JP7142378B2 - 植物細胞培養用の液体培地および植物細胞の培養方法 - Google Patents
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Description
MS培地:和光純薬工業株式会社製のMS培地、pH5.6~5.7
発芽用固体培地:0.25質量%のゲランガムを含有するMS培地、pH5.6~5.7
カルス誘導用固体培地:0.25質量%のゲランガム、10-5Mのナフタレン酢酸、10-6Mのベンジルアデニンを含有するMS培地、pH5.6~5.7
カルス誘導用液体培地:10-7Mのナフタレン酢酸、10-5Mのベンジルアデニンを含有するMS培地、pH5.6~5.7
酸化亜鉛粒子1:シーアイ化成株式会社製、平均粒子径34nm
酸化亜鉛粒子2:シーアイ化成株式会社製、平均粒子径2000nm
酸化チタン粒子:シーアイ化成株式会社製、平均粒子径36nm
酸化ケイ素粒子:シーアイ化成株式会社製、平均粒子径25nm
エッペンチューブにタバコの種子と70%エタノール1mLを加え、30秒攪拌後6000rpmで遠心分離し上清を取り除いた。次に、次亜塩素酸濃度0.6%の滅菌液1mLを加え、3~5分攪拌後6000rpmで遠心分離し上清を取り除いた後、滅菌水を1mL加え、よく攪拌後6000rpmで遠心分離し上清を取り除いた。この洗浄操作を計3回行った。洗浄後のタバコの種子を寒天濃度0.1%のアガー液に懸濁し、シャーレ中の発芽用固体培地上に播種した。シャーレのふたを閉じサジカルテープを巻き2週間、25℃の人工気象器(EYELA製)で生育させた。生育したタバコの葉を葉脈を傷つけるようにメスで切り取りカルス誘導用固体培地に静置した。シャーレのふたを閉じサジカルテープを巻いた後、約1週間、25℃の人工気象器(EYELA製)で培養した。葉の切片から形成したカルスを暗所において継代培養繰り返すことによって作成した遺伝子レベルで同一の細胞を実施例および比較例に使用した。培地の作製、種子の滅菌、カルスの誘導は滅菌条件で行うことが重要であるため、使用する器具は滅菌し、作業は全てクリーンベンチで行った。
表1~3に示す処方に従い各液体培地を調製した。まず、70℃で一晩乾熱滅菌処理した各金属酸化物をカルス誘導用液体培地に添加し、超音波洗浄機で15分間分散処理を行うことで各試験用液体培地を調製した。
表1に示す各試験用液体培地が12.5mLずつ入った三角フラスコ(50mL)に、0.2gのタバコカルスを投入し、実施例1~6および比較例1は白色蛍光灯(光量7000lux)照射環境下、比較例2および3は暗所で、2週間、25℃で懸濁培養した。
表2に示す各試験用液体培地が7mLずつ入った6穴マルチウェルプレートのウェルに、0.2gのタバコカルスを投入し、青色LED(光量1500lux)照射環境下、2週間、25℃で懸濁培養した。
表3に示す各試験用液体培地が7mLずつ入った6穴マルチウェルプレートのウェルに、0.2gのタバコカルスを投入し、赤色LED(光量1500lux)照射環境下、2週間、25℃で懸濁培養した。
培養後のタバコ培養細胞について、細胞量およびクロロフィル量を評価した。結果を表1~3に示す。
懸濁培養後の培養液から吸引ろ過により液体培地を取り除き、残った培養細胞の重量を測定した。
細胞量の測定で得られた細胞培養を、細胞量の約4倍量の100%アセトンを用いて乳鉢上で乳棒を用いてカルスを摩砕した。摩砕後の細胞をバスツールピペットを用いて十分冷えた試験管に回収した。回収した摩砕液を3500rpmで10min遠心分離した後、上澄み液を目盛り付き試験管に回収した。上澄み液を85%アセトンでメスアップし、分光光度計を用いて663.6nmおよび646.6nmの吸光度を測定した。ただし750nmにおいてゼロ点合わせを行った。測定した吸光度と下記式によりクロロフィル含有量(μg/mL)を算出した。
クロロフィル含有量(μg/mL)=
17.76×646.6nmの吸光度+7.34×663.6nmの吸光度
そして、クロロフィル含有量、加えたアセトンの量およびカルスの生重量を用いて培養細胞あたりのクロロフィル量を算出した。
Claims (11)
- 植物細胞培養用の液体培地であって、
前記液体培地が金属酸化物粒子を配合してなり、
前記植物細胞培養が光照射環境下の培養である液体培地。 - MS培地またはB5培地に、植物ホルモンと、前記金属酸化物粒子とを配合してなる請求項1記載の液体培地。
- 前記金属酸化物粒子が、酸化亜鉛粒子、酸化チタン粒子、酸化ケイ素粒子、酸化鉄粒子、および酸化銅粒子からなる群より選ばれる1以上の金属酸化物粒子である、請求項1または2記載の液体培地。
- 前記金属酸化物粒子が、酸化亜鉛粒子および/または酸化チタン粒子である請求項1~3のいずれか1項に記載の液体培地。
- 前記金属酸化物粒子の平均粒子径が3000nm以下である請求項1~4のいずれか1項に記載の液体培地。
- 前記金属酸化物粒子の含有量が5~200mg/Lである請求項1~5のいずれか1項に記載の液体培地。
- 光照射環境下で、金属酸化物粒子を配合してなる植物細胞培養用の液体培地を用いる植物細胞の培養方法。
- 前記金属酸化物粒子が、酸化鉄粒子、および酸化銅粒子からなる群より選ばれる1以上の金属酸化物粒子である、請求項7記載の培養方法。
- 照射光が白色光である請求項7または8記載の培養方法。
- 照射光が青色光および/または赤色光である請求項7または8記載の培養方法。
- 請求項7~10のいずれか1項に記載の培養方法による植物細胞の培養工程を含む、クロロフィルの製造方法。
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Non-Patent Citations (4)
Title |
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Frontieres in Plant Science, 2016, Vol.7, Article 535, pp.1-8 |
Int. J. Environ. Res. Public Health, 2013, Vol.10, pp.47-71 |
日本植物学会第78回大会研究発表記録, 2014, Vol.78, p.220, P-077 |
日本植物学会第79回大会研究発表記録, 2015, Vol.78, p.207, P-092 |
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