JP2018019631A - 細胞培養装置、及び撹拌方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】可撓性材料からなる培養バッグを用いて細胞培養を行うにあたり、加圧された状態にある培養バック内の内容液を撹拌することができるようにする。【解決手段】培養バッグ10が載置された載置台2と、培養バッグ10の上面側を押圧する押圧体3との間に、内容液が収容された培養バッグ10が加圧下に挟持された状態で、載置台2と押圧体3の一方又は両方を、互いに非平行に傾斜するように揺動させて、培養バッグ10内の内容液を撹拌する。【選択図】 図2
Description
本発明は、可撓性材料からなる培養バッグを用いて細胞培養を行う細胞培養装置、及び当該培養バック内の内容液を撹拌する撹拌方法に関する。
近年、医薬品の生産、遺伝子治療、再生医療、免疫療法などの医薬学・生化学分野において、細胞(組織、微生物、ウイルスなどを含む)を人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような要求に応えるべく、本出願人は、可撓性材料からなる袋状の培養バッグを用いて閉鎖系の環境を構築し、コンタミネーションのリスクを低減しつつ、効率的に細胞を培養することができる細胞培養システムについて検討を重ねてきた。
例えば、細胞の培養には、通常、数日〜数週間程度の期間を要し、定期的に細胞の状態や細胞数を観察することが求められるが、その際、培地中の溶存気体が気泡化し、培養バッグ内に気泡が滞留してしまうと正確な観察ができなくなってしまう。このような不具合を解消するために、本出願人は、特許文献1において、加圧板で押圧するなどして培養バッグを加圧することにより、培養バッグ内に気泡が発生するのを抑制し、培養中の細胞の状態や細胞数を長期間にわたって安定的に観察できるようにした細胞培養方法を提案している。
一方、培養バッグが取り付けられた載置台を揺動させて、培養バックの内容液を撹拌するようにした細胞培養装置が知られている(例えば、特許文献2参照)。
細胞を効率良く培養する上で、培養バック内の内容液中の細胞の分布や、培地の成分濃度が均一となるようにして、良好な培養環境を維持できるようにすることも求められる。このためには、特許文献2のように、培養バッグを揺動させて内容液を撹拌することも有効である。
しかしながら、本出願人の検討によれば、培養バッグ内に気泡が発生するのを抑制して細胞の状態や細胞数を支障なく観察できるように、培養バッグを加圧板で押圧して加圧すると、培養バッグを揺動しても内容液を十分に撹拌できなくなってしまうという知見が得られている。これは、培養バッグが加圧された状態にあると、培養バッグ内での内容液の流動が妨げられてしまうためであると考えられる。
そこで、本出願人は、培養中の細胞の状態や細胞数を長期間にわたって安定的に観察できるように、培養バッグ内に気泡が発生するのを抑制しながらも、培養バック内の内容液を十分に撹拌できるようにすべく鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、可撓性材料からなる培養バッグを用いて細胞培養を行うにあたり、加圧された状態にある培養バック内の内容液を撹拌することができる細胞培養装置、及び撹拌方法の提供を目的とする。
本発明に係る細胞培養装置は、可撓性材料からなる培養バッグを用いて細胞培養を行う細胞培養装置であって、前記培養バッグが載置される載置台と、前記培養バッグの上面側を押圧する押圧体とを備え、前記載置台と前記押圧体との間に、内容液が収容された前記培養バッグが加圧下に挟持された状態で、前記載置台と前記押圧体の一方又は両方が、互いに非平行に傾斜するように揺動可能とされた構成としてある。
本発明に係る撹拌方法は、可撓性材料からなる培養バッグを用いて細胞培養を行うに際し、前記培養バッグが載置された載置台と、前記培養バッグの上面側を押圧する押圧体との間に、内容液が収容された前記培養バッグが加圧下に挟持された状態で、前記載置台と前記押圧体の一方又は両方を、互いに非平行に傾斜するように揺動させて、前記培養バッグ内の内容液を撹拌する方法としてある。
本発明によれば、加圧された状態にある培養バック内の内容液を撹拌することができる。
以下、本発明の好ましい実施形態について、図面を参照しつつ説明する。
[第一実施形態]
まず、本発明に係る細胞培養装置の第一実施形態について説明する。
図1は、本実施形態に係る細胞培養装置の概略を示す説明図であり、図2は、本実施形態に係る細胞培養装置の動作を示す説明図である。これらの図に示す培養装置1は、可撓性材料からなる培養バッグ10を用いて細胞培養を行うための装置である。
まず、本発明に係る細胞培養装置の第一実施形態について説明する。
図1は、本実施形態に係る細胞培養装置の概略を示す説明図であり、図2は、本実施形態に係る細胞培養装置の動作を示す説明図である。これらの図に示す培養装置1は、可撓性材料からなる培養バッグ10を用いて細胞培養を行うための装置である。
培養バッグ10は、細胞培養を閉鎖系で行うことができるように、細胞培養に必要なガス透過性(酸素透過性、二酸化炭素透過性)を有しているのが好ましい。さらに、高い細胞増殖効率を実現するために、低細胞毒性、低溶出性、及び放射線滅菌適性を有しているのが好ましく、細胞培養の進行状況や細胞の状態を観察できるように、内部を透視できる程度の透明性を有しているのが好ましい。
培養バッグ10を形成する可撓性材料としては、例えば、ポリエチレン,ポリプロピレン,エチレン−酢酸ビニル共重合体,ポリエステル,シリコーン系エラストマー,ポリスチレン系エラストマー,テトラフルオロエチレン−ヘキサフルオロプロピレン共重合体(FEP)等の熱可塑性樹脂を用いた樹脂フィルムが挙げられる。これらの樹脂は単層で用いても、同種又は異種の樹脂を積層して用いてもよい。
培養バッグ10は、このような可撓性材料を用いて袋状に形成される。例えば、周辺部が熱融着によりシールされ、方形状などの所望の形状に製袋されたものとすることができるが、培養の対象となる細胞とともに、かかる細胞を培養するために調製された培地を培養に支障なく収容できれば、その具体的な形態は限定されない。
特に図示しないが、培養バッグ10は、送液チューブを接続可能とする送液用のポートを備えることができる。このようなポートを備えることで、例えば、培地が貯留された培地バッグから培養バッグ10に培地を供給したり、培養された細胞が培地中に懸濁する細胞懸濁液を培養終了後に培養バッグ10から回収したりするなどの操作を、かかるポートに接続された送液チューブを介して閉鎖系を維持したまま行うことができきる。
また、培養装置1は、培養バッグ10が載置される載置台2と、載置台2上に載置された培養バッグ10の上面側を押圧する押圧体3とを備えており、内容液として細胞とともに培地が収容された培養バッグ10が、載置台2と押圧体3との間に加圧下に挟持されるように構成されている。
押圧体3は、通常、矩形の平板状に形成することができるが、押圧体3の形状は特に限定されない。適度の剛性を以て培養バッグ10を面状に押圧できれば、押圧体3は、パンチングメタル状、ワイヤーメッシュ状、ネット状に形成されたものであってもよい。
また、押圧体3の大きさは、少なくとも培養バッグ10の上面側の全面を覆う程度の大きさであればよく、培養バッグ10の大きさや形状などに応じて適宜変更できるのはいうまでもない。
また、押圧体3の大きさは、少なくとも培養バッグ10の上面側の全面を覆う程度の大きさであればよく、培養バッグ10の大きさや形状などに応じて適宜変更できるのはいうまでもない。
図示する例において、押圧体3は、培養バッグ10を押圧する面とは反対側の面に立設された支持アーム31を有している。かかる支持アーム31は、フレーム4に設けられた挿通部40に遊嵌状に挿通されており、押圧体3は、水平に保持された状態で、フレーム4に吊り下げられるように取り付けられている。そして、支持アーム31は、ネジ締めなどによってフレーム4に固定することができ、培養バック10に収容される内容液の液量に応じて、支持アーム31をフレーム4に固定する位置を適宜調整することで、押圧体3が培養バッグ10の上面側を押圧できるようになっている。
また、押圧体3をフレーム4に取り付けるにあたり、培養バック10に収容される内容液の液量が増減して培養バッグ10の厚みが変化しても、押圧体3が培養バッグ10を押圧できるように、支持アーム31をフレーム4に固定せずに、押圧体3を上下動可能にしておくこともできる。
この場合、押圧体3には、必要に応じて重りを付設して、その重量によって培養バッグ10を押圧するようにしてもよく、押圧体3をコイルバネ、板バネ、エアシリンダなどで付勢して、その付勢力によって培養バッグ10を押圧するようにしてもよい。
この場合、押圧体3には、必要に応じて重りを付設して、その重量によって培養バッグ10を押圧するようにしてもよく、押圧体3をコイルバネ、板バネ、エアシリンダなどで付勢して、その付勢力によって培養バッグ10を押圧するようにしてもよい。
押圧体3が培養バック10を押圧する押圧力は、培養バッグ10内に気泡が発生するのを抑制できるように適宜調整するが、例えば、1〜100kPaの押圧力で、培養バッグ10が押圧されるようにするのが好ましい。
一方、載置台2は、培養バッグ10が載置される平面状の載置面を有する台であり、特に図示しないが、培養バッグ10を載置面上に定置するための固定具などを備えることができる。図示する例において、載置台2は、揺動可能となるようにフレーム4に軸支されており、図示しない駆動機構によって左右に交互に傾くように構成されている。これにより、載置台2は、押圧体3に対して非平行に傾斜するように、すなわち、一端縁側が押圧体3に近接すると、他端側が押圧体3から離間するように揺動する。
なお、載置台2を揺動させる機構は、図示する例には限定されない。例えば、回動可能にフレーム4に軸支された揺動アームを載置台2の四隅に取り付けて、これらの揺動アームを回動させるタイミングを適宜調整することによって、載置台2が揺動するようにしてもよい。
載置台2が、押圧体3に対して非平行に傾斜するように揺動することによって、水平に保持された押圧体3との間に加圧下に挟持された培養バッグ10は、一方の端部側と他方の端部側とが交互に押し窄められるように変形する。そして、培養バッグ10の一方の端部側が押し窄められると、培養バッグ10に収容された内容液は他方の端部側に向かって流動し(図2(a)参照)、培養バッグ10の他方の端部側が押し窄められると、培養バッグ10に収容された内容液は一方の端部側に向かって流動する(図2(b)参照)。
その結果、培養バッグ10に収容された内容液には、流動方向が交互に逆向きに変化する流れが生じ、これによって、気泡の発生を抑制するために加圧された状態にある培養バック内の内容液を撹拌することができる。
その結果、培養バッグ10に収容された内容液には、流動方向が交互に逆向きに変化する流れが生じ、これによって、気泡の発生を抑制するために加圧された状態にある培養バック内の内容液を撹拌することができる。
[第二実施形態]
次に、本発明に係る細胞培養装置の第二実施形態について説明する。
図3は、本実施形態に係る細胞培養装置の概略を示す説明図であり、図4は、本実施形態に係る細胞培養装置の動作を示す説明図である。
次に、本発明に係る細胞培養装置の第二実施形態について説明する。
図3は、本実施形態に係る細胞培養装置の概略を示す説明図であり、図4は、本実施形態に係る細胞培養装置の動作を示す説明図である。
第一実施形態では、押圧体3を水平に保持するとともに、載置台2を揺動可能としているが、本実施形態では、載置台2を水平に保持するとともに、押圧体3を揺動可能としている。
載置台2は、例えば、フレーム4と一体に形成することによって、水平に保持されるようにすることができる。
一方、押圧体3を揺動可能とするには、例えば、揺動可能となるようにフレーム4に軸支された揺動体32に、押圧体3を取り付けるなどすればよい。揺動体32は、図示しない駆動機構によって左右に交互に傾くように構成することができる。これにより、押圧体3は揺動体32に追従して、載置台2に対して非平行に傾斜するように、すなわち、一端縁側が載置台2に近接すると、他端側が載置台2から離間するように揺動する。
なお、揺動体32を揺動させる機構は、図示する例には限定されない。例えば、回動可能にフレーム4に軸支された揺動アームを揺動体32の四隅に取り付けて、これらの揺動アームを回動させるタイミングを適宜調整することによって、揺動体32が揺動するようにしてもよい。
また、第一実施形態では、押圧体3はフレーム4に吊り下げられるように取り付けているが、本実施形態では、これと同様にして、揺動体32に吊り下げられるように取り付けられた押圧体3が、培養バッグ10の上面側を押圧するようにしてある。
押圧体3が、載置台2に対して非平行に傾斜するように揺動することによって、水平に保持された載置台2との間に加圧下に挟持された培養バッグ10は、一方の端部側と他方の端部側とが交互に押し窄められるように変形する。そして、培養バッグ10の一方の端部側が押し窄められると、培養バッグ10に収容された内容液は他方の端部側に向かって流動し(図4(a)参照)、培養バッグ10の他方の端部側が押し窄められると、培養バッグ10に収容された内容液は一方の端部側に向かって流動する(図4(b)参照)。
その結果、培養バッグ10に収容された内容液には、流動方向が交互に逆向きに変化する流れが生じ、これによって、気泡の発生を抑制するために加圧された状態にある培養バック内の内容液を撹拌することができる。
その結果、培養バッグ10に収容された内容液には、流動方向が交互に逆向きに変化する流れが生じ、これによって、気泡の発生を抑制するために加圧された状態にある培養バック内の内容液を撹拌することができる。
本実施形態が第一実施形態と異なるのは、載置台2を水平に保持するとともに、押圧体3を揺動可能とした点にあり、これ以外の構成は、前述した第一実施形態と共通するため、重複する説明は省略する。
以下、具体的な実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明する。
[実施例1]
ヒト末梢血単核球(h−PBMC)を培養対象とし、これとともに培地200mlを培養バッグ10に収容した。
培養バッグ10は、ポリエチレン製の樹脂フィルムを用いて、周辺部を熱融着によりシールして縦205mm×横110mmの矩形状に製袋されたものを使用した。
ヒト末梢血単核球(h−PBMC)を培養対象とし、これとともに培地200mlを培養バッグ10に収容した。
培養バッグ10は、ポリエチレン製の樹脂フィルムを用いて、周辺部を熱融着によりシールして縦205mm×横110mmの矩形状に製袋されたものを使用した。
次に、図1及び図2に示す培養装置1に、内容液が収容された培養バッグ10をセットした。すなわち、内容液が収容された培養バッグ10を揺動可能とされた載置台2上に定置し、水平に保持された押圧体3により培養バッグ10の上面側が押圧されるように、培養バッグ10をセットした。
なお、押圧体3は、支持アーム31をフレーム4に固定せずに、培養バック10の内容液の液量の変化に応じて、水平に保持されたまま上下動可能となるようにフレーム4に取り付けた。支持アーム31を含む押圧体3の全体の重量は2.5kgfであり、約1kPaの押圧力で培養バッグ10が押圧されるようにした。
これにより、載置台2と押圧体3との間に培養バッグ10が加圧下に挟持された状態として、定法にしたがって細胞培養を行った。
培養終了後、押圧体3を水平に保持したまま載置台2を往復30回揺動させ、培養中に沈殿していた細胞を巻き上げて懸濁させた。揺動後、ポートが下向きに傾斜した状態で載置台2を停止させ、その直後に、培養バッグ10内の細胞懸濁液を、ポート同士を送液チューブにて連結した第二の培養バッグにペリスタポンプを用いて送液した。
培養終了後、押圧体3を水平に保持したまま載置台2を往復30回揺動させ、培養中に沈殿していた細胞を巻き上げて懸濁させた。揺動後、ポートが下向きに傾斜した状態で載置台2を停止させ、その直後に、培養バッグ10内の細胞懸濁液を、ポート同士を送液チューブにて連結した第二の培養バッグにペリスタポンプを用いて送液した。
次いで、培養バッグ10内に残留する細胞を回収するために、空になった培養バッグ10に、ポート同士を送液チューブにて連結した培地バッグから、ペリスタポンプを用いて共洗い用の培地50mlを供給して、押圧体3を水平に保持したまま載置台2を往復30回揺動させた。これにより、培養バッグ10内に残留する細胞を共洗い用の培地に懸濁させ、揺動後、ポートが下向きに傾斜した状態で載置台2を停止させた直後に、その細胞懸濁液を第二の培養バッグに送液した。
なお、培養バッグ10は、分岐する送液チューブを介して、別途用意した第二の培養バッグと培地バッグとに一つのポートで連結され、バルブを切り替えることによって、それぞれのバッグとの間でペリスタポンプによる送液がなされるようにした。
このような共洗い操作を四回繰り返したところ、培養によって増殖した細胞の99%以上を第二の培養バッグに回収することができ、培養バッグ10に残存する細胞の残存率を1%未満とすることができた。
[比較例1]
図1及び図2に示す培養装置1から押圧体3を取り外し、これに代えて、載置台2と平行に培養バッグ10の上面側を押圧する押圧体を載置台2に取り付けて、押圧体3が載置台2に対して常に平行に培養バッグ10を押圧するように構成された培養装置を使用した以外は、実施例1と同様にして、細胞培養を行い、培養終了後に細胞の回収操作を行ったところ、培養によって増殖した細胞のうち10%程度もの細胞が回収できずに培養バッグ10に残留した。
図1及び図2に示す培養装置1から押圧体3を取り外し、これに代えて、載置台2と平行に培養バッグ10の上面側を押圧する押圧体を載置台2に取り付けて、押圧体3が載置台2に対して常に平行に培養バッグ10を押圧するように構成された培養装置を使用した以外は、実施例1と同様にして、細胞培養を行い、培養終了後に細胞の回収操作を行ったところ、培養によって増殖した細胞のうち10%程度もの細胞が回収できずに培養バッグ10に残留した。
このような結果から、実施例1では、培養バッグ10内に残留する細胞を共洗い用の培地に懸濁させる際に内容液を十分に撹拌でき、当該細胞を内容液中に均一に懸濁させて効率良く回収できることが確認できた。
以上、本発明について、好ましい実施形態を示して説明したが、本発明は、前述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲で種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、第一実施形態では、押圧体3を水平に保持するとともに、載置台2を揺動可能としており、第二実施形態では、載置台2を水平に保持するとともに、押圧体3を揺動可能としているが、載置台2と押圧体3とは、両方が互いに非平行に傾斜するように揺動可能としてもよい。
本発明は、閉鎖系で細胞を大量に培養する再生医療、免疫療法、抗体医薬生産などにおいて好適に利用することが可能である。
1 培養装置
2 載置台
3 押圧体
10 培養バッグ
2 載置台
3 押圧体
10 培養バッグ
Claims (4)
- 可撓性材料からなる培養バッグを用いて細胞培養を行う細胞培養装置であって、
前記培養バッグが載置される載置台と、
前記培養バッグの上面側を押圧する押圧体と
を備え、
前記載置台と前記押圧体との間に、内容液が収容された前記培養バッグが加圧下に挟持された状態で、前記載置台と前記押圧体の一方又は両方が、互いに非平行に傾斜するように揺動可能とされたことを特徴とする細胞培養装置。 - 前記押圧体が水平に保持されるとともに、前記載置台が揺動可能とされた請求項1に記載の細胞培養装置。
- 前記載置台が水平に保持されるとともに、前記押圧体が揺動可能とされた請求項1に記載の細胞培養装置。
- 可撓性材料からなる培養バッグを用いて細胞培養を行うに際し、
前記培養バッグが載置された載置台と、前記培養バッグの上面側を押圧する押圧体との間に、内容液が収容された前記培養バッグが加圧下に挟持された状態で、前記載置台と前記押圧体の一方又は両方を、互いに非平行に傾斜するように揺動させて、前記培養バッグ内の内容液を撹拌することを特徴とする撹拌方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016152546A JP2018019631A (ja) | 2016-08-03 | 2016-08-03 | 細胞培養装置、及び撹拌方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2021524378A (ja) * | 2018-07-12 | 2021-09-13 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングMerck Patent Gesellschaft mit beschraenkter Haftung | 混合装置 |
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CN114308177A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-12 | 昕慕(江苏)生物医药科技有限公司 | 一种细胞培养袋用细胞收获支架及使用方法 |
KR102418908B1 (ko) * | 2021-11-18 | 2022-07-11 | (주)마이크로디지탈 | 세포 배양 시스템 |
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-
2016
- 2016-08-03 JP JP2016152546A patent/JP2018019631A/ja active Pending
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