio del transporte a presión elevada.

En un modo de realización, la pared del reactor presenta ventajosamente la forma de una superficie envolvente de un cilindro, que también se puede designar como tubo. Un lado de la superficie envolvente está cerrado preferiblemente de forma fija con una superficie de fondo. La superficie envolvente y eventualmente la superficie de fondo representan preferiblemente la segunda parte de la pared del reactor. La primera parte de la pared del reactor comprende preferiblemente una segunda superficie de fondo, que también se puede designar como cubierta y que está dispuesta de forma móvil en el otro lado de la superficie envolvente, más preferiblemente dentro de la superficie envolvente.

En otro modo de realización, el espacio de reacción está configurado de modo que una superficie de sección transversal horizontal del espacio de reacción aumenta de abajo hacia arriba, donde la dirección de abajo hacia arriba está opuesta a la dirección de la gravedad. La superficie de sección transversal horizontal del espacio de reacción aumenta preferiblemente de forma continua, donde más preferiblemente una primera superficie de sección transversal horizontal del espacio de reacción a una primera altura es al menos dos veces más grande que una segunda superficie de sección transversal horizontal del espacio de reacción en una segunda altura, la primera superficie de sección transversal horizontal se sitúa por encima de la segunda superficie de sección transversal horizontal y en particular preferiblemente existe una distancia entre la primera superficie de sección transversal horizontal y la segunda superficie de sección transversal horizontal que corresponde a menos del 50% de un ensanchamiento vertical máxima del espacio de reacción. En el curso del procedimiento según la invención aumenta el nivel de llenado de la fase líquida en el espacio de reacción, de modo que aumenta la altura de llenado en el espacio de reacción, cuya superficie de sección transversal horizontal aumenta desde abajo hacia arriba y el volumen de la fase líquida en el espacio de reacción, que comprende el segundo medio líquido y eventualmente el primer medio líquido, aumenta en al menos un 500%, más preferiblemente en al menos un 1000% y preferiblemente en no más de un 10000%, referido a un volumen inicial líquido mínimo. El volumen inicial líquido mínimo designa el volumen de la fase líquida en el espacio de reacción antes de que se dosifique el segundo medio líquido en la etapa c). El volumen inicial líquido mínimo se sitúa preferiblemente en un rango de 1,5 ml a 800 ml, más preferiblemente en un rango de 3 ml a 400 ml y en particular preferiblemente en un rango de 4 ml a 100 ml. La altura de llenado está referida a la fase líquida y designa la distancia vertical más larga entre la superficie del líquido dirigida hacia la fase gaseosa y la pared del reactor o un fondo del reactor. La relación de la interfaz de fase entre la fase líquida y una fase gaseosa en el espacio de reacción al volumen de las fases líquidas durante la dosificación del segundo medio líquido cambia preferiblemente en menos de un factor de 10, más preferiblemente en menos de un factor de 5. El espacio de reacción está cerrado eventualmente con una cubierta, que preferiblemente comprende un material flexible. La al menos una conexión para la adición de gas y/o líquido también puede estar dispuesta en la cubierta.

La pared del reactor tiene preferiblemente una forma cónica, donde la punta del cono señala hacia abajo, es decir en la dirección de la gravedad. Complementariamente, la pared del reactor puede estar realizada al menos parcialmente como un fuelle, donde la pared del reactor está plegada al menos parcialmente como un acordeón.

El dispositivo y en particular la pared del reactor pueden estar configurados para un solo uso o para el uso múltiple. En el caso de un solo uso, el espacio de reacción también se puede designar reactor desechable o reactor de un solo uso. En este caso, en particular la pared del reactor se elimina después de un solo uso para el cultivo de células. Para un eventual uso múltiple, al menos la pared del reactor y la al menos una conexión para la adición de gas y/o líquido, preferiblemente todas las superficies del dispositivo para el cultivo de células que entran en contacto con las células, se limpian, esterilizan y utilizan repetidamente después del cultivo concluido de las células.

En la etapa b) del procedimiento según la invención, las células y eventualmente un primer medio líquido se presentan en el espacio de reacción. Alternativamente, las células también se pueden presentar en primer lugar en el espacio de reacción, que luego se suspenden preferiblemente en el segundo medio líquido en la etapa c) del procedimiento según la invención, o se puede presentar en primer lugar el primer medio líquido, al que luego se añaden las células.

El primer medio líquido y el segundo medio líquido presentan preferiblemente una misma composición. Una misma composición también comprende el caso de que sea diferente un contenido de productos metabólicos extracelulares de las células en el primer y segundo medio líquido. Así, las células se pueden presentarse en suspensión en el primer medio líquido, que luego solo se diluyen añadiendo el segundo medio líquido, de modo que la suspensión celular se diferencie esencialmente solo en la densidad celular antes y después de la etapa c), pero no en composición del medio.

En un modo de realización alternativo, la composición del primer medio líquido puede diferir de la composición del segundo medio líquido. Por ejemplo, así la composición del segundo medio líquido puede estar adaptada a la fase de crecimiento avanzado de las células.

El segundo medio líquido y eventualmente el primer medio líquido contienen preferiblemente al menos un 50% en peso de agua, más preferiblemente al menos un 75 % en peso y en particular preferiblemente al menos un 90% en peso de agua. El segundo medio líquido y eventualmente el primer medio líquido contienen preferiblemente hasta un 99 % en peso de agua.

Además, el segundo medio líquido y eventualmente el primer medio líquido contienen preferiblemente sales inorgánicas como CaCl², Fe(NO³)³, KCl, MgSO⁴, NaCl, NaH²PO⁴y/o NaHCO³, aminoácidos como L-arginina, L-cistina, L-glutamina, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-serina, L-treonina, L-triptófano y L-tirosina y/o L-valina, vitaminas como D-pantotenato de calcio, cloruro de colina, ácido fólico, i-inositol, niacinamida, riboflavina y/o tiamina, y/u otros componentes como D-glucosa, rojo fenol y/o piruvato de sodio.

El segundo medio líquido y eventualmente el primer medio líquido contienen de forma especialmente preferida al menos un 50% en peso de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), más preferiblemente al menos un 75 % en peso y en particular preferiblemente al menos un 90% en peso de DMEM.

El segundo medio líquido se añade preferiblemente de forma continua. Alternativamente, la adición del segundo medio líquido se puede realizar gradualmente, lo que también se puede designar como en porciones. La velocidad de suministro en el suministro continuo puede ser constante o adaptarse al crecimiento celular. En el caso de la adición gradual, el momento y el volumen añadido por paso pueden estar adaptados al crecimiento celular o realizarse respectivamente después de un intervalo de tiempo fijo y con un volumen fijo.

Debido a la adición del segundo medio líquido, el procedimiento según la invención también se puede designar como procedimiento de alimentación por lotes.

Además, también se puede añadir adicionalmente otro gas y/u otro líquido al espacio de reacción. La pared del reactor presenta preferiblemente al menos dos conexiones para la adición de gas y/o líquido. La dosificación del segundo medio líquido y/o del gas en la etapa c) se realiza ventajosamente a través de las conexiones, donde de manera especialmente preferida el segundo medio líquido y/o el gas se realiza respectivamente por separado a través de una conexión. En particular, la pared del reactor puede comprender conexiones para el aire de alimentación y/u oxígeno, dióxido de carbono, nitrógeno y/o aire de escape del espacio de reacción. El dispositivo para el cultivo de células comprende preferiblemente conexiones que presentan filtros estériles. Preferiblemente, el espacio de reacción se gasifica continuamente y el gas se evacúa continuamente del espacio de reacción, de modo que tiene lugar un intercambio continuo de la fase gaseosa en el espacio de reacción.

Además, pueden estar presentes conexiones, preferiblemente sin filtros estériles, que conectan el espacio de reacción con recipientes de almacenamiento estériles, de modo que estén presentes conexiones para la adición de otros líquidos, en particular medio nutritivo. También puede estar prevista una conexión para la toma de muestras.

Preferiblemente, la pared del reactor presenta una pieza de conexión en la que está dispuesta la al menos una conexión para la adición de gas y/o líquido.

Las células, el segundo medio líquido y eventualmente el primer medio líquido se mezclan preferiblemente en el espacio de reacción, en particular con la ayuda del dispositivo de mezcla. El dispositivo de mezcla puede comprender un mezclador con eje rotativo, un mezclador vibratorio, un mezclador hidráulico, un mezclador neumático, un mezclador estático o un agitador.

Por ejemplo, el dispositivo de mezcla está dispuesto en el espacio de reacción en forma de un agitador, en particular en forma de agitador magnético. El espacio de reacción está dispuesto preferiblemente en un agitador tal como una placa de agitación o un agitador orbital. Más preferiblemente, el espacio de reacción está fijado al agitador con un medio de sujeción, donde el medio de sujeción se puede extender preferiblemente. Con la ayuda del dispositivo de mezcla, el segundo medio líquido y eventualmente el primer medio líquido que contiene las células se ponen preferiblemente en un movimiento ondulatorio.

El espacio de reacción contiene preferiblemente la fase gaseosa y la fase líquida, donde la fase líquida, que preferiblemente es una suspensión, comprende el segundo medio líquido, las células y eventualmente el primer medio líquido. La relación en volumen de la fase gaseosa y la fase líquida en el espacio de reacción permanece preferiblemente esencialmente sin cambios, lo que es posible por el agrandamiento del volumen interior al dosificar el segundo medio líquido y/o el gas. De esta manera, el tamaño de la interfaz de fase entre la fase líquida y la fase gaseosa también permanece esencialmente constante en relación con el volumen de la fase líquida, de modo que los efectos de evaporación también permanecen esencialmente sin cambios durante el tiempo de cultivo.

Antes de la dosificación en la etapa c), la fase líquida ocupa preferiblemente del 20% en volumen al 80% en volumen, más preferiblemente del 30% en volumen al 70% en volumen y en particular preferiblemente del 40% en volumen al 60% en volumen del volumen interior. Además, después de la dosificación en la etapa c), la fase líquida ocupa preferiblemente del 10% en volumen al 80% en volumen, más preferiblemente del 20% en volumen al 60% en volumen y en particular preferiblemente del 30% en volumen al 50% en volumen del volumen interior. La presencia de la fase gaseosa en el espacio de reacción, que contiene preferiblemente oxígeno, es ventajosa en particular durante el cultivo de células aeróbicas.

Las células están presentes preferiblemente en cultivo en suspensión en el espacio de reacción. Las células compren en particular células no adhesivas, lo que se debe entender de manera que las células no se adhieren esencialmente a la pared del reactor u otras superficies en el espacio de reacción.

Las células comprenden preferiblemente células eucariotas que están presentes en el cultivo en suspensión, en particular células de mamíferos, células vegetales, células de insectos y/o células de hongos, en particular preferiblemente células de mamíferos. Alternativa o adicionalmente, las células también pueden comprender células procariotas tales como bacterias.

Asimismo es concebible utilizar el dispositivo para el cultivo de células adherentes, de modo que las células presentes en el espacio de reacción comprendan células adherentes.

En la etapa c) del procedimiento según la invención, el número de células presentes en el espacio de reacción aumenta preferiblemente debido al crecimiento celular. Para ello, el espacio de reacción se atempera preferiblemente a una temperatura en el rango de 15 °C a 50 °C, más preferiblemente de 20 °C a 45 °C, más preferiblemente de 35 °C a 40 °C y en particular preferiblemente de 36°C a 48°C.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos están representados un ejemplo de realización según el estado de la técnica y modos de realización según la invención y se explican con más detalle en la siguiente descripción.

Muestran:

La figura 1 una representación esquemática de una expansión en serie del cultivo convencional;

La figura 2 un dispositivo según la invención para el cultivo de células con una pared de reactor que comprende un material extensible;

La figura 3 un dispositivo según la invención para el cultivo de células con una pared de reactor cónica,

La figura 4 una vista lateral de un espacio de reacción con una pared del reactor que comprende un material extensible,

La figura 5 otra vista del espacio de reacción con una pared del reactor que comprende un material extensible,

La figura 6 una representación esquemática de un dispositivo para el cultivo de células con un espacio de reacción con una pared de reactor de un material extensible.

La figura 1 muestra una representación esquemática de la secuencia de una expansión en serie del cultivo convencional. Un cultivo celular en forma de una suspensión celular, que comprende células y un medio de cultivo, con un volumen de 1 ml y una densidad celular de 2*107 células/ml se coloca en un primer recipiente de expansión 2.1 desde un recipiente de almacenamiento 1 que contiene un cultivo de partida. En conjunto se utilizan cuatro recipientes de expansión 2.1, 2.2, 2.3 y 2.4 para poder producir suficientes células como inóculo para inocular un recipiente de producción 4. Dado que no se debe sobrepasar una densidad celular específica al volumen máxima para no obstaculizar el crecimiento celular, se añade medio fresco a la suspensión celular durante la expansión con número creciente de células.

Si en el primer recipiente de expansión 2.1 se ha alcanzado un nivel de llenado máximo, la suspensión celular se transfiere del primer recipiente de expansión 2,1 al segundo recipiente de expansión 2.2 y se añade más medio fresco conforme al crecimiento celular. A continuación, la suspensión celular se transfiere correspondientemente al tercer recipiente de expansión 2.3 y luego al cuarto recipiente de expansión 2.4.

Desde el primer recipiente de expansión 2.1 hasta el cuarto recipiente de expansión 2.4, el volumen de la suspensión celular se eleva de 125 ml a 10 l. Con la suspensión celular, que se encuentra en el cuarto recipiente de expansión 2.4, se inocula un recipiente de preproducción 3, que presenta un volumen interior de 50 l y también se designa como etapa n-1. El número de células en el recipiente de preproducción 3 aumenta aún más, de modo que el contenido del recipiente de preproducción 3 sirve para inocular el recipiente de producción 4, que presenta un volumen interior de 500 litros. Los recipientes aquí representados son reactores discontinuos, que también se denominan reactores por lotes.

La figura 2 muestra una representación esquemática de un dispositivo según la invención para el cultivo de células 10 con una pared de reactor 16 que comprende un material extensible. Está representado un dispositivo para el cultivo de células 10, que puede sustituir a los cuatro recipientes de expansión 2.1, 2.2, 2.3 y 2.4 de acuerdo con la figura 1, ya que el aumento de volumen requerido de la suspensión celular es posible en el mismo recipiente.

El dispositivo para el cultivo de células 10 comprende un dispositivo de mezcla 12 en el que está dispuesto un espacio de reacción 14. El dispositivo de mezcla 12 es, por ejemplo, un agitador orbital. El espacio de reacción 14 con un volumen interior 15 se delimita por una pared del reactor 16. La pared del reactor 16 comprende una conexión para la adición de líquido 18 y una conexión para la adición de gas 20, donde la conexión para la adición de gas 20 presenta un filtro estéril 22. Adicionalmente está prevista una manguera 24 para la toma de muestras.

El espacio de reacción 14 contiene tanto una fase líquida 28 como una fase gaseosa 30. La fase líquida 28 contiene un segundo medio líquido 26 y eventualmente también un primer medio líquido y células 29.

En un estado inicial 32, el espacio de reacción 14 presenta un volumen inicial interior mínimo y mediante la adición de un segundo medio líquido 28 y/o gas a través de la conexión para la adición de líquido 18 y/o a través de la conexión para la adición de gas 20 se extiende la pared del reactor 16, que en este modo de realización presenta un material extensible, de modo que se consigue un primer estado de extensión 34. Gracias a la extensión del material extensible se agranda una superficie 17 de la pared del reactor 16 dirigida hacia el espacio de reacción. Mediante adición adicional de segundo medio líquido 26 o gas, la pared 16 del reactor se extiende aún más, de modo que se consigue un segundo estado de extensión 36.

A diferencia de los contenedores 2.1, 2.2, 2.3 y 2.4 de acuerdo con la figura 1, en el modo de realización según la invención de acuerdo con la figura 2, no solo aumenta el volumen de la fase líquida 28, es decir, la suspensión celular, sino también el volumen interior 15 de la cámara de reacción 14, de modo que se suprime un transvase de la fase líquida 28 a un recipiente siguiente más grande hasta que se alcanza un volumen interior máximo del espacio de reacción 14 según la invención. Correspondientemente, la expansión celular se puede llevar a cabo en solo un recipiente.

La figura 3 muestra un dispositivo según la invención para el cultivo de células 10 con una pared de reactor cónica 16. El dispositivo de cultivo de células 10 comprende un dispositivo de mezcla 12 en forma de agitador. El espacio de reacción 14 con un volumen interior 15 presenta forma cónica.

En el espacio de reacción 14, cuya superficie de sección transversal horizontal 42 aumenta de abajo hacia arriba, se sitúa tanto una fase líquida 28 que comprende el segundo medio líquido 26, eventualmente el primer medio líquido y las células 29, así como una fase gaseosa 30. La fase líquida 28 alcanza una altura de llenado 40. En comparación con las paredes del reactor 16 de forma diferente, la forma cónica permite que, en el caso de volúmenes pequeños de la fase líquida 28, también esté presente una relación suficientemente pequeña de la interfaz de fase 38, que se sitúa entre la fase líquida 28 y la fase gaseosa 30, al volumen de la fase líquida 28, de modo que los efectos de la evaporación no sean predominantes. Sin embargo, es posible un aumento requerido del volumen de la fase líquida 28 en la expansión de la célula.

La figura 4 muestra una vista lateral de un espacio de reacción 14 con una pared de reactor 16 que comprende un material extensible. El espacio de reacción 14 presenta un volumen interior 15 que se puede agrandar mediante extensión del material extensible. La pared del reactor 16 presenta una pieza de conexión 44 en la que están dispuestas una conexión para la adición de líquido 18, una conexión para la toma de muestras 19, una conexión para la adición de gas 20 y una salida de gas 21.

La figura 5 muestra otra vista del espacio de reacción 14 con la pared del reactor 16 que comprende un material extensible de acuerdo con la figura 5. La pieza de conexión 44 presenta una conexión para la adición de líquido 18, una conexión para la toma de muestras 19, una conexión para la adición de gas 20 y una salida de gas 21.

En la figura 6 está representado esquemáticamente un dispositivo para el cultivo de células con un espacio de reacción de un material extensible.

A este respecto, el espacio de reacción 14 de material extensible puede estar construido, por ejemplo, según está representado en las figuras 4 y 5. No obstante, es una alternativa y se prefiere que el espacio de reacción 14 esté completamente encerrado por una pared del reactor 16 de material extensible y la conexión para la adición de líquido 18, la conexión para la adición de gas 20, la salida de gas 21 y la conexión para la toma de muestras 19 se guíe directamente a través del material extensible que forma la pared del reactor. La obturación de la conexión para la adición de líquido 18, la conexión para la adición de gas 20, la salida de gas 21 y la conexión para la toma de muestras 19 se realiza a este respecto de la manera habitual conocida por el experto en la técnica, por ejemplo, mediante encolado.

Para el cultivo de células, el medio de cultivo 46 se transporta desde un recipiente de almacenamiento 48 por medio de una bomba 50, preferiblemente una bomba neumática, a través de la conexión para la adición de líquido 18 al espacio de reacción. A este respecto, la potencia de transporte de la bomba depende del crecimiento de las células 29 cultivadas en el espacio de reacción 14. En este caso, el medio de cultivo 46 se puede transportar de forma continua al espacio de reacción 14 o también gradualmente, donde luego el medio de cultivo se agrega en cada caso cuando el contenido en el espacio de reacción está casi agotado. Alternativamente a una bomba neumática también se puede utilizar cualquier otra bomba con la que sea posible un transporte sin contaminación del medio de cultivo 46 al espacio de reacción 14.

El gas necesario para el cultivo de las células, habitualmente un gas que contiene oxígeno, como oxígeno puro o aire o incluso aire enriquecido con oxígeno, se suministra al espacio de reacción a través de la conexión para la adición de gas 20. La adición de gas se realiza a este respecto por medio de una bomba de gas 52. Para evitar que se introduzcan impurezas en el espacio de reacción con el gas, el gas se conduce a través de un filtro estéril 54 antes de la adición al espacio de reacción. Una bomba de diafragma, por ejemplo, es adecuada como bomba de gas 52. No obstante, aquí también se puede utilizar cualquier otra bomba adecuada con la que se pueda transportar el gas.

El exceso de gas se puede eliminar del espacio de reacción 14 a través de la salida de gas 21. Para evitar que los componentes no deseados sean sacados del espacio de reacción 14 con el gas, se conecta igualmente un filtro estéril 54 a la salida de gas 21.

La conexión para la toma de muestras 19 está conectada a un sistema de toma de muestras adecuado 56. Para que aquí tampoco se pueda introducir contaminación en el sistema y las muestras tomadas tampoco estén contaminadas, es necesario que el sistema de toma de muestras 56 sea estéril. Para tomar una muestra del espacio de reacción 14, es necesario que se pueda aplicar una presión a la conexión para la toma de muestras 19, la cual se sitúa por debajo de la presión en el espacio de reacción 14, de modo que la muestra se tome del espacio de reacción 14 debido a la diferencia de presión. Como sistema de toma de muestras es adecuada, por ejemplo, una jeringuilla en cuyo émbolo de jeringuilla se tira para la toma de muestras, de modo que el espacio para recibir la muestra se agranda durante la toma de muestras.

Ejemplo 1

Una fase líquida con un volumen de 10 ml se presentó en un dispositivo para el cultivo de células de acuerdo con la figura 2, que presentaba un material extensible como material de pared. Durante diez horas se suministró continuamente un medio acuoso y aire, hasta que la fase líquida en la cámara de reacción alcanzó un volumen de 20 l.

El experimento se llevó a cabo con tres materiales de pared diferentes. La pared del reactor estaba hecha esencialmente de caucho natural, poliisopreno o poliuretano, que presentan respectivamente una buena biocompatibilidad. Al principio, la pared del reactor presentaba un espesor de pared de aproximadamente 100 |jm antes del ensanchamiento.

Con los tres materiales se consiguió un ensanchamiento de volumen del volumen interior de al menos el 2000%. La pared del reactor de poliisopreno y la pared del reactor de caucho natural presentaron una capacidad de extensión incluso mayor que la pared del reactor de poliuretano.

Ejemplo 2

En un dispositivo para el cultivo de células de acuerdo con la figura 2, que presentaba una pared de reactor hecha esencialmente por poliisopreno, se presentaron 500 ml de una suspensión acuosa que contenía células de levadura (Saccharomyces cerevisiae). Las células se cultivaron durante un período de 14 días mientras se añadieron adicionalmente gradualmente 4,5 l de medio acuoso. La producción de metabolitos se pudo observar durante todo el período de cultivo.

Ejemplo 3

Se esterilizó en autoclave a 120 °C y 2 bar durante 2 horas un dispositivo para el cultivo de células de acuerdo con la figura 2, que presentaba una pared del reactor hecha esencialmente por poliisopreno. Se incubaron 50 ml de medio de cultivo celular, que consistía en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), que contenía un 10% en peso de suero de ternero fetal (FCS), en el dispositivo esterilizado en autoclave a 37 °C durante 7 días, luego una muestra del medio de cultivo celular se observó al microscopio. No se observaron células con un aumento de 10.000 veces. En consecuencia, el dispositivo era adecuado para trabajos estériles.

Lista de referencias

1 Recipiente de almacenamiento

2 Recipientes de expansión

2.1 Primer recipiente de expansión

2.2 Segundo recipiente de expansión

2.3 Tercer recipiente de expansión

2.4 Cuarto recipiente de expansión

3 Recipiente de preproducción

4 Recipiente de producción

10 Dispositivo para el cultivo de células

12 Dispositivo de mezcla

14 Espacio de reacción

15 Volumen interior

16 Pared del reactor

16.1 Primera parte

16.2 Segunda parte

17 Superficie dirigida hacia el espacio de reacción

18 Conexión para la adición de líquido

19 Conexión para la toma de muestras

20 Conexión para la adición de gas

21 Salida de gas

22 Filtro estéril

24 Manguera

26 Segundo medio líquido

28 Fase líquida

29 Células

30 Fase gaseosa

32 Estado inicial

34 Primer estado de extensión

36 Segundo estado de extensión

38 Interfaz de fase

42 Superficie de sección transversal horizontal

44 Pieza de conexión

46 Medio de cultivo

48 Recipiente de almacenamiento

50 Bomba

52 Bomba de gas

54 Filtro estéril

56 Sistema de toma de muestras

Claims

REIVINDICACIONES

1. Dispositivo para el cultivo de células (10), que comprende un dispositivo de mezcla (12) y un espacio de reacción (14) que se delimita por una pared del reactor (16), donde la pared del reactor (16) presenta al menos una conexión (18, 20) para la adición de gas y/o líquido y el espacio de reacción (14) presenta un volumen interior (15),

donde el espacio de reacción (14) está configurado de modo que el volumen interior (15) se pueda agrandar en al menos un 500%, referido a un volumen inicial interior mínimo, y

donde la pared del reactor (16) presenta un material extensible, donde el material extensible presenta una capacidad de extensión de al menos el 200%.

2. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el material extensible contiene caucho natural, caucho sintético, poliisobutileno, caucho de silicona o mezclas de los mismos.

3. Dispositivo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que el volumen inicial interior mínimo se sitúa en un rango de 2 ml a 1 l y se puede agrandar hasta un volumen interior máximo de 10 l a 100 l.

4. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la al menos una conexión (18, 20) para la adición de gas y/o líquido está guiada a través del material extensible de la pared del reactor (16).

5. Procedimiento para el cultivo de células en un dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende las siguientes etapas:

a. eventualmente, esterilización de la pared del reactor (16) a una temperatura de 80 °C a 150 °C o mediante radiación gamma,

b. llenado del dispositivo, donde células (29) y eventualmente un primer medio líquido se agrega en el espacio de reacción (14),

c. dosificación de un segundo medio líquido (26) y/o un gas en el espacio de reacción (14), donde el segundo medio líquido presenta preferiblemente una composición que corresponde a la del primer medio líquido (26),

y

agrandamiento del volumen interior (15) del espacio de reacción (14) en al menos un 500% referido al volumen inicial interior mínimo,

donde la pared del reactor (16) comprende un material extensible y el material extensible se extiende en la etapa c.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado por que el segundo medio líquido (26) se añade de forma continua y/o progresiva.

7. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 5 o 6, caracterizado por que las células (29), el segundo medio líquido (26) y eventualmente el primer medio líquido se mezclan en el espacio de reacción (14).

8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado por que antes y después de la dosificación en la etapa c), la fase líquida (28) ocupa del 10% en volumen al 80% en volumen del volumen interior (15) .

9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 8, caracterizado por que las células (29) están presentes en cultivo en suspensión en el espacio de reacción (14).