NO344489B1

NO344489B1 - Kontinuerlig dyrkingsanordning med bevegelig beholder og tilvirking av en dyrking på en kontinuerlig måte

Info

Publication number: NO344489B1
Application number: NO20090953A
Authority: NO
Inventors: Eudes De Crecy
Original assignee: Eudes De Crecy
Priority date: 2006-07-28
Filing date: 2009-03-02
Publication date: 2020-01-13
Also published as: CA2658126A1; JP2013135692A; AU2007277105A1; JP2009544323A; NZ597527A; JP6154439B2; WO2008013967A3; CA2658126C; IL196620A0; JP2015213515A; US20150056644A1; KR20090050060A; CN103725611A; US9428734B2; US20120184009A1; WO2008013967A2; BRPI0714707A2; BRPI0714707B1; NO20090953L; RU2009107209A

Description

Område for oppfinnelsen

Den omtalte oppfinnelsen skaffer tilveie en fremgangsmåte og en anordning som tillater utvelgelse av levende celler med økte rater av reproduksjon og spesielle metabolske egenskaper i en væske eller et halvfast medium. For prosessen med utvelgelse (tilpasningsegnet utvikling) oppstår genetiske variantorganismer (mutanter) i en populasjon og konkurrerer med andre varianter av den samme opprinnelsen. De med den hurtigste raten for reproduksjon øker i innbyrdes proporsjon over tid, noe som fører til en populasjon (og individuelle organismer) med økt reproduktiv rate. Denne prosessen kan forbedre ytelsen til organismer brukt i industrielle prosesser eller akademiske formål. Den foreliggende oppfinnelse benytter en kontinuerlig dyrkingsanordning for å oppnå den levedyktige tilvirkningen av levende celler (f.eks. prokaryoter, arkaea, virus, eukaryoter, sopp, alger, gjær, planteceller, dyreceller og stamceller). Den foreliggende oppfinnelse kan brukes for å tilvirke en aktiv ingrediens eller et biologisk stoff som er tilvirket av de levende cellene. Den aktive ingrediensen eller det biologiske stoffet kan i sin tur brukes som et diagnostisk, preventivt eller terapeutisk middel.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Dokument JP H0330665A beskriver en automatisk subkultiveringsanordning for mikroskopiske organismer eller celler som omfatter et fleksibelt rør hvor dyrkningsmedium er fylt og mange klemmer som kan stramme eller løsne røret og som forskyves langs det for å skape et nytt vekstkammer.

Dokument WO 9409895 A beskriver et reaktorsystem som egner seg spesielt for en modell av en gastrointestinal kanal, som omfatter minst en enhet bestående av to eller flere trykkamre. Hvert av trykkamrene omfatter en slange laget av fleksibel materiale og som er åpen i begge ender. Slangene er festet med sine ender forseglet på en slik måte at mellomrommene mellom veggen til trykkamrene og slangene er lukket. Forbindelsesanordninger er også til stede for tilførsel av en gass eller væske til og uttapping av den fra mellomrommene mellom veggen til trykkamrene og slangene. Koblingsmidler er tilstede for å kople trykkamrene til hverandre og/eller til endedeler eller mellomdeler.

Dokument CH 552063A beskriver en anordning for dyrking av rene bakteriekulturer, som innbefatter et rør sveiset i begge ender som inneholder et flytende næringsmedium og en ampulle inneholdende sterile lyofiliserte bakteriestammer. Røret er delt inn i celler med klemmer. En første celle inneholder ampullen, som brytes for å begynne dyrkningen, og videre dyrkning utføres i de andre cellene.

Utvelgelse for økt reproduktiv rate (egnethet) krever uavbrutt vekst som er oppnådd gjennom regelmessig fortynning av en voksende dyrking. I den tidligere kjente teknikken er dette blitt utført på tre måter: fast dyrking, seriell fortynning og kontinuerlig dyrking, som skiller seg primært i graden av fortynning.

Fast dyrking innebærer repeterende overføring av en liten mengde med vokst dyrking eller celler fra en petriskål til en beholder med friskt vekstmedium. Seriell dyrking innebærer repeterende overføring av en liten mengde med vokst dyrking til et meget større kar som inneholder friskt vekstmedium. Når de dyrkede cellene har vokst til metning i det nye karet, repeteres prosessen. Denne måten er blitt brukt for å oppnå de lengste demonstrasjonene av mettet dyrking i litteraturen (Lenski & Travisano:

Dynamics of adaptation and diversification: a 10.000-generation experiment with bacterial populations.1994. Proc Natl Acad Sci USA.15:6808-14), i hvilke eksperimenter det var klart demonstrert konsistent forbedring i reproduktiv rate over en periode på år. Denne prosessen gjøres vanligvis manuelt med betraktelig arbeidsinvestering og er utsatt for forurensning gjennom eksponering mot det utvendige miljøet. Seriell dyrking er likeså ineffektiv, slik som omtalt i det følgende avsnittet.

Raten for utvelgelse, eller raten for forbedring i reproduktiv rate, er avhengig av populasjonsstørrelse (Fisher: The Genitical theory of Natural Selection.1930. Oxford University press, London, UK). Enn videre er i en situasjon liknende seriell overføring der populasjonsstørrelse veksler hurtig, utvelgelse proporsjonal med den harmoniske middelverdien (Ñ) til populasjonen (Wright: Size of population and breeding structure in relation to evolution. 1938. Science 87: 430-431), og kan følgelig tilnærmes av den minste populasjonen i løpet av syklusen.

Populasjonsstørrelse kan opprettholdes, og utvelgelse gjøres derfor mer effektiv gjennom kontinuerlig dyrking. Kontinuerlig dyrking innebærer, slik som skjelnet fra seriell fortynning, mindre innbyrdes volum, slik at et lite parti av en voksende dyrking regelmessig erstattes av en lik mengde av friskt vekstmedium. Denne prosessen maksimerer den effektive populasjonsstørrelsen ved økning av dens minimumsstørrelse i løpet av syklisk fortynning. Innretninger som tillater kontinuerlig dyrking betegnes:

”chemostater” dersom fortynninger skjer ved spesifiserte tidsintervaller, og ”turbidostater” dersom fortynning skjer automatisk når dyrkingen vokser til en spesifikk densitet.

For enkelhets skyld vil begge typer av innretninger heretter grupperes under uttrykket ”chemostat”. Chemostater var oppfunnet samtidig av to grupper på 1950-tallet (Novick & Szilard: Description of the chemostat. 1950. Science 112: 715-716) og (Monod: La technique de la culture continue - Théorie et applications. 1950. Ann. Inst. Pasteur 79:390-410). Chemostater er blitt brukt for å demonstrere korte perioder med hurtig forbedring i reproduktiv rate (Dykhuizen DE. Chemostats used for studying natural selection and adaptive evolution.1993. Methods Enzymol. 224:613-31).

Tradisjonelle chemostater er ute av stand til å opprettholde lange perioder av utvelgelse for økt reproduksjonsrate på grunn av den utilsiktede utvelgelsen av fortynningsbestandige (statiske) varianter. Disse variantene er i stand til å motstå fortynning ved klebing til overflaten av chemostaten og utkjemper ved å gjøre således mindre klebende individer, innbefattende de som har høyere reproduktive rater, noe som således er til hinder for det tiltenkte formålet av innretningen (Chao & Ramsdell: The effects of wall populations on coexistence of bacteria in the liquid phase of chemostat cultures.1985. J. Gen. Microbiol.131: 1229-36).

En metode og chemostatisk innretning (den genetiske motoren) er blitt oppfunnet for å unngå fortynningsbestandighet i kontinuerlig dyrking (patent US 6.686.194-B1, innlevert av PASTEUR INSTITUT [FR] & MUTZEL RUPERT [DE]. Denne metoden bruker ventilstyrt fluidoverføring for periodisk å bevege den voksende dyrkingen mellom to chemostater, noe som tillater at hver steriliseres og renses mellom perioder av aktiv dyrkingvekst. De regelmessige sterilisasjonssyklusene forhindrer utvelgelse av fortynningsbestandige varianter ved ødeleggelse av dem. Denne metoden og innretningen oppnår formålet, men krever uavhengige kompliserte håndteringer av atskillige fluider innenfor et sterilt (forseglet) miljø, innbefattende en (NaOH) som både er svært kaustisk og eventuelt meget reaktiv, noe som hurtig ødelegger ventiler samt presenterer problemer med forurensning og avfallsavhending. Chemostatinnretningen er likeså begrenset ved at ingen tildannelser er gjort for å bevirke en understøttelse for celler og gro på. Innretninger, så som den genetiske motoren, og annen kjent teknologi, tillater ikke den kontinuerlige dyrkingen av celler som ikke gror i suspensjon og/eller gror som kohesive celler.

Det finnes noen typer av celler som er vanskelige å dyrke i store mengder på grunn av tilstanden cellene krever for å overleve og vokse. Det er antatt at disse cellene kunne vokse i tilstander besørget med en kontinuerlig dyrkingstilnærming. Dette er spesielt tilfellet for eukaryoter (f.eks. alger, gjær, sopp, planteceller, dyreceller og stamceller).

Det følgende avsnittet, som vedrører menneskeembryostamceller, er tatt med kun for referansehensikt og er ikke en del av oppfinnelsen: For eksempel er menneskeembryostamceller typisk produsert ved isolering og overføring av en stamcellemasse til en plastlaboratoriedyrkingsskål som inneholder en næringsbuljong kjent som dyrkingsmedium. Cellene deler og sprer seg over overflaten av skålen. Den indre overflaten av dyrkingsskålen er typisk belagt med museembryohudceller som er blitt behandlet således at de ikke vil dele seg. Dette belegningslaget av celler er betegnet et matelag. Begrunnelsen for å ha matelaget i bunnen av dyrkingsskålen er for å gi menneskeembryostamcellene en klebrig overflate, til hvilken de kan sette seg fast. Likeså frigir matecellene næringsstoffer inn i dyrkingsmediet. Nylig har vitenskapsfolk begynt å tenke ut måter for produsering av embryostamceller uten musematecellene. Dette er et betydelig vitenskapelig fremskritt fordi det unngår faren at virus eller andre makromolekyler i musecellene kan overføres til menneskecellene.

Over forløpet av atskillige dager formerer cellene i den indre cellemassen seg og begynner å flokke seg på dyrkingsskålen. Når dette skjer fjernes de forsiktig og settes på plate i atskillige friske dyrkingsskåler. Prosessen med ny setting på plate av cellene gjentas mange ganger og i mange måneder og betegnes subdyrking. Hver syklus med subdyrking av cellene betegnes som en passasje. Etter seks måneder eller mer leverer de opprinnelige cellene av cellemassen millioner av embryostamceller. Embryostamceller som har formert seg i celledyrking i seks eller flere måneder er flerpotente og synes genetisk normale, betegnes som en embryostamcellelinje.

Så snart cellelinjer er opprettet, eller endog før dette trinnet, kan batcher av disse fryses og forsendes til andre laboratorier for ytterligere dyrking og eksperimentering. Kontinuerlig dyrking gir imidlertid fordelen med demping av et maksimum av håndteringer som påkjenner de levende cellene og frembringer en potensiell kilde for forurensning. Når en dyrking er startet, tillater kontinuerlige dyrkingstilstander at den erfarne fagpersonen trekker fordel av en kontinuerlig produksjon av celler. Så snart stamceller er produsert, kunne produksjonen av stamceller fortsette uten avbrytelse for å frembringe betydelig flere stamceller enn metoder som typisk brukes i dag.

Sammenfatning av oppfinnelsen

Det er derfor et formål med den foreliggende oppfinnelse å skaffe tilveie en forbedret (og fullstendig uavhengig) fremgangsmåte og anordning for kontinuerlig dyrking av celler (som innbefatter prokaryoter, bakterier, arkaea, eukaryoter og virus) uten påvirkning av fortynningsbestandige varianter. Liknende andre chemostater tildanner anordningen et middel for regelmessig fortynning av en vokst dyrking med friskt vekstmedium, et middel for gassutveksling mellom dyrkingen og det utvendige miljøet, Sterilitet og automatisk drift, slik som enten en chemostat eller en turbidostat.

Følgelig er det et formål med oppfinnelsen å skaffe tilveie en forbedret og særskilt fremgangsmåte og anordning for kontinuerlig dyrking av celler som ikke vokser i suspensjon, eller som vokser som kohesive celler, så som eukaryoter (f.eks. planteceller, alger, sopp, gjær, dyreceller eller stamceller), og visse prokaryoter (f.eks. streptomyceter) og eventuelt noen arkaea og virus. Stamceller som kan dyrkes med den foreliggende oppfinnelse innbefatter, men er ikke begrenset til, embryostamceller, fosterstamceller, navlestrengstamceller, placentaavledede stamceller og voksenstamceller.

Voksenstamcellene som kan dyrkes med den foreliggende oppfinnelse innbefatter, men er ikke begrenset til hematopoiestamceller, beinmargsstamceller, stromalceller, astrocytter og oligidendrrocytter (f.eks. hematopoietie stamcelleprotokoller av C. Klug og C. Jordan, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2002).

Den foreliggende oppfinnelse er utformet for å oppnå disse målene uten hvilken som helst fluidoverføring, innbefattende sterilisasjons- eller rensingsfunksjoner. Dette utgjør en spesiell fordel for den foreliggende oppfinnelsen med hensyn til tidligere kjent teknikk så langt som den unngår farene og vanskelighetene knyttet til sterilisasjon og rensing, innbefattende inneslutning og kompliserte fluidoverføringer som involverer kaustiske løsemidler, forurensning og forstyrrelsen av vekst på grunn av overføringen av dyrkingen fra et kar til et annet.

Kontinuerlig dyrking er oppnådd inne i et bøyelig, sterilt rør fylt med vekstmedium. Mediet og kammeroverflaten er statiske med hensyn til hverandre, og begge er regelmessig og samtidig byttet ut ved peristaltisk bevegelse av rørledningen gjennom ”porter” eller punkter, ved hvilke røret er sterilt oppdelt med klemmer som forhindrer at de dyrkede cellene beveger seg mellomområder av røret. UV-porter kan likeså (valgfritt) tilføyes oppstrøms eller nedstrøms for dyrkingskaret for ytterligere sikkerhet.

I et aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en anordning for produksjon av levende celler som ikke er i suspensjon på en kontinuerlig måte, kjennetegnet ved at anordningen omfatter:

en bøyelig rørledning som inneholder dyrkingsmedium og en overflate, på hvilken de levende cellene kan vokse, og at rørledningen er gjennomsiktig eller gjennomskinnelig for å måle turbiditet;

et system av porter utført ved klemmer, hver i stand til åpne og lukkede posisjoner, hvori systemet med porter oppdeler rørledningen i:

i) et oppstrømsområde som inneholder ubrukt dyrkingsmedium og en ubrukt overflate på hvilken nevnte celler kan vokse;

ii) et nedstrømsområde som inneholder brukt dyrkingsmedium; og iii) et vekstkammerområde for produksjon av cellene anbrakt mellom oppstrøms- og nedstrømsområder;

og at systemet av porter er konstruert og anordnet for å åpne og lukke seg for å klemme av og definere vekstkammerområdet av rørledningen mellom oppstrøms- og nedstrømsområder av rørledningen, og for syklisk å gjendefinere vekstkammerområdet av rørledningen, slik at et første parti av det tidligere definerte vekstkammerområdet blir et parti av nedstrømsområdet av rørledningen, og et parti av det tidligere definerte oppstrømsområdet av rørledningen blir et parti av vekstkammerområdet av rørledningen og tilveiebringer overflaten for videre vekst av nevnte celler; og

et turbidimeter eller et annet apparat anordnet for å måle optisk densitet av de levende cellene i dyrkingsmediet,

hvori de lukkede portene som definerer vekstkammerområdet, portområdet av rørledningen som utgjør vekstkammerområdet, mediet og dyrkingen inne i vekstkammerområdet er bevegelige sammen gjennom en samtidig bevegelse av systemet av porter slik at hver av portene ikke beveger seg med hensyn til rørledningen når porten er i en lukket posisjon, og hvori nevnte celler ikke vokser i suspensjon.

I et ytterligere aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for produksjon av celler som ikke er i suspensjon på en kontinuerlig måte, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter:

a) anvendelse av anordningen som angitt ifølge oppfinnelsen;

b) måling av turbiditeten til dyrkingsmediet med et turbidimeter eller et annet apparat som måler turbiditet;

c) lukking av de utvalgte av portene på rørledningen for å definere vekstkammerområdet av rørledningen mellom oppstrøms- og nedstrømsområdene av rørledningen og innføring av levedyktige celler i vekstkammerområdet;

d) overvåkning av turbiditet i vekstdyrkingsmediet og når en turbiditetsmåling svarer til en ønsket vekst av dyrkingen er oppnådd lukking og åpning av de utvalgte av portene for å gjendefinere vekstkammerområdet av rørledningen, slik at et første parti av det tidligere definerte vekstkammerområdet blir et parti av nedstrømsområdet av rørledningen, og et parti av det tidligere definerte oppstrømsområdet av rørledningen blir et parti av vekstkammerområdet av rørledningen og tilveiebringer overflate for videre vekst av cellene; og e) gjentakelse av trinn d) inntil en tilstrekkelig mengde av celler har vokst, hvori de lukkede portene som definerer vekstkammerområdet, portområdet av rørledningen som utgjør vekstkammerområdet, mediet og dyrkingen inne i vekstkammerområdet beveger seg sammen gjennom en samtidig bevegelse av systemet av porter slik at hver av portene ikke beveger seg med hensyn til rørledningen når porten er i en lukket posisjon, og hvori cellene ikke vokser i suspensjon.

Den foreliggende oppfinnelses fremgangsmåte og anordning er likeså en forbedring med hensyn til tidligere kjent teknikk i det omfang de kontinuerlig, snarere enn periodisk, velger mot hefting av fortynningsbestandige varianter til chemostatoverflatene, ettersom utbytting av de påvirkede overflatene skjer parallelt med prosessen for fortynning. Likeså for celler som vokser i suspensjon, og celler som vokser som kohesive celler, gir rørledningen en kontinuerlig understøttelse for vekst med fordelen uten forstyrrelse av cellene ved overføring av cellene fra karet til et annet kar.

Røret er oppdelt på en transient måte, slik at det finnes områder som inneholder mettet (vokst) dyrking, områder som inneholder friskt medium, og et område mellom disse to, idet ett eller flere kamre betegnes som vekst- eller dyrkingskamre er tilstede for å tilforme et vekstkammerområde, i hvilket vokst dyrking er blandet med friskt medium for å oppnå fortynning. Portene er periodisk frigitt fra ett punkt på røret og erstattet ved et annet punkt, slik at vokst dyrking sammen med dets tilknyttede vekstkammeroverflate og tilknyttede statiske celler er flyttet ved isolasjon fra vekstkammeret og erstattet av både friskt medium og frisk kammeroverflate.

Kortfattet omtale av tegningene

Uten å være uttømmende og begrensende vil én mulig generell konfigurasjon innbefatte atskillige komponenter, slik som omtalt her senere. I det etterfølgende er den foreliggende oppfinnelse eksempelvis forklart på grunnlag av en foretrukket utførelse, for derved å henvise til tegningene, i hvilke:

Figur 1 viser et samlet riss av en mulig konfigurasjon av anordningen, i hvilken: 1 representerer den bøyelige rørledningen som inneholder de ulike områdene av anordningen, og som er: oppstrøms friskt medium 7, vekstkammer 10, prøvekammer 11 og avhendet vokst dyrkingsområde 15

2 utgjør den termostatisk styrte kassen som tillater regulering av temperatur i samsvar med tilstander bestemt av en bruker, og i hvilket det kan lokaliseres:

a. vekstkammeret 10,

b. prøvekammeret 11,

c. en oppstrøms port 3 som definerer begynnelsen av vekstkammeret 10, d. en nedstrøms port 4 som definerer slutten av vekstkammeret 10 og begynnelsen av prøvekammeret 11

e. en andre nedstrøms port 5 som definerer enden av prøvekammeret 11, f. et turbidimeter 6 som tillater brukeren eller et automatisk styresystem å overvåke optisk densitet av voksende dyrking og for å betjene et tilbakemeldingsstyresystem 13 som tillater styrt bevegelse av rørledningen 1 på grunnlaget av dyrkingsdensitet (turbidostatfunksjon),

g. en eller flere agitatorer 9.

Det bør legges merke til at anordningselementene opplistet i a-g likeså kan lokaliseres utenfor eller i fraværet av en termostatisk styrt kasse.

7 utgjør det friske mediet i en ubrukt bøyelig rørledning,

8 utgjør en tønne lastet med fersk mediumsfylt rørledning for å utlevere det ferske mediet og rørledningen under drift.

12 representerer valgfrie ultrafiolette strålingsporter,

13 representerer styresystemet som kan bestå av en computer koplet med midler for kommunikasjon med ulike overvåknings- eller betjeningsgrensesnitt, liknende optiske densitetsturbidimålere, temperaturmålings- og reguleringsinnretninger, agitatorer og vippemotorer etc., som tillater automatisering og styring av drift,

14 representerer den valgfrie avhendingstønnen på hvilken det vikles opp en rørledning som inneholder avhendet vokst dyrkingsfylt rørledning,

15 representerer avhendet vokst dyrking lokalisert nedstrøms for prøvekammeret.

Figur 2 viser to mulige posisjoner av anordningen, og som eksemplifiserer faktumet at den termisk styrte kassen 2 og andre stykker av anordningen knyttet til dyrkingskammeret kan vippes til ulik grad for rørformål, gassirkulasjons- og fjerningsformål og formål for sikring av fjerningen av granulerte (rørte) celler som kunne unnslippe fortynning ved avsetting på bunnen. Anordningen kunne likeså stå i den samme posisjonen (f.eks. flat posisjon eller med en vinkel) i tilfellet at cellene ikke trenger røring for vekst.

Figur 3 til 9 utgjør den bøyelige rørledningen 1 på plass i den termisk styrte kassen 2 og innført gjennom portene 3, 4 og 5, gjennom hvilke rørledningen vil forbli under alle trinn av prosessen, og gjennom hvilke rørledningen vil bevege seg i samsvar med den peristaltiske bevegelse.

Figur 3 symboliserer status T0 av anordningen i hvilken alle områder av den bøyelige rørledningen er fylt med friskt medium før injeksjon av cellen tiltenkt for kontinuerlig dyrking.

Figur 4 symboliserer status T1 av den bøyelige rørledningen like etter injeksjon av cellestamme.

Figur 5 symboliserer status T2 av anordningen, og som er en vekstperiode i løpet av hvilken dyrkingen vokser i området avgrenset som vekstkammeret 10 begrenset av slusene 3 og 4.

Figur 6 symboliserer status T3 av anordningen like etter den første peristaltiske bevegelsen av rørledningen og det tilknyttede mediet, og som bestemmer begynnelsen av den andre vekstsyklusen, noe som introduserer frisk rørledning og medium gjennom bevegelse av porten 3 samtidig med en overføring av et ekvivalent volum av rørledning, medium og vokst dyrking ut av vekstkammerområdet 10 og inn i prøvekammerområdet 11 ved bevegelse av porten 4. Det er kritisk å anerkjenne at rørledningen, mediet som er inne i rørledningen, og hvilken som helst dyrking som har vokst i dette mediet, alle beveger seg sammen. Fluidoverføring kan skje i det omfang friskt medium og vokst dyrking blander seg sammen gjennom røring inne i vekstkammerområdet.

Figur 7 symboliserer status T4 av anordningen, og som er den andre voksesyklusen; i løpet av denne syklusen kan celler som forblir i vekstkammeret etter en peristaltisk bevegelse av rørledningen nå vokse ved bruk av næringsstoffer levert i det friske mediet og som er blandet med den resterende dyrkingen under dette trinnet.

Figur 8 symboliserer status T5 av anordningen like etter den andre peristaltiske bevegelsen av rørledningen, samt det opptatte mediet, og som bestemmer begynnelsen av den tredje voksesyklusen, og som introduserer den ferske rørledningen og mediet gjennom bevegelse av porten 3 samtidig med en overføring av en ekvivalent mengde av rørledning, medium og vokst dyrking ut av vekstkammerområdet 10 og inn i prøvekammerområdet 11 ved bevegelse av porten 4.

Figur 9 symboliserer status T6 av anordningen, og som er den tredje voksesyklusen; dette trinnet er ekvivalent med status T4 og angir den gjentakende beskaffenheten av ytterligere prosedyrer. Prøver av valgte celler kan fjernes ved hvilket som helst tidspunkt fra prøvekammerområdet 11 ved bruk av en sprøyte eller en annen gjenhenteinnretning.

Figur 10 viser en mulig profil av tenner som bestemmer en port i konfigurasjonen som består av to stablingstenner, som sammentrykker den bøyelige rørledningen. Portene kunne likeså bestemmes av enkeltvise tenner som presser mot et bevegelig bånd, fjernbare klemmer eller andre mekanismer som forhindrer bevegelse av celler gjennom porten, og som vekslende kan plasseres og fjernes i variable posisjoner langs rørledningen.

Detaljert omtale av oppfinnelsen

Den grunnleggende driften for anordningen er skildret på figur 3 til 9.

En mulig konfigurasjon for den foreliggende anordning er vist på figur 1, slik som den kommer til syne etter å ha blitt lastet med et friskt rør av sterilt medium (vist oppdelt i områder A-H av portene 3, 4 og 5).

Inokulering av anordningen med den valgte cellen kunne oppnås ved introduksjon av cellen i vekstkammeret (fig.3) gjennom injeksjon (figur 4, område B). Dyrkingen kunne deretter tillates for å vokse til den ønskede densiteten og en kontinuerlig dyrking ville begynne (fig.5).

En kontinuerlig dyrking ville gå fremover med gjentakende bevegelser av portområdene på rørledningen. Dette innebærer samtidige bevegelser av portene, rørledningen, mediet og hvilken som helst dyrking inne i rørledningen. Rørledningen ville alltid bevege seg i den samme retningen; den ubrukte rørledningen som inneholder friskt medium (og heretter sagt å være ”oppstrøms” for vekstkammeret 7) vil bevege seg inn i vekstkammeret og blande seg med dyrkingen som forblir der, noe som tildanner substratet for ytterligere vekst av cellene opptatt der. Før en introduksjon i vekstkammerområdet vil dette mediet og dets tilknyttede rørledning opprettholdes i en steril tilstand ved en atskillelse fra vekstkammeret med oppstrømsporten 3. Brukt rørledning som inneholder vokst dyrking vil samtidig beveges ”nedstrøms” og skilles fra vekstkammeret av nedstrømsporten 4.

Når ett eller flere vekstkamre er tilstede kan vekstkamrene brukes for det samme eller avvikende formål. For eksempel kunne levende celler produseres i et første vekstkammer og et andre vekstkammer med den samme eller avvikende tilstander. I en utførelse kan det første vekstkammeret brukes for å produsere celler, og det andre vekstkammeret kan da brukes for å behandle de levende cellene under forskjellige tilstander. Cellene kan for eksempel behandles for å foranledige inntrykket av et ønsket produkt. Komponenter eller tilsetningsstoffer til selve dyrkingsmediet kan tilsettes før eller etter dyrkingen begynner. For eksempel kunne alle komponenter eller tilsetningsstoffer inkluderes i mediet før en begynnelse av dyrkingen, eller komponenter kan injiseres inn i ett eller flere av vekstkamrene etter at dyrkingen er blitt innledet.

Portkonfigurasjonen er ikke et spesielt punkt for den foreliggende oppfinnelsen. I en gitt konfigurasjon kan portene utformes for eksempel gjennom en kjede av mangfoldige tenner samtidig beveget eller i en annen konfigurasjon skilt i atskilte synkroniserte kjeder, slik som skildret på figur 1. Portene kan bestå av et system utført av to tenner som sammenklemmer rørledningen på en stablende måte, slik som omtalt på figur 10, noe som forhindrer forurensning mellom områdene G og H av rørledningen gjennom nøyaktigheten til grenseflaten mellom tennene. I en annen konfigurasjon kan sterile porter oppnås ved pressing av én tann mot én side av rørledningen og derved pressing av rørledningen stramt mot et fast understell, langs hvilket rørledningen glis under dens peristaltiske bevegelse, slik som skissert på figur 3 til 9, med henvisningstall 3, 4 ot 5. I enda en annen konfigurasjon er en mekanisme, i hvilken klemmer rotert rundt en fast akse med hensyn til anordningen, brukt for å bevege rørledningen.

Den termostatisk styrte kassen 2 er oppnådd med allerede kjente midler, så som et termometer koplet med en oppvarmings- og avkjølingsinnretning.

Lufting (gassutveksling) er, når påkrevd for vekst av den dyrkede cellen eller av utformingen til eksperimentet, oppnådd direkte og uten mekanisk bistand ved bruken av en gassgjennomslippelig rørledning. For eksempel, og uten å være begrensende, kan den bøyelige gassgjennomslippelige rørledningen utføres av silikon. Lufting kunne oppnås gjennom utveksling med den omgivende atmosfæren eller gjennom utveksling med en kunstig definert atmosfære (væske eller gass) som berører vekstkammeret eller hele chemostaten. Når et eksperiment krever anaerobiose kan den bøyelige rørledningen være gassugjennomslippelig. For eksempel, og uten å være begrensende, kan den bøyelige gassugjennomslippelige rørledningen utføres av belagt eller behandlet silikon.

For anaerobe utviklingstilstander kan områder av rørledningen likeså begrenses i et spesifikt og styrt atmosfæreområde for å styre gassutvekslingsdynamikk. Dette kan oppnås enten ved å gjøre den termostatisk styrte kassen gasstett og deretter injisere nøytral gass inn i den eller ved å plassere hele anordningen i et atmosfærestyrt rom.

Telleutvelgelse av statiske varianter er oppnådd ved utbytting av vekstkammeroverflaten sammen med vekstmediet.

Anordningen er videre utformet for å være drivbar i et mangfold av orienteringer med hensyn til tyngdekraften, det vil si for å vippes, slik som vist på figur 2, langs et spekter på inntil 360o.

Fortynningsbestandige varianter kan unngå fortynning ved hefting til hverandre snarere enn til kammerveggen, dersom rørte celler kan falle oppstrøms og derved unngå fjerning fra kammeret. Følgelig er det ønskelig at rørledningen generelt vippes nedover, slik at rørte celler vil falle mot området som vil fjernes fra vekstkammeret i løpet av en syklus for rørbevegelse. Denne konfigurasjonen involverer slik vipping av anordningen at nedstrømsportene er under oppstrømsportene med hensyn til tyngdekraften.

Voksekammeret kan trykkavlastes eller trykkforhøyes i samsvar med tilstander valgt av eksperimentatoren. Forskjellige måter for justering av trykk kan brukes, for eksempel påføring av vakuum eller trykkluft mot det friske mediet og rørledningen gjennom dens oppstrøms ytterkant og over vekstkammeret; en annen måte for trykkavlasting eller trykkforhøying av rørledningen kan gjøres ved vekslende sammenklemming og låsing av rørledningen oppstrøms for eller inne i vekstkammeret.

Når mediet er opptatt i den gassgjennomslippelige rørledningen kan luftbobler tilformes innenfor mediet. Disse vil heve seg til toppen av et forseglet område av rørledningen og bli innfanget der, inntil bevegelsen av området (og portene som avgrenser det) frigir området i hvert enkelt vekstkammer, prøvekammeret eller sluttpunktet av chemostaten (figur 6, henholdsvis områdene D-C, B eller A). Dersom anordningen er vippet nedover vil slike bobler samle seg i vekstkammeret eller prøvekammeret og fortrenge dyrkingen.

Anordningen er utformet for periodisk å vippe oppover for en syklus av rørbevegelsen, noe som besørger fjerningen av oppsamlet gass fra kamrene.

Vippebevegelser av anordningen og/eller risting av vekstkammeret med en utvendig innretning 9 kan brukes for å minske agitering av celler innenfor vekstkammeret.

Alternativt kan én eller atskillige rørstenger inkluderes i rørledningen fylt med friskt medium før sterilisasjon og agiteres magnetisk under dyrkingsprosedyrer. I tilfelle av celler som ikke trenger agitering for å vokse kunne maskinen stå i den samme posisjonen.

Den proporsjonale lengden til områder med friskt medium definert av oppstrømsportene, slik som sammenliknet med lengden av dyrkingskammeret, vil definere omfanget av fortynning oppnådd i løpet av en syklus.

Frekvensen for fortynning kan bestemmes ved tidsinnstilling (f.eks. chemostatfunksjon). Stamceller kan for eksempel høstes i en begrenset tidsramme, slik at stamcellene er samlet før differensieringen av cellene begynner. Alternativt kan frekvensen for fortynning bestemmes med en tilbakemeldingsregulasjon, slik at densiteten av dyrkingen i vekstkammeret er målt med en turbidimåler (figur 1 – henvisningstall 6) og fortynningssyklusen forekommer når turbiditeten når en terskelverdi (turbidostatfunksjon). Rørledningen kan være gjennomsiktig eller gjennomskinnelig for å måle turbiditet.

Prøvekammeret tillater tilbaketrekking av vokst dyrking for å analysere resultatet av et eksperiment, samle celler med en forbedret vekstrate for ytterligere dyrking, lagring eller funksjonell implementering eller andre formål, så som helling av populasjonen, kontroll av den kjemiske sammensetningen til mediet eller testing av pH i vokst dyrking, eller tilvirkning av celler i mengde (f.eks. eukaryoter, så som stamceller, prokaryoter, Arkaea og virus). For å oppnå varig overvåkning av pH inni vekstkammeret kan rørledningen innbefatte ved konstruksjon en pH-indikatorledning innleiret/overtrukket i veggen av rørledningen.

Hvilken som helst form av flytende eller halvfast materiale kan brukes som et vekstmedium i den foreliggende oppfinnelse. Evnen til å benytte halvfaste vekstsubstrater er et merkbart fremskritt med hensyn til tidligere kjent teknikk. Vekstmediet som vil definere de metabolske prosessene forbedret med utvelgelsesprosessen kan velges og defineres av brukeren.

Om nødvendig kan denne anordningen inneholde mangfoldige vekstkamre, slik at nedstrømsportene til ett vekstkammer blir oppstrømsportene til et annet. Dette kunne tillate at for eksempel en celle vokser alene i det første kammeret og deretter virke som kilden for ernæring for en andre celle (eller virus) i det andre kammeret.

Oppfinnelsen kan brukes for å tilvirke en preparering, så som et biologisk stoff for et legemiddel, en vaksine eller et antitoksin, som er syntetisert av celler vokst med oppfinnelsen eller deres produkter. Det biologiske stoffet kan brukes som et diagnostisk, preventivt eller terapeutisk middel. Oppfinnelsen kan brukes for eksempel for å tilvirke terapeutiske proteiner, så som insulin.

I en foretrukket utførelse kan anordningen og/eller fremgangsmåten settes i syklus på en måte for kontinuerlig å samle stamceller i deres udifferensierte tilstand. Enn videre kan dyrkingstilstandene modifiseres for å hemme differensieringen av stamcellene. For eksempel kan stamcelledifferensierende inhibitorer (f.eks. inhibitorer av aldehyddehydrogenase, inhibitorer av fosfoinositide 3-kinase, TGF-reseptorkinaseinhibitorer, TGF-B-reseptorkinaseinhibitorer etc.) tilsettes dyrkingsmediet. Alternativt kan prosesstilstander, så som mengden av oksygen avgitt til dyrkingsmediet, økes eller minskes for å forbedre veksten av bestemte stamceller og/eller senke eller forbedre differensiering av stamcellene.

Ettersom visse celler krever et substrat for å vokse, kan en fysisk understøttelse eller struktur tilsettes kardyrkingskammeret. I en foretrukket utførelse kunne kontinuerlig understøttelse tilsettes inne i rørledningen, liknende kan et kontinuerlig fiberlag, dannet av en kontinuerlig fiberliknende understøttelsesstruktur, tilsettes kardyrkingskammeret, noe som kunne la celler vokse i 3 dimensjoner. For eksempel kunne understøttelsen være et fiberlag som bevirker understøttelse for veksten av celler, så som stamceller, planteceller og andre typer av celler som foretrekker en slik understøttelsesstruktur, eller ikke kan vokse i suspensjon eller vokse som kohesive celler, og i noen spesifikke tilstander eller endringer av tilstander for å prosessere den naturlige utvelgelsen for målrettede mutasjoner.

I en foretrukket utførelse innlemmes et fiberaktig materiale, slik som omtalt i ”Huang et al., Continuous Production of butanol by Clostridium acetobutylicum immobilized in a fibrous bed reactor, Appl Biochem Biotechnol.2004 Spring; 113-116:887-98”.

Strukturen og størrelsen til rørledningen kan likeså varieres for å unngå behovet for inkludering av en understøttelsesstruktur i det bevegelige kardyrkingskammeret. I en foretrukket utførelse er en rørledning med en mindre diameter brukt, således kan cellene hefte seg på en mer naturlig måte, eller rørledningen er brukt som en naturlig understøttelse uten behovet for hefting for noen kohesive celler.

Denne anordningen og fremgangsmåten tillater at forskere og produktutviklere skiller ut hvilken som helst stamme av dyrkbare levende celler i suspensjon eller hvilken som helst stamme av dyrkbare levende celler som ikke er i suspensjon, og som gror på veggen av rørledningen eller på en understøttelse, som kunne være et fiberlag i rørledningen gjennom uavbrutt vekst (kontinuerlig dyrking); den resulterende forbedrede cellen kan utgjøre en ny stamme eller arter. Disse nye cellene kan identifiseres av mutasjoner ervervet under forløpet av dyrkingen, og disse mutasjonene kan tillate at de nye cellene skjelnes fra deres forgjengeres genotype egenskaper. Denne anordningen og fremgangsmåten tillater at forskeren velger nye stammer av hvilken som helst levende celle ved segregering av individer med forbedrede rater av reproduksjon gjennom prosessen av naturlig utvelgelse. Oppfinnelsen kan likeså gi en forbedret og fullstendig atskilt fremgangsmåte og anordning for kontinuerlig dyrking av celler, så som eukaryoter (f.eks. gjær, sopp, planteceller, alger, dyreceller eller stamceller), prokaryoter, arkaea og virus.

I en ytterligere utførelse kan en emitter brukes for å utsette cellene, permanent eller midlertidig, for minst ett av radiobølger, lysbølger, røntgenstråler, lydbølger, et elektromagnetisk felt, et radioaktivt felt, radioaktive medier eller kombinasjoner av dette. Biofizika. 2005 jul.-aug., 50(4):689-92; Bioelectromagnetics.2005 sept., 26(6):431-9; Chem Commun (Camb).2005 jan. 14, (2):174-6; Biophys J.2005 feb., 88(2):1496-9; Bioelectromagnetics. 1981, 2(3):285-9; Sb Lek.1998, 99(4):455-64; Antimicrob Agents Chemother. 2004 des., 48(12):4662-4; J Food Prot.2003 sept., 66(9):1712-5;

Astrobiology. 2006 apr., 6(2):332-47; Life Sci Space Res.1970, 8:33-8; Adv Space Res. 1995 mar., 15(3):211-4; Radiat Res.2006 mai, 165(5):532-7; Mutagenesis. 2004 sept., 19(5):349-54; Cancer Si.2006 jun., 97(6):535-9; Appl Environ Microbiol.2006 mai, 72(5):3608-14 og Pol J Microbiol.2005, 54 Suppl:7-11.

I en annen utførelse kunne vekstkammerområdet av anordningen utsettes for, permanent eller midlertidig, påføring av cellene med en ulik gravitasjonskraft. For eksempel kan cellene vokse i et mikrogravitasjonsmiljø. J Gravit Physiol.2004 mar., 11(1):75-80; Immunol Rev. 2005 des.; 208:267-80 og J Gravit Physiol. Jul.; 11(2):P181-3.

Claims

Patentkrav

1.

Anordning for produksjon av levende celler som ikke er i suspensjon på en kontinuerlig måte, k a r a k t e r i s e r t v e d at anordningen omfatter: en bøyelig rørledning (1) som inneholder dyrkingsmedium og en overflate, på hvilken de levende cellene kan vokse, og at rørledningen (1) er gjennomsiktig eller gjennomskinnelig for å måle turbiditet;

et system av porter (3, 4, 5) utført ved klemmer, hver i stand til åpne og lukkede posisjoner, hvori systemet med porter oppdeler rørledningen (1) i:

i) et oppstrømsområde som inneholder ubrukt dyrkingsmedium (7) og en ubrukt overflate på hvilken nevnte celler kan vokse;

ii) et nedstrømsområde som inneholder brukt dyrkingsmedium (15); og iii) et vekstkammerområde (10) for produksjon av cellene anbrakt mellom oppstrøms- og nedstrømsområder;

og at systemet av porter (3, 4, 5) er konstruert og anordnet for å åpne og lukke seg for å klemme av og definere vekstkammerområdet (10) av rørledningen (1) mellom oppstrøms- og nedstrømsområder av rørledningen (1), og for syklisk å gjendefinere vekstkammerområdet (10) av rørledningen (1), slik at et første parti av det tidligere definerte vekstkammerområdet (10) blir et parti av nedstrømsområdet av rørledningen (1), og et parti av det tidligere definerte oppstrømsområdet av rørledningen (1) blir et parti av vekstkammerområdet (10) av rørledningen (1) og tilveiebringer overflaten for videre vekst av nevnte celler; og

et turbidimeter (6) eller et annet apparat anordnet for å måle optisk densitet av de levende cellene i dyrkingsmediet,

hvori de lukkede portene som definerer vekstkammerområdet (10), portområdet av rørledningen (1) som utgjør vekstkammerområdet (10), mediet og dyrkingen inne i vekstkammerområdet (10) er bevegelige sammen gjennom en samtidig bevegelse av systemet av porter (3, 4, 5) slik at hver av portene ikke beveger seg med hensyn til rørledningen (1) når porten er i en lukket posisjon, og hvori nevnte celler ikke vokser i suspensjon.

2.

Anordning ifølge krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at turbidimeteret (6) eller det andre apparatet som måler optisk densitet er anordnet for å virke som en del av et tilbakemeldingsstyresystem som tillater kontrollert bevegelse av rørledningen (1) basert på dyrkningsdensiteten.

3.

Anordning ifølge ett av kravene 1-2, k a r a k t e r i s e r t v e d at portene (3, 4, 5) omfatter en syklisk kjede av tenner anordnet for å sammenklemme rørledningen (1) for å definere oppstrømsområdet, nedstrømsområdet og vekstkammerområdet (10).

4.

Anordning ifølge ett av kravene 1-3, k a r a k t e r i s e r t v e d at overflaten er en innvendig overflate av rørledningen (1), eller en kontinuerlig understøttelse satt inn inne i rørledningen (1), eller en kontinuerlig fiber.

5.

Anordning ifølge ett av kravene 1-4, k a r a k t e r i s e r t v e d at anordningen videre omfatter en trykkregulator konstruert for å endre et trykk i vekstkammerområdet (10) av rørledningen (1) med hensyn til et omgivende trykk og/eller en temperaturregulator konstruert for å tillate styring av en temperatur i vekstkammerområdet (10) av rørledningen (1).

6.

Anordning ifølge ett av kravene 1-5, k a r a k t e r i s e r t v e d at rørledningen (1) omfatter en pH-indikator som kan være i rørledningens sammensetning eller kledning.

7.

Anordning ifølge ett av kravene 1-6, k a r a k t e r i s e r t v e d at anordningen videre omfatter en agitator som kan være i form av en rørestang (9) konstruert for å tillate agitasjon av vekstkammerområdet (10) av rørledningen (1).

8.

Anordning ifølge ett av kravene 1-7, k a r a k t e r i s e r t v e d at anordningen videre omfatter en emitter konstruert for å utsette vekstdyrkingskammerområdet for minst ett av radiobølger, lysbølger, røntgenstråler, lydbølger, et elektromagnetisk felt og et radioaktivt felt, og en avvikende gravitasjonskraft.

9.

Anordning ifølge ett av kravene 1-8, k a r a k t e r i s e r t v e d at portene (3, 4, 5) omfatter en eller flere kjeder av mangfoldige tenner beveget samtidig i form av to tenner som sammentrykker rørledningen (1) på en stablende måte for å unngå forurensning mellom områder (G, H) av rørledningen (1) gjennom nøyaktigheten av grenseflaten mellom tennene.

10.

Anordning ifølge ett av kravene 1-9, k a r a k t e r i s e r t v e d at anordningen videre omfatter en vippemekanisme for å vippe vekstkammerrørledningen (1) enten nedover for å fjerne oppsamlede celler eller oppover for å fjerne luft.

11.

Anordning ifølge ett av kravene 1-10, k a r a k t e r i s e r t v e d at vekstkammerområdet (10) omfatter ett eller flere vekstkamre som inneholder dyrkingsmedium.

12.

Fremgangsmåte for produksjon av celler som ikke er i suspensjon på en kontinuerlig måte, k a r a k t e r i s e r t v e d at fremgangsmåten omfatter:

a) anvendelse av anordningen ifølge et hvilket som helst av kravene 1-11;

b) måling av turbiditeten til dyrkingsmediet med et turbidimeter (6) eller et annet apparat som måler turbiditet;

c) lukking av de utvalgte av portene (3, 4, 5) på rørledningen (1) for å definere vekstkammerområdet (10) av rørledningen (1) mellom oppstrøms- og nedstrømsområdene av rørledningen (1) og innføring av levedyktige celler i vekstkammerområdet (10);

d) overvåkning av turbiditet i vekstdyrkingsmediet og når en turbiditetsmåling svarer til en ønsket vekst av dyrkingen er oppnådd lukking og åpning av de utvalgte av portene (3, 4, 5) for å gjendefinere vekstkammerområdet (10) av rørledningen (1), slik at et første parti av det tidligere definerte vekstkammerområdet (10) blir et parti av nedstrømsområdet av rørledningen (1), og et parti av det tidligere definerte oppstrømsområdet av rørledningen (1) blir et parti av vekstkammerområdet (10) av rørledningen (1) og tilveiebringer overflate for videre vekst av cellene; og

e) gjentakelse av trinn d) inntil en tilstrekkelig mengde av celler har vokst, hvori de lukkede portene som definerer vekstkammerområdet (10), portområdet av rørledningen (1) som utgjør vekstkammerområdet (10), mediet og dyrkingen inne i vekstkammerområdet (10) beveger seg sammen gjennom en samtidig bevegelse av systemet av porter (3, 4, 5) slik at hver av portene ikke beveger seg med hensyn til rørledningen (1) når porten er i en lukket posisjon, og hvori cellene ikke vokser i suspensjon.

13.

Fremgangsmåte ifølge krav 12, k a r a k t e r i s e r t v e d at fremgangsmåten omfatter det ytterligere trinnet med tilbaketrekking av noen levende celler fra dyrkingsmediet fra nedstrømsområdet og isolering av de levende cellene fra nedstrømsområdet.

14.

Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 12-13, k a r a k t e r i s e r t v e d at de levende cellene velges fra gruppen bestående av alger, sopp, gjærceller, dyreceller, planteceller og stamceller.

15.

Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 12-13, k a r a k t e r i s e r t v e d at de levende cellene utgjøres av stamceller som kan være hematopoetiske stamceller, beinmargsstamceller, stromalceller, astrocytter, oligidendrocytter, embryostamceller, fosterstamceller, navlestrengstamceller, placentaavledede stamceller og voksenstamceller.

16.

Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 12-15, k a r a k t e r i s e r t v e d at fremgangsmåten videre omfatter dyrking av én eller flere typer celler i vekstkammerområdet (10).

17.

Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 12-16, k a r a k t e r i s e r t v e d at fremgangsmåten videre omfatter at cellene ikke vokser i suspensjon eller vokser som kohesive celler.

18.

Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 12-17, k a r a k t e r i s e r t v e d at trinn d) tillater fortynning ved anbringelse av en bestemt mengde med friskt medium fra oppstrømsområdet i vekstkammeret, mens en lik mengde av dyrkning isoleres og fjernes fra vekstkammeret til nedstrømsområdet gjennom den andre ytterkanten av vekstkammeret.

19.

Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 12-17, k a r a k t e r i s e r t v e d at trinn d) videre omfatter bevegelse av rørledningen (1) mellom hver vekstsyklus slik at vekstkammerområdet fornyes sammen med innføringen av ubrukt dyrkingsmedium (7), noe som således forhindrer en mulig formering av en fortynningsbestandig populasjon mens eventuell forurensning av det isolerte voksekammeret unngås.

20.

Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 12-19, k a r a k t e r i s e r t v e d at fremgangsmåten videre omfatter dyrking av celler under tilstander som begunstiger den naturlige utvelgelsen av de levende cellene, slik at de levende cellene oppviser en økt rate av reproduksjon og/eller spesifikke metabolske egenskaper.