JP7379824B2 - 液厚制御機構、培養装置、及び液厚制御方法 - Google Patents
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Description
例えば、培地交換を行うために、多数のウェルを培養部に備えた培養バッグ(袋状の培養容器)内に培地を送液すると、スフェアは簡単にウェルから飛び出して他のウェルに移動するため、培地の流速を極めて遅くする必要があり、迅速な培地交換が非常に困難であった。このため、このような培養バッグは、頻繁に培地交換が必要な長期間培養には不向きであった。
また、このような培養バッグでは、振動を与えただけでもスフェアが簡単にウェルから飛び出してしまうため、スフェアの培養中に培養バッグを安全に移動させることは、容易にはできなかった。
しかしながら、このように培養バッグにおける培地の液厚を制御することは、従来は、実現されていなかった。
例えば、重量センサを用いて、培養バッグとこれを保持する保持プレートなどを合わせた重量を測定し、この重量にもとづき培地の重量を算出して、培養バッグへの培地の送液を制御することが行われていた。
また、このような重量センサを用いた従来の測定では、培地の重量にもとづいて送液量を制御することはできるが、培養バッグにおける培地の液厚を制御することはできなかった。
この培養装置では、距離センサをスペーサに配置して、保持板とスペーサとの距離が一定以上に大きくなった状態を把握可能にしている。
しかしながら、この培養装置では、培養バッグにおける培地の液厚を検出しておらず、培地の液厚の制御は行われていない。
しかしながら、このような培養容器では、隔室の周壁部と仕切り部材の位置合わせや、隔室と仕切り部材間のギャップの調整が難しいという問題があった。また、底部や仕切り部材の反りがある場合には、これらは更に難しくなるため、この培養容器を軟包材からなる培養バッグに適用することは困難であった。
また、培養バッグの上面フィルムと下面フィルムが接触するタイミングを把握できるため、ポンプの故障や設置不良などの異常検出を行うことも可能となる。
さらに、このように培養バッグ内における凹部間でスフェアが移動できないようにした状態のままで、培地を送液して、培地交換を行うことも可能である。
そして、培養バッグ10に注入される培地の量に応じて、底部側フィルム11と天板側フィルム12の間隔(液厚)が変化するようになっている。
なお、本実施形態に係る液厚制御機構において用いられる培養バッグは、このような形状のものに限定されず、同一形状の底部側フィルム11と天板側フィルム12をヒートシールなどにより貼り合わせることによって形成してもよい。
培養バッグ10における凹部をこのような形状にすることで、ポート13から培養バッグ10内に培地を送液する場合に、その流速を1ml/分以上にしても、凹部から培養対象物が飛び出して、他の凹部へ移動することを防止することが可能である。
例えば、培養対象物をスフェアとする場合、凹部の開口部の円又は内接円の直径の下限を、60μm以上,70μm以上,80μm以上,90μm以上,100μm以上,110μm以上,120μm以上,150μm以上等としてもよい。また、凹部の開口部の円又は内接円の直径の上限を、1mm以下,900μm以下,800μm以下,700μm以下,500μm以下等としてもよい。
また、培養対象物をシングルセルとする場合、凹部の開口部の円又は内接円の直径の下限を、5μm以上,6μm以上,8μm以上等としてもよい。また、凹部の開口部の円又は内接円の直径の上限を、50μm以下,40μm以下,30μm以下等としてもよい。
細胞接着抑制剤としては、リン脂質ポリマー、ポリビニルアルコール誘導体、リン脂質・高分子複合体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、アルブミン等を用いることができる。また、これらを組み合わせて用いてもよい。
、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリスチレン系エラストマー、FEPなどの熱可塑性樹
脂で成形することができる。
培地の液厚の変化に応じて生じる変化としては、部材の位置の変位とすることができ、検出部として測長センサを好適に用いることができる。
また、制御部により検出情報にもとづき培地の液厚を算出させ、この液厚にもとづき送液手段の動作を制御することができる。
また、電磁誘導タイプの測長センサなどを用いる場合、測定する位置に金属部材を取り付けることが好ましい。これにより、センサの感度を向上させることができるためである。なお、レーザタイプや超音波タイプの測長センサなどを用いる場合は、測定する位置に金属部材を取り付けることなく、測定することができる。
例えば、培養部の面積が50cm2の培養バッグを用いる場合、0.01mmの液厚の培地の液量は、0.05mlである。この場合、送液速度を2ml/分とすると、1.5秒で培地を送液でき、液厚を0.01mm増減させることができる。また、送液速度を0.5ml/分とすると、6秒で培地を送液でき、液厚を0.01mm増減させることができる。
この場合、液厚は、測長センサの出力電圧に所定の係数を乗算し、フィルムの厚みなどを減算する補正を行うことで得ることができる。
この場合、液厚は、測長センサの出力電圧に所定の係数を乗算して測長センサから金属部材までの距離を算出し、培養バッグが載置された架台の上面から測長センサの下面までの距離から、上記の算出された距離と金属部材の厚みと押圧部材の高さとフィルムの厚みを減算することで得ることができる。
すなわち、測定時点の重量から培養バッグの液厚がゼロの時点の重量を減算して体積に換算し、これを培養部の面積で除算することによって液厚を算出し、この液厚にもとづき送液手段の動作を制御することも可能である。
また、培養バッグの上面フィルムと下面フィルムが接触するタイミングを把握できる。これにより、培養バッグ内に培地が無い状態になることを防止することができる。また、ポンプの故障や設置が不適切であることによる送液エラーを検出することも可能となる。
さらに、天板部23には、天板開口部231が設けられており、この天板開口部231を通じて培養装置20の内部が視認できるようになっている。
なお、付勢手段73は、永久磁石に限定されない。また、付勢手段73を省略して、押圧部材27の自重により、押圧部材27を天板側フィルム12に対して上下に移動させてもよい。
このように、押圧部材27により培養バッグ10を押圧することによって、天板側フィルム12の起伏の発生が抑制される。その結果、培地の注入又は排出を行う間、天板側フィルム12が架台21の載置面と平行に保たれ、培養バッグ10における培地の液厚が均一となる。
一方、培養バッグ10のポート13に連結されたチューブ14を介して、チューブ14に配置された送液手段30により培養バッグ10から培地が排出されると、それに従って、培養バッグ10における培地の液厚は減少し、これに伴って押圧部材27は下降する。
例えば、液厚は、測長センサ25の出力電圧に所定の係数を乗算して測長センサ25から金属部材2722までの距離を算出し、架台21の上面から測長センサ25の下面までの距離から、上記の算出された距離と金属部材2722の厚みと押圧部材の高さと上面フィルム及び下面フィルムの厚みを減算することによって得ることが可能である。
送液手段30の動作は、測長センサ25からの検出情報にもとづいて、制御部60により制御される。このとき、制御部60は、測長センサ25から入力した(送信されてきた)出力電圧(又は出力電流)にもとづき培養バッグ10における培地の液厚を算出して、液厚にもとづき送液手段30の動作の開始と停止、及び回転速度等を制御して、液厚を所望の大きさに制御することが可能になっている。
インキュベータ50は、培養バッグ10、培養バッグ収容部20、送液手段30、及び培地バッグ40を収容して一定の温度及び湿度を保ち、培養バッグ10内における細胞やスフェアの培養環境を維持する。
例えば、制御部60におけるPLC62により、培地の液厚がゼロである第一の状態に対応する第一の情報を記憶させ、第一の情報に所定の変化量を加算して第二の情報を算出し、第二の情報にもとづき送液手段30の動作を制御して、培地の液厚を第二の情報に対応する第二の状態に制御することができる。なお、第一の情報及び第二の情報は、電圧、電流、トランジスタ出力、又は培地の液厚等とすることができる。
例えば、培養バッグを載置する架台に測長センサを配置すると共に、押圧部材に金属部材を配置して、培養装置を構成することもできる。また、重量センサを用いて、培養バッグ10における培地を含む重量を検出して制御部60に出力し、制御部60が、培地の重量にもとづき培地の液厚を算出して、送液手段30の動作を制御する構成とすることもできる。
すなわち、二つのポートのそれぞれに連結されたチューブにポンプなどを配設して、本実施形態に係る培養装置及び液厚制御方法を実現することも好ましい。
これらの図において、培養バッグ10aの一方のポート13aには、チューブを介して培地バッグ40が連結され、これに送液手段30が配設されている。このとき、培地バッグ40は、培地供給バッグなどとして用いることができる。また、培養バッグ10aの他方のポート13aには、チューブを介して廃液バッグ40aが連結され、これに送液手段30aが配設されている。なお、各ポートにチューブを介して連結するバッグは、その他の用途のものであってもよい。
このため、例えば培養バッグ10aにおける培地の液厚を、スフェアが移動できない大きさ(約50μmの隙間)にした状態のままで、培地を培地バッグ40から培養バッグ10aへ送液し、かつ、培地を培養バッグ10aから廃液バッグ40aへ送液して、培地の交換を行うことが可能となる。また、このとき、送液手段30及び送液手段30aの動作を制御して、培地の送液スピードを制御することも可能である。
また、iPS細胞やES細胞、その他幹細胞から既に分化誘導工程を経て得られた分化細胞を使用してスフェアを形成させる方法や、分化誘導した細胞を一度凍結保存し、再度解凍後にスフェアを形成する方法等において用いることもできる。
また、培養バッグの上面フィルムと下面フィルムが接触するタイミングを把握でき、これにより、培養バッグ内に培地が無い状態になることを防止することが可能である。また、ポンプの故障や設置が不適切であることによる送液エラーを検出することも可能である。
11,11a,11b 底部側フィルム
111,111a,111b 凹部
12 天板側フィルム
13 ポート
14 チューブ(管状部材)
20 培養バッグ収容部
21 架台
22 天板支持部
23 天板部
231 天板開口部
24 センサ支持部
25 測長センサ
26 永久磁石
27 押圧部材
271 押圧部
272 取付部
2721 永久磁石
2722 金属部材
273 ガイドピン
30 送液手段
40 培地バッグ
50 インキュベータ
60 制御部
61 入出力部
62 PLC(プログラマブルロジックコントローラ)
63 継電部
64 操作部
65 電源部
66 配線遮断部
Claims (12)
- 少なくとも一つのポートが備えられた軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を制御する培養装置であって、
前記培養バッグが載置される架台と、
前記培養バッグを前記架台に対して押圧することにより、前記培養バッグ内の液厚を均一にする押圧部材と、
前記押圧部材に対面して配置された天板部と、
前記天板部に対して前記押圧部材を垂直方向に移動可能に支持する支持機構と、
前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化を測定するアナログ式の測長センサである検出部と、
前記検出部から入力した検出情報にもとづいて、前記培養バッグ及び培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、前記培養バッグ及び前記培地バッグ間における培地の送液を制御する制御部と、有し、
前記制御部は、前記送液手段の動作を制御することにもとづいて前記培地の液厚を制御することを特徴とする培養装置。 - 前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化が、部材の位置の変位であり、前記検出部が前記測長センサであることを特徴とする請求項1記載の培養装置。
- 前記制御部が前記培地の液厚を算出し、この液厚にもとづき前記送液手段の動作を制御することを特徴とする請求項1又は2記載の培養装置。
- 前記測長センサが前記天板部に配置され、前記測長センサが前記押圧部材に配置された金属部材までの距離を測定することを特徴とする請求項2又は3に記載の培養装置。
- 前記測長センサが前記架台に配置され、前記測長センサが前記押圧部材に配置された金属部材までの距離を測定することを特徴とする請求項2又は3に記載の培養装置。
- 前記押圧部材における前記培養バッグを押圧する押圧部の水平面の形状が、前記培養バッグにおける培養部の水平面の形状と同一であり、前記押圧部が前記培養部の領域内のみを押圧することを特徴とする請求項1~5のいずれかに記載の培養装置。
- 前記培養バッグにおける培養部に培養対象物を収容する複数の凹部が形成され、
前記制御部は、前記送液手段の動作を制御することにもとづいて前記培地の液厚を前記培養対象物が移動できない大きさに制御可能であることを特徴とする請求項1~6のいずれかに記載の培養装置。 - 少なくとも一つのポートが備えられた軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を制御する液厚制御方法であって、
前記培養バッグが載置される架台と、前記培養バッグを前記架台に対して押圧することにより、前記培養バッグ内の液厚を均一にする押圧部材と、前記押圧部材に対面して配置された天板部と、前記天板部に対して前記押圧部材を垂直方向に移動可能に支持する支持機構と、前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化を測定するアナログ式の測長センサである検出部と、前記検出部から入力した検出情報にもとづいて、前記培養バッグ及び培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、前記培養バッグ及び前記培地バッグ間における培地の送液を制御する制御部を有する培養装置を用いて、
前記制御部により、前記培地の液厚がゼロである第一の状態に対応する第一の情報を記憶し、第一の情報に所定の変化量を加算して第二の情報を算出し、前記第二の情報にもとづき前記送液手段の動作を制御して、前記培地の液厚を第二の情報に対応する液厚に制御する
ことを特徴とする液厚制御方法。 - 前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化が、部材の位置の変位であり、前記検出部が前記測長センサであることを特徴とする請求項8に記載の液厚制御方法。
- 前記第一の情報及び前記第二の情報が、電圧、電流、トランジスタ出力、又は前記培地の液厚のいずれかであることを特徴とする請求項8又は9記載の液厚制御方法。
- 二つのポートが備えられた前記培養バッグを用いて、第一のポート及び第一のバッグを連結する管状部材に第一の送液手段を配設すると共に、第二のポート及び第二のバッグを連結する管状部材に第二の送液手段を配設し、前記制御部により、前記検出部から入力した検出情報にもとづいて、前記第一の送液手段及び前記第二の送液手段を介して送液される培地の液厚を、前記第一の送液手段及び前記第二の送液手段の動作を制御することにもとづいて制御することを特徴とする請求項8~10のいずれかに記載の液厚制御方法。
- 前記培養バッグにおける培養部に培養対象物を収容する複数の凹部が形成され、
前記制御部は、前記送液手段の動作を制御することにもとづいて前記培地の液厚を前記培養対象物が移動できない大きさに制御可能であることを特徴とする請求項8~11のいずれかに記載の液厚制御方法。
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