BRPI0714707A2 - aparelho de cultura contÍnua com recipientes màvel que permite a seleÇço de variantes de cÉlulas reparadoras e produÇço de uma cultura de forma contÍnua - Google Patents

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Abstract

APARELHO DE CULTURA CONTÍNUA COM RECIPIENTE MàVEL QUE PERMITE A SELEÇçO DE VARIANTES DE CÉLULAS REPARADORAS E PRODUÇçO DE UMA CULTURA DE FORMA CONTíNUA. O presente pedido de patente de invenção se refere a um método e dispositivo para crescimento de células vegetais, animais e células-tronco em uma forma contínua.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO Pedido de Patente de Invenção para: "APARELHO DE CULTURA CONTÍNUA COM RECIPIENTE MÓVEL QUE PERMITE A SELEÇÃO DE VARIANTES DE CÉLULAS REPARADORAS E PRODUÇÃO DE UMA CULTURA DE FORMA CONTÍNUA". CAMPO DA INVENÇÃO
A invenção descrita provê um método e um dispositivo que permite a seleção de células vivas, com propriedades aumentadas das taxas de reprodução e metabolismo especifico, em um meio liquido ou semi-sólido. Para o processo de seleção (evolução adaptativa) , organismos geneticamente variantes (mutantes) surgem em uma população e competem com outras variantes da mesma origem. Aqueles com a taxa de reprodução mais rápida aumentam em proporção relativa ao longo do tempo, levando a uma população (e organismos individuais) com taxa reprodutiva aumentada. Este processo pode melhorar o desempenho dos organismos usados em processos industriais ou finalidades acadêmicas. A presente invenção utiliza um aparelho de cultura continua para alcançar a produção viável de células vivas (por exemplo, Procariontes, Archaea, Vírus, Eucariontes, fungos, algas, levedura, células vegetais, células animais ou células-tronco) . A presente invenção pode ser usada para produzir um ingrediente ativo ou biológico que é produzido pelas células vivas. 0 ingrediente ativo ou biológico pode vir a ser utilizado como um agente de diagnóstico, de prevenção ou terapêutico.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A seleção para o aumento da taxa reprodutiva (adequação), requer o crescimento sustentado, que se consegue através da diluição regular de uma cultura em crescimento. No estado da arte, isso foi consumado de três formas: cultura sólida, diluição em série e cultura continua, que difere geralmente no grau de diluição. A cultura sólida envolve a transferência repetitiva de
um pequeno volume de culturas crescidas ou células de uma placa de Petri para um recipiente com meio de crescimento fresco. A cultura em série envolve a transferência repetitiva de um pequeno volume de cultura crescida para um recipiente muito maior contendo meio de crescimento fresco. Quando as células cultivadas cresceram para a saturação no novo recipiente, o processo é repetido. Este método foi usado para atingir as demonstrações mais duradouras de cultura prolongada na literatura (Lenski & Travisano: Dynamics of adaptation and diversification: a 10, 000- generation experiment with bacterial populations. 1994. Proc Natl Acad Sci USA. 15:6808-14), em experimentos que demonstraram claramente melhoria consistente na taxa reprodutiva por anos. Este processo é normalmente feito manualmente, com investimento de trabalho considerável, e está sujeito à contaminação através da exposição ao ambiente externo. A cultura em série é também ineficaz, conforme descrito no parágrafo seguinte.
A taxa de seleção, ou a taxa de melhoria na taxa de reprodução, é dependente do tamanho da população (Fisher: The Genetical Theory of Natural Selection. 1930. Oxford University Press, London, UK). Além disso, em uma situação com transferência em série onde o tamanho da população oscila rapidamente, a seleção é proporcional à média harmônica (N) da população (Wright: Size of population and breeding structure in relation to evolution. 1938. Science 87: 430-431), e, portanto, pode ser aproximada pela menor população durante o ciclo.
0 tamanho da população pode ser mantido, e a seleção então feita mais eficiente, por cultura continua. A cultura continua, enquanto distinta da diluição em série, envolve volume relativo menor tal que uma pequena parte de uma cultura em crescimento é regularmente substituída por um volume igual do meio de crescimento fresco. Este processo maximiza o tamanho da população eficaz pelo aumento do seu tamanho minimo durante a diluição cíclica. Dispositivos que permitem a cultura contínua são denominados "quimiostatos" se as diluições ocorrem em intervalos de tempo específicos, e "turbidostatos" se a diluição ocorre automaticamente quando a cultura cresce a uma densidade específica. Por razões de simplicidade, ambos os tipos de
dispositivos a seguir serão agrupados sob o termo "quimiostatos". Os quimiostatos foram inventados simultaneamente por dois grupos em 1950 (Novick & Szilard: Description of the chemostat. 1950. Science 112: 715-716) e (Monod: La technique de Ia culture continue - Théorie et applications. 1950. Ann. Inst. Pasteur 79:390-410). Os quimiostatos foram usados para demonstrar curtos períodos de rápida melhoria na taxa reprodutiva (Dykhuizen DE. Chemostats used for studying natural selection and adaptive evolution. 1993. Methods Enzymol. 224:613-31). Quimiostatos tradicionais são incapazes de suportar
longos períodos de seleção para aumento da taxa de reprodução, devido ã inesperada seleção de variantes resistentes à diluição (estática). Estas variantes são capazes de resistir à diluição, aderindo-se à superfície do quimiostato, e ao fazê-lo, supera indivíduos menos pegajosos, incluindo aqueles que têm maiores taxas de reprodução, eliminando, assim, a finalidade desejada do dispositivo (Chão & Ramsdell: The effects of wall populations on coexistence of bactéria in the liquid phase of chemostat cultures,. 1985. J. Gen. Microbiol. 131: 1229- 36) .
Um método e dispositivo quimiostástico (O motor genético, do inglês "the Genetic Engine") foram inventados para evitar a resistência à diluição na cultura contínua (patente US 6,686,194-B1 depositada pelo PASTEUR INSTITUT [FR] & MUTZEL RUPERT [DE]). Este método usa a transferência de fluido controlada por válvula para deslocar periodicamente a cultura crescente entre dois quimiostatos, permitindo cada um ser esterilizado e lavado entre os períodos de crescimento ativo da cultura. Os ciclos de esterilização regular evitam a seleção de variantes resistentes à diluição pela sua destruição. Este método e dispositivo atingem o objetivo, mas requerem manipulações complexas independentes de vários fluidos num ambiente estéril (vedado), incluindo um (NaOH) que é simultaneamente muito cáustico e potencialmente muito reativo, danificando rapidamente as válvulas, e apresentando problemas de contenção e tratamento de resíduos. 0 dispositivo quimiostático é também limitado na medida em que nenhuma provisão é feita para fornecer um apoio para as células crescerem. Dispositivos tais como Motor Genético e outra tecnologia conhecida não permitem a cultura contínua das células, que não crescem em suspensão e/ou crescem como células coesas.
Existem alguns tipos de células que são difíceis de cultivar em grande quantidade devido às condições que as células necessitam para sobreviver ou crescer. Acredita-se que estas células poderiam crescer em condições fornecidas por uma estratégia de cultura contínua. Isto é particularmente o caso para eucariontes (por exemplo, algas, leveduras, fungos, células vegetais, células animais, e células-tronco) . Por exemplo, células-tronco embrionárias humanas crescem tipicamente pelo isolamento e transferência de uma massa de célula-tronco em uma placa laboratorial de cultura de plástico que contém um caldo nutritivo conhecido como meio de cultura. As células se dividem e se espalham na superfície da placa. A superfície interna da placa de cultura é tipicamente coberta com células embrionárias de pele de rato que foram tratadas, assim elas não se dividirão. Esta camada de revestimento das células é chamada de camada nutriente. A razão para se ter a camada nutriente no fundo da placa de cultura é para dar às células-tronco embrionárias humanas uma superfície viscosa a qual elas podem se ligar. Além disso, as células nutrientes liberam nutrientes no meio de cultura. Recentemente, os cientistas começaram a projetar formas de crescimento de células-tronco embrionárias sem as células nutrientes de rato. Isto é um avanço científico significativo por evitar o risco que vírus ou outras macromoléculas nas células de ratos possam ser transmitidos às células humanas.
Ao longo de vários dias, as células do interior da massa celular se proliferam e começam a se aglomerar na placa de cultura. Quando isto ocorre, elas são removidas delicadamente e plaqueadas em várias placas de cultura fresca. O processo de replaqueamento das células é repetido muitas vezes e por muitos meses, e é chamado de subcultura. Cada ciclo de subcultura das células é referido como uma passagem. Após seis meses ou mais, as células originais da massa celular produzem milhões de células-tronco embrionárias. As células-tronco embrionárias que proliferaram na cultura celular por seis ou mais meses sem diferenciação, são pluripotentes, e parecem geneticamente normais são referidas como uma linhagem de célula-tronco embrionária.
Quando as linhagens celulares são estabelecidas, ou mesmo antes dessa etapa, suas porções podem ser congeladas e enviadas para outros laboratórios para mais cultura e experimentação. No entanto, a cultura continua concede a vantagem de suprimir um máximo de manipulações que estressam as células vivas e criam uma fonte potencial de contaminação. Quando uma cultura é iniciada, as condições de cultura continua permitem ao versado na técnica tirar proveito de uma produção continua de células. Uma vez que as células-troco estão sendo produzidas, a produção de células-tronco poderia prosseguir sem interrupção para produzir substancialmente mais células-tronco do que os métodos que normalmente são usados hoje. RESUMO DA INVENÇÃO
É, portanto, um objeto da presente invenção proporcionar um método melhorado (e completamente independente) e um dispositivo para a cultura continua de células (incluindo procariontes, bactéria, Archaea, eucariontes e vírus) sem interferência das variantes resistentes à diluição. Como outros quimiostatos, o dispositivo fornece um meio para a diluição regular de uma cultura de crescimento com meio de crescimento fresco, meios para troca gasosa entre a cultura e o ambiente externo, esterilidade, e operação automática como também um quimiostato ou um turbidostato.
Adicionalmente, é um objeto da presente invenção fornecer um método distinto e melhorado e um dispositivo para cultura contínua de células que não crescem em suspensão e ou que crescem como células coesas tais como eucariontes (por exemplo, células de plantas, algas, fungos, leveduras, células animais ou células-tronco) e determinados procariontes (por exemplo, estreptomicetos)e possivelmente certos Archaea e vírus. As células-tronco que podem ser cultivadas com a presente invenção incluem, mas não são limitadas às células-tronco embrionárias, células- tronco fetais, células-tronco do cordão umbilical, células- tronco derivadas da placenta, e células-tronco adultas. As células-tronco adultas que podem ser cultivadas com a presente invenção incluem, mas não estão limitadas às células-tronco hematopoiéticas, células-tronco da medula óssea, células estromais, astrócitos e oligodendrócitos (por exemplo, Protocolo de células-tronco hematopoiéticas por C. Klug e C. Jordan, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2002, incorporados aqui por referência). A presente invenção é projetada para atingir estes objetivos sem qualquer transferência de fluido, incluindo as funções de esterilização ou lavagem. Isto representa uma vantagem especifica da presente invenção em relação ao estado da arte, na medida que evita os perigos e as dificuldades associadas com a esterilização e lavagem, incluindo a contenção e as complexas transferências de fluido que envolvem solventes cáusticos, contaminação, e os distúrbios de crescimento devido à transferência de cultura de um recipiente para outro.
A cultura continua é alcançada dentro de uma tubulação flexível estéril preenchida com o meio de crescimento. O meio e a superfície de câmara são estáticos um em relação ao outro, e ambos são substituídos regularmente e simultaneamente por movimentos peristálticos da tubulação através de "portas", ou pontos no qual o tubo é subdividido esterilmente por grampos que impedem as células cultivadas de se deslocarem entre as regiões do tubo. Portas UV podem ser também (opcionalmente) adicionadas a jusante ou a montante do recipiente de cultura para segurança adicional.
O presente método e dispositivo são também uma melhoria em relação estado da arte, na medida em que continuamente, em vez de periodicamente, seleciona diante da aderência das variantes resistentes à diluição para as superfícies quimiostáticas, como substituição das superfícies afetadas ocorrem em paralelo com o processo de diluição. Além disso, para as células que crescem em suspensão e as células que crescem como células coesas, a tubulação oferece um apoio continuo para crescimento com a vantagem de não perturbar as células pela transferência de células de um recipiente para outro.
O tubo é subdividido numa forma transiente tal que há regiões que contém cultura saturada (totalmente crescidas), regiões que contém meio fresco, e uma região entre essas duas, onde uma ou mais câmaras referidas como crescimento ou câmara de cultura estão presentes para formar uma região de câmara de crescimento em que a cultura crescida é misturada com o meio fresco para realizar a diluição. As portas são periodicamente liberadas de um ponto do tubo e substituídas por outro ponto, tal que a cultura crescida junto com sua superfície associada à câmara de crescimento e as células estáticas ligadas, são removidas pelo isolamento da câmara de crescimento e substituídas tanto pelo meio fresco como pela superfície de câmara fresca. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Sem ser exaustivo e limitante, uma possível
configuração geral incluirá vários componentes como descritos a seguir. Na seqüência da presente invenção está exemplarmente explicada com base em uma modalidade preferida, referindo-se, assim, aos desenhos em que: A Figura 1 apresenta uma vista geral de uma possível
configuração do dispositivo em que: (1) representa a tubulação flexível contendo as diferentes regiões do dispositivo que são: meio fresco a montante (7), câmara de crescimento (10), câmara de amostragem (11) e região disposta de cultura cultivada (15) (2) representa a caixa termostaticamente controlada
que permite a regulação da temperatura de acordo com as condições determinadas pelo usuário, e na qual pode ser localizada:
a. a dita câmara de crescimento (10),
b. a dita câmara de amostragem (11),
c. a porta a montante (3) que define o inicio da dita câmara de crescimento (10),
d. a porta a jusante (4) que define o final da dita câmara de crescimento (10) e o inicio da dita câmara de
amostragem (11),
e. a segunda porta a jusante (5) que define o final da dita câmara de amostragem (11),
f. o turbidimetro (6) que permite ao usuário ou ao sistema de controle automatizado monitorar a densidade
óptica do crescimento da cultura e operar um sistema de controle de retorno (13), que permite o movimento controlado da tubulação (1) com base da densidade da cultura (função de turbidostato),
g. um ou vários agitadores (9). Deve-se notar que os elementos do dispositivo listados em a-g podem ser também localizados fora de, ou na ausência de, uma caixa termostaticamente controlada.
(7) representa o meio fresco na tubulação flexível não usado,
(8) representa um barril carregado com a tubulação preenchida de meio fresco, para dispensar o dito meio fresco e a tubulação durante as operações.
(12) representa a porta opcional de radiação ultra- violeta,
(13) representa o sistema de controle que pode consistir de um computador conectado aos meios de comunicação para monitoramento diferente ou interfaces de operação, como turbidímetros de densidade óptica, medição
de temperatura e dispositivos de regulagem, agitadores e motores de inclinação, etc., que permitem a automação e o controle das operações,
(14) representa o barril de disposição opcional no qual subiu a tubulação contendo a cultura cultivada
disposta na tubulação preenchida,
(15) representa a cultura cultivada disposta localizada à jusante da dita câmara de amostragem.
A Figura 2 apresenta suas posições possíveis do dispositivo, exemplificando o fato que a dita caixa termostaticamente controlada (2) e outras peças do dito dispositivo associado com a dita câmara de cultura podem ser inclinadas a vários graus para finalidades de agitação, circulação de gás e finalidades de remoção, e para garantir a remoção de células granuladas (agregadas) que possam escapar da diluição instalando-se no fundo. 0 dispositivo poderia também ficar na mesma posição (por exemplo, na posição plana ou com um ângulo) no caso de as células não necessitarem de agitação para crescimento.
As Figuras de 3 a 9 representam a dita tubulação flexível (1) no lugar da dita caixa termostaticamente controlada (2) e introduzida por portas (3), (4) e (5) pela qual a dita tubulação estará durante todas as etapas do processo e pela qual a dita tubulação se deslocará de acordo com seus movimentos peristálticos.
A figura 3 simboliza a condição TO do dispositivo na qual todas as regiões da dita tubulação flexível são preenchidas com meio fresco antes da injeção das células pretendidas para a cultura contínua.
A Figura 4 simboliza a condição Tl do dito tubo flexível apenas após a injeção da linhagem celular. A figura 5 simboliza a condição T2 do dispositivo que
é um período de crescimento durante o qual a cultura cresce na região definida como câmara de crescimento (10) limitada pelas ditas portas (3) e (4).
A Figura 6 simboliza a condição T3 do dispositivo, apenas após o primeiro movimento peristáltico da tubulação e o meio associado, que determina o início do segundo ciclo de crescimento, introduzindo a tubulação e o meio fresco pelo movimento da porta 3 simultâneo com a transferência do volume equivalente da tubulação, meio, e da cultura crescida fora da região da câmara de crescimento (10) e dentro da região da câmara de amostragem (11) pelo movimento da porta 4. É fundamental reconhecer que a tubulação, o meio que está dentro da tubulação, e qualquer cultura que tenha crescido naquele meio, se desloquem todos juntos. A transferência de fluido ocorre apenas na medida em que o meio fresco e o cultivo crescido se misturam por agitação dentro da região da câmara de crescimento.
A Figura 7 simboliza a condição T4 do dispositivo que é o segundo ciclo de crescimento; durante este ciclo as células que permanecem na câmara de crescimento após o movimento peristáltico da tubulação já podem crescer usando nutrientes fornecidos no meio fresco que é misturado com o restante da cultura durante esta etapa.
A Figura 8 simboliza a condição T5 do dispositivo, logo após o segundo movimento peristáltico da tubulação e o meio contido, que determina o inicio do terceiro ciclo de crescimento, introduzindo a tubulação e o meio fresco pelo movimento da porta 3 simultâneo com uma transferência de volume equivalente da tubulação, meio, e cultura crescida fora da região da câmara de crescimento (10) e dentro da região da câmara de amostragem (11) pelo movimento da porta 4 . A Figura 9 simboliza a condição T6 do dispositivo que é o terceiro ciclo de crescimento; esta etapa é equivalente à condição T4 e indica a natureza repetitiva das outras operações. As amostras das células selecionadas podem ser removidas a qualquer tempo da região da câmara de amostragem (11) usando uma seringa ou outro dispositivo de recuperação.
A Figura 10 apresenta um perfil possível dos dentes que determinam uma porta na configuração que consiste de dois dentes empilhados apertando a tubulação flexível. As portas também poderiam ser determinadas por um único dente pressionando contra um cinto móvel, presilhas removíveis, ou outros mecanismos que impeçam a circulação das células através da porta e que podem ser removidos e colocados alternadamente em posições variável ao longo da tubulação. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A operação básica do dispositivo é retratada nas figuras 3 a 9.
Uma configuração potencial para o presente dispositivo é apresentada na figura 1, como aparece após ter sido carregado com um tubo fresco de meio estéril (apresentado dividido em regiões A-H pelas ditas portas (3), (4) e (5)).
A inoculação do dispositivo com a célula escolhida poderia ser alcançada pela introdução da célula na câmara de crescimento (fig. 3), por injeção (figura 4, região B) . A cultura seria, então, deixada crescer até a densidade desejada e a cultura continua começaria (fig. 5).
A cultura continua procederia pelos deslocamentos repetitivos das regiões de entrada da tubulação. Isso envolve deslocamentos simultâneos das portas, da tubulação, do meio, e de qualquer cultura dentro da tubulação. A tubulação sempre se deslocará na mesma direção; a tubulação não usada contendo o meio fresco (e a seguir dita ser "a montante" da câmara de crescimento (7)) se deslocará na câmara de crescimento e se misturará com a cultura remanescente, fornecendo o substrato para o crescimento adicional das células nele contidas. Antes da introdução na região da câmara de crescimento, este meio e sua tubulação associada serão mantidos numa condição estéril pela separação da câmara de crescimento pelas portas a montante (3) . A tubulação usada contendo a cultura crescida será deslocada simultaneamente "a jusante" e separada da câmara de crescimento pelas portas a jusante (4).
Quando uma ou mais câmaras de crescimento estão presentes, as câmaras de crescimento podem ser usadas para a mesma ou diferente finalidade. Por exemplo, as células vivas poderiam crescer numa primeira câmara de crescimento e uma segunda câmara de crescimento com as mesmas ou diferentes condições. Em uma modalidade, uma primeira câmara de crescimento pode ser usada para crescer as células sob condições diferentes. Por exemplo, as células podem ser tratadas para induzir a expressão de um produto desejado. Os componentes ou aditivos do próprio meio de cultura podem ser adicionados antes ou após a cultura começar. Por exemplo, todos os componentes ou aditivos poderiam ser inclusos no meio antes do inicio da cultura, ou os componentes podem ser injetados em uma ou mais câmaras de crescimento após a cultura ter sido iniciada.
A configuração da porta não é um ponto especifico do presente pedido de patente. Por exemplo, numa dada configuração, as portas podem ser projetadas por uma cadeia de múltiplos dentes simultaneamente deslocados ou numa outra configuração separada em distintas cadeias sincronizadas conforme retratado na figura 1. As portas podem consistir de um sistema feito de dois dentes que apertam a tubulação numa forma empilhada como descrito na figura 10, evitando a contaminação entre as regiões GeH da tubulação através da pressão da interface entre os dentes. Numa outra configuração, as entradas estéreis podem ser obtidas pressionando um os dentes contra um lado da tubulação e através disso pressionando a tubulação com força contra um chassi ao longo de uma tubulação que é deslizada durante seu movimento peristáltico, conforme esboçado na figura 3 a 9, marcas 3, 4 e 5. Ainda em uma outra configuração, um mecanismo onde as presilhas giradas em torno de um eixo fixo em relação ao dispositivo é usado para mover a tubulação. A dita caixa termostaticamente controlada (2) é obtida por meios já conhecidos tais como um termômetro acoplado com um dispositivo de aquecimento e resfriamento.
A aeração (troca gasosa), quando requerida para o crescimento da célula cultivada ou pela projeção do experimento, é atingida diretamente e sem assistência mecânica pelo uso da tubulação permeável a gás. Por exemplo, e sem ser limitante, a tubulação flexível permeável a gás pode ser feita de silicone. A aeração poderia ser alcançada pela troca com a atmosfera ambiente ou pela troca com uma atmosfera artificialmente definida (líquida ou gasosa) que comunica a câmara de crescimento ou o quimiostato inteiro. Quando um experimento necessita de anaerobiose a tubulação flexível pode ser impermeável a gás. Por exemplo, e sem ser limitante, a tubulação flexível permeável a gás pode ser feita de silicone revestido ou tratado.
Para condições de evolução de anaerobiose, as regiões da tubulação podem ser confinadas numa área de atmosfera específica e controlada para controlar as dinâmicas trocas gasosas. Isso pode ser alcançado ou fazendo a dita caixa termostaticamente controlada hermética e depois injetando gás neutro ou colocando o dispositivo completo numa atmosfera controlada ambiente. A seleção de mostrador das variantes estáticas é atingida pela substituição da superfície da câmara de crescimento junto com o meio de crescimento.
0 dispositivo é projetado ainda para ser operável em uma variedade de orientações em relação à gravidade, ou seja, para ser inclinado como apresentado pela figura 2, ao longo de uma faixa de até 360°.
As variantes resistentes à diluição podem evitar a diluição aderindo uma à outra, em vez da parede da câmara se as células agregadas podem cair a montante e, assim, evitam a remoção da câmara. Assim, é desejável que a tubulação em geral seja inclinada para baixo, tal que as células agregadas caiam através da região que será removida da câmara de crescimento durante um ciclo de deslocamento do tubo. Esta configuração envolve a inclinação do dispositivo de modo que as portas a jusante estejam abaixo da porta a montante quanto à gravidade.
A câmara de crescimento pode ser despressurizada ou superpressurizada de acordo com as condições escolhidas pelo experimentador. Diferentes formas de ajuste de pressão podem ser usadas, por exemplo, aplicando vácuo ou ar pressurizado ao meio fresco e a tubulação através da extremidade a montante e através da câmara de crescimento; uma outra forma de despressurização ou superpressurização de tubulação pode ser feita apertando e fechando a tubulação a montante da ou dentro da câmara de crescimento. Quando o meio está contido na tubulação permeável a gás, podem se formar bolhas de ar dentro do meio. Essas subirão ao topo de uma região fechada da tubulação e se tornarão presas lá até que o movimento da região (e as portas que a definem) libere a região na câmara de crescimento, a câmara de amostragem ou o ponto final do quimiostato (figura 6, regiões D-C, B ou A, respectivamente). Se o dispositivo é inclinado à jusante tais bolhas se acumularão na câmara de crescimento ou câmara de amostragem e deslocarão a cultura. O dispositivo é projetado para inclinar periodicamente para cima por um ciclo do movimento do tubo, permitindo a remoção do gás acumulado das ditas câmaras.
Os movimentos de inclinação do dispositivo, e/ou agitação da câmara de crescimento por um dispositivo externo (9) podem ser usados para reduzir a agregação das células dentro da câmara de crescimento. Alternativamente, uma ou várias barras de agitação podem ser inclusas na tubulação preenchida com o meio fresco perante a esterili zação e magneticamente agitada durante as operações de cultura. No caso das células que não necessitam de agitação para crescer, a máquina poderia ficar na mesma posição.
0 comprimento proporcional das regiões do meio fresco definido pelas portas a montante quando comparado com o comprimento da câmara de cultura definirão o grau de diluição alcançada durante um ciclo.
A freqüência de diluição pode ser determinada por cronometragem (por exemplo, função quimiostato). Por exemplo, as células-tronco podem ser colhidas num tempo limitado de modo que as células-tronco sejam coletadas antes de começar a diferenciação das células. Alternativamente, a freqüência de diluição pode ser determinada com uma regulação de retorno segundo a qual a densidade da cultura na câmara de crescimento é medida por um turbidimetro (figura 1 - marca 6) e o ciclo de diluição ocorre quando a turbidez atinge um valor mínimo (função turbidostato). A tubulação pode ser transparente ou translúcida para medição da turbidez. A câmara de amostragem permite a retirada da cultura
crescida para analisar o resultado de um experimento, células coletadas com melhoria na taxa de crescimento para cultura adicional, estocagem, ou implementação funcional, ou outras finalidades tais como contagem de população, checagem da composição química do meio, ou testagem de pH da cultura crescida, ou produção de células em quantidade (por exemplo, eucariontes tais como células-tronco, procariontes, Archeae e vírus). Para alcançar o monitoramento permanente do pH dentro da câmara de crescimento, a tubulação pode incluir por construção uma linha indicadora de pH embutida/incrustada na parede da tubulação.
Qualquer forma de material liquido ou semi-sólido pode ser usada como um meio de crescimento no presente dispositivo. A capacidade de utilizar substratos de crescimento semi-sólidos é um avanço notável sobre o estado da arte. 0 meio de crescimento, que definirá os processos metabólicos melhorados pelo processo selecionado, pode ser escolhido e definido pelo usuário. Se necessário esse dispositivo pode conter múltiplas
câmaras de crescimento, tais que as portas a jusante de uma câmara de crescimento se tornem as portas a montante de uma outra. Isso poderia, por exemplo, permitir uma célula crescer sozinha na primeira câmara, e atuar como uma fonte de nutriente para uma segunda célula (ou virus) na segunda câmara.
A invenção pode ser usada para produzir uma preparação, tal como uma preparação biológica para um fármaco, uma vacina, ou uma antitoxina, que é sintetizada das células de crescimento pela invenção ou seus produtos. O processo biológico pode ser usado como um agente de diagnostico, preventivo ou terapêutico. Por exemplo, a presente invenção pode ser usada para produzir as proteínas terapêuticas tais como insulina. Em uma modalidade preferida, o dispositivo e/ou método
pode ser submetido a ciclos para coletar de forma contínua as células-tronco no seu estado indiferenciado. Além disso, as condições de cultura podem ser modificadas para inibir a diferenciação das células-tronco. Por exemplo, os inibidores diferenciados da célula-tronco (por exemplo, inibidores da aldeido-desidrogenase, inibidores da fosfoinositida 3-quinase, inibidor do receptor TGF quinase, inibidor do receptor TGF-B quinase, etc.) podem ser adicionados ao meio de cultura. Alternativamente, as condições de processo tais como a quantidade de oxigênio liberado para o meio de cultura pode ser aumentada ou diminuída para melhorar o crescimento de determinadas células-tronco e/ou moderar ou melhorar a diferenciação das células-tronco.
Como algumas células necessitam de um substrato para crescer, um apoio físico ou estrutura pode ser adicionado à câmara de recipiente de cultura. Em uma modalidade preferida, um apoio contínuo poderia ser adicionado dentro da tubulação como um leito de fibra contínua, constituído por uma fina fibra contínua como estrutura apoio, pode ser adicionada à câmara de recipiente de cultura que poderia deixar as células crescerem em 3 dimensões. Por exemplo, o apoio poderia ser um leito de fibra, que fornece apoio para o crescimento das células tais como células-tronco, células vegetais e outros tipos de células que preferem tal estrutura de apoio, ou não podem crescer em suspensão ou crescem como células coesas, e em algumas condições especificas ou troca de CondigSes7 para processar a selegao natural para mutag5es alvejadas.
Em uma modalidade preferida, um material fibroso conforme descrito em Huang et al., Continuous Production of butanol by Clostridium acetobutylicum immobilized in a fibrous bed reactor, Appl Biochem Biotechnol. 2004 Spring,· 113—116:887—98, aqui incorporado por referencia. A estrutura e 〇 tamanho da tubulagao podem ser tambem variados para evitar a necessidade de incorporagao de uma estrutura de apoio na camara de cultura do recipiente movel. Em uma modalidade preferidaf a tubulagao com um diametro menor e usada de modo que as celulas possam aderir em uma forma ma is natural, ou a tubulagao e usada como um apoio natural sem a necessidade de adesao para algumas celulas coesas.
Esse dispositivo e metodo permitem que pesquisadores e desenvolvedores de produto desenvolvam qualquer linhagem de celulas vivas cultivaveis em suspensao ou qualquer linhagem de celulas vivas cultivaveis que nao estejam em suspensao que cresgam na parede da tubulagao ou em um apoio que poderia ser um leito de fibra na tubulagao atraves do crescimento prolongado (cultura continue)； a celula resuitante melhorada possa constituir uma nova linhagem ou especie. Essas novas celulas podem ser identificadas pelas mutagoes adquiridas durante ο periodo de cultura, e essas mutagoes podem permitir as novas celulas serem distinguidas das caracteristicas genotipicas dos seus ancestrais. Este dispositivo e raetodo permitem ο pesquisador selecionar novas linhagens de qualquer celula viva pela segregagao dos individuos com taxas melhoradas de reprodugao atraves do processo de selegao natural. A invengao tambem fornece um metodo melhorado e completamente distinto e dispositivo para cultura continua de celulas tais como Eucariontes, (por exemplo, leveduras, fungos, celulas vegetais, algas, celulas ariimais ou celulas-tronco) , Procariontes, Archaea e Virus.
Em uma modalidade adicional, um emissor pode ser usado para submeter as celulas, permanentemente ou temporariamente, a pelo menos uma das ondas de radio, ondas de Iuz, raios-X, ondas sonoras, um campο eletromagnetico, um c amp ο radioativo, meio radioativo ou suas combinag;oes. As publicag5es a seguir sao incorporadas por referenda: Biofizika. 2 005 Jul-Aug, 50 (4) : 689-92; Bioelectromagnetics . 2005 Sep, 26(6): 431-9; Chem Commun (Camb) . 2005 Jan 14, (2) :17 4-6; Biophys J. 2005 Feb, 88(2) :1496-9;
Bioelectromagnetics. 1981, 2(3) :285-9; Sb Lek. 1998, 99 (4) : 455-64; Antimicrob Agents Chemother. 2004 Dec, 48 (12) : 4662-4; J Food Prot. 2003 Sep, 66(9) :1712-5; Astrobiology. 2006 Apr, 6(2): 332-47; Life Sci Space Res. 1970, 8:33-8; Adv Space Res. 1995 Mar, 15(3) :211-4; Radiat Res. 2006 May, 165(5) :532-7; Mutagenesis. 2004 Sep, 19(5) :349-54; Cancer Sci· 2006 Jun, 97 (6) :535-9; Appl Environ Microbiol. 2006 May, 72 (5) : 3608-14; e Pol J Micr〇bi〇l. 2005, 54 Suppl:7 —11.
Em uma outra modalidade, a regiao da camara de crescimento do dispositivo poderia ser submetida, permanentemente 〇u temporarlamente, a submissao das celulas a uma forga gravitacional diferente. Por exemplo, as celulas podem crescer em um ambiente de microgravidade. As seguintes publicagoes sao incorporadas por referenda: J Gravit Physiol. 2004 Mar; 11 (1) :75-80; Immunol Rev. 2005 Dec;208:267-80; e J Gravit Physiol. 2004 Jul;11(2) :P181-3.
Modificag5es e varia?5es da presente invengao em relagao ao aparelho e metodo serao 6bvias para aqueles versados na tecnica de que precede uma descrigao detalhada da invengao· Tais modificagoes e variagoes serao intencionadas a entrar no escopo das reivindicagoes anexas.

Claims (55)

1. Dispositivo para crescimento de celulas vivas em uma forma continua caracterizado pelo fato de compreender: uma tubulagao flexivel (1) contendo um meio de cultura e uma superficie em que as celulas vivas podem ereseer em suspensao 〇u em nao suspensao, coesas ou nao, na qual a tubulagao (1) e transparente ou transliicida para medigao da turbidez; um sistema de presilhas (3, 4 r 5) , cada uma capaz de posigoes abertas e fechadas, as presilhas sendo posicionadas de modo a serem capazes de dividir a tubulagao (1) em: i) uma regiao a montante contendo ο meio de cultura nao utilizado (7 ) ,· ii) uma regiao a jusante contendo 〇 meio de cultura gasto (15)； e iii) uma regiao de camara de crescimento (10) para ο crescimento das ditas celulas disposta entre as regioes a montante e a jusante; onde ο sistema de presilhas (3, 4, 5) e construido e disposto para abrir e fechar de forma apertada as presilhas e definir a regiao de camara de crescimento (10) da tubulagao (1) entre as regi5es a montante e a jusante da tubulagao (1) , e para redefinir ciclicamente a regiao de camara de crescimento (10) da tubulagao (1) de modo que uma primeira porgao da regiao de camara de crescimento (10) previamente definida se torne uma porgao da regiao a j usante da tubulagao (1), e uma porgao da regiao a montante previamente definida da tubulagao (1) se torne uma porgao da regiao da camara de crescimento (10) da tubulagao (1); e um turbidimetro (6) ou outro aparelho disposto para medir a densidade 0ptica das celulas vivas no meio de cultura.
2. Dispositivo de acordo com a reivindicagao 1, caracterizado pelo fa to de ο turbidimetro (6) ou outro aparelho ser disposto para operar como parte do sistema de controle de retorno que controla a abertura e fechamento das presilhas·
3. Dispositivo de acordo com uma das reivindica?5es 1-2, caracterizado pelo fa to de a tubulagao (1) , ο meio, a cultura dentro da tubulagao (1), e ο sistema de presilhas (3, 4, 5) serem dispostos para deslocar simultaneamente um com um outro para redefinir de forma ciclica a regiao da camara de crescimento (10) da tubulagao (1).
4. Disp〇sitiv〇 de acordo com uma das reivindicagSes 1_3, caracterizado pelo fato de as presilhas compreenderem uma cadeia ciclica de dentes dispostos para apertar a tubulagao (1) para definir a regiao a montante, a regiao a jusante, e a regiao da camara de crescimento (10).
5. Dispositivo de acordo com uma das reivindicagoes 1 一 4, caracterizado pelo fato de a ο sistema de presilhas (3,4, 5) ser estruturado e disposto de modo que cada uma das presilhas nao se mova em relagao a tubulagao (1) quando a dita presilha estiver na posigao fechada.
6. Dispositivo de acordo com uma das reivindicagoes 1 一5, caracterizado pelo fato de a superficie ser a superficie interna da tubulagao (1).
7. Dispositivo de acordo com uma das reivindicagoes 1 — 5, caracterizado pelo fa to de a superf icie ser um apoio continuo inserido no interior da tubulagao (1).
8. Dispositivo de acordo· com a reivindicagao 7,10 caracterizado pelo fato de a superf icie ser uma f ibra continua.
9. Dispositivo de acordo com uma das reivindicagoes de1一8, caracterizado pelo fato de a tubulagao (1) ser permeavel a gas.
10. Dispositivo de acordo com uma das reivindicagoes de1一8, ‘ caracterizado pelo fato de a tubulagao (1) ser impermeavel a gas.
11. Dispositivo de acordo com uma das reivindicagoes de1-10, caracterizado pelo fato de a tubulagao (1) compreender silicone ou qualquer material flexivel.
12. Dispositivo de acordo com uma das reivindicagoes de1-11, caracterizado pelo fato de 〇 dispositivo compreender ainda um regulador de pressao construido para alterar uma pressao da porgao da camara de crescimento da tubulagao (1) em relagao a pressao ambiente.
13. Dispositivo de acordo com uma das reivindicagoes de1-12, caracterizado pelo fato de a tubulagao (1) compreender um indicador de pH.
14. Dispositivo de acordo com uma das reivindicagSes de1-13, caracterizado pelo fato de compreender ainda um regulador de temperatura construido para permitir 〇 controle de uma temperatura da regiao da camara de crescimento (10) da tubulagao (1)·
15. Dispositivo de acordo com uma das reivindicagoes de1-14, caracterizado pelo fato de compreender ainda um agitador (9) construido para permitir a agitagao da porgao da camara de crescimento da tubulagao (1).
16. Dispositivo de acordo com a reivindicagao 15, caracterizado pelo fato de ο agitador (9) compreender ao menos uma barra de agitagao.
17. Dispositivo de acordo com uma das reivindicagoes de 1 — 16, caracterizado pelo fato de compreender ainda um emissor construido para submeter a regiao da camara de crescimento a pelo menos uma das ondas de radio, ondas de Iuz, raios-Xr ondas sonoras, um campο eletromagnetico, e um campο radioativo.
18. Dispositivo de acordo com uma das reivindicagoes de 1-17 f caracterizado pelo fato de compreender ainda meios para submeter a regiao da camara de crescimento (10) a uma forga gravitacional diferente.
19. Dispositivo de acordo com uma das reivindicagoes de 1 — 18, caracterizado pelo fa to de a turbidez ser medida dentro da tubulagao (1) ·
20. Dispositivo de acordo com uma das reivindicagoes de 1-19, caracterizado pelo fato de as ditas presilhas compreenderem uma ou ma is cadeias de rmiltiplos dentes deslocados simultaneamente.
21. Dispositivo de acordo com uma das reivindicagoes de 1-2 0, caracterizado pelo fato de as ditas presilhas compreenderem um sistema feito de dois dentes que apertam a tubulagao (1) numa forma empilhada, evitando a contaminagao entre as regioes (Gf H) da tubulagao (1) pela precisao da interface entre 〇s dentes.
22. Dispositivo de acordo com a reivindicagao 13, caracterizado pelo fato de compreender ainda um indicador de pH na composigao ou linha da tubulagao (1) para permitir a medigao de pH do meio.
23. Dispositivo de acordo com uma das reivindicag5es de 1-22, caracterizado pelo fato de compreender ainda um mecanismo de inclinagao para inclinar a tubulagao (1) da camera de crescimento para baixo para remover as celulas agregadas, ou para cima para remover ο ar.
24. Dispositivo de acordo com a reivindicagao 1, caracterizado pelo fato de ο dito dispositivo permitir a cultura continua de celulas, na qual as celulas sao eucariontes, pr〇cari〇ntes, Archaea7 ou virus, e onde as ditas celulas nao ere seem em suspensao no meio ou nao crescent em suspensao na tubulagao (1).
25 · Dispositivo de acordo com uma das reivinciicagoes de 1 一 24, caracterizado pelo fato de 〇 dito dispositivo permitir a culture continua das celulas, onde as celulas sa〇 eucari〇ntes, procariontes, Archaea, ou virus, e onde as celulas crescem como celulas coesas·
26. Dispositivo de acordo com uma das reivindicagoes de 1 — 25, caracterizado pelo fato de a regiao da camara de crescimento (10) compreender uma ou ma is camara s de crescimento contendo ο meio de cultura.
27. Metodo para crescimento de celulas em uma forma continuaf caracterizado pelo fato de compreender: a) fornecimento de uma tubulagao (1) flexivel, transparente ou transliicida contendo meio de cultura, e uma superficie na qual as celulas vivas podem crescer na dita tubulagao (1) , e um sistema de presilhas (3, 4, 5) , cada uma das presilhas sendo capaz de p〇sigoes abertas e fechadas, as presilhas sendo posicionadas para serem capazes de dividir a tubulagao (1) em: i) uma regiao a montante contendo meio de cultura nao utilizado (7)； ii) uma regiao a j us ante contendo meio de cultura gasto (15)； e iii) uma região de câmara de crescimento (10) para crescer as ditas células dispostas entre as regiões a montante e a jusante; b) medição da turbidez dentro da tubulação com um turbidimetro (6) ou outro aparelho que mede a turbidez; c) fechamento em uma das presilhas selecionado na tubulação (1) para definir a região da câmara de crescimento (10) da tubulação (1) entre as regiões a montante e a jusante da tubulação (1), e introdução de células viáveis na região da câmara de crescimento (10); d) monitoramento da turbidez do meio de cultura crescido e quando a medida da turbidez correspondente a um crescimento desejado da cultura for obtida fechando e abrindo uma das presilhas selecionadas para redefinir a região da câmara de crescimento (10) da tubulação (1) de modo que uma primeira porção da região da câmara de crescimento (10) previamente definida se torna uma porção da região a jusante da tubulação (1), e uma porção da região a montante previamente definida da tubulação (1) se torna uma porção da região da câmara de crescimento (10) da tubulação (1); e e) repetir a etapa d) até que uma quantidade suficiente de células tenha crescido.
28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de o turbidimetro (6) ser disposto para operar como patê de um sistema de controle de retorno que controla a abertura e fechamento das presilhas.
29. Método de acordo com uma das reivindicações 27-28, caracterizado pelo fato de a tubulação (1) , o meio, a cultura dentro da tubulação (1), e o sistema de presilhas (3, 4, 5) serem dispostos para se deslocarem simultaneamente um com o outro para redefinir de forma cíclica a região da câmara de crescimento (10) da tubulação (1) -
30. Método de acordo com uma das reivindicações 27-29, caracterizado pelo fato de as presilhas compreenderem uma cadeia cíclica de dentes dispostos para apertarem a tubulação (1) para definir a região a montante, a região a jusante, e a região da câmara de crescimento (10).
31. Método de acordo com uma das reivindicações 27-30, caracterizado pelo fato de compreender ainda o isolamento de algumas células vivas do dito meio de cultura da região a jusante.
32. Método de acordo com uma das reivindicações 27-31, caracterizado pelo fato de compreender ainda o isolamento das ditas células vivas da região a jusante.
33. Método de acordo com uma das reivindicações de 27- 32, caracterizado pelo fato de as células vivas serem selecionadas a partir de um grupo que consiste de algas, fungos, células de leveduras, células animais, células vegetais e células-tronco.
34. Método de acordo com uma das reivindicações 27-32, caracterizado pelo fato de as células vivas serem células- tronco.
35. Método de acordo com uma das reivindicações 27-32, caracterizado pelo fato de as células vivas serem selecionadas do grupo consistindo de células-tronco hematopoiéticas, células-tronco da medula óssea, células estromais, astrócitos, oligodendrócitos, células-tronco embrionárias, células-tronco fetais, células-tronco do cordão umbilical, células-tronco derivadas da placenta, e células-tronco adultas.
36. Método de acordo com uma das reivindicações de 27-35, caracterizado pelo fato de a superfície na qual as células crescem ser a superfície interna da tubulação (1).
37. Método de acordo com uma das reivindicações de 27-35, caracterizado pelo fato de a superfície na qual as células crescem ser uma fibra contínua.
38. Método de acordo com uma das reivindicações de 27-37, caracterizado pelo fato de a turbidez ser medida dentro da tubulação (1) .
39. Método de acordo com uma das reivindicações de 27-38, caracterizado pelo fato de compreender ainda o crescimento de um ou mais tipos de células na região da câmara de crescimento (10).
40. Método de acordo com uma das reivindicações de 27-39, caracterizado pelo fato de a tubulação (1) ser permeável a gás.
41. Método de acordo com uma das reivindicações de 27-4 0, caracterizado pelo fato de a tubulação (1) ser impermeável a gás.
42. Método de acordo com uma das reivindicações de 27-41, caracterizado pelo fato de compreender ainda a regulação da pressão na porção da câmara de crescimento da tubulação (1) em relação à pressão ambiente.
43. Método de acordo com uma das reivindicações de 27-42, caracterizado pelo fato de compreender ainda a medição de um pH do meio de cultura na região da câmara de crescimento (10).
44. Método de acordo com uma das reivindicações de 27-43, caracterizado pelo fato de compreender ainda a regulação da temperatura da região da câmara de crescimento (10) com um regulador de temperatura construído para controlar a temperatura da região da câmara de crescimento (10) da tubulação (1).
45. Método de acordo com uma das reivindicações de 27-44, caracterizado pelo fato de compreender ainda a agitação do meio de cultura na região da câmara de crescimento (10) com um agitador (9).
46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de o agitador (9) compreender pelo menos uma barra de agitação.
47. Método de acordo com uma das reivindicações de 27-4 6, caracterizado pelo fato de compreender ainda a submissão da região da camada de cultura de crescimento a pelo menos uma das ondas de rádio, ondas de luz, raios-X, ondas sonoras, um campo eletromagnético, e um campo radioativo.
48. Método de acordo com uma das reivindicações de 27-47, caracterizado pelo fato de compreender ainda a submissão da região da câmara de crescimento (10) a uma força gravitacional diferente.
49. Método de acordo com uma das reivindicações 27-48, caracterizado pelo fato de as células não crescerem em suspensão.
50. Método de acordo com uma das reivindicações 27-49, caracterizado pelo fato de as células crescerem como células coesas.
51. Método de acordo com uma das reivindicações 27-50, caracterizado pelo fato de compreender ainda o crescimento das células vivas em uma ou mais câmaras de crescimento que estão presentes na região da câmara de crescimento (10).
52. Método de acordo com uma das reivindicações 27-51, caracterizado pelo fato de compreender ainda o crescimento das células vivas numa primeira câmara de crescimento e numa segunda câmara de crescimento com a mesma ou diferente condição.
53. Método de acordo com uma das reivindicações 27-52, caracterizado pelo fato de a etapa d) permitir a diluição fornecendo certa quantidade de meio fresco da região a montante dentro da câmara de crescimento enquanto uma quantidade igual de cultura é isolada e removida da câmara de crescimento para a região a jusante, através de outra extremidade da dita câmara de crescimento.
54. Método de acordo com uma das reivindicações 27-52, caracterizado pelo fato de a etapa d) compreender ainda o deslocamento da tubulação (1) entre cada ciclo crescido de modo que a região da câmara de crescimento seja renovada junto com a introdução do meio de cultura não cultivado (7), prevenindo, assim, uma possível proliferação de uma população resistente à diluição enquanto evita contaminação possível da câmara de crescimento isolada.
55. Método de acordo com uma das reivindicações 27-54, caracterizado pelo fato de compreender ainda o crescimento das células sob condições que favoreçam a seleção natural das células vivas de modo que as células vivas exibam uma taxa de reprodução aumentada e/ou propriedades metabólicas específicas.
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