JP6431341B2 - 接着性細胞の培養方法 - Google Patents

Description

本発明は、袋状容器を用いて接着性細胞を培養する方法に関する。

従来、接着性細胞の培養容器として、一般に、スチレン製の組織培養用シャーレまたは組織培養用フラスコが使用されている。これらの容器の培養面を形成するスチレン樹脂自体は疎水性であり、接着性細胞は、接着し難く、その結果、細胞はきわめて増殖しにくく、死滅してしまうことも多い。
ところが、組織培養用のシャーレまたはフラスコは、紫外線照射処理またはプラズマ処理等により、培養面を親水化して接着性細胞が培養面に接着するのを容易にしている。

また、袋状容器を利用した細胞を培養する容器が市販されているが、これらのほとんどが、浮遊性細胞を培養するものである。これらの袋状容器は、一般に、柔軟性を有するオレフィン系樹脂により形成されており、内面が疎水性で、その接触角は９０°近傍または９０°以上であり、一般的に、接着性細胞培養用容器としては適していないと考えられており、通常、これを接着性細胞の培養に使用することはない。
しかし、袋状容器は、閉鎖系で培養できるというメリットがあり、これを接着性細胞の培養に使用しようとする幾つかの試みがなされている。

これらの試みの中で、スチレン製のシャーレまたはフラスコと同じように、袋状容器の内面、すなわち、培養面を紫外線照射処理またはコロナ放電処理等により表面処理して親水化し、接着性細胞が接着しやすい培養面を提供するものがある。例えば、特許文献１では、フィルム表面に紫外線照射して親水化した後で、親水化した面が内面になるように２枚のフィルムを重ね合わせ、周縁をシールして接着性細胞培養用の袋状容器を形成している。また、特許文献２及び３では、フィルム表面をコロナ放電処理した後で、親水化した面が内面になるように２枚のフィルムを重ね合わせ、周縁をシールして接着性細胞培養用の袋状容器を形成している。

ところが、これらの何れの方法も、袋状容器の内面すなわち培養面になる面を外気に晒した状態で表面処理しなければならず、その時に、培養面への異物、細菌の付着を避けるのが困難であった。例えば、インフレーション成形によれば、内面に異物、細菌のないフィルムを容易に形成できるが、折角インフレーション成形しても、表面処理するために、将来培養面になる面を外気に晒さなければならず、同面に異物、細菌が付着することを避けるのが困難である。

また、もう一つの問題点として、ポリエチレンのような柔軟性の高いオレフィン系の樹脂の場合、経時的に、表面処理の劣化が生じやすいという欠点もあり、製品としての具現化が難しく、今もって、商品として汎用化されない理由の一つでもあると考える。

また、袋状容器は、その柔軟さにより、収容した液体の形にならうように変形するので、移動時に生じる小さな慣性力でも反復する波が発生し、これが容器内での前記液状収容物に流れを生じさせて、細胞が接着するのを阻害し、または、接着した細胞が剥離するのを助長する。この傾向は、袋状容器の容量に対して前記液状収容物の量が少ない時に強くでるので、袋状容器の容量に比べて前記液状収容物の量が著しく少ない接着性細胞の培養においては、細胞が接着するのを阻害し、または、接着した細胞をより剥離する傾向が強くなる。これも、袋状容器での接着性細胞の培養をさらに困難としていた。

特開２００９−２７９４４号公報 特開平３−１６０９８４号公報 特開平６−９７５６号公報

そこで、本発明者らは、鋭意検討を行った結果、一般に、未処理のままでは接着性細胞が培養できないと言われてきた素材により形成された培養面を有する容器、すなわち、接着性細胞が接着し難い培養面を有し、かつ、袋状の容器であっても、接着性細胞の接着性を亢進させて培養でき、しかも、接着した細胞が容易に剥離しない培養方法を見出し、本出願人は、先に特願２０１４−１６６２４３明細書で上記の培養方法を提案している。

この培養方法は、細胞培養面となる容器壁を備えた袋状容器に、接着性細胞と液体培地とを含む液状収容物を封入し、容器壁を載置する載置面を有する第１部材と容器壁に対向する容器壁を押さえる押さえ面を有する第２部材とを備えた形状保持手段に袋状容器をセットして、載置面と押さえ面とで袋状容器を押圧して当該容器の内圧を上昇させ、この内圧の上昇により液状収容物の流動を抑制し、この状態を保持することで、接着性細胞が細胞培養面に接着することを促し、または、接着した細胞が剥離することを抑制して、培養性能を向上するものである。
この培養方法により、袋状容器の内面を表面処理することなく接着性細胞の培養ができるので、袋状容器を使用した閉鎖系での接着性細胞の培養が可能となった。

しかしながら、上述した袋状容器を用いた培養方法では、培地交換の際などに、容器内の液体培地を排出して容器内部が空になると、細胞培養面となる容器壁とこの容器壁に対向する容器壁とが接触し、この接触で細胞培養面に接着している細胞が剥離して、その後の培養が不能になることがあった。
特に、本出願人が提案している新たな培養方法にあっては、接着性細胞と液体培地とを含む液状収容物を封入した袋状容器を押圧することで、当該容器の内圧を上昇させ、この内圧の上昇により液状収容物の流動を抑制した状態を保持しているため、容器内の液体培地を排出して容器内部が空になると、細胞培養面となる容器壁とこの容器壁に対向する容器壁とが当接し、この当接で細胞培養面に接着している細胞が剥離するおそれがより高かった。
また、内部が空の袋状容器、すなわち、細胞培養面となる容器壁とこの容器壁に対向する容器壁とが接触または当接している袋状容器に、新たな液体培地を注入すると、注入される液体培地の流動で、細胞培養面に接着している細胞が剥離するおそれがあった。
さらに、培養された細胞を回収する際、液体培地を排出した空の容器内に洗浄液や剥離液を注入するが、細胞培養面に接着している細胞の細胞間結合が解かれる前に、容器内に注入される洗浄液や剥離液の流動で、細胞接着面に接着している細胞の一部が膜状に捲かれて剥離するおそれがあり、分散した状態での細胞の回収が困難となることがあった。
そのため、袋状容器を用いた接着性細胞の培養は、浮遊性細胞の培養に比べて効率が悪いという問題点があった。
また、上述した袋状容器を用いた培養方法において、容器内の液体培地を排出せずに、新たな液体培地等を注入する場合であっても、細胞接着面に接着している細胞の剥離を抑制できることが望ましい。

そこで、本発明は、袋状容器を用いた簡易な方法で、効率よく接着性細胞を培養できる接着性細胞の培養方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成する本発明の接着性細胞の培養方法は、細胞培養面となる容器壁を備えた袋状容器に接着性細胞及び液体培地を含む液状収容物を封入して接着性細胞を培養する培養方法であって、袋状容器を押圧して内圧を上昇させることで液状収容物の流動を抑制し、この状態を維持して接着性細胞が細胞培養面に接着することを促し、または、接着した細胞が剥離することを抑制しながら接着性細胞を培養し、その後、袋状容器の底面側の容器壁に対向する容器壁が細胞培養面となるように袋状容器を反転させた後、袋状容器に気体を注入して、袋状容器の液状収容物の排出又は袋状容器に新たな液状収容物の注入を行う。

本発明において培養し得る接着性細胞は、担体に接着していなければ、増殖できなかったり、死滅したりしてしまう細胞を含むのはもちろんのこと、世代または環境により、担体に接着しなくても成育または増殖可能な細胞であっても、担体に接着させて培養することで何らかの効果を期待して培養する細胞も含まれる。

本発明で使用する袋状容器は、例えば重ね合わされた２枚のフィルムまたはシートの周縁がシールまたは密封された封筒様の形態であって、内容物の形状によって外形が容易に変形する容器であってもよい。また袋状容器は、液状収容物の形状に倣って変形する程度の柔軟性を有する容器であり、例えば、当該容器を移動する時に生じる小さな慣性力で、液状収容物が容器壁と共に変形可能な容器であってもよい。

この袋状容器の細胞培養面とは、細胞が接着して成育または増殖する面であり、容器壁の内面自体であってもよく、細胞の接着性を向上する表面処理を施した面や細胞の接着性を向上する物質を存在させた面などであってもよい。
本発明において袋状容器に注入する気体は、コンタミネーション防止の処理が施された気体が好適であり、その注入量は、袋状容器内の液状収容物を排出して容器内部が空になったときに、細胞培養面となる容器壁とこの容器壁に対向する容器壁との間に気体を存在させることで、両容器壁の接触または当接が回避できる量とするのが好適である。

本発明の接着性細胞の培養方法では、袋状容器を押圧して内圧を上昇させることで液状収容物の流動を抑制するには、容器壁を載置する載置面を有する第１部材と、容器壁に対向する容器壁を押さえる押さえ面を有する第２部材と、を備えた形状保持手段を用い、この形状保持手段に袋状容器をセットし、載置面と押さえ面とで袋状容器を押圧するのが好適である。
袋状容器の内圧を押圧により上昇させると、袋状容器の容器壁に張力が生じ、袋状容器内の液状収容物があたかも周囲を剛体で覆われたかのようになり、容器壁近傍の流動性が失われる。接着性細胞の培養では、一般に培地量が少ないので、液状収容物は狭い隙間に押し込められたような状態になり、全ての液状収容物の近傍が容器壁で占められるようになって、液状収容物全体としての流動が抑制される。
それ故、この状態を維持することによって、接着性細胞の接着性を亢進させて培養でき、また、細胞培養面に接着した細胞が容易に剥離することを抑制でき、この状態で接着性細胞を良好に培養することができる。

本発明の接着性細胞の培養方法では、細胞培養面を袋状容器に注入した気体に晒した状態で、袋状容器の液状収容物の排出又は袋状容器への新たな液状収容物の注入を行うのが好適である。その場合、袋状容器を反転させた後、袋状容器に気体を注入して行うことで、細胞培養面上の接着性細胞をより安定に保つことができる。

本発明の接着性細胞の培養方法によれば、袋状容器を押圧して内圧を上昇させることで液状収容物の流動を抑制した状態を維持できるので、接着性細胞の接着性を亢進させて培養でき、また、細胞培養面に接着した細胞が容易に剥離することを抑制できる。
そして、培地交換、細胞の回収などのために、袋状容器の液状収容物の排出や注入を行う際には、袋状容器に気体を注入してから行うので、容器内の液状収容物を排出して容器内部が空になっても、細胞培養面となる容器壁とこの容器壁に対向する容器壁との間に気体が存在するため、この気体の存在により両容器壁の接触または当接が回避できる。よって、両容器壁の接触または当接による接着性細胞の剥離を防止することができる。

また、細胞培養面を袋状容器中の気体に晒した状態で、液状収容物の排出又は注入を行えば、細胞培養面に接着した接着性細胞と流動する液状収容物との干渉を避けることができる。そのため、液状収容物の流動による接着性細胞の剥離を防止することができ、より好適である。
従って、袋状容器を用いた簡易な方法で、足場依存性の高い接着性細胞を効率よく培養することが可能である。

本発明の実施形態において液状収容物を収容した袋状容器を培養用トレイにセットした状態を示す斜視図である。 図１の一部を断面で示した一部断面図である。 図１の培養用トレイの分解斜視図である。 （ａ）乃至（ｅ）は、液状収容物の排出方法の一例を説明する図である。 （ａ）乃至（ｅ）は、液状収容物の注入方法の一例を説明する図である。 （ａ）乃至（ｃ）は、液状収容物の注入方法の他の例を説明する図である。 （ａ）乃至（ｄ）は、液状収容物の排出方法の他の例を説明する図である。 （ａ）乃至（ｅ）は、液状収容物の排出方法のさらに他の例を説明する図である。 （ａ）乃至（ｇ）は、液状収容物の追加方法を説明する図である。 実施例１における細胞の状態を示す顕微鏡写真であり、（ａ）は細胞播種から２４時間経過後の状態を示し、（ｂ）は細胞播種から４日後の状態を示す。 比較例１における細胞の状態を示す顕微鏡写真であり、（ａ）は細胞播種から２４時間経過後の状態を示し、（ｂ）は細胞播種から４日後の状態を示す。 実施例２における細胞の状態を示す顕微鏡写真であり、（ａ）は細胞播種から４日後の状態を示し、（ｂ）は細胞回収時の剥離直後の状態を示す。 比較例２における細胞の状態を示す顕微鏡写真であり、（ａ）は細胞播種から４日後の状態を示し、（ｂ）は細胞回収時の剥離直後の状態を示す。

以下、本発明の実施形態について説明する。
本発明の実施形態の培養方法では、図1乃至図３に示すように、細胞培養面２２となる容器壁２１を備えた袋状容器２に、接着性細胞と液体培地とを含む液状収容物６を封入して、容器壁２１を載置する載置面３１を有する第１部材３と前記容器壁２１に対向する容器壁２１を押さえる押さえ面４２を有する第２部材４とを備えた形状保持手段１に袋状容器２をセットし、載置面３１と押さえ面４２とで袋状容器２を押圧して当該袋状容器２の内圧を上昇させ、この内圧の上昇により液状収容物６の流動を抑制し、この状態を保持してインキュベートすることで、接着性細胞が細胞培養面２２に接着することを促し、または、接着した細胞が剥離することを抑制して、培養性能を向上する。なお、本発明において、液状収容物は液体収容物を含むものとする。

［液状収容物］
本実施形態の液状収容物６は、袋状容器２に収容され、流動性を有する液体である。培養開始時に収容される液状収容物６は、接着性細胞、液体培地を主成分とする液体であって、これに、血清、その他の添加剤、指示薬等が含まれていても構わない。培養開始又は培養終了後に注入される液状収容物６は、例えば液体培地、接着性細胞やその浮遊液、緩衝液、生理食塩水等の洗浄液、トリプシン、コラゲナーゼ等の細胞剥離液、各種指示薬などであり、これらの１種であってもよく、２種以上の混合物であってもよい。

［袋状容器］
本実施形態の袋状容器２は、互いに対向する一対の容器壁２１，２１間に収容空間が形成された扁平形状の樹脂製袋状容器である。周囲には収容空間と外部とを連通するためのポート２３及びチューブ２４が設けられている。チューブ２４の端部は、液状収容物６を収容空間内に収容または排出する際に、シリンジや他のチューブ等を接続できるとともに密封可能な接続部２５となっている。

ここで、柔軟性を有するとは、例えば液状収容物６を収容した状態で一部を支持した際、自重により容器壁２１が変形する程度の柔軟性を有することを意味し、好ましくは、容器壁２１の変形により、容器内への気体の出入りなしに、収容されている液状収容物６の略全量を排出可能な程度の柔軟性を意味する。

袋状容器２の各容器壁２１，２１はそれぞれ樹脂により形成されており、培養時に載置面３１に接面する容器壁２１の内面が細胞培養面２２となる。細胞培養面２２は培養時に接着性細胞が接着し易い材料からなる容器壁２１の表面であってもよく、容器壁２１の表面に細胞の接着性を向上する表面処理が施された面であってもよい。さらに細胞の接着性を向上する表面処理が施されていない接着性細胞が接着し難い面であってもよい。

ここで、細胞の接着性を向上する表面処理とは、例えば、袋状容器２の容器壁２１を構成する樹脂フィルムや樹脂成形品の表面に、紫外線照射、コロナ放電、プラズマ放電、電子線などの高エネルギーの電磁波や粒子線を照射することで、樹脂表面に親水性の官能基または極性基を生じさせる処理である。

なお、袋状容器２の容器壁２１の少なくとも一部、好ましくは全部が、細胞の成育に必要な酸素の供給と細胞の代謝産物の二酸化炭素の排出とを行えるガス透過性を有しているのがよい。容器壁２１に要求されるガス透過性は、容器内に収容される細胞の種類と細胞の目標増殖数、培養目的、培養容器の寸法によって大幅に変わるので、一概に数値限定できるものではなく、培養目的に合わせて、容器壁の素材、容器壁の面積、容器壁の厚さを選定して調整すればよい。また、収容空間内の細胞の形、細胞の状態、培養の進み具合等を顕微鏡等で観察可能な程度の透明性を有しているのがよい。

この実施形態の容器壁２１を構成する材料としては、例えば低密度ポリエチレン樹脂、低密度直鎖状ポリエチレン樹脂、エチレン・酢酸ビニル共重合体、フッ化ビニリデン樹脂、４フッ化エチレン・６フッ化プロピレン共重合体、及び、これらの混合物により形成されたフィルムまたはシート、さらには、前記素材を少なくとも細胞培養面２２に用いた多層フィルムまたはシートなどの樹脂材料が挙げられる。

［形状保持手段］
本実施形態の形状保持手段１は、液状収容物６が封入された袋状容器２を載置面３１と押さえ面４２とで押圧して袋状容器２の内圧を上昇させ、この内圧の上昇により液状収容物６の流動を抑制する手段である。この形状保持手段１は、インキュベートの間連続して袋状容器２を保持するだけでなく、そのまま細胞培養中の各操作を行える構造となっている。

この形状保持手段１は図３に示すように、トレイ状の第１部材３と袋状容器２を押圧可能に付勢部材４３が設けられた第２部材４と、第１部材３と第２部材４の距離を保持し、押圧状態を維持するための蓋体５から構成されている。第１部材３と蓋体５は、第１部材３に設けられた突起５２と蓋体５に設けられた突起受け５１により第１部材３に固定される。

第１部材３は、袋状容器２を載置する載置面３１と、袋状容器２に連結されたチューブ２４等の引出口３２を有している。載置面３１は平面状に設けられており、培養時には略水平に維持され、袋状容器２は、載置面３１に一方の容器壁２１が当接した状態で載置される。なお、載置面３１は、必ずしも平坦面である必要はなく、多少の凹凸があってもよい。また、載置面３１に、後述する通気孔と同様の通気孔を設けてもよい。

第２部材４は、押さえ板４１と付勢部材４３からなり、押さえ板４１は、載置面３１に対向して配置される押さえ面４２を有し、バネ等の付勢部材４３が組み込まれたピン４４を介して蓋体５に移動可能に支持され、且つ、蓋体５から離間する方向に付勢されている。
袋状容器２を第一部材３に載置して蓋体５を閉じ、突起５２と突起受け５１で第１部材３と蓋体５を固定することで、載置面３１に載置された一方の容器壁２１に対向する他方の容器壁２１を押さえ面４２で押圧する。

押さえ板４１及び押さえ面４２の形状は袋状容器２を押圧できれば特に限定されないが、押さえ板４１と当接する容器壁２１のガス透過性を確保するために、押さえ板４１には複数の通気孔４５を設けたり、通気性を有する材料により形成したりすることができる。

形状保持手段１の第１部材３、蓋体５、押さえ板４１は、保持中に袋状容器２が変形することを防止できる程度の強度を有する。例えば、これらを硬質な材料により形成するのが好ましい。また、インキュベート期間中に保持された袋状容器２の内部を観察し易くするため、透明性を有する材料により形成されているのがよい。

このような形状保持手段１では、液状収容物６を収容した袋状容器２を第１部材３の載置面３１と押さえ板４１の押さえ面４２との間に配置することで、付勢部材４３の付勢力に応じて載置面３１と押さえ面４２とで袋状容器２を押圧して容器の内圧を上昇させた状態で保持することができる。

［培養方法］
次に、このような袋状容器２及び形状保持手段１を用いて接着性細胞を培養する方法について説明する。

まず、予め液体培地を収容した袋状容器２と、予め接着性細胞の細胞浮遊液を充填したシリンジを準備する。袋状容器２のチューブ２４の接続部２５に前記シリンジを接続して、チューブ２４を経由して袋状容器２内に接着性細胞の細胞浮遊液を注入し、チューブ２４を密封して、接着性細胞と液体培地とを含む液状収容物６を封入した袋状容器２を作製する。このとき袋状容器２の収容空間内には気体が入らない方がよい。容器内での気体の移動は液状収容物６に流れを生じさせるからである。

図１乃至図３に示すように、袋状容器２の一方の容器壁２１を第１部材３の載置面３１に載置し、他方の容器壁２１に押さえ板４１の押さえ面４２を当接させて蓋体５を閉じる。すなわち、袋状容器２を形状保持手段１に横に寝かした状態でセットする。

袋状容器２は、セットされた状態では、付勢部材４３の付勢力に応じて載置面３１と押さえ面４２とで押圧され、これにより容器の内圧が上昇する。容器内の内圧が上昇すれば、容器壁２１に接液面と平行方向の張力が生じ、袋状容器２は、あたかもその容器壁２１が剛体であるかのように一定の形状に保持される。
袋状容器２内の液状収容物６は、容器壁２１が剛体のように維持されることで、慣性力によって袋状容器２を変形させることができず、すなわち、液状収容物６は移動する余地がないので、流動が規制される。
この実施形態では、このようにして細胞培養面２２近傍の液状収容物６の流動を阻止し、または、制限した状態で接着性細胞を培養する。

袋状容器２の内圧は、慣性力の大きさに応じて適宜設定することができる。例えば、液状収容物６の質量、袋状容器２の移動時の加速度、または、袋状容器２が受ける振動の強さについては、大きければ大きいほど内圧を高く設定する。すなわち、液状収容物６の慣性力による袋状容器２の変形を抑えられるだけの内圧を袋状容器２に与える。
また、培養操作上、袋状容器２を傾斜させたり、反転させたりする場合には、収容空間の高低差により生じる液圧の変化に対して容器壁が実質的に変形しない程度に加圧する。この実施形態では、袋状容器２を反転させても液状収容物６を収容した袋状容器２の形状が保たれる内圧にしている。

接着性細胞は、自ら生産し、容器壁２１の細胞培養面２２に付着させた接着成分を介して細胞培養面２２に接着し、初めて生育、または、増殖する。そのため、接着性細胞と細胞培養面２２との位置関係を保持するだけでなく、細胞が生産した接着成分を、周囲に拡散させずに、接着細胞とその近傍の細胞培養面２２周辺に集中して保持することが望ましい。

培地の流動性を規制することで、接着性細胞と細胞培養面２２との位置関係を保持し、細胞が生産した接着成分を周囲に拡散させずに、接着細胞とその近傍の細胞培養面２２周辺に集中して保持する。これにより接着性細胞が細胞培養面２２に接着し易くなる。

細胞培養面２２においては、細胞培養面２２近傍の液状収容物６が流動すれば、細胞培養面２２に接着した細胞は、液状収容物６から大きな摩擦力や剪断力を受けて剥離することがあり、培養容器が袋状容器の場合には、容器壁２１の変形によっても細胞が剥離することがある。

特に、培養後期においては、細胞が増殖して密集し、細胞相互の接着が進行し、細胞培養面２２に膜状の細胞集合体を形成する。この状況下で、液状収容物６から大きな摩擦力や剪断力を受けると、その力は、膜状の細胞集合体の端に集中し、端から捲れて巻き込みながら剥離し、利用不可能な細胞塊を形成する。
ところが、この実施形態では、培地の流動性を規制するため、培養後期まで、剥離せずに、利用可能な細胞形態を維持しながら培養することができる。

接着性細胞の細胞培養面２２への接着性は、細胞種及び細胞培養面２２の材質により様々であるので、接着性細胞が影響を受ける液状収容物６の流動の程度は様々である。そのため本実施形態の培養方法では、容器壁２１の変形を阻止または制限しない培養方法と比較し、次の２点が明らかであれば、細胞培養面２２近傍の液状収容物６の流動を阻止し、または、制限しているとみなすことができる。
第１の点は、液状収容物６の流動性が低下していることであり、第２の点は、その液状収容物６の流動性よりも細胞の細胞培養面２２への接着性若しくは増殖性が勝っていること、または、細胞培養面２２に接着した細胞の剥離抵抗性が勝っていることである。

本実施形態では、このように袋状容器２の内圧を上昇させた状態を維持しつつインキュベートする。ここでは袋状容器２をセットした形状保持手段１を、載置面３１が略水平となるようにインキュベータ内に静置して、所定温度で所定時間保持することで行う。
これにより、載置面３１に当接させた一方の容器壁２１の内面側である細胞培養面２２に接着性細胞が接着して培養される。

インキュベート期間中には、細胞の形、細胞の状態、培養の進み具合等を顕微鏡で観察するなど、袋状容器２を移動させて各種の操作が行われることがある。その場合でも、形状保持手段１に袋状容器２をセットした状態を維持したまま各種の操作を行えることが好ましい。
ここでは、インキュベートとは、培養容器を細胞および培養液と共にインキュベータ内に静置することを意味し、インキュベート期間とは、細胞の播種から細胞の取り出しまでの一連のインキュベートが終了するまでの期間を意味し、この期間には、細胞の観察、培地または添加剤の追加または交換等により、インキュベートを一時的に中断する期間も含まれる。

本実施形態における培養方法では、このようにしてインキュベートして接着性細胞を袋状容器２の細胞培養面２２に接着または増殖させ、所定期間経過した後で液体培地を交換し、継続してインキュベートすることを１乃至複数回繰り返す。

液体培地を交換するには、例えば図４及び図５に示すようにして行うことができる。この実施形態では、液体培地を交換するための一連の操作を、袋状容器２を形状保持手段１にセットした状態のまま、即ち、載置面３１と押さえ面４２とで袋状容器２を押圧した状態のままで行う。
ここでは液状収容物６を封入した袋状容器２を形状保持手段１にセットされた状態でインキュベートした後、図４に示す液状収容物の排出方法により、液状収容物６を排出する。

まず、図４（ａ）に示すように、袋状容器２のチューブ２４の接続部２５にシリンジ１７を接続し、（ｂ）に示すように、袋状容器２を形状保持手段１ごとゆっくりと上下反転させ、細胞培養面２２を上側に配置する。
図４（ｃ）に示すように、シリンジ１７によりチューブ２４から袋状容器２内に気体を注入する。これにより液状収容物６の液面を細胞培養面２２に接着した細胞から離間させる。
次に、図４（ｄ）に示すように、液状収容物６の液面を細胞培養面に接着した細胞から離間させた状態を維持しつつ、シリンジ１７によりチューブ２４から袋状容器２の液状収容物６を排出する。このとき気体は、袋状容器２内に残存させ、袋状容器２が形状保持手段１の載置面３１と押さえ面４２とで押圧されていても、この気体の存在により、両容器壁２１，２１が当接しないように維持する。なお、袋状容器２内への気体の注入に関しては、以下に示す実施形態においても、同様である。
その後、図４（ｅ）に示すように、シリンジ１７をチューブ２４から取り外す。

次に、図５に示す液状収容物の注入方法により、新たな液体培地等を含有する新たな液状収容物６を注入する。ここでは、図５（ａ）に示すように、新たな液状収容物６が収容されたシリンジ１７を袋状容器２のチューブ２４の接続部２５に接続する。
そして、図５（ｂ）に示すように、袋状容器２内に気体が残存したままの状態で、シリンジ１７によりチューブ２４から袋状容器２内に新たな液状収容物６を注入する。このとき液状収容物６の液面を、細胞培養面２２に接着した細胞から離間させた状態を維持しつつ液状収容物６を注入する。

次に、図５（ｃ）に示すように、シリンジ１７によりチューブ２４から袋状容器２内の気体を排出することで、細胞培養面２２に接着している接着性細胞を新たな液状収容物６と接触させ、袋状容器２内が液状収容物６で略満たされた状態にする。
そして図５（ｄ）に示すように、袋状容器２を形状保持手段１ごと再びゆっくりと上下反転させ、細胞培養面２２を下側に配置し、その後（ｅ）に示すように、シリンジ１７をチューブ２４から取り外す。これにより培地交換を終了する。

このような培地交換後は、再び、図２に示すように、形状保持手段１を載置面３１が略水平となるようにインキュベータ内に静置し、その状態を維持して再びインキュベートする。そして、１回乃至複数回のインキュベート及び培地交換を経て、細胞培養面で十分に接着性細胞を培養した後、培養された接着性細胞を回収する。

次に、培養された接着性細胞を回収する方法について説明する。
接着性細胞を回収するには、培地交換の操作と同じく、図４（ａ）乃至（ｅ）に示す液状収容物の排出方法により、袋状容器２にシリンジ１７を接続して袋状容器２を上下反転させ、細胞培養面２２を上側に配置し、袋状容器２内に気体を注入して液状収容物６の液面を細胞培養面２２に接着した細胞から離間させる。そして袋状容器２の液状収容物６を排出し、シリンジ１７を取り外すことで、液状収容物６の排出を行う。

次に、図６（ａ）乃至（ｃ）に示す他の液状収容物の注入方法により、液状収容物６としての細胞剥離液を注入する。
ここでは図６（ａ）に示すように、細胞剥離液が収容されたシリンジ１７を袋状容器２のチューブ２４の接続部２５に接続し、（ｂ）に示すように、袋状容器２内の気体が存在する状態で、シリンジ１７によりチューブ２４から袋状容器２内に細胞剥離液を注入する。このとき、細胞剥離液の液面を細胞培養面２２に接着した細胞から離間させた状態を維持しつつ細胞剥離液を注入する。

そして図６（ｃ）に示すように、袋状容器２を形状保持手段１とともに再びゆっくりと上下反転させ、細胞培養面２２を下側に配置することで、細胞培養面２２に接着した細胞に細胞剥離液を接触させるとともに分散状態とし、細胞剥離液に懸濁した状態で接着性細胞を回収する。
その後、他の容器等を利用して固液分離し、洗浄液を用いて十分に洗浄した後、分離して回収する。これにより培養された接着性細胞の回収操作を完了する。

［作用効果］
以上のような本実施形態の接着性細胞の培養方法によれば、培養時には、袋状容器２を押圧して内圧を上昇させることで、液状収容物６の流動を抑制した状態を維持できるので、接着性細胞の接着性を亢進させて培養でき、また、細胞培養面２２に接着した細胞が容易に剥離することを抑制できる。

そして、培地交換時や細胞の回収時に袋状容器２の液状収容物６の排出や注入を行う際には、袋状容器２に気体を注入してから行うので、袋状容器２内の液状収容物６を排出して容器内部が空になっても、細胞培養面２２となる容器壁２１とこの容器壁２１に対向する容器壁２１との間に気体が存在するため、この気体の存在により両容器壁２１，２１の当接が回避できるので、両容器壁２１，２１の当接による、細胞培養面２２に接着している接着性細胞の剥離を防止することができる。
特に、この実施形態では、袋状容器２に気体を注入して細胞培養面２２を気体に晒した状態で、液状収容物６の排出や注入を行うので、細胞培養面２２に接着した接着性細胞と流動する液状収容物６との干渉を避けることができるため、液状収容物６の流動による接着性細胞の剥離を防止することができる。

液状収容物６の排出時に比べ、液状収容物６の注入時には、注入されて流動する液状収容物６に細胞が接触すると大きな摩擦力や剪断力が作用する。そのためこの実施形態では、液状収容物６の注入時に、細胞培養面２２を袋状容器２中の気体に晒して行うことが特に好適である。

［変形例］
なお、上記実施形態は本発明の範囲内で適宜変更可能である。
例えば上記実施形態では、液状収容物６の注入操作と液状収容物６の排出操作とを複数回行い、それぞれに本発明を適用した例について説明したが、何れか１回の操作に本発明を適用することができる。
さらに、液状収容物６の注入操作と液状収容物６の排出操作の双方を行う必要はなく、液状収容物６の注入操作だけであっても、液状収容物６の排出操作だけであっても本発明の範囲内である。

上記実施形態では、液状収容物６の注入時と液状収容物６の排出時とで、それぞれ気体の注入及び反転操作を行ったが、何れか一方でのみ気体を注入して細胞培養面２２を気体に晒してもよく、さらに反転操作を全く行わなくてもよい、
例えば液状収容物６の排出を穏やかに行うことで細胞の剥離を防止できるのであれば、図７（ａ）に示すように、袋状容器２のチューブ２４の接続部２５にシリンジ１７を接続し、図７（ｂ）に示すように、シリンジ１７により袋状容器２内に気体を注入し、図７（ｃ）に示すように、そのまま反転させることなくシリンジ１７により袋状容器２の液状収容物６を排出させることも可能である。
この場合も、気体を注入してから液状収容物６を排出させるため、この気体の存在により両容器壁２１，２１の当接が回避できるので、両容器壁２１，２１の当接による接着性細胞の剥離を防止することができる。
しかも袋状容器２内に気体が存在していれば、容器壁２１，２１同士が離間しているため、袋状容器２内の液状収容物６を完全に排出することが容易となる。
さらに、このように液状収容物６を排出させた後、反転させて図５或いは図６に示される液状収容物の注入方法により液状収容物６を収容することも可能である。

上記実施形態では、液状収容物６の排出操作で容器を反転させる場合、気体注入前に反転させた例と液体排出後に反転させる例について説明したが、図８（ａ）に示すように、袋状容器２のチューブ２４の接続部２５にシリンジ１７を接続し、図８（ｂ）に示すように、シリンジ１７により袋状容器２内に気体を注入し、図８（ｃ）に示すように、袋状容器２を反転させ、その後に図８（ｄ）に示すように、シリンジ１７により袋状容器２の液状収容物６を排出させることも当然に可能である。

上記実施形態では、培養開始後に液状収容物６を注入する場合には、袋状容器２内に既に収容されている液状収容物６の排出操作の後で新たな液状収容物６を注入したが、袋状容器２内に収容されている液状収容物６の排出操作無しで、例えば液体培地のような液状収容物６を追加することも可能である。
例えば図９（ａ）に示すように、シリンジ１７を接続し、図９（ｂ）に示すように、袋状容器２を上下反転させ、図９（ｃ）に示すように、気体を注入して細胞培養面２２を気体に晒した状態にする。この状態で図９（ｄ）に示すように、袋状容器２内に気体を残存させたまま、新たな液状収容物６が収容されたシリンジ１７を袋状容器２に接続し、液状収容物６を注入して追加する。その後、図９（ｅ）に示すように、シリンジ１７により袋状容器２内の気体を排出し、図９（ｆ）に示すように、再び袋状容器２反転させて細胞培養面２２を下側に配置して、図９（ｇ）に示すように、シリンジ１７を取り外して、液状収容物６を追加することもできる。

上記実施形態では、細胞を回収する際、袋状容器２内に液状収容物６を注入して接着性細胞の懸濁液の状態で回収したが、特に限定されるものではなく、懸濁液にすることなく細胞培養面２２に接着した接着性細胞のままで回収することも可能である。

上記実施形態では、図５のように、細胞培養面２２を気体に晒した状態で液体培地等の液状収容物６を注入し、気体を排出させて細胞培養面２２の接着性細胞を液状収容物６に接触させ、その後に袋状容器２を上下反転させる例について説明したが、気体を排出する前に袋状容器２をゆっくり上下反転させることで、細胞の剥離を抑制できれば、上下反転後に気体を排出することも可能である。

上記実施形態では、袋状容器２を押圧して内圧を上昇させることで液状収容物６の流動を抑制するために、図１乃至図３に示すような形状保持手段１を用いた例について説明したが、袋状容器２を押圧するための手段や、袋状容器２の形状を安定化させるための手段は何ら限定されない。例えば、形状保持手段として、第１部材としてのトレイ本体３及び第２部材としての押さえ板４を備えた培養用トレイの例によらず、容器壁を載置する載置面３１と、容器壁を押さえて内圧を上昇させる押さえ面４２と、を備えたものであれば適宜使用可能である。

上記実施形態では、一つの形状保持手段１に一つの袋状容器２を保持して、培養を行った例について説明したが、袋状容器２の数や袋状容器２を保持する部材の数は、任意に設定可能である。例えば、複数の形状保持手段１にそれぞれ一つの袋状容器２を保持させてもよく、一つの形状保持手段１に複数の袋状容器２を保持させることも可能である。さらに複数の形状保持手段１や複数の袋状容器２の配置などについても適宜設定可能である。

上記実施形態では、袋状容器２として、接着性細胞が接着し難い材料からなり、細胞の接着性を向上する表面処理が施されていない容器壁２１を備えたものを使用し、液状収容物６の排出又は注入を行いつつ、接着性細胞を培養し得るが、本発明は、例えば細胞培養面２２を表面処理し、接着性細胞が接着し易い容器壁２１を備えた袋状容器２を使用して、より効率よく接着性細胞を培養することも勿論可能である。
上記実施形態では、袋状容器２の細胞培養面２２を構成する側の容器壁２１として、平坦な内面形状を有するものを例示したが、この容器壁２１の内面の面方向に複数の凹部を設け、各凹部の底面がそれぞれ細胞培養面２２となるように構成することも可能である。

以下、本発明の実施例について説明する。
［実施例１］
図１乃至図３に示すような袋状容器２及び形状保持手段１を用い、接着性細胞を培養した。

（培養準備）
接着性細胞は、正常ヒト新生児包皮線維芽細胞（クラボウ社製）を使用した。
液体培地は線維芽細胞用合成培地ＥＩＤＦ（＋）（ニプロ社製、商標）を用い、牛胎児血清を５ｗｔ％となるように添加し、調製した。

袋状容器２は、エチレン酢酸ビニル共重合体（東ソー社製ウルトラセン６３０（商標））をインフレーション成形により形成した厚さ０．１４ｍｍのシートからなる一対の容器壁２１，２１を有し、容器壁２１，２１間に形成される収容空間の最大幅及び最大長さが５ｃｍ×１０ｃｍで、細胞培養面２２の面積は約５０ｃｍ^２であった。なお、細胞培養面２２は、接着性細胞が接着し易くなる表面処理が施されておらず、細胞培養面２２の水の接触角は９３度であった。

（細胞播種）
袋状容器２に予め前記液体培地に２５ｍｌの液状収容物６を封入しておき、細胞浮遊液をシリンジで注入することで、細胞播種濃度が５０００ｃｅｌｌ／ｃｍ^２となるように接着性細胞を播種し、同時に、袋状容器２内に空気が残留しないように、混入した空気を除去した。この時、袋状容器２の二つの容器壁２１，２１間の寸法は外寸で約５ｍｍであった。

袋状容器２を横に寝かせた状態で形状保持手段１にセットし、一対の容器壁２１，２１を載置面３１と押さえ面４２とで押圧した。セット状態では袋状容器２の内圧は、３００ｍｍ水柱であった。

（培養過程）
袋状容器２を形状保持手段１にセットした状態のまま、インキュベータに収容し、３７℃、二酸化炭素濃度５％、湿度９５％以上の加湿下で、４日間インキュベートした。
インキュベート期間中には、袋状容器２を形状保持手段１にセットした状態のまま、インキュベータから取り出して顕微鏡により細胞の接着状態を観察した。
また、インキュベート期間中には、図４に示す液状収容物の排出方法と図５に示す液状収容物の注入方法とを使用した培地交換方法により、培養開始３日目に培地交換を１回行った。この培地交換では、液状収容物２０ｍｌを抜き取って廃棄し、新たに２０ｍｌの新鮮培地を注入した。

インキュベート期間経過後、図４に示す液状収容物の排出方法と図６に示す液状収容物の注入方法とを使用した細胞回収方法により、細胞を取り出した。
１０ｍｌの無菌空気の入ったシリンジを袋状容器２のチューブ２４の接続部２５に接続し、細胞培養面２２が上側になるように袋状容器２を形状保持手段１ごとゆっくりと反転し、袋状容器２に空気を注入して、袋状容器２の液状収容物６の液面を細胞培養面２２に接着した細胞から離間させてから、チューブ２４を介して袋状容器２の液状収容物６をゆっくりと抜き出した
その後、細胞剥離液としてＰＢＳで１０倍希釈したトリプシン（０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ-ＥＤＴＡ Ｇｉｂｃｏ）３ｍｌを収容したシリンジを袋状容器２のチューブ２４の接続部２５に接続し替えて、袋状容器２内にゆっくりと細胞剥離液を注入した。次に、ゆっくりと反転して細胞培養面２２が下側になるように戻して、すなわち、細胞剥離液が細胞面にゆっくりと、均一に広がるようにして、細胞剥離液と細胞を接触させた。

１分後、細胞分散用の液体として、ＰＢＳ１０ｍｌを収容したシリンジを袋状容器２のチューブ２４の接続部２５に接続し替えて、袋状容器２内にゆっくりとＰＢＳを注入し、細胞を分散させてからシリンジに抜き出し、回収した。

（培養結果）
細胞播種から２４時間経過後と４日後の細胞回収直前の顕微鏡写真を、図１０（ａ）と図１０（ｂ）に示す。また、細胞の生育状態の評価及び細胞濃度を表１に示す。
図１０（ａ）より、細胞播種から２４時間後、殆どの細胞が細胞培養面に接着していて、細胞の凝集は見られなかった。また、図１０（ｂ）より、４日後の細胞回収直前においては、コンフルとなっていたが、捲れて巻きながら剥離するもの、剥離して細胞塊になったものは見られなかった。そのため、トリプシンによる回収操作で、細胞を個々に分散した状態で回収することができ、細胞数の計数もできた。表１より、回収された細胞総数は、細胞播種時より十分に増加しており、細胞が順調に増殖したことが確認できた。

［比較例１］
形状保持手段１を用いずに、液状収容物６を封入した袋状容器２を平らなアクリル板上に、押圧をかけずに載置して培養したが、細胞が浮遊して細胞塊を形成していたため、培地交換及び細胞回収操作を行うことができなかった。
このため、実施例１で行った３日目の培地交換及び４日後の回収操作は行っていないが、それ以外については、全て実施例１と同様に接着性細胞を培養した。

細胞播種から２４時間経過後と４日後の細胞回収直前の顕微鏡写真を図１１（ａ）と図１１（ｂ）に示す。また、細胞の生育状態の評価及び細胞濃度を表１に示す。
図１１（ａ）より、細胞播種から２４時間後、細胞培養面２２に接着している細胞もあるが、その数は少なく、細胞培養面２２に接着せずに浮遊して細胞の凝集塊を形成するものもあった。また、図１１（ｂ）より、４日後においては、接着している細胞は見られず、少し大きくなった細胞の凝集塊がまばらに見られた。量的な観点から見て、これは、細胞塊が増殖した結果ではなく、播種した細胞が凝集した結果と考えられる。
なお、この細胞塊は、トリプシンで処理しても個々の細胞に分散しないので、細胞数の特定にまで至らなかった。

［実施例２］
実施例１で培養した接着性細胞を、図６に示す液状収容物の注入方法によりトリプシンで処理して回収した。
細胞播種から４日後と細胞回収時の剥離直後との観察結果を示す顕微鏡写真を図１２（ａ）及び図１２（ｂ）に示す。
図１２（ａ）、図１２（ｂ）から明らかな通り、４日後殆どの接着性細胞が細胞培養面に接着していて凝集なども見られず、回収時の剥離直後には、細胞が分散した状態で剥離していた。また細胞回収濃度が十分に増加しており細胞が増殖していて、効率よく回収できた。さらに回収された細胞の一部を使用した継代も可能であった。

［比較例２］
袋状容器の反転及び気体の注入を行わずに、ゆっくりと細胞剥離液を注入して細胞回収を行う他は、全て実施例２と同様に接着性細胞を培養して回収した。
培養結果として、細胞播種から４日後の観察結果を示す顕微鏡写真を図１３（ａ）及び図１３（ｂ）に示す。

図１３（ａ）から明らかなとおり、比較例２では４日後には、実施例２と同程度に接着性細胞が細胞培養面に接着していて凝集なども見られなかった。しかし図１３（ｂ）のように、回収時の剥離直後には、細胞が一部膜状に剥離していた。そのため、膜状に剥離した部分の細胞は分散状態にできず、細胞数の計数は不可能であった。また、継代も不可能であった。

１ 形状保持手段
２ 袋状容器
３ 第１部材
４ 第２部材
５ 蓋体
６ 液状収容物
２１ 容器壁
２２ 細胞培養面
２３ ポート
２４ チューブ
２５ 接続部
３１ 載置面
３２ 引出口
４１ 押さえ板
４２ 押さえ面
４３ 付勢部材
４４ ピン
４５ 通気孔
５１ 突起受け
５２ 突起

Claims (2)

1. 細胞培養面となる容器壁を備えた袋状容器に接着性細胞及び液体培地を含む液状収容物を封入して接着性細胞を培養する培養方法であって、
   前記袋状容器を押圧して内圧を上昇させることで前記液状収容物の流動を抑制し、この状態を維持して前記接着性細胞が前記細胞培養面に接着することを促し、または、接着した細胞が剥離することを抑制しながら前記接着性細胞を培養し、
   その後、前記袋状容器の底面側の容器壁に対向する容器壁が前記細胞培養面となるように前記袋状容器を反転させた後、前記袋状容器に気体を注入して、前記袋状容器の液状収容物の排出又は前記袋状容器に新たな液状収容物の注入を行う、接着性細胞の培養方法。
2. 前記細胞培養面を前記気体に晒した状態で、前記袋状容器の液状収容物の排出又は前記袋状容器に新たな液状収容物の注入を行う、請求項１に記載の接着性細胞の培養方法。