JP7142378B2 - 植物細胞培養用の液体培地および植物細胞の培養方法 - Google Patents

Description

本発明は植物細胞培養用の液体培地、およびこの液体培地を用いる植物細胞の培養方法に関する。

植物細胞は分化全能性を有することから、植物細胞を用いて特定の植物組織を培養する組織培養や、異種植物のプロトプラストを細胞融合させる雑種形成などの研究が盛んに行われている。

植物細胞は、植物体をカルス誘導用ＭＳ（ムラシゲスクーグ）培地に植えることで未分化植物細胞の塊であるカルスを誘導し、得られたカルスの一部を固体培養や懸濁培養により増殖させて製造することが一般的である。懸濁培養は、カルス化した小細胞塊または細胞集団を液体培地に移植し、振とうまたは攪拌によって通気しながら、浮遊状態で培養する方法である。懸濁培養は、固体培地に比べて培地に加えた物質の影響が出やすく、比較的均一な細胞集団を形成し、細胞増殖速度に優れるという特徴を有する。しかし、さらなる増殖速度の向上が求められている。

特許文献１には、ジベレリンが添加されていることを特徴とする植物細胞懸濁培養用の液体培地が記載されており、この液体培地を用いて培養することにより、形成される細胞塊を小型化できることが記載されている。しかしながら、細胞増殖速度の向上については考慮されていない。

特開２０１１－２５０７２７号公報

植物細胞および／またはクロロフィルの増殖速度に優れた植物細胞培養用の液体培地、および植物細胞および／またはクロロフィルの増殖速度に優れた植物細胞の培養方法を提供することを目的とする。

本発明は、金属酸化物粒子を配合してなる植物細胞培養用の液体培地に関する。

前記金属酸化物粒子が、酸化亜鉛粒子および／または酸化チタン粒子であることが好ましい。

前記金属酸化物粒子の平均粒子径が３０００ｎｍ以下であることが好ましい。

前記金属酸化物粒子の含有量が５～２００ｍｇ／Ｌであることが好ましい。

また、本発明は光照射環境下で、前記の液体培地を用いる植物細胞の培養方法に関する。

照射光が白色光であることが好ましい。

照射光が青色光および／または赤色光であることが好ましい。

さらに、本発明は前記の培養方法による植物細胞の培養工程を含む、クロロフィルの製造方法に関する。

本発明の液体培地を用いて植物細胞を培養することにより、細胞および／またはクロロフィルの増殖速度が向上し、従来よりも効率的に植物細胞および／またはクロロフィルを製造することができる。

本発明の植物細胞培養用の液体培地は、金属酸化物粒子を配合してなることを特徴とする。

前記液体培地としては、植物細胞培養用の液体培地であれば特に限定されない。例えば、ＭＳ（ムラシゲスクーグ）培地やＢ５培地が挙げられる。

前記金属酸化物粒子を配合してなる液体培地を用いて植物細胞を培養することにより、細胞および／またはクロロフィルの増殖速度が向上し、従来よりも効率的に植物細胞を製造することができる。

金属酸化物粒子としては、酸化亜鉛粒子、酸化チタン粒子、酸化ケイ素粒子、酸化鉄粒子、酸化銅粒子などの生体に悪影響を及ぼし難い金属の酸化物粒子が挙げられる。なかでも、白色光照射環境下および青色光照射環境下での培養で細胞増殖速度が顕著に向上するという理由からは酸化亜鉛粒子が好ましく、青色光照射環境下および赤色光照射環境下での培養でクロロフィル増殖速度が向上するという理由からは酸化チタン粒子および酸化ケイ素粒子が好ましい。

金属酸化物粒子の平均粒子径は、本発明の効果がより発揮されるという理由から、３０００ｎｍ以下が好ましく、２０００ｎｍ以下がより好ましく、クロロフィルの形成がより促進されるという理由から、１００ｎｍ以下がさらに好ましく、５０ｎｍ以下が最も好ましい。また、金属酸化物粒子の平均粒子径は、培地中での凝集を抑制するという理由から、１０ｎｍ以上が好ましく、２０ｎｍ以上がより好ましい。なお、本明細書における金属酸化物粒子の平均粒子径は、ＢＥＴ法により求められる値である。

金属酸化物粒子の液体培地中の配合量は、完全に溶解してしまうことを抑制し、本発明の効果を効果的に発揮するという理由から、５ｍｇ／Ｌ以上が好ましく、２０ｍｇ／Ｌ以上がより好ましく、クロロフィルの形成がより促進されるという理由から、４０ｍｇ／Ｌ以上がさらに好ましい。また、金属酸化物粒子の液体培地中の配合量は、２００ｍｇ／Ｌ以下が好ましく、１５０ｍｇ／Ｌ以下がより好ましく、１２０ｍｇ／Ｌ以下がさらに好ましい。配合量が２００ｍｇ／Ｌを超える場合は、液体培地中の固形分（金属酸化物粒子）が多すぎて植物細胞の培養が困難となる傾向がある。

本発明の液体培地を用いて植物細胞を懸濁培養する場合、金属酸化物粒子の他に植物細胞培養に必要な植物ホルモンを適宜配合する必要がある。植物ホルモンとしては、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリンなどが挙げられ、培養する植物細胞に応じた植物ホルモンを所定量含有する液体培地とすればよい。

本発明の液体培地の製造方法は特に限定されず、従来の方法により製造することができる。例えば、ＭＳ培地に植物ホルモン添加およびｐＨ調整を行った後、オートクレーブなどで滅菌した液体培地に、乾熱滅菌などで滅菌した金属酸化物粒子を添加して撹拌する方法がある。液体培地中の金属酸化物粒子を撹拌する方法としては、金属酸化物粒子を効率的に分散させることができるという理由から超音波洗浄機を用いた方法が好ましい。

本発明の植物細胞の培養方法は、光照射環境下で前記の液体培地を用いることを特徴とし、この液体培地を用いること以外は従来の培養方法と同様とすることができる。

光照射環境は、植物細胞増殖速度、クロロフィル生成量の観点から、自然光または白色光を照射する環境が好ましい。ここで、白色光とは自然光に近い人工光であり、白色蛍光灯による光や、青色光と緑色光と赤色光とを所定の分布で混合した光とすることができる。自然光または白色光を照射する場合の光照射量は、従来の植物細胞培養条件であれば特に限定されず、５０００～１００００ｌｕｘが好ましい。

光照射にかかる電力を低減できるという理由からは、青色光および赤色光の少なくとも１つを照射する環境が好ましい。なお、本明細書における青色光は４５０～４９５ｎｍ領域の光成分が優勢である光であり、赤色光は６２０～７５０ｎｍ領域の光成分が優勢である光である。青色光および赤色光の照射機器としては特に限定されず、青色ＬＥＤ、赤色ＬＥＤなどを用いることができる。青色光および／または赤色光を照射する場合の光照射量は、従来の植物細胞培養条件であれば特に限定されず、５００～３０００ｌｕｘが好ましい。

本発明の培養方法に用いる植物細胞は、本発明の効果が損なわれない限り特に限定されない。例えば、タバコ、シロイヌナズナ、エンドウなどの双子葉類植物、イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギなどの単子葉類植物の植物細胞の培養に用いることができる。

本発明の一実施形態に係る植物細胞の培養方法によれば、細胞増殖速度が向上し、従来よりも効率的に植物細胞を製造することができる。また、一実施形態に係る培養方法により増殖した植物細胞は、クロロフィルの形成が促進されるため、本発明の培養方法による植物細胞の培養工程を含む、クロロフィルの製造方法とすることが好ましい。

本発明のクロロフィルの製造方法は、前記の培養方法により培養された植物細胞からクロロフィルを抽出することを特徴とする。

クロロフィルの抽出方法としては、従来の方法を採用することができる。例えば、植物細胞をアセトンなどの有機溶媒中ですり潰すなどして、有機溶媒中に溶解させ、遠心分離などで精製することで抽出することができる。

本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。

以下に実施例および比較例において用いた各種薬品をまとめて示す。
ＭＳ培地：和光純薬工業株式会社製のＭＳ培地、ｐＨ５．６～５．７
発芽用固体培地：０．２５質量％のゲランガムを含有するＭＳ培地、ｐＨ５．６～５．７
カルス誘導用固体培地：０．２５質量％のゲランガム、１０^-5Ｍのナフタレン酢酸、１０^-6Ｍのベンジルアデニンを含有するＭＳ培地、ｐＨ５．６～５．７
カルス誘導用液体培地：１０^-7Ｍのナフタレン酢酸、１０^-5Ｍのベンジルアデニンを含有するＭＳ培地、ｐＨ５．６～５．７
酸化亜鉛粒子１：シーアイ化成株式会社製、平均粒子径３４ｎｍ
酸化亜鉛粒子２：シーアイ化成株式会社製、平均粒子径２０００ｎｍ
酸化チタン粒子：シーアイ化成株式会社製、平均粒子径３６ｎｍ
酸化ケイ素粒子：シーアイ化成株式会社製、平均粒子径２５ｎｍ

カルス細胞の誘導
エッペンチューブにタバコの種子と７０％エタノール１ｍＬを加え、３０秒攪拌後６０００ｒｐｍで遠心分離し上清を取り除いた。次に、次亜塩素酸濃度０．６％の滅菌液１ｍＬを加え、３～５分攪拌後６０００ｒｐｍで遠心分離し上清を取り除いた後、滅菌水を１ｍＬ加え、よく攪拌後６０００ｒｐｍで遠心分離し上清を取り除いた。この洗浄操作を計３回行った。洗浄後のタバコの種子を寒天濃度０．１％のアガー液に懸濁し、シャーレ中の発芽用固体培地上に播種した。シャーレのふたを閉じサジカルテープを巻き２週間、２５℃の人工気象器（ＥＹＥＬＡ製）で生育させた。生育したタバコの葉を葉脈を傷つけるようにメスで切り取りカルス誘導用固体培地に静置した。シャーレのふたを閉じサジカルテープを巻いた後、約１週間、２５℃の人工気象器（ＥＹＥＬＡ製）で培養した。葉の切片から形成したカルスを暗所において継代培養繰り返すことによって作成した遺伝子レベルで同一の細胞を実施例および比較例に使用した。培地の作製、種子の滅菌、カルスの誘導は滅菌条件で行うことが重要であるため、使用する器具は滅菌し、作業は全てクリーンベンチで行った。

試験用液体培地の調製
表１～３に示す処方に従い各液体培地を調製した。まず、７０℃で一晩乾熱滅菌処理した各金属酸化物をカルス誘導用液体培地に添加し、超音波洗浄機で１５分間分散処理を行うことで各試験用液体培地を調製した。

実施例１～６、比較例１～３
表１に示す各試験用液体培地が１２．５ｍＬずつ入った三角フラスコ（５０ｍＬ）に、０．２ｇのタバコカルスを投入し、実施例１～６および比較例１は白色蛍光灯（光量７０００ｌｕｘ）照射環境下、比較例２および３は暗所で、２週間、２５℃で懸濁培養した。

実施例７～９、比較例４
表２に示す各試験用液体培地が７ｍＬずつ入った６穴マルチウェルプレートのウェルに、０．２ｇのタバコカルスを投入し、青色ＬＥＤ（光量１５００ｌｕｘ）照射環境下、２週間、２５℃で懸濁培養した。

実施例１０～１２、比較例５
表３に示す各試験用液体培地が７ｍＬずつ入った６穴マルチウェルプレートのウェルに、０．２ｇのタバコカルスを投入し、赤色ＬＥＤ（光量１５００ｌｕｘ）照射環境下、２週間、２５℃で懸濁培養した。

評価
培養後のタバコ培養細胞について、細胞量およびクロロフィル量を評価した。結果を表１～３に示す。

細胞量の測定
懸濁培養後の培養液から吸引ろ過により液体培地を取り除き、残った培養細胞の重量を測定した。

クロロフィル量の測定
細胞量の測定で得られた細胞培養を、細胞量の約４倍量の１００％アセトンを用いて乳鉢上で乳棒を用いてカルスを摩砕した。摩砕後の細胞をバスツールピペットを用いて十分冷えた試験管に回収した。回収した摩砕液を３５００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離した後、上澄み液を目盛り付き試験管に回収した。上澄み液を８５％アセトンでメスアップし、分光光度計を用いて６６３．６ｎｍおよび６４６．６ｎｍの吸光度を測定した。ただし７５０ｎｍにおいてゼロ点合わせを行った。測定した吸光度と下記式によりクロロフィル含有量（μｇ／ｍＬ）を算出した。
クロロフィル含有量（μｇ／ｍＬ）＝
１７．７６×６４６．６ｎｍの吸光度＋７．３４×６６３．６ｎｍの吸光度
そして、クロロフィル含有量、加えたアセトンの量およびカルスの生重量を用いて培養細胞あたりのクロロフィル量を算出した。

上記表１～３の結果より、本発明の液体培地が植物細胞および／またはクロロフィルの増殖速度に優れた植物細胞培養用の液体培地であり、さらに本発明の培養方法が植物細胞および／またはクロロフィルの増殖速度に優れた植物細胞の培養方法であることがわかる。

Claims (11)

1. 植物細胞培養用の液体培地であって、
   前記液体培地が金属酸化物粒子を配合してなり、
   前記植物細胞培養が光照射環境下の培養である液体培地。
2. ＭＳ培地またはＢ５培地に、植物ホルモンと、前記金属酸化物粒子とを配合してなる請求項１記載の液体培地。
3. 前記金属酸化物粒子が、酸化亜鉛粒子、酸化チタン粒子、酸化ケイ素粒子、酸化鉄粒子、および酸化銅粒子からなる群より選ばれる１以上の金属酸化物粒子である、請求項１または２記載の液体培地。
4. 前記金属酸化物粒子が、酸化亜鉛粒子および／または酸化チタン粒子である請求項１～３のいずれか１項に記載の液体培地。
5. 前記金属酸化物粒子の平均粒子径が３０００ｎｍ以下である請求項１～４のいずれか１項に記載の液体培地。
6. 前記金属酸化物粒子の含有量が５～２００ｍｇ／Ｌである請求項１～５のいずれか１項に記載の液体培地。
7. 光照射環境下で、金属酸化物粒子を配合してなる植物細胞培養用の液体培地を用いる植物細胞の培養方法。
8. 前記金属酸化物粒子が、酸化鉄粒子、および酸化銅粒子からなる群より選ばれる１以上の金属酸化物粒子である、請求項７記載の培養方法。
9. 照射光が白色光である請求項７または８記載の培養方法。
10. 照射光が青色光および／または赤色光である請求項７または８記載の培養方法。
11. 請求項７～１０のいずれか１項に記載の培養方法による植物細胞の培養工程を含む、クロロフィルの製造方法。