JP5309305B2 - 培養バッグ及び細胞培養方法 - Google Patents
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Description
[1]細胞接着性の粒状担体が収容された、密閉可能な通気性袋状容器を備えた培養バッグ。
[2]粒状担体の比重が1.006を上回る、[1]記載の培養バッグ。
[3]培地が袋状容器内に充填されている、[1]記載の培養バッグ。
[4]粒状担体の比重が該培地の比重を上回る、[3]記載の培養バッグ。
[5]細胞接着性物質が粒状担体の表面に配置されている、[1]記載の培養バッグ。
[6]細胞接着性物質が金属粒子である、[5]記載の培養バッグ。
[7]細胞接着性の粒状担体、及び密閉可能な通気性袋状容器を含む、細胞培養用キット。
[8]細胞を、細胞接着性の粒状担体上に接着させた状態で、密閉可能な通気性袋状容器内で培養することを含む、細胞の培養方法。
[9]初期細胞濃度が2.0×103〜5.0×108個/mlである、[8]記載の方法。
[10]所望の細胞分泌性成分を製造する方法であって、
(I)該成分を分泌し得る細胞を、細胞接着性の粒状担体上に接着させた状態で、密閉可能な通気性袋状容器内で培養すること;
(II)培養物から細胞が接着した粒状担体を除去し、培養培地を回収すること;及び
(III)培養培地から該成分を単離すること
を含む、方法。
[11]粒状担体の除去が、培地と粒状担体との間の比重差に基づき行われる、[10]記載の方法。
本発明の培養バッグを用いれば、多種多様な接着性細胞の高密度培養、長期間培養、高効率タンパク質生産が可能となる。
本発明の培養バッグは、通気性の部材を使用しているため、バッグ内の環境をインキュベーター内気中に開放する必要がない。また、培地の蒸発がほとんど無く、インキュベーター内部を加湿する必要が無いため、接着性細胞の培養時における雑菌のコンタミネーションのリスクが著しく低減される。更に、湿度に弱い精密機器をインキュベーター内に組み込むことが可能であるため、培養、タンパク質精製の自動化が簡便になる。
本発明の培養バッグは、閉鎖系での接着細胞の培養が容易であり、安全面に優れている。本発明の培養バッグを用いれば、接着細胞を播種した後の作業、培地添加、培地回収、有効成分の単離などの作業を自動化できるため、将来的にGMPレベルでのタンパク質生産等に対応しやすい。
本発明の培養バッグを用いれば、細胞数が多くなるに連れて、閉鎖回路を通じて、容量の大きいバッグへ細胞を移動させ、培地及び培養担体を添加するだけでスケールアップが可能である。従って、閉鎖系での接着細胞の継代、スケールアップが容易になる。
本発明の培養バッグを用いれば、容易に培養物から細胞を除去し、培養培地を回収することが可能であるので、タンパク質の大量生産における操作を簡素化することができる。
別の観点から、上記の事例において、粒状担体1gの総表面積は約314〜1031cm2である。ここで、10cm dish 1枚分の表面積は、約60cm2である。したがって、上記の総表面積は、10cm dish 約5〜18枚に相当するのである。尚、粒状担体1gの総表面積は、細胞接着性物質の粒径が粒状担体の粒径と比較して非常に小さいことを鑑みて、細胞接着性物質の表面積を無視し、粒状担体の粒径及び比重から算出している。
別の観点から、上記の事例において、粒状担体1gにおける多孔質シリカゲル粒子の総表面積は約314〜1031cm2である。ここで、10cm dish 1枚分の表面積は、約60cm2である。したがって、上記の総表面積は、10cm dish 約5〜18枚に相当するのである。尚、粒状担体1gの総表面積は、細胞接着性物質の粒径が粒状担体の粒径と比較して非常に小さいことを鑑みて、細胞接着性物質の表面積を無視し、粒状担体の粒径及び比重から算出している。
(I)該成分を分泌し得る細胞を、細胞接着性の粒状担体上に接着させた状態で、密閉可能な通気性袋状容器内で培養すること;
(II)培養物から細胞が接着した粒状担体を除去し、培養培地を回収すること;及び
(III)培養培地から該成分を単離すること
を含む、方法を提供する。
特開2006-280564号公報に記載の方法に従い、0.025wt%Au-SiO2培養担体をコロイド法により調製した。
培養担体の基材である金属酸化物(セラミックス)SiO2は、ここでは透明性を示す多孔質シリカゲル(球状、粒子径64μm〜210μm:Wako製)を使用した。
SiO2は、まず始めに加熱処理として小型電気炉(マッフル炉)を用いて大気中1000℃で6時間の仮焼成を行った。次に、SiO2を1.158g秤量して、これにAuコロイド溶液(粒子径20nm:SIGMA製)を5ml及び蒸留水を加えた後、スターラーでの数時間の攪拌においてSiO2表面にAuコロイド粒子を吸着させながら蒸発乾固させた。得られた試料は、十分な乾燥及び乳鉢等で混合を行った後、小型電気炉を用いて大気中900℃で3時間の貴金属−セラミックス界面の焼結処理により、SiO2の表面上にAuナノ粒子を高分散に固定化させた。この仕様による粒状担体(Au-SiO2系)の全重量に対するAuの担持重量の割合(wt%)は0.025wt%であった。また、この粒状担体の比重は2.2であった。
8cm×12cmの長方形の形状を有する2枚のポリエチレン製通気性シート材を重ねあわせ、1辺に導入/導出ポート1を設けた状態で周囲約1cmをヒートシールすることで強シール部2を設け、バッグを成型した。ヒートシールの条件は、温度約160度、荷重約4kg/cm2とした。バッグの容量は50mlであった。次にポートより参考例1で作成した担体3(1.0g:概算による表面積約600cm2相当)をバッグ内に収容した。更に、ポートよりDMEM培地(約50ml)4を充填することで、本発明の培養バッグを作成した(図1)。
実施例1で作成した50ml培養バッグを用いて、初期細胞数1x107個(CHO細胞)、37℃、5% CO2の条件で1週間培養を行った。1週間後の細胞数をLDH(乳酸脱水素酵素)量にて計算したところ、2.15x108個であった。
10cm dish 1枚で培養できるCHO細胞は多くて1.5x107個程度であることから、本実施例で得られた細胞数は、10cm dish 15枚分相当の細胞数に該当した。10cm dish 15枚分の表面積は、約1200cm2であることから、本発明の培養バッグを用いると、ディッシュの表面積と同一表面積に相当する培養担体上に約2倍の個数のCHO細胞が培養可能であることが分かった。
実施例1と同様に350ml培養バッグを作成した。バッグの中には5gの培養担体を収容した。
表1に記載の培養条件でヒトIL-6産生CHO細胞の培養を開始し、ヒトIL-6生産量および培地組成変化を経時的に測定した。尚、培養開始時には5%のウシ胎児血清を使用し、徐々に血清濃度を低下させ、培養開始12日以降は無血清培地中で細胞を培養した。結果を表1及び図2に示す。
本発明の培養バッグを用いた培養においては、細胞を培養開始から11日間含血清培地にて培養し、無血清培地へ交換後更に4日間培養し、培養後の培養上清を回収してヒトIL−6の生産量を測定した。
10cm dish培養においては、細胞含血清培地を用いて細胞がコンフルエントになるまで培養し、無血清培地へ交換後更に4日間培養し、培養後の培養上清を回収してヒトIL−6の生産量を測定した。
それぞれの生産量を比較したグラフを(図3)に示す。培養担体を用いたバッグ培養においてはIL−6生産量は6.9mgであったのに対して、10cm dish培養においては0.088mgであった。即ち、容量が350mlの本発明の培養バッグ(培養担体含む)1個で、10cm dish 78枚分のIL−6が生産可能であることが示された。
また、10cm dishを用いた培養は、無血清培地へ置換後、1週間程度で細胞が丸まって培養の継続が困難となった。一方、本発明の培養バッグを用いた場合においては、無血清培地へ置換後2ヶ月程度は、安定して培養が継続できた。従って、本発明の培養バッグを用いれば、極めて長期間安定して無血清培地中で細胞を培養可能であることが示された。
本発明の培養バッグを用いれば、多種多様な接着性細胞の高密度培養、長期間培養、高効率タンパク質生産が可能となる。
本発明の培養バッグは、通気性の部材を使用しているため、バッグ内の環境をインキュベーター内気中に開放する必要がない。また、培地の蒸発がほとんど無く、インキュベーター内部を加湿する必要が無いため、接着性細胞の培養時における雑菌のコンタミネーションのリスクが著しく低減される。更に、湿度に弱い精密機器をインキュベーター内に組み込むことが可能であるため、培養、タンパク質精製の自動化が簡便になる。
本発明の培養バッグは、閉鎖系での接着細胞の培養が容易であり、安全面に優れている。本発明の培養バッグを用いれば、接着細胞を播種した後の作業、培地添加、培地回収、有効成分の単離などの作業を自動化できるため、将来的にGMPレベルでのタンパク質生産等に対応しやすい。
本発明の培養バッグを用いれば、細胞数が多くなるに連れて、閉鎖回路を通じて、容量の大きいバッグへ細胞を移動させ、培地及び培養担体を添加するだけでスケールアップが可能である。従って、閉鎖系での接着細胞の継代、スケールアップが容易になる。
2 強シール部
3 粒状担体
4 培地
Claims (1)
- 所望の細胞分泌性成分を製造する方法であって、
(I)該成分を分泌し得る細胞を、培養培地にて、比重が該培養培地の比重を上回りかつ細胞接着性である粒状担体上に接着させた状態で、密閉可能かつポートが備えられた通気性袋状容器内で培養すること;
(II)通気性袋状容器内で培養物を静置することにより細胞が付着した粒状担体を沈殿させること;
(III)培養物から細胞が接着した粒状担体をポートを通じて除去し、培養培地を回収すること;及び
(IV)培養培地から該成分を単離すること
を含む、方法。
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