WO2024014317A1 - 細胞培養装置、細胞培養システム、及び細胞培養方法 - Google Patents

細胞培養装置、細胞培養システム、及び細胞培養方法 Download PDF

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WO2024014317A1
WO2024014317A1 PCT/JP2023/024352 JP2023024352W WO2024014317A1 WO 2024014317 A1 WO2024014317 A1 WO 2024014317A1 JP 2023024352 W JP2023024352 W JP 2023024352W WO 2024014317 A1 WO2024014317 A1 WO 2024014317A1
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culture
cell culture
pressing member
impact
cells
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修 小関
郷史 田中
貴彦 戸谷
喬晴 西山
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東洋製罐グループホールディングス株式会社
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    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/02—Apparatus for enzymology or microbiology with agitation means; with heat exchange means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to cell culture technology, and particularly to a cell culture device for culturing adherent cells in a bag-shaped culture container.
  • the cell cluster into pieces. For example, if you try to separate the cells from the culture surface using a cell scraper or the like to make single cells, the cells may be pressed too hard. Alternatively, the adhesion proteins on the culture surface and the proteins on the cell surface were forcibly separated and damaged, often resulting in an increase in the number of dead cells.
  • the cell culture device is equipped with a pressing member capable of pressing a bag-shaped culture container filled with a liquid to reduce the thickness of the liquid in the container, and applying an impact to the pressing member.
  • a pressing member capable of pressing a bag-shaped culture container filled with a liquid to reduce the thickness of the liquid in the container, and applying an impact to the pressing member.
  • Patent Document 1 describes a method of filling a bag-shaped culture container with a medium while draining the stripping solution until at least a portion of the inner surface of the container comes into contact with the container, detaching the cells, and disintegrating the cell mass using a tube pump. is listed.
  • this method has a problem in that a cleaning step cannot be performed appropriately after the stripping solution is discharged.
  • a means for pressing the bag-shaped culture container is not provided, there is also a problem that even if a cleaning step is carried out, the inside of the culture container cannot be sufficiently cleaned as it is.
  • Patent Document 2 discloses an automatic subculturing device that subcultures adherent cells. However, this method could not be used in bag-shaped culture containers. Additionally, a special filter material was required.
  • Patent Document 3 discloses a cell culture device that is capable of stirring the liquid inside a bag-shaped culture container.
  • this cell culture device is for culturing floating cells such as mononuclear cells, and is not capable of efficiently peeling adherent cells from the culture surface to form single cells.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned circumstances, and provides a cell culture system that can efficiently detach adherent cells from a culture surface to form single cells when culturing adherent cells in a bag-shaped culture container.
  • the purpose is to provide devices, cell culture systems, and cell culture methods.
  • the cell culture device of the present invention is a cell culture device for culturing cells using a bag-shaped culture container made of a flexible packaging material, and includes a pedestal on which the culture container is placed; It has a pressing member that presses the culture container placed on the pedestal against the pedestal, and an impact applying mechanism that applies an impact to the pressing member, and the pressing member is tiltable with respect to the pedestal.
  • the impact applying mechanism applies an impact to the end of the pressing member in a state where the culture container filled with the content liquid is held between the pedestal and the pressing member.
  • the two impact applying mechanisms are provided so as to apply impact to opposing ends of the pressing member, and the culture container filled with the liquid content is connected to the pedestal. It is preferable that the two impact applying mechanisms alternately apply impact to opposing ends of the pressing member while being held between the pressing members.
  • the cell culture device of the present invention may be configured such that the thickness of the liquid in the culture container is 10 mm or less when the culture container filled with the content liquid is held in parallel between the pedestal and the pressing member. It is also preferable to do so. Further, it is also preferable that the cell culture device of the present invention is configured such that application of an impact by the impact applying mechanism can be stopped in a state where the pressing member is inclined with respect to the pedestal.
  • the cell culture apparatus of the present invention is configured to use a cam, a solenoid cylinder, an air cylinder, or a linear actuator as the impact applying mechanism.
  • the cell culture device of the present invention is configured such that the cells are adherent cells.
  • the cell culture device of this embodiment is a combination of various configurations of the above-described cell culture devices.
  • the cell culture system of the present invention includes a plurality of any of the cell culture devices described above, and has a configuration in which the culture vessels placed in each cell culture device are connected in parallel through ports.
  • the cell culture method of the present invention is a cell culture method using any of the cell culture devices described above, in which the culture container is filled with adherent cells and a medium to perform cell culture, and the culture container is placed on the mount. and the pressing member, and the impact applying mechanism applies an impact to the end of the pressing member, thereby peeling the adhered cells from the culture container.
  • the cell culture method of the present invention may include a method of applying an impact to the end of the pressing member using the impact applying mechanism to peel off the adhered cells from the culture container and disassemble the cell mass into single cells. It is preferable to do so.
  • the cell culture method of the present invention is a method in which the culture container is used for subculturing cells or inducing differentiation of cells.
  • a cell culture device capable of efficiently peeling adherent cells from a culture surface to form single cells when culturing adherent cells in a bag-shaped culture container. It becomes possible to provide a method.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a plan view and a front view of a bag-shaped culture container used in a cell culture device according to an embodiment of the present invention.
  • 1 is a schematic diagram showing a plan view and a front view of a cell culture device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic diagram showing a plan view and a front view of a cell culture apparatus equipped with an impact applying mechanism (solenoid cylinder type) according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the operation of the impact applying mechanism (solenoid cylinder type) according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a front view of a cell culture device equipped with an impact applying mechanism (cam type) according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of a cell culture system including bag-shaped culture vessels arranged in parallel and communicating with each other in a cell culture apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of a cell culture system including bag-shaped culture containers connected in series in a cell culture apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • the cell culture device of this embodiment is a cell culture device for culturing cells using a bag-shaped culture container made of a flexible packaging material, and includes a pedestal on which the culture container is placed, and a culture container placed on the pedestal. It has a pressing member that presses the container against the pedestal, and an impact applying mechanism that applies an impact to the pressing member, the pressing member is tiltable with respect to the pedestal, and the culture container filled with the content liquid is placed on the pedestal.
  • the impact applying mechanism applies an impact to the end of the pressing member while being held between the pressing member and the pressing member.
  • the cell culture device of this embodiment is equipped with two impact applying mechanisms so as to apply impact to opposing ends of the pressing member, and the culture container filled with the liquid content is placed between the pedestal and the pressing member. It is preferable that the two impact applying mechanisms alternately apply impact to opposing ends of the pressing member while being sandwiched therebetween.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a plan view and a front view of a bag-shaped culture container used in the cell culture apparatus of this embodiment.
  • the bag-shaped culture container 10 used in the cell culture device of this embodiment is made by pasting the peripheral edges of two films together by heat sealing or the like, and culturing by adhering adherent cells inside.
  • a culture chamber having a culture surface 11 for the purpose of culturing is formed.
  • the culture container 10 is equipped with a port 12 for injecting and discharging the contents.
  • a port 12 for injecting and discharging the contents.
  • a tube is connected to the port 12, and the liquid content is supplied to the culture container 10 and the liquid content is discharged from the culture container 10 through the port 12 by a liquid feeding means such as a pump installed in the tube. .
  • a bulge shape extending outward is formed in the peripheral area of the culture chamber of the culture container 10. This makes it easier to apply a shock to the upper surface of the culture container 10 using the pressing member, as will be described later.
  • the shape of the culture container 10 is not limited to this, and may not have a bulging shape.
  • olefin resins such as polyethylene and polypropylene can be suitably used.
  • Other materials that can be used include polymethylpentene, cyclic olefin polymer, cyclic olefin copolymer, polyvinyl chloride, polyurethane, polymethyl methacrylate, polyester, polyamide, ionomer, ethylene-alpha olefin copolymer, ethylene-vinyl acetate copolymer, etc.
  • Polymer ethylene-vinyl alcohol copolymer, ethylene-acrylic acid copolymer, ethylene-methacrylic acid copolymer, ethylene-methyl methacrylate copolymer, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polymethyl acrylate, poly Examples include methyl methacrylate, polydimethylsiloxane, fluororesin, silicone resin, polybutadiene resin, and chlorinated polyethylene.
  • thermoplastic elastomers such as olefin thermoplastic elastomer, vinyl chloride thermoplastic elastomer, styrene thermoplastic elastomer, urethane thermoplastic elastomer, ester thermoplastic elastomer, and nylon thermoplastic elastomer can also be used.
  • thermosetting elastomers such as urethane rubber, silicone rubber, and fluororubber, and thermosetting materials such as phenolic resin, epoxy resin, melamine resin, urea resin, unsaturated polyester resin, alkyd resin, urethane resin, and thermosetting polyimide are also available. Resins can also be used.
  • thermoplastic resin such as polyethylene, polypropylene, vinyl chloride, polystyrene elastomer, FEP (perfluoroethylene propene copolymer), etc.
  • the content liquid filled in the culture container 10 is not particularly limited, but a cell growth medium, a differentiation induction medium, a washing liquid, a stripping liquid, a cell suspension, etc. are used.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a plan view and a front view of the cell culture device of this embodiment.
  • the cell culture device 20 of this embodiment includes a pedestal 21 on which the culture container 10 is placed. Further, a top plate support part 22 that supports a top plate part 23 is provided at an end of the pedestal 21 in an upright manner.
  • Magnets 231 are provided at the four corners of the lower surface of the top plate portion 23, and guide pins 232 are attached. Further, the top plate portion 23 is equipped with a length measurement sensor 233 that detects the liquid thickness within the culture container 10.
  • the cell culture device 20 of this embodiment is equipped with a pressing member 24 that presses the culture container 10 against the pedestal 21.
  • Magnets 241 are provided at the four corners of the upper surface of the pressing member 24 so as to face the magnets 231 of the top plate portion 23.
  • the magnets 231 and 241 repel each other, so that the pressing member 24 can press the culture container 10 against the pedestal 21.
  • the means for pressing the culture container 10 by the pressing member 24 is not limited to this, but it is also possible to use a biasing means such as a spring, or to press the culture container 10 by the own weight of the pressing member 24. good.
  • guide holes 242 are formed at the four corners of the pressing member 24 to allow the guide pins 232 of the top plate portion 23 to be movably inserted, and the pressing member 24 can be moved up and down along the guide pins 232. It is possible to move to. Furthermore, by setting the diameter of the guide hole 242 to be wider than the diameter of the guide pin 232, the pressing member 24 can be tilted with respect to the pedestal 21, as will be described later, and a shock can be applied to the culture container 10. is now possible.
  • a metal member 243 is provided on the upper surface side of the pressing member 24 so as to face the length measurement sensor 233 of the top plate portion 23 .
  • the length measurement sensor 233 measures the distance to this metal member 243, and based on the measurement result, the liquid thickness of the culture container 10 can be calculated by a control device connected to the length measurement sensor 233.
  • the pressing member 24 is equipped with a pressing plate 244 that contacts the culture container 10.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a plan view and a front view of a cell culture apparatus equipped with an impact applying mechanism (solenoid cylinder type).
  • the cell culture device 20 of this embodiment further includes an impact applying mechanism 25.
  • This impact applying mechanism 25 is configured using a solenoid cylinder, is provided with a rod 251, and is fixed to the top plate portion 23 via a bracket 252.
  • the impact applying mechanism 25 can tilt the pressing member 24 with respect to the pedestal 21 by impacting the pressing member 24 with the rod 251.
  • a strong impact can be applied to the culture container 10 which is held and pressed between the pressing member 24 and the pedestal 21, and the adherent cells are peeled off from the culture surface 11 of the culture container 10 and broken up into single cells. is now possible.
  • two impact applying mechanisms 25 are provided, but it is also possible to use only one of them.
  • the impact is applied alternately to opposing end regions of the pressing member 24, as shown in FIG. . In this way, a stronger impact can be applied to the culture container 10, so that adherent cells can be more efficiently peeled off into single cells.
  • the impact by the impact applying mechanism 25 is applied at the timing when the impact applying mechanism 25 is turned ON (the pressing member 24 is hit by the rod 251). It may also be configured to apply at the timing of turning off (pulling the rod 251 from the pressing member 24) after tilting with respect to the pedestal 21.
  • the pressing members 24 are provided on the two port sides, and that each pressing member 24 is provided with two impact applying mechanisms 25. At this time, in order to make each pressing member 24 tiltable with respect to the pedestal 21, it is preferable to form a gap between the two pressing members 24.
  • the cell culture device 20 of this embodiment is configured in this way, it is possible to apply an impact to the culture container 10 using the two pressing members 24 on the left and right, so that adhesive cells can be more efficiently peeled off. It becomes possible to make it into a single cell. In particular, with such a configuration, even adherent cells present near the center of the culture container 10 can be more efficiently peeled off into single cells. Moreover, it is also possible to apply such a configuration to the case where other impact applying mechanisms described below are provided.
  • the culture container 10 is pressed from below by the pressing member 24, and it is also possible to apply an impact to the culture container 10 from the bottom surface side by the impact applying mechanism 25. .
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing the configuration of the cell culture device and its control device of this embodiment.
  • the control device 30 may include an input/output section 31, a control section 32, an operation section 33, and a power supply section 34.
  • the input/output unit 31 is connected to the length measurement sensor 231 and the impact applying mechanism 25 in the cell culture device 20 . Then, input information from the length measurement sensor 231 is output to the control section 32. Further, input information from the control unit 32 is output to the impact applying mechanism 25 .
  • the control unit 32 is constituted by a PLC (programmable logic controller) or the like, and can program and store desired control contents in advance and control the operations of each section based on this.
  • control unit 32 can transmit information for controlling the impact applying mechanism 25 to the impact applying mechanism 25 via the input/output unit 31 at a predetermined timing to control its operation. Further, the control unit 32 can calculate the liquid thickness within the culture container 10 based on input information from the length measurement sensor 231a.
  • the operation unit 33 includes a display unit such as a touch panel, and transmits information input by the user to the control unit 32 to perform PLC settings and the like. Additionally, input information from the control unit 32 is displayed.
  • the power supply section 34 (such as a stabilized power supply) supplies electricity to each section within the control device 30.
  • the control device 30 may be configured to further include a relay section (relay) and a wiring interrupting section (breaker). Furthermore, part or all of the control section 32, operation section 33, etc. in the control device 30 may be realized by an information processing device such as a microcomputer or a computer.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing a front view of a cell culture device equipped with an impact applying mechanism (cam type). As shown in FIG. 6, it is also preferable that the cell culture device 20' of this embodiment includes an impact applying mechanism 26 configured using a cam.
  • a cam 262 is attached to a rotating shaft 261, and by rotating the rotating shaft 261 with a motor 263, the cam 262 can apply an impact to the pressing member 24.
  • the motor 263 is supported by a support section 264 erected on the pedestal 21'.
  • FIG. 6 the same code
  • cams 262 are provided in FIG. 6, only one of them may be provided. Furthermore, when the cell culture device 20 of this embodiment is provided with two cams 262, it is possible to alternately apply impacts to opposing end regions of the pressing member 24, thereby more efficiently peeling off adhered cells. It is possible to make it into a single cell.
  • the impact applying mechanism in the cell culture apparatus of this embodiment is not limited to one using a solenoid cylinder or a cam, but may be configured with other mechanisms such as an air cylinder or a linear actuator whose shaft can be expanded and contracted by motor operation. Of course, it is also possible to do so.
  • the cell culture apparatus 20 equipped with a solenoid cylinder-type impact applying mechanism 25 shown in FIG. It is possible to control the impact on the
  • the thickness of the liquid inside the culture container 10 is set to 10 mm or less when the culture container 10 filled with the content liquid is sandwiched in parallel between the pedestal 21 and the pressing member 24. is preferred. That is, by applying an impact to the culture vessel 10 while pressing the culture vessel 10 with the pressing member 24 so that the liquid thickness within the culture vessel 10 is 10 mm or less, adhered cells can be removed from the culture surface 11 more efficiently. It is possible to separate the cells into single cells.
  • the cell culture device of this embodiment As the liquid thickness within the culture container 10 increases, it becomes difficult to peel adhered cells from the culture surface 11.
  • the cell culture device of this embodiment is configured to apply an impact to the end region of the pressing member 24 by the impact applying mechanism 25 and the impact applying mechanism 26, but the pressing member 24 is tilted with respect to the pedestal 21. Even if the temperature is increased, the liquid thickness in the central region within the culture container 10 does not change much. Therefore, it is difficult to apply a shock to the central region within the culture container 10.
  • the liquid thickness in the culture container 10 is set to 10 mm or less while the culture container 10 is held in parallel between the pedestal 21 and the pressing member 24, and from this state By applying an impact to the end region of the pressing member 24, it is possible to efficiently separate adherent cells from the culture surface 11 into single cells. Moreover, at this time, it is more preferable that the liquid thickness in the culture container 10 be 5 mm or less, it is even more preferable that the liquid thickness be 2 mm or less, and it is particularly preferable that the liquid thickness be 1 mm or less.
  • the impact applying mechanisms 25 and 26 stop applying the impact while the pressing member 24 is tilted with respect to the pedestal 21.
  • the control device 30 connected to the impact applying mechanisms 25 and 26 can stop or start applying the impact by the impact applying mechanisms 25 and 26.
  • the pressing member 24 can be kept in an inclined state with respect to the pedestal 21, so that, for example, when injecting the content liquid into the culture container 10.
  • the pressing member 24 can be kept in an inclined state with respect to the pedestal 21, so that, for example, when injecting the content liquid into the culture container 10.
  • air in the tube or the like flows into the culture container 10
  • the cell culture system of this embodiment includes a plurality of cell culture devices 20 of the present embodiment described above, and the culture vessels 10 placed on each cell culture device 20 are communicated in parallel via ports 12. It is characterized by Specifically, as shown in FIG. 7, for example, a first culture container 10-1 is placed on a first cell culture device 20-1, and a second culture container 10-1 is placed on a second cell culture device 20-2. Place the container 10-2, place the third culture container 10-3 on the third cell culture device 20-3, and connect the ports provided in each culture container in parallel using tubes. It is preferable to have a configuration in which: Further, it is preferable that a liquid feeding means such as a pump is provided in each tube connected to the port of each culture container.
  • a liquid feeding means such as a pump is provided in each tube connected to the port of each culture container.
  • the first culture container 10-1, the second culture container 10-2, and the third culture container 10-3 of the same size are shown, but the culture areas are It is also preferable to have a large value.
  • the cell culture system of this embodiment includes a medium A container 41, a medium B container 42, a washing liquid container 43, and a stripping liquid container 44, each of which is communicated with each culture container 10 via a valve. ing. Further, the waste liquid container 45 is also communicated with each culture container 10 via a valve.
  • the control device 30 described above.
  • the input/output section 31 of the control device 30 is connected to each pump and valve, and the operations of these pumps and valves are controlled based on information from the control section 32.
  • the pump is not particularly limited, for example, a tube pump or the like can be suitably used.
  • the valve is not particularly limited, but a pinch valve or the like can be suitably used, for example.
  • the operation of the pump and valve can be controlled based on the input information from the length measurement sensor 231, and each culture container filled with the liquid content is held between the pedestal 21 and the pressing member 24 in parallel. In this state, it is possible to transfer the content liquid between containers while keeping the liquid thickness in the culture container constant.
  • the cell culture system of this embodiment can be used, for example, as follows. First, a medium is supplied from the medium A container 41 to the first culture vessel 10-1, and adherent cells are supplied to the first culture vessel 10-1, and the cells are cultured on the culture surface 11-1 of the first culture vessel 10-1. As a result, a cell mass of adherent cells is formed on the culture surface 11-1. Next, before detaching the cells from the culture surface 11-1, a cleaning solution is supplied from the cleaning solution container 43 to the first culture container 10-1, and a waste solution container 45 is supplied from the first culture container 10-1. Then, drain the cleaning solution to clean the inside of the first culture container 10-1.
  • a stripping solution is supplied from the stripping solution container 44 to the first culture container 10-1, and the container is left at 37° C. for 10 minutes, so that the adhered cells are easily peeled off from the culture surface.
  • the impact applying mechanisms 25 and 26 in the first cell culture device 20-1 are activated to peel the adherent cells in the culture container 10-1 from the culture surface 11-1 and separate adjacent cells. Disassemble cell clumps into single cells.
  • the cells in the first culture container 10-1 are transferred to the second culture container 10-2, and the same process is performed. That is, the adherent cells cultured in the second culture vessel 10-2 are detached from the culture surface 11-2 and decomposed into single cells (hereinafter, this may be simply referred to as detachment). Then, the cells in the second culture container 10-2 are transferred to the third culture container 10-3, and the same process is performed.
  • Adhesive cells can be detached by the following procedure in a state filled with a culture medium in a culture container.
  • Adhesive cells can be detached in a state filled with PBS in a culture container by the following procedure.
  • ix) Cell movement to second culture container 10-2 ⁇
  • Adhesive cells can be detached by the following procedure while a culture container is filled with a detachment solution.
  • the cell culture system of this embodiment can be used not only for subculture but also for inducing cell differentiation.
  • iPS cells after iPS cells are adherently cultured and proliferated in the first culture container 10-1, they are peeled off from the culture surface 11-1 and transferred to the second culture container 10-2, and the cells necessary for differentiation induction are It is possible to supply the medium from the medium B container 42 and perform cell culture in the second culture container 10-2.
  • the cell culture system of the present embodiment includes a plurality of cell culture devices 20 of the present embodiment described above, and the culture vessels 10 placed on each cell culture device 20 are connected in series through the ports 12. It can also be configured. Specifically, as shown in FIG. 8, for example, the first culture vessel 10-1 is connected to the second culture vessel 10-2 via a port, and the second culture vessel 10-2 is connected to the third culture vessel 10-2.
  • the culture container 10-3 is communicated with each other through a port, and a medium A container 41, a medium B container 42, a cleaning liquid container 43, a stripping liquid container 44, and a waste liquid container 45 are connected to each culture container through valves. It can also be communicated.
  • adherent cells can be automatically detached from the culture surface to form single cells, and subculture and differentiation can be efficiently performed. It is possible.
  • the inside of the culture container can be automatically cleaned both before filling the culture container with detachment solution and after draining it, cell detachment can be carried out efficiently and the next generation passage It has become possible to safely perform culture and differentiation induction.
  • a cell culture device not equipped with a shock imparting mechanism is used so that the culture vessels placed in each cell culture device have ports. It is also possible to have a configuration in which they are connected in parallel or in series. Such a cell culture system can be used, for example, as follows.
  • a medium is supplied from the medium A container 41 to the first culture vessel 10-1, and adherent cells are supplied to the first culture vessel 10-1, and the cells are cultured on the culture surface 11-1 of the first culture vessel 10-1. As a result, a cell mass of adherent cells is formed on the culture surface 11-1.
  • a cleaning solution is supplied from the cleaning solution container 43 to the first culture container 10-1, and a waste solution container 45 is supplied from the first culture container 10-1. Then, drain the cleaning solution to clean the inside of the first culture container 10-1.
  • a stripping solution is supplied from the stripping solution container 44 to the first culture container 10-1, and the container is left at 37° C. for 10 minutes, so that the adhered cells are easily peeled off from the culture surface. Then, the first culture container 10-1 is struck from the outside to peel the adherent cells in the culture container 10-1 from the culture surface 11-1, separate adjacent cells, and break down the cell cluster into single cells. .
  • the cells in the first culture container 10-1 are transferred to the second culture container 10-2, and the same process is performed. That is, the adherent cells cultured in the second culture container 10-2 are peeled off from the culture surface 11-2 and decomposed into single cells. Then, the cells in the second culture container 10-2 are transferred to the third culture container 10-3, and the same process is performed. In such a cell culture system, it is possible to manually detach adherent cells from the culture surface into single cells, and perform subculture and differentiation induction.
  • the cell culture method of this embodiment is a cell culture method using the cell culture device 20 of this embodiment described above, in which a culture container 10 is filled with adherent cells and a medium, cell culture is performed, and the culture container 10 is placed on a mount. 21 and the pressing member 24, an impact is applied to the end of the pressing member 24 by the impact applying mechanisms 25 and 26, thereby peeling the adhered cells from the culture container 10.
  • an impact is applied to the end of the pressing member 24 by the impact applying mechanisms 25 and 26 to peel off the adherent cells from the culture container 10 and break down the cell mass into single cells.
  • a method is preferred.
  • the cell culture method of this embodiment is a method in which the culture container 10 is used for subculturing cells or inducing differentiation of cells.
  • the adherent cells can be efficiently peeled off from the culture surface to form single cells, and the cells can be passed on. It can be suitably used for subculture and cell differentiation induction.
  • a bag-shaped culture container was created and adherent cells were cultured. Specifically, a polyethylene sheet (Umerit 125FN, Ube Maruzen Polyethylene Co., Ltd.) was surface-treated, and a film was created using the surface-treated area as a culture surface. Then, the two films were stacked and the peripheral portions were bonded together by heat sealing to form a culture bag. As a result, culture bags for samples 1 to 6 were obtained.
  • a polyethylene sheet Umerit 125FN, Ube Maruzen Polyethylene Co., Ltd.
  • ports were sandwiched between two opposing sides of the culture bag and the two ports were pasted together to form a culture bag with two ports.
  • the area of the culture part of the culture bag excluding the outer peripheral seal part and the port installation part was about 100 cm 2 .
  • an excimer irradiation device manufactured by M.D.Com Co., Ltd. was used to make the culture surface hydrophilic.
  • Excimer irradiation was performed under the conditions of a voltage of 12 V, an irradiation distance of 4 mm, and an irradiation speed of 2 mm/s x 3 times.
  • StemFit® (AK-02N, Ajinomoto Healthy Supply Co., Ltd.) was sealed as a medium in each culture bag, and adherent cells (iPS cell 1231A3 strain, Kyoto University iPS Cell Research Institute) were seeded for 7 days. Cultured. Thereafter, the medium was drained, and the culture bag was washed with PBS (phosphate buffered saline), and then the PBS was drained. Next, a 2-fold dilution of cell dissociation enzyme (TrypLE TM Select, Thermo Fisher Scientific) + EDTA in PBS was added, and the mixture was left at 37°C for 10 minutes. After the cell dissociation enzyme was discharged, the cells were washed with PBS and a medium was added.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the adherent cells were peeled off by manually hitting the bag from the outside. Then, the detached cells were collected with a syringe, and the number of cells was counted using a hemocytometer. This number of cells was used as the reference value for calculating the recovery rate. Further, the culture bag of sample 2 was installed in the cell culture device (solenoid cylinder type) of this embodiment and pressed, and the amount of medium in the culture bag was 10 ml and the liquid thickness was 1 mm. Then, the culture bag was shocked 50 times using a shock applying mechanism to peel off the adherent cells. The detached cells were collected with a syringe, the number of cells was counted using a hemocytometer, and the recovery rate relative to the reference value was calculated.
  • the culture bags of Samples 3 to 6 are similarly placed in the cell culture device (solenoid cylinder type) of this embodiment and pressed, and the amount of medium in the culture bags is adjusted to 20 ml, 50 ml, 100 ml, 120 ml, respectively.
  • the liquid thickness was set to 2 mm, 5 mm, 10 mm, and 12 mm, respectively.
  • each culture bag was shocked 50 times using a shock applying mechanism to peel off the adherent cells.
  • the detached cells were collected with a syringe, the number of cells was counted using a hemocytometer, and the recovery rate relative to the reference value was calculated. The results are shown in Table 1.
  • cells are collected by placing a culture bag in the cell culture device of this embodiment and pressing it, applying an impact using the impact mechanism with the liquid thickness in the culture bag set to 1 mm to 12 mm. has been done.
  • the recovery rate is 100% when the liquid thickness is 1 mm, 96% when the liquid thickness is 2 mm, 96% when the liquid thickness is 5 mm, 88% when the liquid thickness is 10 mm, and 88% when the liquid thickness is 12 mm. At that time, it was 48%. From this result, it was found that by reducing the liquid thickness in the culture bag to 1 mm to 10 mm or less and applying an impact using the impact mechanism, it was possible to obtain a cell recovery rate comparable to that of manually tapping the bag. .
  • the present invention can be suitably utilized when performing cell collection, subculture, differentiation induction, etc. when culturing adherent cells using a bag-shaped culture container.

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Abstract

【課題】　接着細胞を袋状の培養容器により培養する場合において、接着細胞を効率よく培養面から剥離してシングルセルにすることの可能な細胞培養装置を提供する。 【解決手段】　軟包材からなる袋状の培養容器（１０）を用いて細胞の培養を行う細胞培養装置（２０）であって、培養容器（１０）を載置する架台（２１）と、架台（２１）に載置される培養容器（１０）を架台（２１）に対して押圧する押圧部材（２４）と、押圧部材（２４）に衝撃を付与する衝撃付与機構（２５）とを有し、押圧部材（２４）が架台（２１）に対して傾斜可能に備えられ、内容液が充填された培養容器（１０）が架台（２１）と押圧部材（２４）の間に挟持された状態で、衝撃付与機構（２５）が押圧部材（２４）の端部に衝撃を付与する。内容液が充填された培養容器（１０）が架台（２１）と押圧部材（２４）の間に平行に挟持された状態における培養容器（１０）内の液厚を１０ｍｍ以下とすることが好ましい。

Description

細胞培養装置、細胞培養システム、及び細胞培養方法
　本発明は、細胞培養技術に関し、特に接着細胞を袋状の培養容器により培養する細胞培養装置に関する。
　近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
　このような状況において、軟包材からなる袋状の培養容器を用いて、細胞を閉鎖系で大量培養することが行われている。
　ところで、接着細胞を袋状の培養容器により培養する場合、細胞が増加するにしたがって、細胞が接着可能な培養面のスペースが次第になくなり、細胞の増殖効率が低下してしまう。
　このため、増殖効率が低下する前に細胞を回収して、継代培養を行うことが必要であった。
　具体的には、細胞を培養面から剥離してシングルセル（単個細胞）にし、これらを新たな培養容器に播種して、次に第二世代目の培養、さらに第三世代目の培養といったように細胞を繰り返し培養することが必要であった。
特許第６６０１７１３号公報 特許第４２２５９２４号公報 特開２０１８－１９６３１号公報
　ところが、細胞の継代培養などを行う場合において、細胞を培養面から剥離してシングルセルにすることは、容易ではないという問題があった。
　すなわち、接着細胞は、培養面に接着しているだけでなく、隣り合う細胞同士でも接着している。
　このため、その細胞塊をバラバラに崩壊させることは簡単には行うことができず、例えばセルスクレーパーなどを用いて細胞を培養面から剥離してシングルセルにしようとすると、細胞が強く押圧されたり、あるいは培養面の接着タンパクと細胞表面のタンパクが強引に切り離されたりして損傷し、死細胞が増えることが多くあった。
　一方、剥離液を用いて細胞を剥離することも一般的に行われているが、細胞を長時間剥離液に浸漬すると、細胞はダメージを受ける。
　そこで、剥離液を添加後、適切な時間のみ浸漬した後に、手作業で培養容器を外側から叩くといった物理的な負荷を加えることにより、細胞を培養面から剥離し、さらに隣同士で接着している細胞を引き剥がしてシングルセルにすることが行われていた。
　しかしながら、このような方法は、細胞を自動的に大量培養する場合には、適していなかった。
　そこで、本発明者らは鋭意研究して、接着細胞を効率よく培養面から剥離してシングルセルにすることが可能な細胞培養装置を開発することに成功して本発明を完成させた。
　具体的には、細胞培養装置において、内容液が充填された袋状の培養容器を押圧して容器内の液厚を小さくすることの可能な押圧部材を備えると共に、押圧部材に衝撃を加えて押圧部材を繰り返し傾斜動作させる衝撃付与機構を備えることにより、接着細胞を効率よく培養面から剥離してシングルセルにすることを可能とした。
　ここで、特許文献１には、袋状の培養容器の内面の少なくとも一部が接触するまで剥離液を排出した状態で培地を充填して細胞を剥離し、チューブポンプで細胞塊を崩壊させることが記載されている。
　しかしながら、この方法では剥離液を排出した後に適切に洗浄工程を行うことができないという問題があった。また、袋状の培養容器を押圧するための手段が備えられていないため、仮に洗浄工程を実施するとしても、そのままでは培養容器内を十分に洗浄できないという問題もあった。
　また、特許文献２には、接着細胞の継代培養を行う自動継代培養装置が開示されている。しかし、これは袋状の培養容器に用いることが可能なものではなかった。また、特殊なフィルタ材が必要となるものであった。
　さらに、特許文献３には、袋状の培養容器内の内容液を撹拌することが可能な細胞培養装置が開示されている。しかし、この細胞培養装置は、単核球などの浮遊系細胞を培養するためのものであり、接着細胞を効率よく培養面から剥離してシングルセルにすることを可能とするものではなかった。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、接着細胞を袋状の培養容器により培養する場合において、接着細胞を効率よく培養面から剥離してシングルセルにすることの可能な細胞培養装置、細胞培養システム、及び細胞培養方法の提供を目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明の細胞培養装置は、軟包材からなる袋状の培養容器を用いて細胞の培養を行う細胞培養装置であって、前記培養容器を載置する架台と、前記架台に載置される前記培養容器を前記架台に対して押圧する押圧部材と、前記押圧部材に衝撃を付与する衝撃付与機構とを有し、前記押圧部材が前記架台に対して傾斜可能に備えられ、内容液が充填された前記培養容器が前記架台と前記押圧部材の間に挟持された状態で、前記衝撃付与機構が前記押圧部材の端部に衝撃を付与する構成としてある。
　また、本発明の細胞培養装置を、２つの前記衝撃付与機構が、前記押圧部材の相対する端部にそれぞれ衝撃を付与するように備えられ、内容液が充填された前記培養容器が前記架台と前記押圧部材の間に挟持された状態で、２つの前記衝撃付与機構が前記押圧部材の相対する端部に交互に衝撃を付与する構成とすることが好ましい。
　また、本発明の細胞培養装置を、内容液が充填された前記培養容器が前記架台と前記押圧部材の間に平行に挟持された状態における前記培養容器内の液厚が１０ｍｍ以下である構成とすることも好ましい。
　また、本発明の細胞培養装置を、前記押圧部材が前記架台に対して傾斜した状態で、前記衝撃付与機構による衝撃の付与を停止可能である構成とすることも好ましい。
　また、本発明の細胞培養装置を、前記衝撃付与機構として、カム、ソレノイドシリンダ、エアシリンダ、又は直動系アクチュエータを用いる構成とすることも好ましい。
　また、本発明の細胞培養装置を、前記細胞が、接着細胞である構成とすることも好ましい。
　さらに、本実施形態の細胞培養装置を、上記の細胞培養装置における各構成を様々に組み合わせたものとすることも好ましい。
　また、本発明の細胞培養システムは、上記のいずれかの細胞培養装置を複数備え、それぞれの細胞培養装置に載置された前記培養容器がポートを介して並列して連通された構成としてある。
　また、本発明の細胞培養方法は、上記のいずれかの細胞培養装置を用いる細胞培養方法であって、前記培養容器に接着細胞と培地を充填して細胞培養を行い、前記培養容器を前記架台と前記押圧部材の間に挟持した状態で、前記衝撃付与機構により前記押圧部材の端部に衝撃を付与して、前記培養容器から前記接着細胞を剥離する方法としてある。
　また、本発明の細胞培養方法を、前記衝撃付与機構により前記押圧部材の端部に衝撃を付与して、前記培養容器から前記接着細胞を剥離すると共に、細胞塊をシングルセルに分解する方法とすることが好ましい。
　また、本発明の細胞培養方法を、前記培養容器を、細胞の継代培養、又は細胞の分化誘導に用いる方法とすることも好ましい。
　本発明によれば、接着細胞を袋状の培養容器により培養する場合において、接着細胞を効率よく培養面から剥離してシングルセルにすることの可能な細胞培養装置、細胞培養システム、及び細胞培養方法の提供が可能となる。
本発明の実施形態に係る細胞培養装置において用いられる袋状の培養容器の平面図と正面図を示す模式図である。 本発明の実施形態に係る細胞培養装置の平面図と正面図を示す模式図である。 本発明の実施形態に係る衝撃付与機構（ソレノイドシリンダ型）を備えた細胞培養装置の平面図と正面図を示す模式図である。 本発明の実施形態に係る衝撃付与機構（ソレノイドシリンダ型）の動作を示す模式図である。 本発明の実施形態に係る衝撃付与機構（ソレノイドシリンダ型）を備えた細胞培養装置とその制御装置の構成を示す模式図である。 本発明の実施形態に係る衝撃付与機構（カム型）を備えた細胞培養装置の正面図を示す模式図である。 本発明の実施形態に係る細胞培養装置における袋状の培養容器を並列して連通して備えた細胞培養システムの構成を示す模式図である。 本発明の実施形態に係る細胞培養装置における袋状の培養容器を直列して連通して備えた細胞培養システムの構成を示す模式図である。
　以下、本発明の細胞培養装置、細胞培養システム、及び細胞培養方法の実施形態について図面を参照して詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
［細胞培養装置］
　本実施形態の細胞培養装置は、軟包材からなる袋状の培養容器を用いて細胞の培養を行う細胞培養装置であって、培養容器を載置する架台と、架台に載置される培養容器を架台に対して押圧する押圧部材と、押圧部材に衝撃を付与する衝撃付与機構とを有し、押圧部材が架台に対して傾斜可能に備えられ、内容液が充填された培養容器が架台と押圧部材の間に挟持された状態で、衝撃付与機構が押圧部材の端部に衝撃を付与することを特徴とする。
　また、本実施形態の細胞培養装置を、２つの衝撃付与機構が、押圧部材の相対する端部にそれぞれ衝撃を付与するように備えられ、内容液が充填された培養容器が架台と押圧部材の間に挟持された状態で、２つの衝撃付与機構が押圧部材の相対する端部に交互に衝撃を付与するものとすることが好ましい。
　まず、図１を参照して、本実施形態の細胞培養装置において用いられる袋状の培養容器について説明する。図１は、本実施形態の細胞培養装置において用いられる袋状の培養容器の平面図と正面図を示す模式図である。
　図１に示すように、本実施形態の細胞培養装置において用いられる袋状の培養容器１０は、２枚のフィルムの周縁部をヒートシールなどによって貼り合わせ、内部に接着細胞を接着させて培養するための培養面１１を有する培養室が形成されている。
　また、培養容器１０は、内容液の注入や排出を行うためのポート１２が備えられている。図１の例ではポート１２が２つ備えられているが、その個数は特に限定されず、１つでも３つ以上であってもよい。
　ポート１２にはチューブが接続され、チューブに配設されたポンプなどの送液手段により、ポート１２を介して培養容器１０への内容液の供給や培養容器１０からの内容液の排出が行われる。
　また、図１において、培養容器１０の培養室の周縁領域に外側向きに張り出した膨出形状が形成されている。これにより、後述するように培養容器１０の上面に対し、押圧部材を用いて衝撃を与え易くなっている。
　なお、培養容器１０の形状は、これに限定されず、膨出形状を備えていないものであってもよい。
　培養容器１０の材料としては、ポリエチレンやポリプロピレンなどのオレフィン系樹脂を好適に用いることができる。その他用いることができる材料として、ポリメチルペンテン、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリメタクリル酸メチル、ポリエステル、ポリアミド、アイオノマー、エチレン-αオレフィン共重合体、エチレン-酢酸ビニル共重合体、エチレン-ビニルアルコール共重合体、エチレン-アクリル酸共重合体、エチレン-メタクリル酸共重合体、エチレン-メタクリル酸メチル共重合体、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、フッ素樹脂、シリコーン樹脂、ポリブタジエン樹脂、塩化ポリエチレンなどが挙げられる。また、オレフィン系熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系熱可塑性エラストマー、スチレン系熱可塑性エラストマー、ウレタン系熱可塑性エラストマー、エステル系熱可塑性エラストマー、ナイロン系熱可塑性エラストマーなどの熱可塑性エラストマーも用いることができる。また、ウレタンゴム、シリコーンゴム、フッ素ゴムなどの熱硬化性エラストマーや、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、ユリア樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、アルキド樹脂、ウレタン樹脂、熱硬化性ポリイミドなどの熱硬化性樹脂も用いることができる。
　また、ポート１２の材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリスチレン系エラストマー、ＦＥＰ（パーフルオロエチレンプロペンコポリマー）などの熱可塑性樹脂を用いることができる。
　培養容器１０に充填される内容液としては、特に限定されないが、細胞増殖用培地、分化誘導用培地、洗浄液、剥離液、細胞懸濁液などが使用される。
　次に、図２を参照して、本実施形態の細胞培養装置について説明する。図２は、本実施形態の細胞培養装置の平面図と正面図を示す模式図である。
　図２に示すように、本実施形態の細胞培養装置２０は、培養容器１０を載置する架台２１を備えている。また、架台２１の端部には、天板部２３を支持する天板支持部２２が立設して備えられている。
　天板部２３の下面側の四隅にはマグネット２３１が備えられると共に、ガイドピン２３２が取り付けられている。
　また、天板部２３には、培養容器１０内の液厚を検出する測長センサ２３３が備えられている。
　また、本実施形態の細胞培養装置２０には、培養容器１０を架台２１に対して押圧する押圧部材２４が備えられている。
　押圧部材２４の上面側の四隅には天板部２３のマグネット２３１に対面するようにマグネット２４１が備えられている。マグネット２３１とマグネット２４１が互いに反発し合うことで、押圧部材２４が培養容器１０を架台２１に対して押圧できるようになっている。
　なお、押圧部材２４により培養容器１０を押圧する手段は、これに限定されるものではなく、バネなどの付勢手段を用いたり、あるいは押圧部材２４の自重により培養容器１０を押圧する構成としてもよい。
　また、押圧部材２４の四隅には、天板部２３のガイドピン２３２を移動可能に挿入するためのガイド孔２４２（貫通孔）が形成されており、ガイドピン２３２に沿って押圧部材２４が上下に移動可能になっている。
　さらに、このガイド孔２４２の直径をガイドピン２３２の直径に対して幅広に設定することにより、後述するように押圧部材２４を架台２１に対して傾斜可能として、培養容器１０に衝撃を付与することができるようになっている。
　また、押圧部材２４の上面側において、天板部２３の測長センサ２３３に対面するように金属部材２４３が備えられている。測長センサ２３３がこの金属部材２４３までの距離を測定し、その測定結果にもとづいて、測長センサ２３３に接続される制御装置により培養容器１０の液厚を算出できるようになっている。
　また、押圧部材２４には、培養容器１０に接する押圧板２４４が備えられている。
　次に、図３を参照して、本実施形態の細胞培養装置における衝撃付与機構について説明する。図３は、衝撃付与機構（ソレノイドシリンダ型）を備えた細胞培養装置の平面図と正面図を示す模式図である。
　図３に示すように、本実施形態の細胞培養装置２０は、衝撃付与機構２５をさらに備えている。
　この衝撃付与機構２５は、ソレノイドシリンダを用いて構成されており、ロッド２５１が備えられ、ブラケット２５２を介して天板部２３に固定されている。
　そして、衝撃付与機構２５は、ロッド２５１により押圧部材２４を打撃することで、押圧部材２４を架台２１に対して傾斜させることができる。これにより、押圧部材２４と架台２１に挟持されて押圧された培養容器１０に激しい衝撃を与えることができ、培養容器１０の培養面１１から接着細胞を剥離してバラバラにし、シングルセルにすることが可能になっている。
　図３において、衝撃付与機構２５が２つ設けられているが、いずれか一方のみとすることもできる。
　また、本実施形態の細胞培養装置において衝撃付与機構２５を２つ設ける場合は、図４に示すように、押圧部材２４の相対する端部領域に対して、交互に衝撃を付与することが好ましい。
　このようにすれば、培養容器１０により激しい衝撃を与えることができるため、接着細胞をより効率的に剥離してシングルセルにすることが可能である。
　また、衝撃付与機構２５による衝撃は、衝撃付与機構２５をＯＮにする（ロッド２５１により押圧部材２４を打撃する）タイミングで付与する構成とするほか、衝撃付与機構２５をＯＮにして押圧部材２４を架台２１に対して傾斜させた後、ＯＦＦにする（ロッド２５１を押圧部材２４から引く）タイミングで付与する構成とすることもできる。
　また、図示しないが、本実施形態の細胞培養装置２０において、押圧部材２４を２つのポート側にそれぞれ備え、各押圧部材２４に衝撃付与機構２５を２つずつ設けるようにすることも好ましい。このとき、各押圧部材２４を架台２１に対して傾斜可能にするために、２つの押圧部材２４間に隙間を形成することが好ましい。
　本実施形態の細胞培養装置２０をこのような構成にすれば、培養容器１０に対して、左右の２つの押圧部材２４を用いて衝撃を付与できるため、接着細胞をさらに効率的に剥離してシングルセルにすることが可能となる。特に、このような構成によれば、培養容器１０の中央付近に存在する接着細胞に対しても、より一層効率的に剥離してシングルセルにすることが可能である。また、このような構成を後述するその他の衝撃付与機構を備える場合に適用することも可能である。
　なお、本実施形態の細胞培養装置において、培養容器１０を押圧部材２４により下側から押圧する構成として、衝撃付与機構２５により培養容器１０に対して下面側から衝撃を付与することも可能である。
　次に、図５を参照して、本実施形態の細胞培養装置の制御機構について説明する。図５は、本実施形態の細胞培養装置とその制御装置の構成を示す模式図である。
　図５に示すように、制御装置３０（制御ユニット）は、入出力部３１、制御部３２、操作部３３、及び電源部３４を有するものとすることができる。
　入出力部３１は、細胞培養装置２０における測長センサ２３１と、衝撃付与機構２５に接続されている。そして、測長センサ２３１からの入力情報を制御部３２に出力する。また、制御部３２からの入力情報を衝撃付与機構２５に出力する。
　制御部３２は、ＰＬＣ（programmable logic controller，プログラマブルロジックコントローラ）などにより構成され、所望の制御内容を予めプログラミングして記憶させ、これにもとづいて各部の動作を制御することができる。
　すなわち、制御部３２は、衝撃付与機構２５を制御するための情報を所定のタイミングで入出力部３１を介して衝撃付与機構２５に送信して、その動作を制御することができる。
　また、制御部３２は、測長センサ２３１ａからの入力情報にもとづき培養容器１０内の液厚を算出することができる。
　操作部３３は、タッチパネルなどの表示部を備え、ユーザによる入力情報を制御部３２に送信してＰＬＣの設定などを実行する。また、制御部３２からの入力情報を表示する。
　電源部３４（安定化電源など）は、制御装置３０内の各部に電気を供給する。
　また、図示しないが、制御装置３０において、さらに継電部（リレー）や配線遮断部（ブレーカー）を備えた構成とすることができる。また、制御装置３０における制御部３２や操作部３３などの一部又は全部の構成をマイコンやコンピュータなどの情報処理装置により実現してもよい。
　次に、図６を参照して、その他の衝撃付与機構を備えた本実施形態の細胞培養装置について説明する。図６は、衝撃付与機構（カム型）を備えた細胞培養装置の正面図を示す模式図である。
　図６に示すように、本実施形態の細胞培養装置２０’において、カムを用いて構成された衝撃付与機構２６を備えることも好ましい。
　衝撃付与機構２６は、回転軸２６１にカム２６２が取り付けられており、回転軸２６１をモータ２６３により回転させることで、カム２６２が押圧部材２４に対して衝撃を与えることが可能になっている。モータ２６３は、架台２１’に立設された支持部２６４により支持されている。なお、図６において、図３に示す本実施形態の細胞培養装置２０と同様の構成には同じ符号が示されている。
　また、図６において、カム２６２は２つ備えられているが、いずれか一方のみとしてもよい。
　また、本実施形態の細胞培養装置２０においてカム２６２を２つ備える場合は、押圧部材２４の相対する端部領域に対して交互に衝撃を付与することができ、接着細胞をより効率的に剥離してシングルセルにすることが可能である。
　さらに、本実施形態の細胞培養装置における衝撃付与機構は、ソレノイドシリンダやカムを用いるものに限定されず、例えばエアシリンダやモータ動作によりシャフトの伸縮が可能な直動系アクチュエータなどその他の機構で構成することも可能であることは勿論である。
　また、図５に示すソレノイドシリンダ型の衝撃付与機構２５を備えた細胞培養装置２０と同様に、カム型やその他の衝撃付与機構を備えた細胞培養装置についても、制御装置３０によって、押圧部材２４に対する衝撃を制御することが可能である。
　次に、本実施形態の細胞培養装置２０における培養容器１０の液厚について説明する。
　本実施形態の細胞培養装置２０において、内容液が充填された培養容器１０が架台２１と押圧部材２４の間に平行に挟持された状態で、培養容器１０内の液厚を１０ｍｍ以下とすることが好ましい。
　すなわち、このように培養容器１０内の液厚が１０ｍｍ以下となるように押圧部材２４によって培養容器１０を押圧した状態で培養容器１０に衝撃を与えることで、培養面１１から接着細胞をより効率的に剥離してシングルセルにすることが可能である。
　ここで、本実施形態の細胞培養装置において、培養容器１０内の液厚が大きくなるにつれて、培養面１１から接着細胞を剥離することが難しくなる。
　また、本実施形態の細胞培養装置は、衝撃付与機構２５や衝撃付与機構２６によって押圧部材２４の端部領域に対して衝撃を付与する構成であるところ、押圧部材２４を架台２１に対して傾斜させても、培養容器１０内の中央領域の液厚はあまり変化することがない。そのため、培養容器１０内の中央領域に対しては、衝撃を付与し難い。
　しかしながら、上記のとおり、本実施形態の細胞培養装置において、培養容器１０が架台２１と押圧部材２４の間に平行に挟持された状態で培養容器１０内の液厚を１０ｍｍ以下とし、この状態から押圧部材２４の端部領域に対して衝撃を付与することにより、効率的に培養面１１から接着細胞を剥離してシングルセルにすることが可能である。
　また、このとき、培養容器１０内の液厚を５ｍｍ以下とすることがより好ましく、同液厚を２ｍｍ以下とすることがさらに好ましく、液厚を１ｍｍ以下とすることが特に好ましい。
　また、本実施形態の細胞培養装置２０において、押圧部材２４が架台２１に対して傾斜した状態で、衝撃付与機構２５，２６による衝撃の付与を停止させることも好ましい。
　この衝撃付与機構２５，２６による衝撃の付与の停止や衝撃の付与の開始は、衝撃付与機構２５，２６に接続された制御装置３０により行うことが可能である。
　例えば、図４において、左側の衝撃付与機構２５をＯＮにしてロッド２５１を伸ばした状態にすると共に、右側の衝撃付与機構２５をＯＦＦにしてロッド２５１を引き込んだ状態にすることで、押圧部材２４が架台２１に対して右側が上方になるように傾斜した状態で、衝撃付与機構２５，２６による衝撃の付与を停止させることができる。
　本実施形態の細胞培養装置２０をこのような構成にすれば、押圧部材２４が架台２１に対して傾斜した状態のままにすることができるため、例えば培養容器１０内に内容液を注入する際に、チューブ内などの空気が培養容器１０に流入した場合に、その空気を培養容器１０内の一方のポート１２側に集めて除去し易くすることなどが可能となる。
［細胞培養システム］
　本実施形態の細胞培養システムは、上述した本実施形態の細胞培養装置２０を複数備え、それぞれの細胞培養装置２０に載置された培養容器１０がポート１２を介して並列して連通されたことを特徴とする。
　具体的には、例えば図７に示すように、第一の細胞培養装置２０－１に第一の培養容器１０－１を載置し、第二の細胞培養装置２０－２に第二の培養容器１０－２を載置し、第三の細胞培養装置２０－３に第三の培養容器１０－３を載置して、各培養容器に備えられたポートをチューブを用いて並列に連通させた構成とすることが好ましい。また、各培養容器のポートに接続されたチューブには、それぞれポンプなどの送液手段を配設することが好ましい。
　また、図７においては、第一の培養容器１０－１と第二の培養容器１０－２と第三の培養容器１０－３として同サイズのものが示されているが、この順番に培養面積が大きなものとすることも好ましい。
　本実施形態の細胞培養システムには、培地Ａ容器４１と、培地Ｂ容器４２と、洗浄液容器４３と、剥離液容器４４とが備えられ、それぞれがバルブを介して、各培養容器１０に連通されている。また、廃液容器４５もバルブを介して、各培養容器１０に連通されている。
　また、本実施形態の細胞培養システムにおいて、上述した制御装置３０を備えることが好ましい。
　そして、制御装置３０の入出力部３１を各ポンプとバルブに接続して、制御部３２からの情報にもとづいて、これらのポンプとバルブの動作を制御することが好ましい。
　ポンプとしては、特に限定されないが、例えばチューブポンプなどを好適に用いることができる。また、バルブも特に限定されないが、例えばピンチバルブなどを好適に用いることができる。
　これにより、測長センサ２３１からの入力情報にもとづいて、ポンプとバルブの動作を制御することができ、内容液が充填された各培養容器が架台２１と押圧部材２４の間に平行に挟持された状態において培養容器内の液厚を一定に保った状態で、内容液を容器間で送液することなどが可能となる。
　このような本実施形態の細胞培養システムは、例えば以下のように使用することができる。
　まず、第一の培養容器１０－１に対して培地Ａ容器４１から培地を供給すると共に、接着細胞を供給し、第一の培養容器１０－１の培養面１１－１において細胞を培養する。これによって、培養面１１－１に接着細胞の細胞塊が形成される。
　次に、培養面１１－１から細胞を剥離するに先立って、第一の培養容器１０－１に対して洗浄液容器４３から洗浄液を供給すると共に、第一の培養容器１０－１から廃液容器４５に洗浄液を排出して、第一の培養容器１０－１内を洗浄する。
　次いで、第一の培養容器１０－１に対して剥離液容器４４から剥離液を供給して、３７℃で１０分間放置し、接着細胞が培養面から剥がれやすくした状態とする。
　そして、第一の細胞培養装置２０－１における衝撃付与機構２５，２６を作動させて、培養容器１０－１内における接着細胞を培養面１１－１から剥離し、隣同士の細胞を分離して細胞塊をシングルセルに分解する。
　次に、第一の培養容器１０－１内の細胞を第二の培養容器１０－２に移送して、同様の処理を実行する。
　すなわち、第二の培養容器１０－２において培養された接着細胞を培養面１１－２から剥離してシングルセルに分解する（以下、これを単に剥離と称する場合がある。）。そして、第二の培養容器１０－２内の細胞を第三の培養容器１０－３に移送して、同様の処理を実行する。
　次に、上述した細胞の剥離及びシングルセルへの分解の詳細な手順について、具体的に説明する。
（１）培地を充填した状態での細胞の剥離及びシングルセルへの分解
　培養容器に培地を充填した状態で接着細胞を以下の手順で剥離することができる。
　（i）第一の培養容器１０－１で細胞培養→（ii）培地排出→（iii）リン酸緩衝生理食塩水により洗浄（以下、ＰＢＳ洗浄と称する。）→（iv）剥離液充填→（v）放置（37℃　10分）→（vi）剥離液排出→（vii）ＰＢＳ洗浄→（viii）培地充填→（ix）衝撃付与により細胞剥離→（x）第二の培養容器１０－２に細胞移動→（xi）第二の培養容器１０－２に培地追加
（２）ＰＢＳを充填した状態での細胞の剥離及びシングルセルへの分解
　培養容器にＰＢＳを充填した状態で接着細胞を以下の手順で剥離することができる。
　（i）第一の培養容器１０－１で細胞培養→（ii）培地排出→（iii）ＰＢＳ洗浄→（iv）剥離液充填→（v）放置（37℃　10分）→（vi）剥離液排出→（vii）ＰＢＳ充填→（viii）衝撃付与により細胞剥離→（ix）第二の培養容器１０－２に細胞移動→（x）第二の培養容器１０－２に培地追加→（xi）数時間後に第二の培養容器１０－２で培地の全量交換
（３）剥離液を充填した状態での細胞の剥離及びシングルセルへの分解
　培養容器に剥離液を充填した状態で接着細胞を以下の手順で剥離することができる。
　（i）第一の培養容器１０－１で細胞培養→（ii）培地排出→（iii）ＰＢＳ洗浄→（iv）剥離液充填→（v）放置（37℃　10分）→（vi）衝撃付与により細胞剥離→（vii）第二の培養容器１０－２に細胞移動→（viii）第二の培養容器１０－２に培地追加→（ix）数時間後に第二の培養容器１０－２で培地の全量交換
　さらに、本実施形態の細胞培養システムは、継代培養のみならず、細胞の分化誘導に用いることが可能である。
　例えば、第一の培養容器１０－１でｉＰＳ細胞を接着培養して増殖させた後、培養面１１－１から剥離して第二の培養容器１０－２に移送して、分化誘導に必要な培地を培地Ｂ容器４２から供給して、第二の培養容器１０－２において細胞培養を行うことが可能である。また、必要に応じて、第二の培養容器１０－２から第三の培養容器１０－３に細胞を移送して、さらに分化誘導を行わせることが可能なことは言うまでもない。
　また、本実施形態の細胞培養システムを、上述した本実施形態の細胞培養装置２０を複数備え、それぞれの細胞培養装置２０に載置された培養容器１０がポート１２を介して直列に連通された構成とすることもできる。
　具体的には、例えば図８に示すように、第一の培養容器１０－１に第二の培養容器１０－２をポートを介して連通させ、第二の培養容器１０－２に第三の培養容器１０－３をポートを介して連通させると共に、それぞれの培養容器に培地Ａ容器４１と、培地Ｂ容器４２と、洗浄液容器４３と、剥離液容器４４と、廃液容器４５をバルブを介して連通させることもできる。
　ここで、本実施形態の細胞培養システムにおいて、培養容器間で細胞の移送を行う場合、培養容器内の液厚を一定にした状態で行うことが好ましい。このため、図８に示すように、培養容器がポートを介して直列に連通された場合には、各培養容器間にポンプが２個ずつ必要であり、また各所に開閉バルブが必要となっている。
　以上説明したように、本実施形態の細胞培養システムによれば、接着細胞を自動的に培養面から剥離してシングルセルにすることができ、効率的に継代培養や分化誘導を行うことが可能となっている。また、剥離液を培養容器に充填する前と排出した後の両方で培養容器内を自動的に洗浄することができるため、細胞の剥離を効率的に行うことができ、また次世代の継代培養や分化誘導を安全に行うことが可能になっている。
　なお、本実施形態の細胞培養システムにおいて、本実施形態の細胞培養装置に代えて、衝撃付与機構を備えていない細胞培養装置を用いて、各細胞培養装置に載置された培養容器がポートを介して並列して又は直列に連通された構成とすることもできる。
　このような細胞培養システムは、例えば以下のように使用することができる。
　まず、第一の培養容器１０－１に対して培地Ａ容器４１から培地を供給すると共に、接着細胞を供給し、第一の培養容器１０－１の培養面１１－１において細胞を培養する。これにより、培養面１１－１に接着細胞の細胞塊が形成される。
　次に、培養面１１－１から細胞を剥離するに先立って、第一の培養容器１０－１に対して洗浄液容器４３から洗浄液を供給すると共に、第一の培養容器１０－１から廃液容器４５に洗浄液を排出して、第一の培養容器１０－１内を洗浄する。
　次いで、第一の培養容器１０－１に対して剥離液容器４４から剥離液を供給して、３７℃で１０分間放置し、接着細胞が培養面から剥がれやすくした状態とする。
　そして、第一の培養容器１０－１を外側から叩き、培養容器１０－１内における接着細胞を培養面１１－１から剥離し、隣同士の細胞を分離して細胞塊をシングルセルに分解する。
　次に、第一の培養容器１０－１内の細胞を第二の培養容器１０－２に移送して、同様の処理を実行する。
　すなわち、第二の培養容器１０－２において培養された接着細胞を培養面１１－２から剥離してシングルセルに分解する。そして、第二の培養容器１０－２内の細胞を第三の培養容器１０－３に移送して、同様の処理を実行する。
　このような細胞培養システムでは、接着細胞を培養面から手作業により剥離してシングルセルにし、継代培養や分化誘導を行うことが可能である。
［細胞培養方法］
　本実施形態の細胞培養方法は、上述した本実施形態の細胞培養装置２０を用いる細胞培養方法であって、培養容器１０に接着細胞と培地を充填して細胞培養を行い、培養容器１０を架台２１と押圧部材２４の間に挟持した状態で、衝撃付与機構２５，２６により押圧部材２４の端部に衝撃を付与して、培養容器１０から接着細胞を剥離することを特徴とする。
　また、本実施形態の細胞培養方法を、衝撃付与機構２５，２６により押圧部材２４の端部に衝撃を付与して、培養容器１０から接着細胞を剥離すると共に、細胞塊をシングルセルに分解する方法とすることが好ましい。
　さらに、本実施形態の細胞培養方法を、培養容器１０を、細胞の継代培養、又は細胞の分化誘導に用いる方法とすることも好ましい。
　本実施形態の細胞培養方法をこのようにすれば、接着細胞を袋状の培養容器により培養する場合において、接着細胞を効率よく培養面から剥離してシングルセルにすることができ、細胞の継代培養や細胞の分化誘導に好適に用いることが可能となる。
　以下、本発明の実施形態に係る細胞培養装置の効果を確認するために行った試験について説明する。
　まず、袋状の培養容器を作成して、接着細胞を培養した。
　具体的には、ポリエチレンシート（ユメリット１２５ＦＮ，宇部丸善ポリエチレン株式会社）に対して表面処理を行い、表面処理を行った領域を培養面とするフィルムを作成した。そして、２枚のフィルムを重ねて周辺部をヒートシールにより貼り合わせ、培養バッグを形成した。これにより、サンプル１～６の培養バッグを得た。
　このとき、培養バッグの向かい合う２辺にポートを挟み込んで貼り合わせ、２つのポートを備えた培養バッグとした。培養バッグにおける外周シール部及びポート設置部を除いた培養部の面積は、約１００cm2であった。
　また、表面処理にはエキシマ照射装置（株式会社エム・ディ・コム製）を使用し、培養面の親水化処理を行った。エキシマ照射は、電圧１２Ｖ、照射距離４ｍｍ、照射速度２ｍｍ／ｓ×３回の条件で実施した。
　次に、各培養バッグに培地としてＳｔｅｍＦｉｔ(R)（ＡＫ－０２Ｎ　，味の素ヘルシーサプライ株式会社）を封入すると共に、接着細胞（ｉＰＳ細胞１２３１Ａ３株，京都大学ｉＰＳ細胞研究所）を播種して７日間培養した。
　その後、培地を排出して、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で培養バッグを洗浄した後、ＰＢＳを排出した。次に、細胞解離酵素（TrypLETM Select，Thermo Fisher Scientific社）＋ＥＤＴＡのＰＢＳ２倍希釈液を添加し、３７℃で１０分間放置した。そして、細胞解離酵素を排出した後、ＰＢＳで洗浄し、培地を添加した。
　次に、サンプル１の培養バッグについては、外側から手でバッグを叩くことによって、接着細胞を剥離した。そして、剥離した細胞をシリンジで回収して、血球計数盤を用いて細胞数を計数した。この細胞数を回収率算出の基準値とした。
　また、サンプル２の培養バッグについては、本実施形態の細胞培養装置（ソレノイドシリンダ型）に設置して押圧し、培養バッグ内の培地量を１０ｍｌ、液厚を１ｍｍとした。
　そして、培養バッグに対して衝撃付与機構により５０回衝撃を与えて、接着細胞を剥離した。剥離した細胞をシリンジで回収して、血球計数盤を用いて細胞数を計数し、基準値に対する回収率を計算した。
　次に、サンプル３～６の培養バッグについても同様に、本実施形態の細胞培養装置（ソレノイドシリンダ型）に設置して押圧し、培養バッグ内の培地量をそれぞれ２０ｍｌ，５０ｍｌ，１００ｍｌ，１２０ｍｌ、液厚をそれぞれ２ｍｍ，５ｍｍ，１０ｍｍ，１２ｍｍとした。
　そして、各培養バッグに対して衝撃付与機構により５０回衝撃を与えて、接着細胞を剥離した。剥離した細胞をシリンジで回収して、血球計数盤を用いて細胞数を計数し、基準値に対する回収率を計算した。その結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示されるように、培養バッグを本実施形態の細胞培養装置に設置して押圧し、培養バッグ内の液厚をそれぞれ１ｍｍ～１２ｍｍとして衝撃付与機構により衝撃を与えることによって、細胞が回収されている。その回収率は、液厚が１ｍｍのときは１００％、液厚が２ｍｍのときは９６％、液厚が５ｍｍのときは９６％、液厚が１０ｍｍのときは８８％、液厚が１２ｍｍのときは４８％であった。
　この結果から、培養バッグ内の液厚を１ｍｍ～１０ｍｍ以下にして衝撃付与機構により衝撃を与えることで、手作業によりバッグを叩く場合と遜色のない細胞の回収率が得られ得ることが分かった。
　本発明は、以上の実施形態及び実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。例えば、衝撃付与機構として他の手段を用いたり、あるいは衝撃回数を実施例と異なるものにしたりするなど適宜変更することが可能である。
　本発明は、袋状の培養容器を用いて接着細胞を培養するにあたり、細胞の回収や継代培養、分化誘導などを行う場合に好適に利用することが可能である。
　この明細書に記載の文献及び本願のパリ優先の基礎となる日本出願明細書の内容を全てここに援用する。
　１０，１０－１～１０－３　培養容器
　１１　培養面
　１２　ポート
　２０，２０’，２０－１～２０－３　細胞培養装置
　２１，２１’　架台
　２２　天板支持部
　２３　天板部
　２３１　マグネット
　２３２　ガイドピン
　２３３　測長センサ
　２４　押圧部材
　２４１　マグネット
　２４２　ガイド孔
　２４３　金属部材
　２４４　押圧板
　２５　衝撃付与機構（ソレノイドシリンダ型）
　２５１　ロッド
　２５２　ブラケット
　２６　衝撃付与機構（カム型）
　２６１　回転軸
　２６２　カム
　２６３　モータ
　２６４　支持部
　３０　制御装置
　３１　入出力部
　３２　制御部
　３３　操作部
　３４　電源部
　４１　培地Ａ容器
　４２　培地Ｂ容器
　４３　洗浄液容器
　４４　剥離液容器
　４５　廃液容器

Claims (10)

  1. 　軟包材からなる袋状の培養容器を用いて細胞の培養を行う細胞培養装置であって、
    　前記培養容器を載置する架台と、前記架台に載置される前記培養容器を前記架台に対して押圧する押圧部材と、前記押圧部材に衝撃を付与する衝撃付与機構と、を有し、
    　前記押圧部材が前記架台に対して傾斜可能に備えられ、
    　内容液が充填された前記培養容器が前記架台と前記押圧部材の間に挟持された状態で、前記衝撃付与機構が前記押圧部材の端部に衝撃を付与する
    　ことを特徴とする細胞培養装置。
  2. 　２つの前記衝撃付与機構が、前記押圧部材の相対する端部にそれぞれ衝撃を付与するように備えられ、
    　内容液が充填された前記培養容器が前記架台と前記押圧部材の間に挟持された状態で、２つの前記衝撃付与機構が前記押圧部材の相対する端部に交互に衝撃を付与する
    　ことを特徴とする請求項１記載の細胞培養装置。
  3. 　内容液が充填された前記培養容器が前記架台と前記押圧部材の間に平行に挟持された状態における前記培養容器内の液厚が１０ｍｍ以下である
    　ことを特徴とする請求項１又は２記載の細胞培養装置。
  4. 　前記押圧部材が前記架台に対して傾斜した状態で、前記衝撃付与機構による衝撃の付与を停止可能であることを特徴とする１又は２記載の細胞培養装置。
  5. 　前記衝撃付与機構として、カム、ソレノイドシリンダ、エアシリンダ、又は直動系アクチュエータを用いることを特徴とする請求項１又は２記載の細胞培養装置。
  6. 　前記細胞が、接着細胞であることを特徴とする請求項１又は２記載の細胞培養装置。
  7. 　請求項１又は２記載の細胞培養装置を複数備え、それぞれの細胞培養装置に載置された前記培養容器がポートを介して並列して連通されたことを特徴とする細胞培養システム。
  8. 　請求項１又は２記載の細胞培養装置を用いる細胞培養方法であって、
    　前記培養容器に接着細胞と培地を充填して細胞培養を行い、
    　前記培養容器を前記架台と前記押圧部材の間に挟持した状態で、前記衝撃付与機構により前記押圧部材の端部に衝撃を付与して、前記培養容器から前記接着細胞を剥離する
    　ことを特徴とする細胞培養方法。
  9. 　前記衝撃付与機構により前記押圧部材の端部に衝撃を付与して、前記培養容器から前記接着細胞を剥離すると共に、細胞塊をシングルセルに分解することを特徴とする請求項８記載の細胞培養方法。
  10. 　前記培養容器を、細胞の継代培養、又は細胞の分化誘導に用いることを特徴とする請求項８記載の細胞培養方法。
     
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JPH01174372A (ja) * 1987-12-28 1989-07-10 Shimadzu Corp 平膜型濾過器
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