KR101507621B1 - 연속방식으로 배양균을 생성하는 이동 용기를 가진 연속 배양장치 - Google Patents

연속방식으로 배양균을 생성하는 이동 용기를 가진 연속 배양장치 Download PDF

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Abstract

본원은 식물세포, 동물세포 또는 줄기세포를 연속방식으로 생장하는 방법과 장치를 제공하는 것이다.
줄기세포, 연속 배양장치, 교반기, 배양 배지, 혼탁계, 배관, 클램프.

Description

연속방식으로 배양균을 생성하는 이동 용기를 가진 연속 배양장치{CONTINUOUS CULTURE APPARATUS WITH MOBILE VESSEL AND PRODUCING A CULTURE IN A CONTINUOUS MANNER}
본 발명은 액체 또는 반고체 배지에서 향상된 증식률 및 특정 물질의 교대 성질로, 생 세포의 선택(selection of living cells)을 허용하는 방법 및 장치를 제공하는 것이다. 선택(적응 진화) 과정에서는, 유전학적으로 다른 변형 유기체(돌연변이체)가 한 개체군에서 생겨나고 그리고 동일한 기원의 다른 변형체와 서로 경쟁을 한다. 가장 빠르게 증식을 하는 유기체가 증가된 증식률의 개체군(그리고 개별 유기체)을 이끌며, 시간이 지날수록 상대적 비율은 늘어난다. 이러한 처리공정은 산업 공정 또는 학술적 목적으로 사용되는 유기체의 성능을 향상시킬 수 있는 것이다. 본 발명은 연속 배양장치를 이용하여 생 세포(예, 원핵생물, 원시세균, 바이러스, 진핵생물, 균류, 조류, 효모, 식물세포, 동물세포, 또는 줄기세포)를 생육 생성(viable production)하는 것이다. 본 발명은 생 세포에 의해 생성된 유효성분(active ingredient) 또는 생물제제(製劑)를 생성하는데 사용할 수 있는 것이다. 상기 유효성분 또는 생물제제(biologic)는 진단제, 예방제, 또는 치료제로서 사용 된다.
증식률이 증가된 선택물(적응물; fitness)은, 생장 배양물을 정기적으로 희석시키어 이루어지는 지속 생장(sustained growth)을 필요로 한다. 종래 기술에서는, 3가지 방식 즉, 고체 배양, 시리얼 희석(serial dilution) 그리고 연속 배양 방식으로 이루어졌는데, 상기 방식은 주로 희석도에서 차이가 있는 것이다.
고체 배양방식은 페트리 접시(Petri dish)에서 새로운 생장 배지를 가진 용기로 소량의 생장 배양균 또는 세포를 반복하여 전달하는 과정을 포함하는 것이다. 시리얼 배양방식은 새로운 생장 배지를 함유한 대형 그룻으로 소량의 생장 배양물을 반복하여 전달하는 과정을 포함하는 것이다. 배양 세포가 새로운 그릇에 포화 상태까지 생장되어졌을 때에, 상기 과정은 반복된다. 이 방법은 최장시간 유지된 배양을 증명한 문헌[미국 Proc Natl Acad Sci. 1994년, 15: 6808-14: Lenski & Travisano의 Dynamics of adaptation and diversification: a 10,000-generation experiment with bacterial populations.]에서 사용되었으며, 상기 문헌의 실험에서 수십년 동안 증식률의 일관된 개선을 명확하게 증명하였다. 이러한 공정은 일반적으로 수작업으로 이루어져, 상당한 노동력을 소요하고, 외부 환경에 노출로 인해 오염되기도 한다. 시리얼 배양방식도 또한 다음과 같이 비효율적인 것이다.
선택 비율, 또는 증식률에서의 향상 비율은 개체군 크기에 따른다[영국, 런던, 옥스포드 대학교 출판부(1930년): Fisher의 The Genetical Theory of Natural Selection]. 더우기, 개체군의 크기가 빠르게 변하는 시리얼 전달과 같은 상태에 서는 선택이 개체군의 조화 평균(
Figure 112009011741614-pct00001
)과 비례하여[사이언스 87(1938년)의 430-431: Wright의 Size of population and breeding structure in relation to evolution], 따라서, 순환 과정에서 최저 개체군이 가깝게 될 수 있다. 따라서, 연속배양을 통해, 개체군의 크기를 유지할 수 있으며, 그에 따라서 선택이 보다 효율적으로 이루어진다. 시리얼 희석과 구별되는 것으로서, 연속배양은 상당히 작은 량을 가지어서 생장 배양의 소 부분(small portion of growing culture)이 규칙적으로 동일한 량의 새로운 생장 배지로 대체되도록 한다. 이러한 처리공정은 순환식 희석(cyclical dilution)을 하는 과정에서 개체군의 최소 크기를 증가시키어 유효 개체군의 크기를 최대로 한다. 연속 배양을 할 수 있는 장치는, 희석이 특정 시간 간격으로 발생할 때에는 "케모스타트(chemostat)"로 명명되고 그리고, 상기 배양이 특정 밀도로 생장하여 자동적으로 희석이 발생한다면 "터비도스타트(turbidostat)"로 명명 된다.
이후에는, 설명의 편의를 위해서 2개 유형의 장치를 모두 "케모스타트"로 통칭한다. 케모스타트는 1950년대에 2그룹의 연구진에 의해 동시에 발명되었다[사이언스 112(1950년)의 715-716: Novick & Szilard의 Description of the chemostat 및 Ann. Inst. 파스퇴르 79(1950년)의 390-410: Monod의 La technique de la culture continue - Theorie et applications]. 케모스타트는 증식률이 단기간에 빠르게 향상하는 것을 입증하는데 사용된다[Methods Enzymol. 224(1993년)의 613-31: Dykhuizen(DE)의 Chemostats used for studying natural selection and adaptive evolution].
전통적인 케모스타트는, 의도하지 않은 항-희석성(정지성) 변형체의 선택[the unintended selection of dilution-resistant(static) variants]으로 인해서, 향상된 증식률을 위한 장시간의 선택을 유지하는데 사용할 수 없다. 상기 변형체들은 케모스타트의 표면에 부착하여 희석활동을 방해할 수 있으며, 이러한 작용으로, 높은 증식률을 가진 변형체를 함유한 점착성이 거의 없는 개체를 경쟁에서 밀어내어, 의도한 장치의 목적을 방해하게 된다[J.Gen.Microbiol. 131(1985년)의 1229-36: Chao & Ramsdell의 The effects of wall populations on coexistence of bacteria in the liquid phase of chemostat cultures].
연속배양 시에 항-희석성(dilution resistance)을 피할 수 있는 방법과 케모스타트 장치(더 제네틱 엔진)가 발명되어 있다[PASTEUR INSTITUT(FR) 및 MUTZEL RUPERT(DE)의 미국특허 6,686,194 B1]. 상기 방법은 밸브 제어식 유체 전달을 하여 2개 케모스타트 사이에서 생장 배양물을 주기적으로 이동시키고, 각각이 활성 배양물 생장 기간 사이에 멸균 및 세정되게 하는 것이다. 규칙적인 멸균 사이클은 이들을 섬멸시키어 항-희석 변형체의 선택을 방지한다. 이러한 방법과 장치는 상기 목적을 달성하기는 하였지만, 멸균(밀봉) 환경에 있는 여러 유체들, 예를 들면 부식성이 심하고 잠재적 반작용성(reactive)이 크며 빠르게 손상되는 밸브와, 속박 및 폐기 문제가 제기되는 수산화나트륨(NaOH)을 함유한 유체를 다루는 독립적이고 복잡한 조작이 필요한 것이다. 또한, 상기 케모스타트 장치는 세포가 그 위에서 생장하는 지지부(support)가 설치된 설비가 없는 한정된 것이다. 상기 '더 제네틱 엔진'과 같은 장치와 그외 다른 알려진 기술은, 현탁 상태에서 생장하지 않고 및/또는 점착성 세포로서 생장하는, 세포의 연속배양을 할 수 없는 것이다.
어떠한 타입의 세포는, 세포가 살아남고 생장하는데 필요한 환경으로 인해서 대량으로 배양하기가 곤란한 것이다. 이러한 세포들은 연속배양 방식으로 접근하면 주어진 조건에서 생장할 수 있을 것이다. 이러한 사실은 특히 진핵세포(예, 조류(algae), 효모균, 균류(fungi), 식물세포, 동물세포, 및 줄기세포)인 경우에 그러하다.
예를 들어, 인간 배아(胚) 줄기세포(human embryonic stem cells)는 전형적으로, 줄기세포 덩어리를 분리하여 배양액으로 알려진 영양액을 함유한 플라스틱제 실험실 배양접시에 옮겨져서 생장된다. 상기 세포는 분할되어 상기 접시의 표면에 뿌려진다. 상기 배양접시의 내표면은 전형적으로, 이들이 분할하지 않게 처리되어져 있는 쥐의 배아 피부세포(mouse embryonic skin cells)로 코팅 된다. 세포의 이러한 코팅 층은 피더 층(feeder layer)으로 불리어진다. 배양접시의 바닥에서 피더 층을 갖는 이유는 이들이 부착할 수 있는 점착면(sticky surface)을 인간 배아 줄기세포에 제공하는 것이다. 또한, 지지세포(feeder cells)는 배양액 안으로 영양물을 방출한다. 근래, 과학자들은 쥐의 지지세포를 갖지 않고 배아 줄기세포를 생장하는 방법을 연구하기 시작하였다. 이러한 사실은 쥐 세포에 있는 바이러스 또는 기타 다른 거대 분자가 인간 세포로 전해질 수 있는 위험을 피할 수 있기 때문에 과학적으로는 상당히 발전하는 것이다.
수 일이 경과하면서, 내부 세포 덩어리의 세포들이 증식하여, 배양접시가 채 워지기 시작하였다. 이러한 현상이 일어나면, 상기 세포들은 원만하게 옮겨지고 그리고 다수개의 새로운 배양접시에 놓여지게 된다. 상기 세포들을 교체하는 처리공정은 수 회(many times)로 수 개월(many months) 동안 반복되는데, 이러한 작업을 계대배양(subculturing)이라 한다. 상기 세포를 계대배양하는 각 사이클을 패시지(passage)라고 한다. 6개월 이상이 지난 다음에, 상기 세포 덩어리의 오리지널 세포는 수백만개의 배아 줄기세포를 산출한다. 세포 분화 없이 6개월 이상 동안 세포 배양으로 증식되어져 있는 배아 줄기세포는, 전능세포 이고 그리고, 배아 줄기세포 라인(embryonic stem cell line)으로 지칭되는 유전학적으로 정상인 것으로 나타난다.
세포 라인이 확립되었으면 또는, 상기 단계 전에 있더라도, 이들 배치(batch)는 빙결(frozen)되고 그리고 추가 배양 및 실험을 위해 다른 실험실로 보내어진다. 그런데, 연속배양은, 생 세포에 변형력을 가하고 그리고 잠재 오염원을 발생하는 조작방식을 최대한 줄일 수 있는 이점이 있는 것이다. 배양이 개시되었을 때에, 연속배양하는 상태가 당분야의 기술인들이 세포를 연속 생성하는데 따른 이점을 취하게 할 것이다. 일단, 줄기세포가 생산되면은, 상기 줄기세포의 생산이 중단없이 연속한다면, 통상적으로 현재 사용되는 방법에 비해 더 많은 줄기세포를 생산할 수 있을 것이다.
본 발명의 목적은 항-희석성 변형체의 방해 없이 세포(원핵생물, 박테리아, 원시세균, 진핵생물 및 바이러스)를 연속배양하는 개량(및 완전 독립) 방법 및 장치를 제공하는 것이다. 다른 케모스타트와 마찬가지로, 상기 장치는, 생장 배양물을 규칙적으로 새로운 생장배지로 희석하는 수단, 배양물과 외부 환경 사이에 기체 교환을 하는 수단, 무균상태 그리고, 케모스타트 또는 터비도스타트로서의 자동 운영을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 현탁 상태에서 생장하지 않고 그리고/또는 진핵세포(예, 식물세포, 조류, 균류, 효모균, 동물세포 또는 줄기세포)와 같은 응집 세포(cohesive cells) 및 임의적 원핵생물(예, 스트렙토미세테스: streptomycetes) 그리고 가능한 임의적인 원시세균과 바이러스로서 생장하는 세포를 연속적으로 배양하는 개량된 특징적인 방법과 장치를 제공하는 것이다. 본 발명으로 배양되는 줄기 세포는 한정적이지 않은 기재로서, 배아 줄기세포, 태아 줄기세포, 탯줄 줄기세포, 태반 추출 줄기세포, 성체 줄기세포를 포함한다. 본 발명으로 배양되는 상기 성체 줄기세포는 제한적이지 않은 기재로서, 조혈모세포, 골수 줄기세포, 기질세포, 성상세포 및 오리지덴드로사이트(oligidendrrocytes)[예, 본원에 참고문헌으로 기재된 미국, 휴맨아 출판사에서 C. Klug와 C. Jordan에 의해 간행된 '조혈모세포 프로토콜(Hematopoietic Stem Cell Protocols) (2002년)]을 포함한다.
본 발명은 이러한 목적이 멸균 또는 세정 기능을 포함하는 어떠한 유체 전달도 없이 이루어지게 설계된 것이다. 이러한 설계는 일 용기에서 타 용기로 배양물을 전달하는데 따른 생장의 혼란, 오염, 및 가성 용매를 포함한 복잡한 유체 전달과 속박을 비롯하여, 멸균 및 세정과 관련된 위험과 어려움이 없다는 점에서 종래 기술과 관련하여 본 발명의 특징적인 잇점을 나타내는 것이다.
연속배양은 배지로 채워진 가요성 멸균 관(tube) 내측에서 이루어진다. 배지와 실(chamber)의 표면은 서로에 대해 정지 상태로 있고, 그리고 상기 배지와 실 표면은, 관의 영역 사이에서 배양 세포가 이동하는 것을 방지하는 클램프로 죄어져 관을 분할하여 멸균하는 분할 "게이트(gates)" 또는 분할점을 통해 배관(tubing)을 연동하여 이동시킴으로써 규칙적이고 동시적으로 위치 이동하게 된다. 또한, 추가 안전을 위해 배양 용기의 상류와 하류에 선택적으로 UV 게이트를 더할 수도 있다.
또한, 본 발명의 방법과 장치는, 작용 면의 대체가 희석 공정과 함께 일어나서, 이들이 주기적이지 않은 연속적인 방식으로 케모스타트 표면에 대한 항-희석 변형체의 부착에 대항하여 선택(selection)되어서, 종래 기술을 능가하는 개량이 이루어진 것이다. 또한, 현탁 상태에서 생장하는 세포와 응집 세포로서 생장하는 세포용으로 배관이 생장을 위한 연속 지지부를 제공하여, 일 용기에서 타 용기로 세포를 전달하는데 세포의 혼란없이 이루어지는 잇점이 있는 것이다.
관은 포화(완전 생장된) 배양물을 함유한 영역, 새로운 배지를 함유한 영역, 그리고 상기 2개 영역 사이에 영역이 있도록 1개 통과 길(a transient way)이 분할되고, 여기서 생장실 또는 배양실로 지칭된 1개 이상의 방이 제공되어 생장 배양물이 새로운 배지와 혼합되어 희석을 달성하는 생장실 영역을 형성한다. 게이트들은 주기적으로 관의 일 지점에 속박을 풀고 타 지점으로 대체되어서, 상관 생장실의 면과 부착된 고정 세포와 함께하는 생장 배양물이, 상기 생장실과 분리되어 이동되고 그리고 새로운 배지와 새로운 실(chamber)의 면으로 대체 된다.
도 1은 본 발명에 따른 장치의 가능한 구성을 전체적으로 볼 수 있게 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 상기 자동 온도조절 컨트롤 박스(2)와 상기 배양실과 관련된 상기 장치의 다른 요소들이 교반(agitation) 목적으로, 기체 순환 및 제거 목적으로, 그리고 바닥에 침강하여 희석을 피할 수 있는 과립(응집) 세포의 제거를 보장할 목적으로 다양한 각도로 기울일 수 있음을 예시한, 장치의 2가지 가능한 자세를 나타낸 도면이다. 또한, 상기 장치는 세포가 생장을 위한 교반이 필요하지 않은 경우에도 동일 자세(예, 평평한 자세 또는 임의 각도를 가진 자세)로 있을 수 있는 것이다.
도 3은 연속배양을 위해 세포를 주입하기 전에, 새로운 배지로 가요성 배관의 모든 영역을 채우는 장치의 T0상태를 나타낸 도면이다.
도 4는 세포주(cell strain)를 주입한 직후에 상기 가요성 배관의 T1상태를 나타낸 도면이다.
도 5는 게이트(3, 4)에 의해 제한된 생장실 영역(10)으로 한정된 영역에서 배양물이 생장하고 있는 생장 기간인, 장치의 T2상태를 나타낸 도면이다.
도 6은 배관과 관련 배지의 1차 연동 이동 직후의 장치의 T3상태를 나타낸 도면으로; 이는 게이트(3)의 이동을 통해 새로운 배관과 배지가 도입되고 이와 동시에 게이트(4)의 이동에 의해서 동일한 체적의 배관, 배지 및 생장 배양물이 생장실 영역(10)에서 나와 샘플링 실 영역(11)으로 전달되는 2차 생장 사이클의 개시를 결정한다. 이 때, 배관, 상기 배관 내에 있는 배지, 및 상기 배지에서 생장되어져 있는 임의 배양물이 모두 함께 이동한다는 사실을 이해하는 것이 중요하다. 생장 실 영역 내에서 새로운 배지와 생장 배양물이 교반을 통해 함께 혼합되는 한에서는 유체 전달만이 일어난다.
도 7은 2차 생장 사이클인, 장치의 T4상태를 나타낸 도면으로; 이 사이클 동안, 배관의 연동 이동 후에 생장실에 남아 있는 세포는, 지금은 이 단계를 실시하는 동안에 남아 있는 배양물과 혼합된 새로운 배지에 공급된 영양물을 사용하여 생장할 수 있다.
도 8은 배관과 여기에 함유된 배지의 2차 연동 이동 직후의 장치의 T5상태를 나타낸 도면으로; 이는 게이트(3)의 이동을 통해 새로운 배관과 배지가 도입되고 이와 동시에 게이트(4)의 이동에 의한 동일한 체적의 배관, 배지 및 생장 배양물이 생장실 영역(10)에서 나와 샘플링 실 영역(11)으로 전달되는 3차 생장 사이클의 개시를 결정한다.
도 9는 3차 생장 사이클 과정인, 장치의 T6상태를 나타낸 도면으로; 이 단계는 T4상태와 같고 그리고 추가 작동의 반복 성질을 나타낸 것으로서, 선택 세포 샘플은 샘플링 실 영역(11)에서 주입기 또는 다른 회수형 기구를 이용하여 임의적인 시간에 이동시킬 수 있다.
도 10은 가요성 배관에 끼워 조여진 2개의 적층 치부(stacking teeth)로 구성된 형태의 게이트를 결정하는 치부가 나타낼 수 있는 외형상의 단면을 나타낸 도면이다. 또한, 게이트는 상기 게이트를 통한 유기체의 이동을 방지하면서 배관을 따라 다양한 위치에서 선택적으로 배치 및 이동할 수 있는 이동성 벨트, 제거식 클램프 또는 그외 다른 메카니즘에 대하여 가압하는 단일 치부로 정해질 수 있다.
본원을 포괄적으로 한정적이지 않은 일반적인 일 실시예의 바람직한 구조를 이루는 여러 구성요소를 통해, 첨부 도면을 참고로 하여 이하에 설명한다.
도1에서, 도면번호 '1'은 상류 새로운 배지(7), 생장실 영역(10), 샘플링 실(11) 및 처리된 생장 배양물 영역(15)으로 이루어진 장치의 여러 영역을 포함하고 있는 가요성 배관(tubing)을 지칭한다.
도면번호 '2'는 사용자가 결정하는 조건에 따라 온도를 조절할 수 있는 자동 온도조절 컨트롤 박스를 지칭하고, 여기에는:
a. 상기 생장실 영역(10),
b. 상기 샘플링 실(11),
c. 상기 생장실 영역(10)의 개시부를 형성하는 상류 게이트(3),
d. 상기 생장실 영역(10)의 말단부와 상기 샘플링 실(11)의 개시부를 형성하는 하류 게이트(4),
e. 상기 샘플링 실(11)의 말단부를 형성하는 제2하류 게이트(5),
f. 사용자 또는 자동 제어 시스템에 의해 생장 중인 배양물의 광학 밀도를 모니터하고 피드백 제어 시스템(13)을 작동시킬 수 있고, 배양물 밀도(터비도스타트 기능)에 기초하여 배관(1)을 조절하여 이동되게 하는 혼탁계(6), 및
g. 1개 또는 복수 개의 교반기(9)가 배치되어 있다.
또한, 상기 a 내지 g에 열거한 장치 요소들은 자동 온도조절 컨트롤 박스의 외부에 또는 상기 박스 없이도 배치될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
도면번호 '7'은 미사용된 가요성 배관 내에 있는 새로운 배지를 지칭하고; 도면번호 '8'은 작동 중에 상기 새로운 배지와 배관을 분배하기 위한, 새로운 배지가 채워진 배관이 적재되어 있는 배럴을 지칭하고; 도면번호 '12'는 선택적인 자외선 게이트(ultra-violet radiation gates)를 지칭하고; 도면번호 '13'은, 광학 밀도 혼탁계(optical density turbidimeters), 온도 측정 및 조절 장치, 교반기(agitators) 및 틸팅(tilting) 모터 등과 같이, 자동 제어 방식 운영을 하는 다양한 모니터링 또는 운영 인터페이스와 통신하는 수단에 연결된 컴퓨터로 구성된 컨트롤 시스템을 지칭하고; 도면번호 '14'는 처리된 생장 배양물이 채워진 배관이 감겨져 있는 선택적 폐기 배럴(optional disposal barrel)을 지칭하고; 그리고 도면번호 '15'는 상기 샘플링 실의 하류에 위치한 처리된 생장 배양물을 지칭한다.
도 3 내지 도 9는 본원 장치의 기본 운영방식을 도시한 도면으로, 가요성 배관(1)이 상기 자동 온도조절 컨트롤 박스(2)에 배치되고 그리고 게이트(3, 4, 5)를 통해 도입되며, 상기 배관은 모든 처리 단계를 수행하는 중에 정지하여 있고 그리고 연동 이동(peristaltic movement)으로 이동하는 과정을 나타낸 것이다.
도1은 본원 장치를 실시할 수 있는 일 구조를 나타낸 도면이다. 도1의 도면은 새로운 멸균 배지 관이 적재된 후를 나타낸 것이다[상기 게이트(3, 4, 5)로 영역(A - H)을 분할하여 도시].
상기 장치에 선택된 세포를 주입하는 작업은 세포를 생장실(도 3) 안으로 주입기(도 4의 B영역)를 이용하여 주입하여 이루어진다. 다음, 배양을 소망 밀도까지 생장하게 하고 그리고 연속 배양을 시작한다(도 5).
연속 배양은 배관의 게이트 영역을 반복 이동하여 수행 된다. 이러한 공정은, 게이트, 배관, 배지, 및 배관 내의 임의 배양물의 동시적인 이동을 포함한다. 상기 배관은 항상 동일한 방향으로 이동한다. 즉, 새로운 배지(7)를 함유한 미사용(unused) 배관(이하, 생장실의 "상류(upstream)"인 것으로 칭함)은 생장실 쪽으로 이동하여 그곳에 남아 있는 배양물과 혼합되고, 안에 함유된 세포의 추가 생장을 위한 기질을 제공한다. 생장실 영역 안으로 유입되기에 앞서, 상기 배지와 그 상관 배관은 상류 게이트(3)에 의해 생장실과 분리되어 멸균상태를 유지 한다. 동시에, 생장 배양물을 함유한 사용(used) 배관이 "하류(downstream)" 이동을 하여, 하류 게이트(4)에 의해 생장실과 분리된다.
1개 이상의 생장실을 설치하여, 상기 생장실을 동일한 또는 서로 다른 목적에 맞게 사용할 수도 있다. 예를 들어, 생 세포가 동일한 또는 서로 다른 조건을 갖고 제1생장실과 제2생장실에서 생장할 수 있다. 일 실시예에서, 제1생장실은 세포를 생장하는데 사용할 수 있고 그리고 제2생장실은 다른 조건 하에서 생 세포를 처리하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 소망 생성물을 산출하게 다루어질 수 있다. 배양 배지 자체의 구성요소 또는 첨가제가 배양을 시작하기에 앞서 또는 그 후에 첨가될 수 있다. 예를 들면, 모든 구성요소 또는 첨가제가 배양을 개시하기 전에 배지에 포함될 수 있으며, 또는 구성요소가 배양이 초기화 되어진 후에 1개 이상의 생장실 안에 주입될 수 있다.
게이트 구조는 본 발명의 특징적인 기술내용에 해당하지 않는다. 예를 들어, 주어진 게이트 구조에서, 게이트는 동시적으로 이동되는 복합 치부(teeth)의 1 개 사슬로 설계되거나 또는 도 1에 도시한 바와 같이 각각 동조적인 사슬에서 분리된 다른 구조로 설계할 수 있다. 게이트는 도 10에 도시된 바와 같이 적층 방식으로 배관에 끼워 조여진(pinching) 2개 치부(teeth)로 제조된 시스템으로 구성되어, 상기 치부 사이의 정밀한 계면으로 배관의 G영역과 H영역 사이에 오염을 피할 수 있다. 다른 구조에서는, 멸균 게이트가, 배관의 일 측에 대해 1개 치부를 압착시키고, 도 3 내지 도 9에서 도면번호 3, 4 및 5로 지시된 바와 같이 배관이 연동 이동을 하는 중에 따라서 활주하는 고정 틀(chassis)에 대하여 배관을 단단히 압착시키어 구해진다.
상기 자동 온도조절 컨트롤 박스(2)는 가열 및 냉각 장치와 결합된 온도계와 같은 공지 수단으로 구해진다.
통기(aeration)(기체 교환)는, 배양 세포의 생장을 위해 필요하거나 또는 실험 계획법에 의해 필요하게 될 때에, 기체 침투성 배관을 이용하여 기계적 보조 수단없이 직접 할 수 있는 것이다. 예를 들어, 가요성 기체 침투성 배관은 실리콘으로 제조될 수 있지만, 재료가 이에 국한되는 것은 아니다. 통기는 생장실 또는 전체 케모스타트에 접촉하는 인공적으로 형성된 대기(액체 또는 기체)와의 교환을 통해 또는 주위 대기와의 교환을 통해 이루어질 수 있다. 실험이 혐기 생활(anaerobiosis)을 요구하면, 가요성 배관이 기체 불침투성일 수 있다. 예를 들면, 한정적이지 않은 기재로서, 가요성 기체 불침투성 배관은 실리콘을 코팅하여 또는 처리가공하여 제조할 수 있다.
혐기성 발생 조건(anaerobic evolution conditions)에 맞게, 배관 영역을 특 정 제어된 대기 구역으로 한정하여 격렬한(dynamics) 기체 교환을 제어할 수 있다. 이러한 작용은 자동 온도조절 컨트롤 박스를 기밀(gastight)하게 제조한 후에 중성 기체를 주입하거나 또는 전체 장치를 대기 조절 룸(atmosphere controlled room)에 배치하여 이루어진다.
정적 변형체의 대향 선택(counter-selection)은 생장 배지와 협력하여 생장실 표면을 대체하여서 이루어진다.
부가로, 장치는 중력과 관련하여 다양한 방향으로 운영될 수 있게 설계된다. 즉, 도 2에 도시한 바와 같이 360°에 이르는 범위까지 기울어지게 설계된다.
항-희석성 변형체는, 응집 세포가 상류에 떨어지는 경우에 생장실 벽에 부착하기 보다는 서로 들러붙어서 생장실에서 제거되지 않아, 희석되지 않는다. 따라서, 일반적으로, 응집 세포가 관 이동 사이클 동안 생장실에서 제거될 수 있는 영역쪽으로 떨어지도록, 상기 배관을 하방향으로 기울이는 것이 바람직할 것이다. 이러한 구조는 하류 게이트가 중력에 대해 상류 게이트 아래에 있도록 장치를 기울이는 동작(tilting)을 포함한다.
상기 생장실은 실험자가 선택한 조건에 따라서 감압 또는 과압될 수 있다. 압력 조정은 다양한 방식을 사용할 수 있는데, 예를 들면 진공 또는 압축 공기를 새로운 배지와 배관에 상류 말단부를 통해 생장실을 따라 적용하는 방식이 있다. 배관을 감압 또는 과압하는 다른 방식은 생장실의 상류 또는 내측에 배관을 교대로 끼워 조여서 결합(pinching and locking)하여 행해진다.
배지가 기체 침투성 배관에 함유되어 있으면, 배지 안에는 공기 기포가 형성 될 수 있다. 상기 기포(bubbles)는 배관의 밀봉영역 정상까지 부풀어 올라와서, 상기 영역(그리고 영역을 한정하는 게이트)의 이동이 상기 영역을 생장실, 샘플링 실 또는 케모스타트의 종료점[각각 도 6의 영역(D-C, B 또는 A)]으로 방출할 때까지 그 곳에 포집(trap)되어 있을 것이다. 만일, 상기 장치가 하방향으로 기울어지면, 상기 기포는 생장실 또는 샘플링 실에 축적되어 상기 배양물을 대신하게 된다. 따라서, 상기 장치는 주기적으로 관 이동 사이클 중에 상방향으로 기울어지게 설계하여, 축적된 기체를 상기 실에서 제거할 수 있게 한 것이다.
상기 장치의 경사 이동(tilting movement) 및/또는 생장실을 외부 장치(9)로 흔드는 방식을 사용하여 생장실 내에 세포가 응집되는 동작을 약화시킬 수 있다. 다르게는, 1개 또는 여러 개의 교반 막대를 멸균에 앞서 새로운 배지로 채워진 배관에 갖추어서, 배양 작업을 하는 중에 자성(磁性)을 이용한 교반을 할 수 있다. 생장하는데 교반(agitation)이 필요하지 않은 세포의 경우에는, 상기 장치를 동일한 자세로 있게 할 수 있다.
배양실의 길이와 비교하여, 상류 게이트에 의해 한정된 새로운 배지 영역의 길이의 비율이 일 사이클 중에 이루어지는 희석도를 정의 한다.
희석 빈도는 적정 시간을 정하여 결정될 수 있다(예를 들어, 케모스타트 기능). 예를 들면, 줄기세포가 세포 분화를 시작하기 전에 모여지도록 줄기세포를 유한 시기(limited time frame)에 채취할 수 있다. 다르게는, 상기 희석 빈도를 피드백 조정으로 결정하여, 생장실 내의 배양물의 밀도를 혼탁계(6)(도 1)로 측정하고, 혼탁도가 임계값에 이르면 희석 사이클을 시작한다(터비도스타트 기능). 상 기 배관은 혼탁도를 측정하게 투명하거나 반투명한 것이다.
상기 샘플링 실은, 실험 결과를 분석하거나, 추가 배양, 저장, 또는 기능 구현을 위한 향상된 생장률의 세포를 수집하거나, 또는 개체군을 계수하는 작업, 배지의 화학 조성물을 점검하는 작업, 또는 생장 배양물의 pH를 검사하는 작업과 같은 다른 목적으로 생장 배양물을 회수하는 작업을 하거나, 또는 다량의 세포(예를 들면, 줄기세포와 같은 진핵생물, 원핵생물, 원시세균, 및 바이러스)를 생성하도록 생장 배양물을 회수하는 작업을 한다. 생성실 내측의 pH를 영구적으로 모니터링하기 위하여 배관의 벽에 pH 지시제 라인을 매립/외피로 덮은 구성을 배관에 포함시킬 수 있다.
액체 또는 반고체 물질로 이루어진 임의적인 형성물을 상기 장치의 생장 배지로서 사용할 수 있다. 반고체 생장 기질을 활용하는 기술은 종래 기술을 현저하게 발전시킨 것이다. 선택 공정에 의해 향상된 물질교대 공정(metabolic processes)을 한정하는 상기 생장 배지는, 사용자가 선택 및 정의할 수 있다.
필요에 따라서, 상기 장치가 다수의 생성실을 포함하게 하여, 1개 생장실의 하류 게이트가 다른 생장실의 상류 게이트가 되게 할 수 있다. 이러한 장치는 예를 들어, 1개 세포가 제1실에서 생장 만을 하게 하고 그리고 다음 제2실에서는 다른 세포(또는 바이러스)의 영양물의 소스로 작용할 수 있게 한다.
본 발명은 본원에 의해 또는 그 생성물에 의해 생성된 세포와 합성된 약제, 백신, 또는 항독소용 생물학적 약제와 같은 조합제를 제조하는데 사용될 수 있는 것이다. 상기 생물학적 약제는 진단제, 예방제, 또는 치료제로서 사용된다. 예를 들면, 본 발명은 인슐린과 같은 치료용 단백질을 제조하는데 사용된다.
양호한 실시예에서, 상기 장치 및/또는 방법은 순환식으로 그들의 미분화된 상태에서 줄기 세포를 연속적으로 수집하는 것이다. 또한, 배양 조건을 부분적으로 변경하여 줄기세포의 분화를 억제한 것이다. 예를 들어, 줄기세포 분화 억제제(inhibitors)(예, 알데하이드 탈수소 효소의 억제제, 포스포이노시타이드 3-키니아의 억제제, TGF 수용체 키니아 억제제, TGF-B 수용체 키니아 억제제 등,등...)가 배양 배지에 더해진다. 다르게는, 상기 배양 배지에 전달되는 산소 량과 같은 처리 공정 조건을 증가 또는 감소하여 임의적인 줄기세포의 생장을 향상하고 그리고/또는 줄기세포의 분화 속도를 감속 또는 향상시킨다.
일부 세포에서는 생장하는데 기질을 필요로 함으로, 물리적 지지부 또는 구성체가 용기 배양실에 더해질 수 있다. 바람직한 실시예에서는, 지지 구조물과 같은 얇은 연속한 파이버로 구성된 연속 파이버 베드(fiber bed)와 같이 배관 내측에 더해지는 연속 지지부가, 3차원적인 세포 생장을 하게 하는 용기 배양실에 추가된다. 예를 들어, 상기 지지부는 줄기세포, 식물세포 및 그외 다른 형태의 세포와 같이 세포 생장용으로 지지부를 제공하는 파이버 베드로 있을 수 있으며, 상기 세포는 지지 구조물이 바람직하거나 또는 현탁 상태에서는 생장할 수 없거나 응집 세포로서 생장하고, 그리고 임의적인 특정 조건에서 또는 조건이 변경된 경우에는 타겟 변형을 위한 자연도태 과정으로 처리된다.
양호한 실시예에서는 본원에 참고문헌으로 개재된 Appl Biochem Biotechnol(2004년 봄)에서 황(Huang)외 다수인에 제출된(113-116:887-98), "Continuous Production of butanol by Clostridium acetobutylicum immobilized in a fibrous bed reactor"에 기재된 섬유 물질이 포함된다. 상기 배관의 구조와 크기는 이동 용기 배양실에 지지 구조물을 합체시킬 필요가 없게 변경시킬 수도 있다. 바람직한 실시예에서, 소 직경의 배관을 사용하여 세포가 보다 자연스런 방식으로 부착되게 하거나, 또는 상기 배관이 임의적인 응집 세포에 필요한 부착성을 갖지 않은 자연 지지체로서 사용된다.
이러한 장치와 방법에 따르면, 연구자와 생성물 개발자는, 지속된 생장(연속 배양)을 통해 배관 내에 파이버 베드를 가진 지지부에서 또는 배관의 벽에서 생장하는 현탁 상태에 있지 않은 배양성 생 세포의 균주(strain) 또는 현탁 상태에 있는 배양성 생 세포의 균주를 함유하게 하였으며; 개량된 생성 세포는 새로운 균주 또는 종(species)을 구성할 수 있다. 이러한 새로운 세포는 배양 과정 중에 획득한 돌연변이(mutations)를 통해 확인될 수 있고, 그리고 이러한 돌연변이는 이들의 선조 유전자형 특징과 새로운 세포를 분간되게 한다. 이러한 장치와 방법은, 연구자가 자연도태의 과정을 통해 향상된 증식률로 개체 분리를 생 세포의 새로운 균주를 선택할 수 있게 한다. 본 발명은 또한, 진핵생물(예, 효모, 균류, 식물세포, 조류, 동물세포 또는 줄기세포), 원핵생물, 원시세균 및 바이러스 같은 세포를 연속 배양하는 새로운 방법과 장치를 제공한 것이다.
부가 실시예에서는, 이미터(emitter)를 사용하여 세포가 영구적으로 또는 일시적으로 무선파, 광파, x-레이, 음파, 전자기장, 방사장, 방사성 미디어, 또는 이들 조합물 중에서 적어도 1개의 영향을 받게 한다. 다음과 같은 문헌들이 본원에 참고 기술내용으로 개재되었다. 다음: Biofizika(2005년 7-8월, 50(4): 689-92); 생체 전자기학(Bioelectromagnetics)(2005년 9월, 26(6):431-9); 영국 화학 통신(Chem Commun(Camb))(2005년 1월 14, (2):174-6); Biophys J(2005년 2월, 88(2): 1496-9); 생체 전자기학(1981년, 2(3): 285-9); Sb Lek(1998년, 99(4): 455-64); Antimicrob Agents Chemother(2004년 12월, 48(12): 4662-4); J Food Prot(2003년 9월, 66(9): 1712-5); 우주 생물학(Astrobiology)(2006년 4월, 6(2): 332-47); Life Sci Space Res(1970년 8: 33-8); Adv Space Res(1995년 3월, 15(3): 211-4); Radiat Res(2006년 5월, 165(5): 532-7); 돌연변이 유도(Mutagenesis)(2004년 9월, 19(5): 349-54); Cancer Sci(2006년 6월, 97(6): 535-9); Appl Environ Microbiol(2006년 5월, 72(5): 3608-14); Pol J Microbiol(2005년, 54 부록:7-11).
다른 실시예에서는 상기 장치의 생장실 영역이 영구적으로 또는 일시적으로 세포가 다른 중력을 받게 할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 무중력 환경에서 생장 할 수 있다. 다음과 같은 문헌들이 본원에 참고로서 기재된다. 다음: J Gravit Physiol(2004년 3월, 11(1): 75-80); Immunol Rev(2005년 12월, 208: 267-80); 및 J Gravit Physiol(2004년 7월, 11(2): P181-3).
당 기술분야의 기술인은 상술한 설명을 통해 상기 장치와 방법과 관련하여 본 발명을 개조 및 변경 할 수 있을 것이며, 첨부 청구범위의 정신을 이탈하지 아니하는 범위 내에서 이루어지는 이러한 개조 및 변경 기술은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 할 것이다.

Claims (55)

  1. 연속방식으로 생 세포를 생장시키는 장치에 있어서, 상기 장치는:
    혼탁도를 측정하도록 투명 또는 반투명하고, 생 세포가 현탁 상태 또는 비현탁 상태에서 점착 또는 비점착으로 생장하는 표면과 배양 배지를 함유한 가요성 배관(1);
    각각의 클램프가 배관을 개방 및 폐쇄시키는 위치에 있고, (i)미사용 배양 배지(7)를 함유한 상류 영역과, (ⅱ)소모된 배양 배지(15)를 함유한 하류 영역, 및 (ⅲ)상류 영역과 하류 영역 사이에 위치한 세포를 생장하는 생장실 영역(10)으로 배관(1)을 분할하게 위치하여 있는 클램프(3, 4, 5)로 이루어진 시스템 및;
    상기 배양 배지에 있는 생 세포의 광학 밀도를 측정하게 배치된 혼탁계(6) 또는 그외 다른 기구를 포함하고:
    상기 클램프(3, 4, 5)로 이루어진 시스템은, 상기 배관(1)의 상류 영역과 하류 영역 사이에 배관(1)의 생장실 영역(10)을 클램프로 죄여서 형성되도록 개방 및 폐쇄하게, 그리고 사전에 형성된 생장실 영역(10)의 제1부분이 상기 배관(1)의 하류 영역의 일 부분이 되고 그리고 상기 배관(1)의 사전 형성된 상류 영역의 일 부분이 상기 배관(1)의 생장실 영역(10)의 일 부분이 되게 상기 배관(1)의 생장실 영역(10)을 주기적으로 재형성하게, 구성 및 배치된 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혼탁계(6) 또는 그외 다른 기구는, 클램프의 개방 및 폐쇄 동작을 제어하는 피드백 컨트롤 시스템의 부품으로 작동하게 정렬 배치된 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 배관(1), 배지, 상기 배관(1) 내측에 배양, 및 클램프(3, 4, 5)로 이루어진 시스템은, 상호 동시적으로 이동하여 주기적으로 상기 배관(1)의 생장실 영역(10)을 재형성하게 정렬 배치된 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 클램프는, 배관(1)을 끼워 조여서 상류 영역, 하류 영역, 및 생장실 영역(10)을 형성하게 정렬 배치된 치부의 순환식 체인을 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 클램프(3, 4, 5) 시스템은, 상기 클램프가 폐쇄 위치에 있을 때에 상기 클램프의 각각이 상기 배관(1)과 상관하여 이동하지 않게 구성 및 정렬 배치된 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표면은 배관(1)의 내부 면인 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표면은 배관(1) 내측에 삽입된 연속 지지부인 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  8. 제1항에 있어서, 상기 표면은 연속 파이버인 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  9. 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 배관(1)은 기체 침투성인 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  10. 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 배관(1)은 기체 불침투성인 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  11. 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 배관(1)은 실리콘 또는 가요성 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  12. 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 장치는 부가로, 대기압에 대한 상기 배관(1)의 생장실 부분의 압력을 변경하게 구성된 압력 조정기를 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  13. 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 배관(1)은 pH 지시제를 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  14. 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 배관(1)의 생장실 영역(10)의 온도를 제어할 수 있게 구성된 온도 조절기를 부가로 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  15. 제1항에 있어서, 상기 장치는 부가로, 배관(1)의 생장실 부분의 교반을 행하게 구성된 교반기(9)를 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  16. 제15항에 있어서, 상기 교반기(9)는 적어도 1개 교반 막대를 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  17. 제1항 또는 제16항에 있어서, 상기 생장실 영역이 무선파, 광파, x-레이, 음파, 전자기장, 및 방사장 중의 적어도 1개를 받게 구성된 이미터를 부가로 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  18. 제1항 또는 제16항에 있어서, 상기 생장실 영역(10)이 다른 중력을 받게하는 수단을 부가로 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  19. 제1항 또는 제16항에 있어서, 상기 혼탁계는 상기 배관(1) 내측을 측정하는 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  20. 제1항 또는 제16항에 있어서, 상기 클램프는 동시적으로 이동하는 복수의 치부로 이루어진 1개 이상의 체인을 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  21. 제1항 또는 제16항에 있어서,
    상기 클램프는 2개 치부로 만들어진 시스템을 포함하고, 상기 2개 치부는 상기 치부들 사이에서의 계면의 정밀함으로 인해 상기 배관(1)의 영역(G, H) 사이에 오염이 발생하지 않게 하는 적층 방식으로 배관(1)을 끼워 조이는 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치
  22. 제1항에 있어서, 상기 배지의 pH를 측정할 수 있게 배관(1) 합성물 또는 라이닝에 pH 지시제를 부가로 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  23. 제1항 또는 제22항에 있어서, 상기 생장실 영역(10)의 배관(1)을, 응집 세포를 제거하기 위해서는 하방향으로 경사지게 하고 또는 공기를 제거하기 위해서는 상방향으로 경사지게 하는 틸팅 메카니즘을 부가로 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  24. 제1항에 있어서, 상기 장치는 세포의 연속 배양을 할 수 있으며, 여기서 상기 세포는 진핵생물, 원핵생물, 원시세균, 또는 바이러스 이고, 그리고 상기 세포는 배지에 현탁 상태에서 생장하지 않거나 또는 상기 배관(1)에 현탁 상태에서 생장하지 않는 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  25. 제1항 또는 제22항에 있어서, 상기 장치는 세포의 연속 배양을 할 수 있으며, 여기서 상기 세포는 진핵생물, 원핵생물, 원시세균, 또는 바이러스 이고, 그리고 상기 세포는 부착성 세포로서 생장하는 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  26. 제1항 또는 제22항에 있어서, 상기 생장실 영역(10)은 배양 배지를 함유한 1개 이상의 생장실을 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식 생 세포 생장 장치.
  27. 연속방식으로 세포를 생장하는 방법에 있어서, 상기 방법은:
    (a)배양 배지를 함유한 가요성의 투명한 또는 반투명한 배관(1), 생 세포가 상기 배관(1)에서 생장할 수 있는 표면, 및 각각의 클램프가 개방 및 폐쇄를 할 수 있으며 배관(1)을 분할 할 수 있게 위치한 클램프(3, 4, 5) 시스템을 설치하는 단계와;
    (b)혼탁도를 측정하는 혼탁계(6) 또는 그외 다른 기구로 상기 배양 배지의 혼탁도를 측정하는 단계와;
    (c)배관(1)의 상류 영역과 하류 영역과의 사이에 배관(1)의 생장실 영역(10)을 형성하도록 배관(1)에서 선택된 클램프 영역을 폐쇄하고, 그리고 상기 생장실 영역(10) 안으로 생육가능한 세포를 유입시키는 단계와;
    (d)생장 배양 배지의 혼탁도를 모니터하고 그리고, 필요한 배양 생장 량에 상당하는 혼탁도 측정치에 이르면, 사전에 형성된 생장실 영역(10)의 제1부분이 상기 배관(1)의 하류 영역의 일 부분이 되도록 그리고 사전에 형성된 배관(1)의 상류 영역의 일 부분이 상기 배관(1)의 생장실 영역(10)의 일 부분이 되도록, 상기 배관(1)의 생장실 영역(10)을 재형성하게, 선택된 클램프 영역을 개방 및 폐쇄하는 단계; 및
    (e)충분한 량의 세포가 생장되어질 때까지 상기 (d)단계를 반복하는 단계를 포함하며;
    (a')상기 (a)단계에서의 배관 분할은, (i)미사용 배양 배지(7)를 함유한 상류 영역과, (ⅱ)소모된 배양 배지(15)를 함유한 하류 영역, 및 (ⅲ)상류 영역과 하류 영역과의 사이에 위치한 상기 세포를 생장하는 생장실 영역(10)으로 되는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 혼탁계(6)는, 클램프의 개방 및 폐쇄 동작을 제어하는 피드백 컨트롤 시스템의 부분으로 작동하게 정렬 배치된 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 배관(1), 배지, 상기 배관(1) 내측에 배양, 및 클램프(3, 4, 5) 시스템은, 상호 동시적으로 이동하여 주기적으로 상기 배관(1)의 생장실 영역(10)을 재형성하게 정렬 배치된 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  30. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 클램프는, 배관(1)을 끼워 조여서 상류 영역, 하류 영역, 및 생장실 영역(10)을 형성하게 정렬 배치된 치부의 순환식 체인을 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  31. 제27항 또는 제28항에 있어서, 하류 영역에서 상기 배양 배지로부터 생 세포를 회수하는 단계를 부가로 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  32. 제27항 또는 제28항에 있어서, 하류 영역에서 상기 생 세포를 분리하는 단계를 부가로 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  33. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 생 세포는 조류, 균류, 효모세포, 동물세포, 식물세포, 및 줄기세포로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  34. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 생 세포는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  35. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 생 세포는 조혈모 세포, 골수 줄기세포, 기질세포, 성상세포, 올이진덴드로사이트스, 배아 줄기세포, 태아 줄기세포, 탯줄 줄기세포, 태반 유도 줄기세포, 및 성체 줄기세포로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  36. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 세포가 생장하는 표면은 상기 배관(1)의 실내 면인 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  37. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 세포가 생장하는 표면은 연속 파이버인 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  38. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 혼탁도는 배관(1) 내측을 측정하는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  39. 제27항 또는 제28항에 있어서, 생장실 영역(10)에서 1개 이상 타입의 세포를 생장하는 단계를 부가로 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  40. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 배관(1)은 기체 침투성인 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  41. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 배관(1)은 기체 불침투성인 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  42. 제27항 또는 제28항에 있어서, 대기압에 대해서 상기 배관(1)의 생장실 부분의 압력을 조정하는 단계를 부가로 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  43. 제27항 또는 제28항에 있어서, 생장실 영역(10)에 배양 배지의 pH를 측정하는 단계를 부가로 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  44. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 배관(1)의 생장실 영역(10)의 온도를 제어하게 구성된 온도 조절기로 상기 생장실 영역(10)의 온도를 조절하는 단계를 부가로 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  45. 제27항에 있어서, 교반기(9)로 생장실 영역(10)에 있는 배양 배지를 교반하는 단계를 부가로 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 교반기(9)는 적어도 1개의 교반 막대를 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  47. 제27항 또는 제46항에 있어서, 상기 생장실 영역(10)이, 무선파, 광파, x-레이, 음파, 전자기장, 및 방사장 중의 적어도 1개를 받게 하는 단계를 부가로 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  48. 제27항 또는 제46항에 있어서, 상기 생장실 영역(10)이 서로 다른 중력을 받게 하는 단계를 부가로 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  49. 제27항 또는 제46항에 있어서, 상기 세포는 현탁 상태에서 생장하지 않는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  50. 제27항 또는 제46항에 있어서, 상기 세포는 응집 세포로서 생장하는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  51. 제27항 또는 제46항에 있어서, 상기 생장실 영역(10)에 제공된 1개 이상의 생장실에서 생 세포를 생장하는 단계를 부가로 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  52. 제27항 또는 제46항에 있어서, 동일한 또는 동일하지 않은 조건에서 제1생장실과 제2생장실에 생 세포를 생장하는 단계를 부가로 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  53. 제27항 또는 제46항에 있어서, 상기 (d)단계는, 상기 생장실 안으로 상류 영역에서 나온 임의 량의 새로운 배지를 제공하여 희석하면서, 동일한 량의 배양물을 상기 생장실의 반대편 말단부를 통해 생장실에서 하류 영역으로 분리 이동시키는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  54. 제27항 또는 제46항에 있어서, 상기 (d)단계는, 분리된 고립 생장실의 오염가능성을 회피하면서 항-희석 개체군의 증식 가능성을 방지하도록, 미사용 배양 배지(7)의 도입과 함께 생장실 영역이 재개되도록, 각 생장 사이클 사이에서 배관(1)을 이동시키는 단계를 부가로 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
  55. 제27항 또는 제46항에 있어서, 상기 생 세포가 향상된 비율의 증식 및/또는 특정 물질교대 성질을 나타내도록 생 세포의 자연도태의 조건 하에서 상기 세포를 생장하는 단계를 부가로 포함하는 것을 특징으로 하는 연속방식으로 세포를 생장하는 방법.
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