WO2020166233A1 - 液厚制御機構、培養装置、及び液厚制御方法 - Google Patents

液厚制御機構、培養装置、及び液厚制御方法 Download PDF

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WO2020166233A1
WO2020166233A1 PCT/JP2020/000210 JP2020000210W WO2020166233A1 WO 2020166233 A1 WO2020166233 A1 WO 2020166233A1 JP 2020000210 W JP2020000210 W JP 2020000210W WO 2020166233 A1 WO2020166233 A1 WO 2020166233A1
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culture
medium
bag
liquid
liquid thickness
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PCT/JP2020/000210
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小関　修
郷史 田中
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東洋製罐グループホールディングス株式会社
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    • C12M41/48—Automatic or computerized control
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M41/44—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of volume or liquid level

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture technique, and particularly to a technique for improving the efficiency of sphere creation and the like.
  • a culture bag made of soft packaging material is used, and by controlling the liquid thickness of the medium filled in the culture bag, the upper surface of the culture bag and the lower surface with wells If the gap between the films can be controlled to a size in which the sphere cannot move, the problem of moving the sphere as described above can be solved.
  • controlling the thickness of the medium in the culture bag in this manner has not been realized in the past.
  • the load cell type is generally used for the measurement using such a weight sensor, and it is difficult to fix it because it is necessary to load the weight of the culture bag and the holding plate to the minute points of the load cell. There was a problem of weakness.
  • the weight sensor is weak in temperature characteristics such as low temperature and needs to be evenly attached to a plurality of places, which makes it difficult to attach the weight sensor.
  • the tube is brought into contact with another housing or the like via the tube, so that the tension of the tube is applied to the weight sensor, resulting in an error in the measured value.
  • the liquid delivery amount can be controlled based on the weight of the medium, but the liquid thickness of the medium in the culture bag cannot be controlled.
  • the culture device described in Patent Document 1 can be cited as a technique related to the control of the feeding of the medium to the culture bag.
  • a distance sensor is arranged on the spacer so that the state where the distance between the holding plate and the spacer becomes larger than a certain value can be grasped.
  • the liquid thickness of the medium in the culture bag is not detected, and the liquid thickness of the medium is not controlled.
  • the weight of the culture bag and its holding portion is detected by using the weight detection portion.
  • the liquid thickness of the medium in the culture bag is not detected, and the liquid thickness of the medium is not controlled.
  • This culture container includes a container body having a bottom portion having a compartment formed therein and a peripheral wall portion rising from a peripheral portion of the bottom portion, and a partition member arranged at a position facing the bottom portion, and at least part of the partition member. Is immersed in the culture solution in the container body. This prevents the spheres from moving during the movement of the culture vessel or the medium exchange.
  • a culture container there is a problem that it is difficult to align the peripheral wall portion of the compartment with the partition member and to adjust the gap between the compartment and the partition member. Further, when there is a warp in the bottom portion or the partition member, these become more difficult, and thus it was difficult to apply this culture container to a culture bag made of a soft packaging material.
  • the present inventors have conducted diligent research to detect the liquid thickness of the culture medium filled in the culture bag made of the soft packaging material, and based on the detection information, the culture bag and the culture medium bag are arranged on the tubular member that connects them.
  • the present invention has been completed by successfully controlling the liquid thickness of the medium in the culture bag by controlling the operation of the liquid feeding means and controlling the liquid feeding of the medium.
  • liquid thickness control mechanism of the culture bag since the liquid thickness of the medium in the culture bag can be grasped, it becomes possible to grasp the remaining amount of the medium in the culture bag. Further, since it is possible to grasp the timing at which the upper surface film and the lower surface film of the culture bag come into contact with each other, it becomes possible to detect an abnormality such as a pump failure or a defective installation.
  • the liquid thickness of the culture medium in the culture bag can be controlled, it is possible to control the gap between the upper surface film of the culture bag and the lower surface film having a plurality of recesses to a size such that the sphere cannot move. Further, it is also possible to exchange the medium by feeding the medium while keeping the sphere immovable between the recesses in the culture bag.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a liquid thickness control mechanism, a culture device, and a liquid thickness control method capable of controlling the liquid thickness of a medium in a culture bag used in cell culture. With the goal.
  • the liquid thickness control mechanism of the present invention is a liquid thickness control mechanism for controlling the liquid thickness of a medium filled in a culture bag made of a soft packaging material having at least one port, A detection unit that measures a change that occurs according to a change in the liquid thickness of the culture medium, and a liquid feeding unit that is arranged in a tubular member that connects the culture bag and the culture medium bag based on the detection information input from the detection unit. And a control unit for controlling the liquid feeding of the culture medium between the culture bag and the culture medium bag.
  • the culturing device of the present invention is a culturing device for controlling the liquid thickness of a medium filled in a culturing bag made of a soft wrapping material provided with at least one port, and a cradle on which the culturing bag is placed.
  • a detection unit that measures a change that occurs according to a change in the liquid thickness of the medium, and based on the detection information input from the detection unit,
  • the culture bag and the culture medium bag are connected to each other by a tubular member, and the operation of the liquid supply means is controlled to control the flow of the culture medium between the culture bag and the culture medium bag.
  • the liquid thickness control method of the present invention is a liquid thickness control method for controlling the liquid thickness of a medium filled in a culture bag made of a soft packaging material provided with at least one port, wherein the culture bag is mounted.
  • a pedestal to be placed, and by pressing the culture bag against the pedestal, a pressing member for making the liquid thickness in the culture bag uniform, and a top plate portion facing the pressing member,
  • a support mechanism that supports the pressing member so as to be vertically movable with respect to the top plate portion, a detection unit that measures a change that occurs according to a change in the liquid thickness of the medium, and detection information that is input from the detection unit.
  • control unit for controlling the operation of the liquid feeding means arranged in the tubular member connecting the culture bag and the medium bag to control the liquid feeding of the medium between the culture bag and the medium bag.
  • the control unit stores the first information corresponding to the first state in which the liquid thickness of the medium is zero, and adds a predetermined change amount to the first information to obtain the second information. Is calculated and the operation of the liquid feeding means is controlled based on the second information to control the liquid thickness of the medium to the second state corresponding to the second information.
  • a liquid thickness control mechanism capable of controlling the liquid thickness of a medium in a culture bag used in cell culture.
  • FIG. 1 is an explanatory view showing the outline of a culture bag used in the liquid thickness control mechanism according to the present embodiment
  • (a) is a plan view
  • (b) is a front view
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a part of a culture part including various recesses of a culture bag used in the liquid thickness control mechanism according to the present embodiment.
  • the culture bag 10 of the present embodiment is a culture bag made of a soft packaging material, and is formed by bonding the bottom side film 11 (lower surface film) and the top plate side film 12 (upper surface film) peripheral portions by heat sealing or the like. can do. Further, the culture bag 10 is provided with at least one port 13. A tube is connected to this port 13, and the medium is injected into the culture bag 10 and the medium is discharged from the culture bag 10 through the port 13 by means of a liquid feeding means arranged in the tube. It is designed to deliver liquid. Then, the interval (liquid thickness) between the bottom side film 11 and the top plate side film 12 is changed according to the amount of the medium injected into the culture bag 10.
  • the surface of the bottom film 11 in the culture bag 10 is used as a culture section for culturing cells and spheres.
  • the culture portion of the bottom film 11 has a plurality of recesses for accommodating culture objects such as cells and spheres. By forming such recesses, it is possible to suitably form and culture spheres. Further, the plurality of recesses in the culture section 11 may be arranged in a staggered pattern or a lattice pattern, for example.
  • the bottom film 11 of the culture bag 10 is flat, and the top film 12 swells upward as the culture medium flows in.
  • the culture bag 10 By setting the culture bag 10 in this way, the liquid thickness of the medium in the culture bag 10 can be made uniform, and all the recesses can be brought into contact with the mounting surface. For this reason, it becomes possible to reduce the difference in the proliferative property of the culture object and the variation in the number of cells at the time of cell seeding.
  • the culture bag used in the liquid thickness control mechanism according to the present embodiment is not limited to such a shape, and the bottom side film 11 and the top plate side film 12 having the same shape may be bonded by heat sealing or the like. It may be formed by.
  • the culture bag 10 is formed such that the shape near the port of the culture section is inclined with respect to the port, which makes it easier for the medium to flow into the port.
  • the shape of the culture section is not limited to such a shape, and the culture section may have a rectangular shape such as a rectangle. Further, as will be described later, the culture bag can be suitably provided with two or more ports.
  • the shape of the recess formed in the culture portion of the bottom film 11 is a cone such as a cone or a quadrangular pyramid as shown in FIG. 2A, or a hemispherical shape or a rounded shape as shown in FIG. 2B. can do.
  • the shape of the recess formed in the culture portion of the bottom side film 11 is such that at least a part of the side wall is formed in a substantially vertical shape as shown in FIG. 2(c).
  • the vertical length of the substantially vertical portion of the side wall is longer than half the maximum diameter of the culture object.
  • the shape of the region where the side wall of the recess is substantially vertical can be, for example, a columnar shape, a quadrangular prism shape, or the like.
  • the depth of the recess is preferably 50 to 500 ⁇ m. This is because if the depth of the recesses is larger than 500 ⁇ m, it may be difficult to sufficiently replace the medium in the recesses even when the culture medium is fed to the culture bag 10. Therefore, the recesses deeper than 500 ⁇ m were provided. This is because the culture container becomes more difficult to process. This is because the size of the sphere is about 50 ⁇ m to 100 ⁇ m for the small sphere and about 200 ⁇ m to 300 ⁇ m for the large sphere.
  • the shape of the bottom of the recess is not particularly limited, when the culture object is a sphere, in order to facilitate the aggregation of single cells to favorably form the sphere, a cone shape, a hemisphere, Or, it is preferable that the shape is rounded.
  • the depth (a) of the recess is preferably 5 to 50 ⁇ m. This is because the size of the single cell is about 6 ⁇ m to 15 ⁇ m, and often about 10 ⁇ m.
  • the shape of the opening of the recess is not particularly limited, and may be circular or rectangular such as square.
  • the width of the opening of the recess can be appropriately set according to the size of the culture object.
  • the lower limit of the diameter of the circle or the inscribed circle of the opening of the recess is 60 ⁇ m or more, 70 ⁇ m or more, 80 ⁇ m or more, 90 ⁇ m or more, 100 ⁇ m or more, 110 ⁇ m or more, 120 ⁇ m or more, 150 ⁇ m or more And so on.
  • the upper limit of the diameter of the circle or the inscribed circle of the opening of the recess may be 1 mm or less, 900 ⁇ m or less, 800 ⁇ m or less, 700 ⁇ m or less, 500 ⁇ m or less. Further, when the culture object is a single cell, the lower limit of the diameter of the circle or the inscribed circle of the opening of the recess may be 5 ⁇ m or more, 6 ⁇ m or more, 8 ⁇ m or more. Further, the upper limit of the diameter of the circle or the inscribed circle of the opening of the recess may be 50 ⁇ m or less, 40 ⁇ m or less, 30 ⁇ m or less.
  • a polyolefin resin such as polyethylene or polypropylene can be preferably used.
  • examples thereof include polyethylene, a copolymer of ethylene and ⁇ -olefin, a copolymer of ethylene and vinyl acetate, an ethylene and acrylic acid or methacrylic acid copolymer, and an ionomer using a metal ion.
  • polyolefin, styrene-based elastomer, polyester-based thermoplastic elastomer, silicone-based thermoplastic elastomer, silicone resin and the like can also be used.
  • silicone rubber soft vinyl chloride resin, polybutadiene resin, ethylene-vinyl acetate copolymer, chlorinated polyethylene resin, polyurethane-based thermoplastic elastomer, polyester-based thermoplastic elastomer, silicone-based thermoplastic elastomer, styrene-based elastomer, for example, SBS (styrene/butadiene/styrene), SIS (styrene/isoprene/styrene), SEBS (styrene/ethylene/butylene/styrene), SEPS (styrene/ethylene/propylene/styrene), polyolefin resin, fluorine resin, etc. Good.
  • SBS styrene/butadiene/styrene
  • SIS styrene/isoprene/styrene
  • SEBS styrene/ethylene/butylene/styrene
  • a low-adhesion surface treatment coating it is preferable to apply a low-adhesion surface treatment coating to the culture portion of the bottom side film 11 so that spheres and single cells are not attached.
  • a cell adhesion inhibitor cell low adhesion treatment agent
  • phospholipid polymer polyvinyl alcohol derivative, phospholipid/polymer complex, polyhydroxyethyl methacrylate, polyvinyl alcohol, agarose, chitosan, polyethylene glycol, albumin and the like can be used. Also, these may be used in combination.
  • thermoplastic resin such as polyethylene, polypropylene, vinyl chloride, polystyrene elastomer, or FEP can be used.
  • the liquid thickness control mechanism of the present embodiment is a liquid thickness control mechanism for controlling the liquid thickness of the culture medium filled in the culture bag made of the soft packaging material provided with at least one port, and the change of the liquid thickness of the culture medium.
  • the operation of the liquid feeding means disposed in the tubular member that connects the culture bag and the medium bag is controlled, and the culture bag
  • a control unit that controls the feeding of the medium between the medium bags can be displacement of the position of the member, and a length measuring sensor can be preferably used as the detection unit. Further, it is possible to calculate the liquid thickness of the medium based on the detection information by the control unit and control the operation of the liquid feeding means based on this liquid thickness.
  • Various sensors such as an electromagnetic induction type, a laser type, an ultrasonic type, and a magnetic type can be used as the length measuring sensor. Further, there are an analog (linear) type and a switch type, but it is preferable to use an analog type sensor which is a type which constantly measures. Further, when using an electromagnetic induction type length measuring sensor or the like, it is preferable to attach a metal member at a position to be measured. This is because the sensitivity of the sensor can be improved. When a laser-type or ultrasonic-type length measuring sensor is used, the measurement can be performed without attaching a metal member at the measurement position.
  • the output voltage (or output current) and the measuring distance are almost the same.
  • the change in the liquid thickness of 0.01 mm the liquid thickness of the medium in the culture bag
  • the liquid volume of a medium having a liquid thickness of 0.01 mm is 0.05 ml.
  • the medium can be fed in 1.5 seconds, and the liquid thickness can be increased or decreased by 0.01 mm. Further, when the liquid feeding speed is 0.5 ml/min, the medium can be fed in 6 seconds, and the liquid thickness can be increased or decreased by 0.01 mm.
  • an analog distance sensor electromechanical induction type, measuring distance 0 to 12 mm, PE2-LA10D manufactured by Fuji Electric Equipment Control Co., Ltd.
  • an analog distance sensor electromechanical induction type, measuring distance 0 to 12 mm, PE2-LA10D manufactured by Fuji Electric Equipment Control Co., Ltd.
  • the liquid thickness can be obtained by multiplying the output voltage of the length-measuring sensor by a predetermined coefficient and performing a correction by subtracting the film thickness or the like.
  • the liquid thickness is calculated by multiplying the output voltage of the length measuring sensor by a predetermined coefficient to calculate the distance from the length measuring sensor to the metal member, and from the upper surface of the pedestal on which the culture bag is placed to the lower surface of the length measuring sensor. Can be obtained by subtracting the calculated distance, the thickness of the metal member, the height of the pressing member, and the thickness of the film from the distance up to.
  • a change that occurs according to a change in the liquid thickness of the culture medium may be regarded as a change in the weight of the culture bag accommodating portion in which the culture bag is placed, and a weight sensor may be used as the detection portion.
  • the control unit can calculate the liquid thickness of the medium based on the change in weight and control the operation of the liquid feeding means based on this liquid thickness. That is, the weight at the time when the liquid thickness of the culture bag is zero is subtracted from the weight at the time of measurement to convert it into a volume, and the liquid thickness is calculated by dividing this by the area of the culture section, and the liquid is sent based on this liquid thickness. It is also possible to control the operation of the liquid means.
  • the liquid thickness control mechanism of the present embodiment since the liquid thickness of the medium in the culture bag can be grasped, it becomes possible to grasp the remaining amount of the medium in the culture bag. Further, it is possible to grasp the timing of contact between the upper surface film and the lower surface film of the culture bag. This makes it possible to prevent the culture bag from having no medium. It is also possible to detect a liquid transfer error due to a pump failure or improper installation.
  • the control unit by feeding back the detected value of the liquid thickness of the culture medium to the control unit, it is possible to control the liquid thickness of the culture medium in the culture bag, so that the gap between the upper surface film of the culture bag and the lower surface film having a plurality of recesses, It is possible to control the size such that the sphere cannot move (gap of about 50 ⁇ m).
  • FIG. 3 is an explanatory view showing the outline of the culture device according to the present embodiment.
  • FIG. 4 is a plan view showing the outline of the culture bag storage part in the culture device according to the present embodiment.
  • 5 is a front view which shows the outline of the culture bag storage part, and has shown the state in which the culture medium was enclosed in the culture bag
  • FIG. 6 is a left side view which shows the outline of the culture bag storage part. , Shows the state where the culture medium is enclosed in the culture bag.
  • FIG. 7 is a front view showing the outline of the culture bag storage part, showing a state where the culture bag is not filled with a medium
  • FIG. 8 is a left side view showing the outline of the culture bag storage part. Yes, the culture bag does not contain the medium.
  • a blocking means such as a pinch valve for blocking the flow path of the tube is omitted.
  • the culture device of the present embodiment is a culture device for controlling the liquid thickness of a medium filled in a culture bag made of a soft packaging material provided with at least one port, and a mount on which the culture bag is placed, By pressing the culture bag against the pedestal, the pressing member that makes the liquid thickness in the culture bag uniform, the top plate portion facing the pressing member, and the pressing member perpendicular to the top plate portion
  • a support mechanism that movably supports the direction, a detection unit that measures changes caused by changes in the liquid thickness of the medium, and a tubular member that connects the culture bag and the medium bag based on the detection information input from the detection unit.
  • a control unit for controlling the operation of the liquid feeding means disposed in the control unit to control the liquid feeding of the medium between the culture bag and the medium bag.
  • the culture bag storage unit 20 the culture bag 10 placed on the culture bag storage unit 20, the medium bag 40, and the tube connecting the culture bag 10 and the medium bag 40 are arranged.
  • the liquid feeding means 30 and the control unit 60 connected to the length measuring sensor 25 and the liquid feeding means 30 are included.
  • the components other than the control unit 60 are arranged in the incubator 50 during culture.
  • the top plate support portions 22 are provided upright at the four corners of the pedestal 21, and the top plate portion 23 is fixed to the top plate support portion 22. Further, a guide pin 273 is provided in the peripheral portion of the top plate portion 23 and penetrates through a guide hole provided in the attachment portion 272 of the pressing member 27, and the pressing member 27 extends vertically along the guide pin 273. It is movably equipped. Further, the top plate portion 23 is provided with a top plate opening 231 so that the inside of the culture device 20 can be visually recognized through the top plate opening 231.
  • permanent magnets 26 are provided at four corners of the top plate portion 23 as biasing means for biasing the pressing member 27 downward, and permanent magnets are provided as permanent biasing means at positions corresponding to the permanent magnets 26 in the mounting portion 272.
  • a magnet 2721 is provided. These permanent magnets are arranged such that the same poles face each other, and the repulsive force acting between the permanent magnets 26 and 2721 causes the pressing portion 271 of the pressing member 27 to the top plate film 12 of the culture bag 10. It can be moved in the vertical direction while being pressed vertically.
  • the biasing means 73 is not limited to the permanent magnet. Alternatively, the urging means 73 may be omitted, and the pressing member 27 may be moved up and down with respect to the top plate film 12 by its own weight.
  • the pressing member 27 is dimensioned such that the bottom surface of the pressing portion 271 is arranged inside the culture portion of the culture bag 10. As described above, by pressing the culture bag 10 with the pressing member 27, the undulation of the top plate film 12 is suppressed. As a result, the top plate side film 12 is kept parallel to the mounting surface of the pedestal 21 while the medium is injected or discharged, and the liquid thickness of the medium in the culture bag 10 becomes uniform.
  • the pressing member 27 may be formed of, for example, a synthetic resin such as polycarbonate or glass. Further, it is preferable that the pressing member 27 is partially or entirely transparent so that the progress of the culture and the state of the culture object can be confirmed.
  • the pressing member 27 When the culture bag 10 is filled with the medium, the pressing member 27 is pushed up by the culture bag 10 as shown in FIGS. 5 and 6. On the other hand, when the medium is discharged from the culture bag 10 by the liquid feeding means 30 arranged in the tube 14 via the tube 14 connected to the port 13 of the culture bag 10, the medium solution in the culture bag 10 is accordingly discharged. The thickness decreases, and the pressing member 27 descends accordingly.
  • the culture bag 10 is in a state in which the upper surface film and the lower surface film are in contact with each other by the pressing member 27 (the top plate side film 12 It is pressed to a state in which the plurality of recesses formed in the bottom film 11 are closed). At this time, the liquid thickness of the culture medium in the culture bag 10 becomes zero.
  • the sensor support portion 24 is fixed to the peripheral portion of the top plate portion 23, and the length measuring sensor 25 is attached to the tip portion thereof. Further, a metal member 2722 is attached to the attachment portion 272 of the pressing member 27 so as to face the length measuring sensor 25.
  • the arrangement of the sensor support portion 24 and the length measurement sensor 25 is not limited to this, and the sensor support portion 24 and the length measurement sensor 25 can be attached at arbitrary positions with respect to the top plate portion 23 within a range in which the distance to the metal member 2722 can be measured.
  • the length measuring sensor 25 measures the distance to the metal member 2722 and calculates the liquid thickness of the medium in the culture bag 10, whereby the liquid thickness can be detected.
  • the output voltage of the length measuring sensor 25 is multiplied by a predetermined coefficient to calculate the distance from the length measuring sensor 25 to the metal member 2722, and the distance from the upper surface of the gantry 21 to the lower surface of the length measuring sensor 25. Can be obtained by subtracting the calculated distance, the thickness of the metal member 2722, the height of the pressing member, and the thicknesses of the upper surface film and the lower surface film from the above.
  • the liquid feeding means 30 is arranged in a tube connecting the culture bag 10 and the culture medium bag 40.
  • a pump such as a peristaltic pump or a syringe pump that can perform liquid feeding at low speed and with high precision.
  • the liquid feeding means 30 is not limited to these pumps, and it is also possible to use a head difference (self-weight), pressurization, or the like.
  • the liquid feeding means 30 By operating the liquid feeding means 30 as described above, it is possible to fill the culture bag 10 with the culture medium and to discharge the culture medium from the culture bag 10 to the culture bag 40.
  • the operation of the liquid feeding means 30 is controlled by the control unit 60 based on the detection information from the length measuring sensor 25.
  • the control unit 60 calculates the liquid thickness of the medium in the culture bag 10 based on the output voltage (or output current) input (transmitted) from the length measuring sensor 25, and the liquid feeding means based on the liquid thickness. It is possible to control the liquid thickness to a desired size by controlling the start and stop of the operation of 30, and the rotation speed and the like.
  • the medium bag 40 can be used as a medium supply bag for supplying the medium or a medium discharge bag for discharging the medium.
  • the incubator 50 accommodates the culture bag 10, the culture bag accommodating portion 20, the liquid feeding means 30, and the culture medium bag 40, maintains a constant temperature and humidity, and maintains a culture environment of cells and spheres in the culture bag 10.
  • the control unit 60 (control unit) is not particularly limited as long as it can control the operation of the liquid feeding means 30 based on the detection information from the length measurement sensor 25, but the input/output unit 61 (input/output unit) and the PLC (Programmable logic controller) 62, relay section 63 (relay), operation section 64 (touch panel, etc.), power supply section 65 (stabilized power supply, etc.), and wiring break section 66 (breaker) It can be configured as provided. Further, such a configuration may be realized by a microcomputer or a computer.
  • a desired control content can be programmed and stored in the PLC 62 in advance, and the operation of the liquid feeding means 30 can be controlled based on this.
  • the PLC 62 in the control unit 60 stores the first information corresponding to the first state in which the liquid thickness of the medium is zero, adds a predetermined change amount to the first information, and outputs the second information.
  • the liquid thickness of the medium can be controlled to the second state corresponding to the second information by calculating and controlling the operation of the liquid feeding means 30 based on the second information.
  • the first information and the second information can be voltage, current, transistor output, liquid thickness of the medium, or the like.
  • the medium in the culture bag 10 is desired based on the detection information from the length measurement sensor 25. It is possible to supply the culture medium to the culture bag 10 by controlling the driving of the liquid feeding means 30 such as a pump so that the liquid becomes thick.
  • the culture device and the liquid thickness control method according to the present embodiment are not limited to the configurations and methods described above, and other configurations and methods can be used as long as they can implement the liquid thickness control mechanism according to the present embodiment. You can also do it.
  • the length measuring sensor may be arranged on the frame on which the culture bag is placed, and the metal member may be arranged on the pressing member to configure the culture device.
  • the weight sensor detects the weight of the culture bag 10 containing the medium and outputs the weight to the control unit 60.
  • the control unit 60 calculates the liquid thickness of the medium based on the weight of the medium, and the liquid feeding means 30. It is also possible to adopt a configuration for controlling the operation of.
  • a culture bag used in the liquid thickness control mechanism a culture bag provided with two ports is used, and the first transfer member is connected to the tubular member connecting the first port and the first bag.
  • a second liquid feeding means is provided on the tubular member that connects the second port and the second bag together with the liquid means, and the control section determines the first liquid level based on the detection information input from the detection section. It is also preferable to control the operations of the first liquid feeding means and the second liquid feeding means. That is, it is also preferable to implement a culture apparatus and a liquid thickness control method according to the present embodiment by disposing a pump or the like in a tube connected to each of the two ports.
  • a culture bag 10a having two ports 13a as shown in FIGS. 9 and 10 can be preferably used.
  • the culture medium bag 40 is connected to one port 13a of the culture bag 10a via a tube, and the liquid feeding means 30 is arranged therein.
  • the culture medium bag 40 can be used as a culture medium supply bag or the like.
  • a waste liquid bag 40a is connected to the other port 13a of the culture bag 10a via a tube, and a liquid feeding means 30a is arranged therein.
  • the bag connected to each port via a tube may have other uses.
  • the culture apparatus has such a configuration, it is possible to control the operations of the liquid feeding means 30 and the liquid feeding means 30a based on the detection information from the length measurement sensor 25. Therefore, for example, the medium is fed from the medium bag 40 to the culture bag 10a while keeping the thickness of the medium in the culture bag 10a at a size such that the spheres cannot move (gap of about 50 ⁇ m), and It is possible to transfer the medium from the culture bag 10a to the waste liquid bag 40a to exchange the medium. At this time, it is also possible to control the operation of the liquid feeding means 30 and the liquid feeding means 30a to control the liquid feeding speed of the medium.
  • a top plate film 12 is provided with a top plate protrusion inside the culture bag 10, and the width of the top plate protrusion is set to the bottom side film 11. Smaller than the width of the opening of the recess formed in the, and the height of the top plate protrusion is smaller than the minimum diameter of the culture object, the top plate protrusion part of the upper end surface of the culture part. It is also preferable that a gap is formed between the upper end surface and the lower surface of the top plate side film 12 when they come into contact with each other.
  • the top plate protrusion is brought into contact with part of the upper end surface, and a gap smaller than the size of the culture object is formed on the upper end surface. It can be in a state of being formed on the top plate portion. This makes it possible to prevent the movement of the culture object such as the sphere while allowing the liquid matter such as the medium to pass through the gap.
  • the culturing apparatus may be used for the step of forming a sphere, the step of culturing and proliferating while maintaining the sphere state, the step of inducing differentiation in the sphere state, etc. it can.
  • a method of forming spheres using differentiated cells obtained from iPS cells, ES cells, and other stem cells that have already undergone a differentiation induction step, or a method in which differentiation-induced cells are cryopreserved once and thawed again to form spheres It can also be used in methods and the like.
  • the liquid thickness control mechanism, the culture device, and the liquid thickness control method according to the embodiment of the present invention since the liquid thickness of the medium in the culture bag can be grasped, the remaining amount of the medium in the culture bag can be grasped. It becomes possible to grasp. Further, it is possible to grasp the timing at which the upper surface film and the lower surface film of the culture bag come into contact with each other, and thus it is possible to prevent the culture bag from having no medium. It is also possible to detect a liquid transfer error due to a pump failure or improper installation.
  • the liquid thickness of the culture medium in the culture bag can be controlled, so that the gap between the upper film of the culture bag and the lower film having a plurality of recesses is It is possible to control the sphere so that it cannot move.
  • the thickness of the culture medium in the culture bag can be adjusted so that the sphere cannot move. It is possible to exchange the medium by sending the medium from the medium bag to the culture bag and the medium from the culture bag to the waste bag while keeping the state as it is.
  • the present invention is not limited to the above embodiment, and various modifications can be made within the scope of the present invention.
  • a culture bag three or more ports are provided, a pump is provided in each tube connected to these, and these pumps are controlled based on the information from the detector. It is possible to make appropriate changes such as changing the arrangement of the length measuring sensors.
  • the present invention can be suitably used when efficiently creating a large number of spheres of uniform size.

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Abstract

細胞培養において用いられる培養バッグ内の培地の液厚を制御することを可能とする。少なくとも一つのポートが備えられた軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を制御する液厚制御機構であって、培地の液厚の変化に応じて生じる変化を測定する検出部と、検出部から入力した検出情報にもとづいて、培養バッグ及び培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、培養バッグ及び培地バッグ間における培地の送液を制御する制御部とを有する液厚制御機構を用いることで、使用される培養バッグの培地の液厚を制御することが可能となる。

Description

液厚制御機構、培養装置、及び液厚制御方法
　本発明は、細胞培養技術に関し、特にスフェアの作成などを効率化する技術に関する。
　近年、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの幹細胞等の接着細胞を大量に培養する場合には、細胞を培養容器に接着させて増殖させるだけではなく、細胞に対して接着性の低い材料を塗工したマイクロウェルプレートなどを備えた培養容器を使用して、スフェア（スフェロイド，凝集塊）やオルガノイドを形成させることによって、細胞をより生体内に近い三次元的な状態で培養する方法が用いられている。
　このような培養容器を使用したスフェアの大量培養においては、スフェアがウェル（凹部）から飛び出して他のウェルに移動してしまい、所望の大きさや形状のスフェアを得ることが難しいという問題があった。
　例えば、培地交換を行うために、多数のウェルを培養部に備えた培養バッグ（袋状の培養容器）内に培地を送液すると、スフェアは簡単にウェルから飛び出して他のウェルに移動するため、培地の流速を極めて遅くする必要があり、迅速な培地交換が非常に困難であった。このため、このような培養バッグは、頻繁に培地交換が必要な長期間培養には不向きであった。
　また、このような培養バッグでは、振動を与えただけでもスフェアが簡単にウェルから飛び出してしまうため、スフェアの培養中に培養バッグを安全に移動させることは、容易にはできなかった。
国際公開２０１６／１９０３１２号パンフレット 国際公開２０１６／１９０３１４号パンフレット 特開２０１８－１０８０３２号公報
　そこで、スフェアの大量培養を行う場合などにおいて、軟包材からなる培養バッグを使用し、培養バッグに充填された培地の液厚を制御することによって、培養バッグの上面フィルムとウェルを備えた下面フィルムの間隙をスフェアが移動できない大きさに制御することができれば、上記のようなスフェアの移動の問題を解消することが可能となる。
　しかしながら、このように培養バッグにおける培地の液厚を制御することは、従来は、実現されていなかった。
　ここで、培養する細胞の数に対して適切な量の培地を培養バッグに充填するために、培養バッグに送液する培地の量を制御することは、従来から行われていた。
　例えば、重量センサを用いて、培養バッグとこれを保持する保持プレートなどを合わせた重量を測定し、この重量にもとづき培地の重量を算出して、培養バッグへの培地の送液を制御することが行われていた。
　このような重量センサを用いた測定は、ロードセル式が一般的であり、培養バッグや保持プレート全ての重量をロードセルの微小ポイントに荷重させる必要があるため、固定が困難であり、また衝撃にも弱いという問題があった。また、重量センサは、低温などの温度特性に弱く、複数箇所に均等に取り付ける必要があるなど、取付が困難であるという問題もあった。さらに、チューブなどの配管がある場合には、チューブを介して他の筐体などと接触してしまうため、チューブのテンションが重量センサにかかり、測定値に誤りが生じるという問題もあった。
　また、このような重量センサを用いた従来の測定では、培地の重量にもとづいて送液量を制御することはできるが、培養バッグにおける培地の液厚を制御することはできなかった。
　培養バッグへの培地の送液の制御に関連する技術として、特許文献１に記載の培養装置を挙げることができる。
　この培養装置では、距離センサをスペーサに配置して、保持板とスペーサとの距離が一定以上に大きくなった状態を把握可能にしている。
　しかしながら、この培養装置では、培養バッグにおける培地の液厚を検出しておらず、培地の液厚の制御は行われていない。
　また、特許文献２に記載の培養装置では、重量検出部を用いて、培養バッグとその保持部の重量の検出が行われている。しかしながら、この培養装置でも、培養バッグにおける培地の液厚を検出しておらず、培地の液厚の制御は行われていない。
　また、スフェアの移動の問題を解消可能な技術として、特許文献３に記載の培養容器を挙げることができる。この培養容器は、隔室が形成された底部と底部の周縁部分から立ち上がった周壁部とを備える容器本体と、底部と対向する位置に配置される仕切り部材とを備え、仕切り部材が少なくとも一部が容器本体内の培養液中に浸漬されている。そして、これにより、培養容器の移動や培地交換の際にスフェアが移動することを抑制している。
　しかしながら、このような培養容器では、隔室の周壁部と仕切り部材の位置合わせや、隔室と仕切り部材間のギャップの調整が難しいという問題があった。また、底部や仕切り部材の反りがある場合には、これらは更に難しくなるため、この培養容器を軟包材からなる培養バッグに適用することは困難であった。
　そこで、本発明者らは鋭意研究して、軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を検出し、その検出情報にもとづき培養バッグと培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、培地の送液を制御することにより、培養バッグにおける培地の液厚を制御することに成功して、本発明を完成させた。
　このような培養バッグの液厚制御機構によれば、培養バッグにおける培地の液厚を把握できるため、培養バッグ内の培地の残量を把握することが可能となる。
　また、培養バッグの上面フィルムと下面フィルムが接触するタイミングを把握できるため、ポンプの故障や設置不良などの異常検出を行うことも可能となる。
　また、培養バッグにおける培地の液厚を制御することができるため、培養バッグの上面フィルムと複数の凹部を有する下面フィルムの間隙を、スフェアが移動できない大きさに制御することが可能となる。
　さらに、このように培養バッグ内における凹部間でスフェアが移動できないようにした状態のままで、培地を送液して、培地交換を行うことも可能である。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、細胞培養において用いられる培養バッグ内の培地の液厚を制御することが可能な液厚制御機構、培養装置、及び液厚制御方法の提供を目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明の液厚制御機構は、少なくとも一つのポートが備えられた軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を制御する液厚制御機構であって、前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化を測定する検出部と、前記検出部から入力した検出情報にもとづいて、前記培養バッグ及び培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、前記培養バッグ及び前記培地バッグ間における培地の送液を制御する制御部とを有する構成としてある。
　また、本発明の培養装置は、少なくとも一つのポートが備えられた軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を制御する培養装置であって、前記培養バッグが載置される架台と、前記培養バッグを前記架台に対して押圧することにより、前記培養バッグ内の液厚を均一にする押圧部材と、前記押圧部材に対面して配置された天板部と、前記天板部に対して前記押圧部材を垂直方向に移動可能に支持する支持機構と、前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化を測定する検出部と、前記検出部から入力した検出情報にもとづいて、前記培養バッグ及び培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、前記培養バッグ及び前記培地バッグ間における培地の送液を制御する制御部と有する構成としてある。
　また、本発明の液厚制御方法は、少なくとも一つのポートが備えられた軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を制御する液厚制御方法であって、前記培養バッグが載置される架台と、前記培養バッグを前記架台に対して押圧することにより、前記培養バッグ内の液厚を均一にする押圧部材と、前記押圧部材に対面して配置された天板部と、前記天板部に対して前記押圧部材を垂直方向に移動可能に支持する支持機構と、前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化を測定する検出部と、前記検出部から入力した検出情報にもとづいて、前記培養バッグ及び培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、前記培養バッグ及び前記培地バッグ間における培地の送液を制御する制御部を有する培養装置を用いて、前記制御部により、前記培地の液厚がゼロである第一の状態に対応する第一の情報を記憶し、第一の情報に所定の変化量を加算して第二の情報を算出し、前記第二の情報にもとづき前記送液手段の動作を制御して、前記培地の液厚を第二の情報に対応する第二の状態に制御する方法としてある。
　本発明によれば、細胞培養において用いられる培養バッグ内の培地の液厚を制御することが可能な液厚制御機構、培養装置、及び液厚制御方法の提供が可能となる。
本発明の実施形態に係る液厚制御機構において用いられる培養バッグの概略を示す説明図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は正面図である。 本発明の実施形態に係る液厚制御機構において用いられる培養バッグの各種の凹部を備えた培養部の一部を示す模式図である。 本発明の実施形態に係る培養装置の概略を示す説明図である。 本発明の実施形態に係る培養装置における培養バッグ収容部の概略を示す平面図である。 本発明の実施形態に係る培養装置における培養バッグ収容部の概略を示す正面図であり、培養バッグに培地が封入された状態を示している。 本発明の実施形態に係る培養装置における培養バッグ収容部の概略を示す左側面図であり、培養バッグに培地が封入された状態を示している。 本発明の実施形態に係る培養装置における培養バッグ収容部の概略を示す正面図であり、培養バッグに培地が封入されていない状態を示している。 本発明の実施形態に係る培養装置における培養バッグ収容部の概略を示す左側面図であり、培養バッグに培地が封入されていない状態を示している。 本発明の実施形態に係る液厚制御機構において用いられる２ポートの培養バッグの概略を示す説明図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は正面図である。 本発明の実施形態に係る培養装置の概略を示す説明図であり、２ポートの培養バッグを用いる場合を示している。
　以下、本発明の液厚制御機構、培養装置、及び液厚制御方法の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態の具体的な内容に限定されるものではない。
　まず、本実施形態に係る液厚制御機構において用いられる培養バッグについて、図１及び図２を参照して説明する。図１は、本実施形態に係る液厚制御機構において用いられる培養バッグの概略を示す説明図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は正面図である。図２は、本実施形態に係る液厚制御機構において用いられる培養バッグの各種の凹部を備えた培養部の一部を示す模式図である。
　本実施形態の培養バッグ１０は、軟包材からなる培養バッグであり、底部側フィルム１１（下面フィルム）と天板側フィルム１２（上面フィルム）の周辺部をヒートシールなどにより貼り合わせることにより形成することができる。また、培養バッグ１０には、少なくとも一つのポート１３が設けられている。このポート１３にはチューブが接続され、チューブに配設された送液手段により、このポート１３を介して、培養バッグ１０への培地の注入、及び培養バッグ１０からの培地の排出などの培地の送液が行われるようになっている。
　そして、培養バッグ１０に注入される培地の量に応じて、底部側フィルム１１と天板側フィルム１２の間隔（液厚）が変化するようになっている。
　培養バッグ１０内における底部側フィルム１１の表面は、細胞やスフェアを培養するための培養部として用いられる。この底部側フィルム１１の培養部には、図２に示すように、細胞やスフェアなどの培養対象物を収容するための複数の凹部が形成されている。このような凹部を形成することにより、スフェアを好適に形成させて培養することが可能である。また、培養部１１における複数の凹部の配置は、例えば千鳥状や格子状等とすることができる。
　図１において、培養バッグ１０の底部側フィルム１１は平面状であり、培地の流入に伴って、天板側フィルム１２が上方に膨らむようになっている。培養バッグ１０をこのようにすることで、培養バッグ１０内における培地の液厚を均一化することができ、全ての凹部を載置面に接触させることができる。このため、培養対象物の増殖性の差異や細胞播種時の細胞数のバラツキを低減することが可能となる。
　なお、本実施形態に係る液厚制御機構において用いられる培養バッグは、このような形状のものに限定されず、同一形状の底部側フィルム１１と天板側フィルム１２をヒートシールなどにより貼り合わせることによって形成してもよい。
　また、図１において、培養バッグ１０は、培養部のポート付近の形状がポートに対して傾斜して形成され、これによって培地がポートに流れやすくなっている。ただし、培養部の形状は、このような形状に限定されず、培養部を例えば長方形などの矩形状としてもよい。さらに、後述するように、培養バッグに二つ以上のポートを好適に備えることもできる。
　底部側フィルム１１の培養部に形成される凹部の形状は、図２（ａ）に示すような円錐や四角錐などの錐状や、図２（ｂ）に示すような半球状やアール状とすることができる。
　また、底部側フィルム１１の培養部に形成される凹部の形状を、図２（ｃ）に示すように、側壁の少なくとも一部が略垂直状に形成されたものとすることも好ましい。これらの凹部において、側壁の略垂直部分の垂直方向の長さは、培養対象物の最大径の半分より長くなっている。また、凹部における側壁が略垂直である領域の形状は、例えば、円柱状、四角柱状等とすることができる。
　培養バッグ１０における凹部をこのような形状にすることで、ポート１３から培養バッグ１０内に培地を送液する場合に、その流速を１ｍｌ／分以上にしても、凹部から培養対象物が飛び出して、他の凹部へ移動することを防止することが可能である。
　培養対象物がスフェアである場合、凹部の深さとしては、５０～５００μｍとすることが好ましい。凹部の深さを５００μｍより大きくすると、培養バッグ１０に培地を送液しても、凹部内の培地を十分に置換することが困難になる場合があるためであり、５００μｍより深い凹部を備えた培養容器は、加工難易度が高くなるためである。また、スフェアの大きさは、小さいもので、５０μｍ～１００μｍ程度であり、大きいものでは、２００μｍ～３００μｍ程度であるためである。
　凹部内の底部の形状は、特に限定されないが、培養対象物がスフェアの場合には、シングルセルを凝集し易くしてスフェアの形成を好適に行えるようにするため、錐体状、半球状、又はアール状とすることが好ましい。
　培養対象物がシングルセルである場合、凹部の深さ（ａ）としては、５～５０μｍとすることが好ましい。シングルセルの大きさは、６μｍ～１５μｍ程度であり、１０μｍ程度のものが多いためである。
　凹部の開口部の形状は、特に限定されず、円形、又は正方形などの矩形状とすることができる。また、凹部の開口部の幅は、培養対象物のサイズに合わせて、適宜設定することができる。
　例えば、培養対象物をスフェアとする場合、凹部の開口部の円又は内接円の直径の下限を、６０μｍ以上，７０μｍ以上，８０μｍ以上，９０μｍ以上，１００μｍ以上，１１０μｍ以上，１２０μｍ以上，１５０μｍ以上等としてもよい。また、凹部の開口部の円又は内接円の直径の上限を、１ｍｍ以下，９００μｍ以下，８００μｍ以下，７００μｍ以下，５００μｍ以下等としてもよい。
　また、培養対象物をシングルセルとする場合、凹部の開口部の円又は内接円の直径の下限を、５μｍ以上，６μｍ以上，８μｍ以上等としてもよい。また、凹部の開口部の円又は内接円の直径の上限を、５０μｍ以下，４０μｍ以下，３０μｍ以下等としてもよい。
　本実施形態に係る液厚制御機構において用いられる培養バッグ１０の材料としては、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン系樹脂などを好適に用いることができる。例えば、ポリエチレン、エチレンとα－オレフィンの共重合体、エチレンと酢酸ビニルの共重合体、エチレンとアクリル酸やメタクリル酸共重合体と金属イオンを用いたアイオノマー等を挙げることができる。また、ポリオレフィン、スチレン系エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、シリコーン樹脂等を用いることもできる。さらに、シリコーンゴム、軟質塩化ビニル樹脂、ポリブタジエン樹脂、エチレン－酢酸ビニル共重合体、塩素化ポリエチレン樹脂、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、スチレン系エラストマー、例えば、ＳＢＳ（スチレン・ブタジエン・スチレン）、ＳＩＳ（スチレン・イソプレン・スチレン）、ＳＥＢＳ（スチレン・エチレン・ブチレン・スチレン）、ＳＥＰＳ（スチレン・エチレン・プロピレン・スチレン）、ポリオレフィン樹脂、フッ素系樹脂等を用いてもよい。
　また、底部側フィルム１１の培養部には、スフェアやシングルセルが接着しないように、低接着性表面処理塗工を行うことが好ましい。具体的には、細胞接着抑制剤（細胞低接着処理剤）を塗布しておくことが好ましい。
　細胞接着抑制剤としては、リン脂質ポリマー、ポリビニルアルコール誘導体、リン脂質・高分子複合体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、アルブミン等を用いることができる。また、これらを組み合わせて用いてもよい。
　さらに、培養バッグ１０におけるポート１３の材料としては、例えば、ポリエチレン
、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリスチレン系エラストマー、ＦＥＰなどの熱可塑性樹
脂で成形することができる。
　次に、本実施形態に係る液厚制御機構について説明する。本実施形態の液厚制御機構は、少なくとも一つのポートが備えられた軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を制御する液厚制御機構であって、培地の液厚の変化に応じて生じる変化を測定する検出部と、検出部から入力した検出情報にもとづいて、培養バッグ及び培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、培養バッグ及び培地バッグ間における培地の送液を制御する制御部とを有することを特徴とする。
　培地の液厚の変化に応じて生じる変化としては、部材の位置の変位とすることができ、検出部として測長センサを好適に用いることができる。
　また、制御部により検出情報にもとづき培地の液厚を算出させ、この液厚にもとづき送液手段の動作を制御することができる。
　測長センサとしては、電磁誘導タイプ、レーザタイプ、超音波タイプ、及び磁気タイプ等の各種センサを用いることができる。また、アナログ（リニア）式とスイッチ式があるが、常時測定するタイプであるアナログ式のセンサを用いることが好ましい。
　また、電磁誘導タイプの測長センサなどを用いる場合、測定する位置に金属部材を取り付けることが好ましい。これにより、センサの感度を向上させることができるためである。なお、レーザタイプや超音波タイプの測長センサなどを用いる場合は、測定する位置に金属部材を取り付けることなく、測定することができる。
　具体的には、測長センサとして、アナログ近接センサ（電磁誘導タイプ，測定距離１～６ｍｍ，センサテック株式会社製，ＭＤＡ－Ｃ５）を用いる場合、出力電圧（又は出力電流）と測定距離は概ね比例し、当該測定距離の範囲において、出力電圧０．０１Ｖごとに、０．０１ｍｍの液厚（培養バッグ内における培地の液厚）の変化を検出することができる。
　例えば、培養部の面積が５０ｃｍ２の培養バッグを用いる場合、０．０１ｍｍの液厚の培地の液量は、０．０５ｍｌである。この場合、送液速度を２ｍｌ／分とすると、１．５秒で培地を送液でき、液厚を０．０１ｍｍ増減させることができる。また、送液速度を０．５ｍｌ／分とすると、６秒で培地を送液でき、液厚を０．０１ｍｍ増減させることができる。
　また、測長センサとして、アナログ距離センサ（電磁誘導タイプ，測定距離０～１２ｍｍ，富士電機機器制御株式会社製，ＰＥ２－ＬＡ１０Ｄ）を用いることで、例えば８ｍｍ程度のより大きい液厚まで制御可能にすることもできる。
　測長センサを用いて、液厚を直接的に測定する場合は、例えば、培養バッグを載置する架台に測長センサを配置すると共に、押圧部材に金属部材を配置して、測長センサにより金属部材までの距離を測定することができる。
　この場合、液厚は、測長センサの出力電圧に所定の係数を乗算し、フィルムの厚みなどを減算する補正を行うことで得ることができる。
　また、後述するように、押圧部材を支持する天板部に測長センサを配置すると共に、押圧部材に金属部材を配置して、測長センサにより金属部材までの距離を測定することもできる。
　この場合、液厚は、測長センサの出力電圧に所定の係数を乗算して測長センサから金属部材までの距離を算出し、培養バッグが載置された架台の上面から測長センサの下面までの距離から、上記の算出された距離と金属部材の厚みと押圧部材の高さとフィルムの厚みを減算することで得ることができる。
　また、培地の液厚の変化に応じて生じる変化を、培養バッグが載置された培養バッグ収容部の重量の変化とし、検出部として重量センサを用いることもできる。そして、制御部により重量の変化にもとづき培地の液厚を算出させて、この液厚にもとづき送液手段の動作を制御することもできる。
　すなわち、測定時点の重量から培養バッグの液厚がゼロの時点の重量を減算して体積に換算し、これを培養部の面積で除算することによって液厚を算出し、この液厚にもとづき送液手段の動作を制御することも可能である。
　このような本実施形態の液厚制御機構によれば、培養バッグにおける培地の液厚を把握できるため、培養バッグ内の培地の残量を把握することが可能となる。
　また、培養バッグの上面フィルムと下面フィルムが接触するタイミングを把握できる。これにより、培養バッグ内に培地が無い状態になることを防止することができる。また、ポンプの故障や設置が不適切であることによる送液エラーを検出することも可能となる。
　また、培地の液厚の検出値を制御部にフィードバックすることにより、培養バッグにおける培地の液厚を制御することができるため、培養バッグの上面フィルムと複数の凹部を有する下面フィルムの間隙を、スフェアが移動できない大きさ（約５０μｍの隙間）に制御することが可能である。
　次に、本実施形態に係る培養装置及び液厚制御方法について、図３～図８を参照して説明する。図３は、本実施形態に係る培養装置の概略を示す説明図である。図４は、本実施形態に係る培養装置における培養バッグ収容部の概略を示す平面図である。図５は、同培養バッグ収容部の概略を示す正面図であり、培養バッグに培地が封入された状態を示しており、図６は、同培養バッグ収容部の概略を示す左側面図であり、培養バッグに培地が封入された状態を示している。図７は、同培養バッグ収容部の概略を示す正面図であり、培養バッグに培地が封入されていない状態を示しており、図８は、同培養バッグ収容部の概略を示す左側面図であり、培養バッグに培地が封入されていない状態を示している。なお、これらの図において、チューブの流路を閉塞するピンチバルブ等の閉塞手段については省略している。
　本実施形態の培養装置は、少なくとも一つのポートが備えられた軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を制御する培養装置であって、培養バッグが載置される架台と、培養バッグを架台に対して押圧することにより、培養バッグ内の液厚を均一にする押圧部材と、押圧部材に対面して配置された天板部と、天板部に対して押圧部材を垂直方向に移動可能に支持する支持機構と、培地の液厚の変化に応じて生じる変化を測定する検出部と、検出部から入力した検出情報にもとづいて、培養バッグ及び培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、培養バッグ及び培地バッグ間における培地の送液を制御する制御部と有することを特徴とする。
　具体的には、図３に示すように、培養バッグ収容部２０と、これに載置された培養バッグ１０と、培地バッグ４０と、培養バッグ１０と培地バッグ４０を連結するチューブに配設された送液手段３０と、測長センサ２５及び送液手段３０に接続された制御部６０とを有している。制御部６０以外の構成は、培養時においては、インキュベータ５０内に配置される。
　培養バッグ収容部２０において、架台２１の四隅に天板支持部２２が立設されており、天板支持部２２に天板部２３が固定されている。また、天板部２３の周辺部にガイドピン２７３が備えられており、押圧部材２７の取付部２７２に設けられたガイド穴に貫通し、押圧部材２７は、ガイドピン２７３に沿って垂直方向に移動可能に備えられている。
　さらに、天板部２３には、天板開口部２３１が設けられており、この天板開口部２３１を通じて培養装置２０の内部が視認できるようになっている。
　また、天板部２３の四隅には、押圧部材２７を下方へ付勢する付勢手段として永久磁石２６が備えられており、取付部２７２において永久磁石２６に対応する位置に付勢手段として永久磁石２７２１が備えられている。これらの永久磁石は、互いに同極側を対向させて配置され、永久磁石２６と永久磁石２７２１の間に働く斥力により、押圧部材２７の押圧部２７１が培養バッグ１０の天板側フィルム１２に対して垂直に押圧した状態で、垂直方向に移動可能になっている。
　なお、付勢手段７３は、永久磁石に限定されない。また、付勢手段７３を省略して、押圧部材２７の自重により、押圧部材２７を天板側フィルム１２に対して上下に移動させてもよい。
　また、押圧部２７１の底面が、培養バッグ１０における培養部の内側に配置されるように、押圧部材２７は寸法決めされている。
　このように、押圧部材２７により培養バッグ１０を押圧することによって、天板側フィルム１２の起伏の発生が抑制される。その結果、培地の注入又は排出を行う間、天板側フィルム１２が架台２１の載置面と平行に保たれ、培養バッグ１０における培地の液厚が均一となる。
　押圧部材２７は、例えば、ポリカーボネートのような合成樹脂で形成してもよいし、ガラスで形成してもよい。また、押圧部材２７は、培養の進行状況や培養対象物の状態などを確認できるように、その一部又は全部が透明性を有していることが好ましい。
　培養バッグ１０内に培地が充填されているときは、図５及び図６に示すように、培養バッグ１０により押圧部材２７が押し上げられた状態となる。
　一方、培養バッグ１０のポート１３に連結されたチューブ１４を介して、チューブ１４に配置された送液手段３０により培養バッグ１０から培地が排出されると、それに従って、培養バッグ１０における培地の液厚は減少し、これに伴って押圧部材２７は下降する。
　そして、培養バッグ１０から培地が完全に排出されると、図７及び図８に示すように、培養バッグ１０は、押圧部材２７により上面フィルムと下面フィルムが接触した状態（天板側フィルム１２により底部側フィルム１１に形成された複数の凹部が閉塞された状態）にまで押圧される。このとき、培養バッグ１０における培地の液厚はゼロとなる。
　センサ支持部２４は、天板部２３の周辺部に固定されており、その先端部に測長センサ２５が取り付けられている。また、測長センサ２５に対面するように、押圧部材２７の取付部２７２に金属部材２７２２が取り付けられている。なお、センサ支持部２４及び測長センサ２５の配置はこれに限定されず、金属部材２７２２までの距離を測定できる範囲で、天板部２３に対して任意の位置に取り付けることができる。
　そして、測長センサ２５により、金属部材２７２２までの距離を測定して、培養バッグ１０における培地の液厚を算出することで、当該液厚を検出することが可能になっている。
　例えば、液厚は、測長センサ２５の出力電圧に所定の係数を乗算して測長センサ２５から金属部材２７２２までの距離を算出し、架台２１の上面から測長センサ２５の下面までの距離から、上記の算出された距離と金属部材２７２２の厚みと押圧部材の高さと上面フィルム及び下面フィルムの厚みを減算することによって得ることが可能である。
　送液手段３０は、培養バッグ１０と培地バッグ４０を連結するチューブに配設される。この送液手段３０としては、例えばペリスタポンプやシリンジポンプのような低速で高精度な送液を行うことが可能なポンプを用いることが好ましい。なお、送液手段３０は、これらのポンプに限定されず、水頭差（自重）や加圧等によるものとすることも可能である。
　このような送液手段３０を動作させることによって、培地バッグ４０から培養バッグ１０への培地の充填、及び培養バッグ１０から培地バッグ４０への培地の排出することができる。
　送液手段３０の動作は、測長センサ２５からの検出情報にもとづいて、制御部６０により制御される。このとき、制御部６０は、測長センサ２５から入力した（送信されてきた）出力電圧（又は出力電流）にもとづき培養バッグ１０における培地の液厚を算出して、液厚にもとづき送液手段３０の動作の開始と停止、及び回転速度等を制御して、液厚を所望の大きさに制御することが可能になっている。
　培地バッグ４０は、培地を供給するための培地供給バック、又は培地を排出するための培地排出バックとして用いることができる。
　インキュベータ５０は、培養バッグ１０、培養バッグ収容部２０、送液手段３０、及び培地バッグ４０を収容して一定の温度及び湿度を保ち、培養バッグ１０内における細胞やスフェアの培養環境を維持する。
　制御部６０（制御ユニット）は、測長センサ２５からの検出情報にもとづき送液手段３０の動作を制御可能なものであれば特に限定されないが、入出力部６１（入出力ユニット）と、ＰＬＣ（programmable logic controller，プログラマブルロジックコントローラ）６２と、継電部６３（リレー）と、操作部６４（タッチパネルなど）と、電源部６５（安定化電源など）と、配線遮断部６６（ブレーカー）とを備えた構成とすることができる。また、このような構成をマイコンやコンピュータにより実現してもよい。
　ＰＬＣ６２に所望の制御内容を予めプログラミングして記憶させ、これにもとづいて送液手段３０の動作を制御させることができる。
　例えば、制御部６０におけるＰＬＣ６２により、培地の液厚がゼロである第一の状態に対応する第一の情報を記憶させ、第一の情報に所定の変化量を加算して第二の情報を算出し、第二の情報にもとづき送液手段３０の動作を制御して、培地の液厚を第二の情報に対応する第二の状態に制御することができる。なお、第一の情報及び第二の情報は、電圧、電流、トランジスタ出力、又は培地の液厚等とすることができる。
　具体的には、培養バッグ１０における培地を排出して、液厚がゼロの状態に対応する出力電圧を記憶させた後、測長センサ２５からの検出情報にもとづき培養バッグ１０における培地が所望の液厚になるように、ポンプなどの送液手段３０の駆動を制御して培養バッグ１０に培地を供給させることができる。
　本実施形態に係る培養装置及び液厚制御方法は、上述した構成や方法に限定されるものではなく、本実施形態に係る液厚制御機構を実施できるものであれば、その他の構成や方法にすることもできる。
　例えば、培養バッグを載置する架台に測長センサを配置すると共に、押圧部材に金属部材を配置して、培養装置を構成することもできる。また、重量センサを用いて、培養バッグ１０における培地を含む重量を検出して制御部６０に出力し、制御部６０が、培地の重量にもとづき培地の液厚を算出して、送液手段３０の動作を制御する構成とすることもできる。
　さらに、本実施形態に係る液厚制御機構において用いられる培養バッグとして、二つのポートが備えられた培養バッグを用いて、第一のポート及び第一のバッグを連結する管状部材に第一の送液手段を配設すると共に、第二のポート及び第二のバッグを連結する管状部材に第二の送液手段を配設し、制御部により、検出部から入力した検出情報にもとづいて、第一の送液手段及び第二の送液手段の動作を制御することも好ましい。
　すなわち、二つのポートのそれぞれに連結されたチューブにポンプなどを配設して、本実施形態に係る培養装置及び液厚制御方法を実現することも好ましい。
　具体的には、図９及び図１０に示すような二つのポート１３ａを備えた培養バッグ１０ａを好適に用いることができる。
　これらの図において、培養バッグ１０ａの一方のポート１３ａには、チューブを介して培地バッグ４０が連結され、これに送液手段３０が配設されている。このとき、培地バッグ４０は、培地供給バッグなどとして用いることができる。また、培養バッグ１０ａの他方のポート１３ａには、チューブを介して廃液バッグ４０ａが連結され、これに送液手段３０ａが配設されている。なお、各ポートにチューブを介して連結するバッグは、その他の用途のものであってもよい。
　本実施形態に係る培養装置をこのような構成にすれば、測長センサ２５からの検出情報にもとづいて、送液手段３０及び送液手段３０ａの動作を制御することができる。
　このため、例えば培養バッグ１０ａにおける培地の液厚を、スフェアが移動できない大きさ（約５０μｍの隙間）にした状態のままで、培地を培地バッグ４０から培養バッグ１０ａへ送液し、かつ、培地を培養バッグ１０ａから廃液バッグ４０ａへ送液して、培地の交換を行うことが可能となる。また、このとき、送液手段３０及び送液手段３０ａの動作を制御して、培地の送液スピードを制御することも可能である。
　また、本実施形態に係る液厚制御機構において用いられる培養バッグとして、天板側フィルム１２において、培養バッグ１０の内側に天板突起部を備えて、天板突起部の幅を底部側フィルム１１に形成された凹部の開口部の幅よりも小さくし、かつ、天板突起部の高さを培養対象物の最小径より小さくして、天板突起部が培養部の上端面の一部に接触した場合に、上端面と天板側フィルム１２の下面に間隙が形成される構成とすることも好ましい。
　本実施形態に係る液厚制御機構において用いられる培養バッグをこのような構成にすれば、天板突起部を上端面の一部に接触させて、培養対象物のサイズよりも小さい間隙を上端面と天板部に形成させた状態にすることができる。これにより、培地などの液状物を間隙から通液可能としつつ、スフェアなどの培養対象物の移動を防止することが可能となる。
　培養対象物をスフェアとする場合、本実施形態に係る培養装置は、スフェアを形成する工程、スフェア状態を維持したまま培養して増殖させる工程、及びスフェア状態で分化誘導する工程等に用いることができる。
　また、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞、その他幹細胞から既に分化誘導工程を経て得られた分化細胞を使用してスフェアを形成させる方法や、分化誘導した細胞を一度凍結保存し、再度解凍後にスフェアを形成する方法等において用いることもできる。
　以上説明したように、本発明の実施形態に係る液厚制御機構、培養装置、及び液厚制御方法によれば、培養バッグにおける培地の液厚を把握できるため、培養バッグ内の培地の残量を把握することが可能となる。
　また、培養バッグの上面フィルムと下面フィルムが接触するタイミングを把握でき、これにより、培養バッグ内に培地が無い状態になることを防止することが可能である。また、ポンプの故障や設置が不適切であることによる送液エラーを検出することも可能である。
　さらに、培地の液厚の検出値を制御部にフィードバックすることにより、培養バッグにおける培地の液厚を制御することができるため、培養バッグの上面フィルムと複数の凹部を有する下面フィルムの間隙を、スフェアが移動できない大きさに制御することが可能である。
　また、培養バッグとして、ポートを二つ備えたものを用いると共に、二つのポートに連結された各チューブにポンプを配設することにより、例えば培養バッグにおける培地の液厚を、スフェアが移動できない大きさにした状態のままで、培地を培地バッグから培養バッグへ送液し、かつ、培地を培養バッグから廃液バッグへ送液して、培地の交換を行うことなどが可能となる。
　本発明は、以上の実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。例えば、培養バッグとしてポートを３つ以上備え、これらに連結された各チューブにポンプを配設して、検出器からの情報にもとづきこれらのポンプを制御する構成としたり、培養装置における押圧部材や測長センサの配置を変更するなど適宜変更することが可能である。
　本発明は、均一なサイズのスフェアなどを効率的に大量に作成する場合などに、好適に利用することが可能である。
　この明細書に記載の文献及び本願のパリ優先の基礎となる日本出願明細書の内容を全てここに援用する。
　１０　培養バッグ
　１１，１１ａ，１１ｂ　底部側フィルム
　１１１，１１１ａ，１１１ｂ　凹部
　１２　天板側フィルム
　１３　ポート
　１４　チューブ（管状部材）
　２０　培養バッグ収容部
　２１　架台
　２２　天板支持部
　２３　天板部
　２３１　天板開口部
　２４　センサ支持部
　２５　測長センサ
　２６　永久磁石
　２７　押圧部材
　２７１　押圧部
　２７２　取付部
　２７２１　永久磁石
　２７２２　金属部材
　２７３　ガイドピン
　３０　送液手段
　４０　培地バッグ
　５０　インキュベータ
　６０　制御部
　６１　入出力部
　６２　ＰＬＣ（プログラマブルロジックコントローラ）
　６３　継電部
　６４　操作部
　６５　電源部
　６６　配線遮断部

Claims (15)

  1. 　少なくとも一つのポートが備えられた軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を制御する液厚制御機構であって、
    　前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化を測定する検出部と、
    　前記検出部から入力した検出情報にもとづいて、前記培養バッグ及び培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、前記培養バッグ及び前記培地バッグ間における培地の送液を制御する制御部と、を有する
    　ことを特徴とする液厚制御機構。
  2. 　前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化が、部材の位置の変位であり、前記検出部が測長センサであることを特徴とする請求項１記載の液厚制御機構。
  3. 　前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化が、前記培養バッグが載置された収容部の重量の変化であり、前記検出部が重量センサであることを特徴とする請求項１記載の液厚制御機構。
  4. 　前記制御部が前記培地の液厚を算出し、この液厚にもとづき前記送液手段の動作を制御することを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の液厚制御機構。
  5. 　少なくとも一つのポートが備えられた軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を制御する培養装置であって、
    　前記培養バッグが載置される架台と、
    　前記培養バッグを前記架台に対して押圧することにより、前記培養バッグ内の液厚を均一にする押圧部材と、
    　前記押圧部材に対面して配置された天板部と、
    　前記天板部に対して前記押圧部材を垂直方向に移動可能に支持する支持機構と、
    　前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化を測定する検出部と、
    　前記検出部から入力した検出情報にもとづいて、前記培養バッグ及び培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、前記培養バッグ及び前記培地バッグ間における培地の送液を制御する制御部と、有する
    　ことを特徴とする培養装置。
  6. 　前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化が、部材の位置の変位であり、前記検出部が測長センサであることを特徴とする請求項５記載の培養装置。
  7. 　前記制御部が前記培地の液厚を算出し、この液厚にもとづき前記送液手段の動作を制御することを特徴とする請求項５又は６記載の培養装置。
  8. 　前記測長センサが前記天板部に配置され、前記測長センサが前記押圧部材に配置された金属部材までの距離を測定することを特徴とする請求項５～７のいずれかに記載の液厚制御装置。
  9. 　前記測長センサが前記架台に配置され、前記測長センサが前記押圧部材に配置された金属部材までの距離を測定することを特徴とする請求項５～７のいずれかに記載の培養装置。
  10. 　前記押圧部材における前記培養バッグを押圧する押圧部の水平面の形状が、前記培養バッグにおける培養部の水平面の形状と同一であり、前記押圧部が前記培養部の領域内のみを押圧することを特徴とする請求項５～９のいずれかに記載の培養装置。
  11. 　前記培養バッグにおける培養部に細胞又はスフェアを収容する複数の凹部が形成されたことを特徴とする請求項５～１０のいずれかに記載の培養装置。
  12. 　少なくとも一つのポートが備えられた軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を制御する液厚制御方法であって、
    　前記培養バッグが載置される架台と、前記培養バッグを前記架台に対して押圧することにより、前記培養バッグ内の液厚を均一にする押圧部材と、前記押圧部材に対面して配置された天板部と、前記天板部に対して前記押圧部材を垂直方向に移動可能に支持する支持機構と、前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化を測定する検出部と、前記検出部から入力した検出情報にもとづいて、前記培養バッグ及び培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、前記培養バッグ及び前記培地バッグ間における培地の送液を制御する制御部を有する培養装置を用いて、
    　前記制御部により、前記培地の液厚がゼロである第一の状態に対応する第一の情報を記憶し、第一の情報に所定の変化量を加算して第二の情報を算出し、前記第二の情報にもとづき前記送液手段の動作を制御して、前記培地の液厚を第二の情報に対応する第二の状態に制御する
    　ことを特徴とする液厚制御方法。
  13. 　前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化が、部材の位置の変位であり、前記検出部が測長センサであることを特徴とする請求項１２記載の液厚制御方法。
  14. 　前記第一の情報及び前記第二の情報が、電圧、電流、トランジスタ出力、又は前記培地の液厚のいずれかであることを特徴とする請求項１２又は１３記載の液厚制御方法。
  15. 　二つのポートが備えられた前記培養バッグを用いて、第一のポート及び第一のバッグを連結する管状部材に第一の送液手段を配設すると共に、第二のポート及び第二のバッグを連結する管状部材に第二の送液手段を配設し、前記制御部により、前記検出部から入力した検出情報にもとづいて、前記第一の送液手段及び前記第二の送液手段の動作を制御することを特徴とする請求項１２～１４のいずれかに記載の液厚制御方法。
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