JP2752918B2 - 動物細胞のマイクロキャリア培養法 - Google Patents
動物細胞のマイクロキャリア培養法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、動物細胞をマイクロキ
ャリアを用いて培養するマイクロキャリア培養法に関す
るものである。
ャリアを用いて培養するマイクロキャリア培養法に関す
るものである。
【０００２】
【技術的背景】動物細胞は、モノクローン抗体やワクチ
ン，ホルモンなどの有用な生理活性物質を生産すること
ができるため、動物細胞を効率良く培養することが可能
な高密度培養法の開発が希求されている。動物細胞は、
その増殖様式から浮遊性細胞と足場依存性細胞に分類さ
れ、そのうち浮遊性細胞の場合は、栄養源が不足しない
ように且つ阻害物質を除去しながら最適環境条件を保持
すれば高密度培養が可能でありスケールアップも容易で
あるが、足場依存性細胞の場合には、培養槽内で担体の
比表面積を大きくするような工夫が必要である。その代
表的な方法として、緩い撹拌下でも培養液中に浮遊する
程度の比重を持つ粒状担体（ガラスビーズなどのマイク
ロキャリア）を用いて、その表面に動物細胞を付着・増
殖させるマイクロキャリア培養法がある。
ン，ホルモンなどの有用な生理活性物質を生産すること
ができるため、動物細胞を効率良く培養することが可能
な高密度培養法の開発が希求されている。動物細胞は、
その増殖様式から浮遊性細胞と足場依存性細胞に分類さ
れ、そのうち浮遊性細胞の場合は、栄養源が不足しない
ように且つ阻害物質を除去しながら最適環境条件を保持
すれば高密度培養が可能でありスケールアップも容易で
あるが、足場依存性細胞の場合には、培養槽内で担体の
比表面積を大きくするような工夫が必要である。その代
表的な方法として、緩い撹拌下でも培養液中に浮遊する
程度の比重を持つ粒状担体（ガラスビーズなどのマイク
ロキャリア）を用いて、その表面に動物細胞を付着・増
殖させるマイクロキャリア培養法がある。
【０００３】
【従来の技術】しかし乍ら、従来のマイクロキャリア法
による培養では、図２に示す如く、培養槽ａ内に入れた
動物細胞を付着させたマイクロキャリア及び培養液等を
Ｔ型撹拌子ｂで撹拌していたため、マイクロキャリアを
高密度にするとマイクロキャリア同士の衝突頻度が高く
なって細胞損傷が起き、また高密度のマイクロキャリア
を均一に分散させるために撹拌子ｂを高速で回転させる
と、撹拌子ｂとマイクロキャリアの衝突やマイクロキャ
リア同士の衝突の頻度が一層高くなって、細胞損傷が多
くなり生産性を上げることができない不具合があった。
による培養では、図２に示す如く、培養槽ａ内に入れた
動物細胞を付着させたマイクロキャリア及び培養液等を
Ｔ型撹拌子ｂで撹拌していたため、マイクロキャリアを
高密度にするとマイクロキャリア同士の衝突頻度が高く
なって細胞損傷が起き、また高密度のマイクロキャリア
を均一に分散させるために撹拌子ｂを高速で回転させる
と、撹拌子ｂとマイクロキャリアの衝突やマイクロキャ
リア同士の衝突の頻度が一層高くなって、細胞損傷が多
くなり生産性を上げることができない不具合があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明者は、この様な
不具合を解消するべく鋭意研究した結果、これらの不具
合は、動物細胞を付着させたマイクロキャリア及び培養
液等からなる混合液体を撹拌子で撹拌すると、培養槽ａ
内の渦流に乱流が発生するためであることを突き止め、
本発明を完成するに至った。本発明は、マイクロキャリ
アを高密度にした場合でもマイクロキャリア同士の衝突
頻度を低下さることを可能とし、その結果、細胞損傷の
発生を低減させて生産性を上げることが出来る動物細胞
のマイクロキャリア培養法を提供せんとするものであ
る。
不具合を解消するべく鋭意研究した結果、これらの不具
合は、動物細胞を付着させたマイクロキャリア及び培養
液等からなる混合液体を撹拌子で撹拌すると、培養槽ａ
内の渦流に乱流が発生するためであることを突き止め、
本発明を完成するに至った。本発明は、マイクロキャリ
アを高密度にした場合でもマイクロキャリア同士の衝突
頻度を低下さることを可能とし、その結果、細胞損傷の
発生を低減させて生産性を上げることが出来る動物細胞
のマイクロキャリア培養法を提供せんとするものであ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】斯る目的を達成する本発
明の動物細胞のマイクロキャリア培養法は、培養槽の内
部に、動物細胞を付着させたマイクロキャリア及び培養
液等を入れると共に円筒回転子を同心同軸状に配置せし
め、該円筒回転子を周方向に回転させることにより、上
記動物細胞を付着させたマイクロキャリア及び培養液等
による渦流を生じさせるようにした事を特徴とし、特に
前記渦流がテイラー渦と称される層流である事を特徴と
したものである。
明の動物細胞のマイクロキャリア培養法は、培養槽の内
部に、動物細胞を付着させたマイクロキャリア及び培養
液等を入れると共に円筒回転子を同心同軸状に配置せし
め、該円筒回転子を周方向に回転させることにより、上
記動物細胞を付着させたマイクロキャリア及び培養液等
による渦流を生じさせるようにした事を特徴とし、特に
前記渦流がテイラー渦と称される層流である事を特徴と
したものである。
【０００６】
【実施例】図１は、本発明に係る培養法を実施するため
の反応器を模式的に現わしたものであり、図中１は培養
槽を示し、２は円筒回転子を示す。
の反応器を模式的に現わしたものであり、図中１は培養
槽を示し、２は円筒回転子を示す。
【０００７】培養槽１及び円筒回転子２は、ガラスまた
はステンレス等の金属材やポリカーボネート等のプラス
チック材などを用いて、所要の直径と高さを有する有底
円筒形状に形成し、培養槽１の内部に円筒回転子２を同
心同軸状に配置すると共に、円筒回転子２を周方向に回
転自在に設置する。
はステンレス等の金属材やポリカーボネート等のプラス
チック材などを用いて、所要の直径と高さを有する有底
円筒形状に形成し、培養槽１の内部に円筒回転子２を同
心同軸状に配置すると共に、円筒回転子２を周方向に回
転自在に設置する。
【０００８】そして、培養槽１と円筒回転子２との間、
すなわち培養槽１の内周面と円筒回転子２の外周面とで
構成される空間部３内に、動物細胞を付着させたマイク
ロキャリア及び培養液等Ｂを入れて、円筒回転子２を回
転させながら培養するものである。
すなわち培養槽１の内周面と円筒回転子２の外周面とで
構成される空間部３内に、動物細胞を付着させたマイク
ロキャリア及び培養液等Ｂを入れて、円筒回転子２を回
転させながら培養するものである。
【０００９】即ち、培養槽１（の空間部３）内に動物細
胞を付着させたマイクロキャリアと培養液等Ｂを入れた
後、円筒回転子２を周方向に回転させることにより、上
記動物細胞を付着させたマイクロキャリア及び培養液等
Ｂによる渦流（テイラー渦）を生じさせ、その中で培養
するものである。
胞を付着させたマイクロキャリアと培養液等Ｂを入れた
後、円筒回転子２を周方向に回転させることにより、上
記動物細胞を付着させたマイクロキャリア及び培養液等
Ｂによる渦流（テイラー渦）を生じさせ、その中で培養
するものである。
【００１０】ここでテイラー渦と称せられる渦流は、培
養槽１内で円筒回転子２を或る回転数でもって周方向に
回転させたときに、動物細胞を付着させたマイクロキャ
リア及び培養液等Ｂが円筒回転子２の外周面を内周とす
るドーナツ状の層となって上下に複数段に重なり合った
状態で培養槽１内を周回しながら流れる層状の安定な流
れ（層流）をいう。
養槽１内で円筒回転子２を或る回転数でもって周方向に
回転させたときに、動物細胞を付着させたマイクロキャ
リア及び培養液等Ｂが円筒回転子２の外周面を内周とす
るドーナツ状の層となって上下に複数段に重なり合った
状態で培養槽１内を周回しながら流れる層状の安定な流
れ（層流）をいう。
【００１１】次に、本発明に係る動物細胞のマイクロキ
ャリア培養法について具体的実施例を説明するが、本発
明はこれらの実施例に限定されるものではない。
ャリア培養法について具体的実施例を説明するが、本発
明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１２】マイクロキャリアとしては、ガラスやＤＥ
ＡＥ化架橋デキストラン，ポリスチレン等のビーズ粒子
が知られているが、本実施例ではガラスビーズを用い
た。具体的には、密度１．０２ｇ／ｃｍ3 ，粒径９０〜
１５０μｍ（SIGMA 社製）のガラスビーズを用いた。こ
のマイクロキャリア（ガラスビーズ）の表面は正の電荷
を持っており、動物細胞の表面は負の電荷を持っている
ため、動物細胞はこのマイクロキャリア（ガラスビー
ズ）の表面に容易に付着する。
ＡＥ化架橋デキストラン，ポリスチレン等のビーズ粒子
が知られているが、本実施例ではガラスビーズを用い
た。具体的には、密度１．０２ｇ／ｃｍ3 ，粒径９０〜
１５０μｍ（SIGMA 社製）のガラスビーズを用いた。こ
のマイクロキャリア（ガラスビーズ）の表面は正の電荷
を持っており、動物細胞の表面は負の電荷を持っている
ため、動物細胞はこのマイクロキャリア（ガラスビー
ズ）の表面に容易に付着する。
【００１３】また、動物細胞としては、遺伝子導入によ
り顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）生産能を付与
したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（中外
製薬社製）を用いた。この動物細胞は、足場依存性細胞
としても浮遊性細胞としても増殖することが知られてい
る。
り顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）生産能を付与
したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（中外
製薬社製）を用いた。この動物細胞は、足場依存性細胞
としても浮遊性細胞としても増殖することが知られてい
る。
【００１４】［培地］培地としては、ＤＭＥＭ（ICN 社
製）とＨａｍ’Ｆ１２（DAIGO 社製）の１対１の混合培
地に下記の成分を加えたものを用いた。 ペニシリン（Gibco 社製） １００Ｕ／ｍｌ ストレプトマイシン（Gibco 社製） １００Ｕ／ｍｌ ＨＥＰＥＳ（和光純薬社製） ３．５ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ3 （和光純薬社製） １．２ｇ／Ｌ ＦＢＳ（Bocknek 社製） １０％（ｖ／ｖ）
製）とＨａｍ’Ｆ１２（DAIGO 社製）の１対１の混合培
地に下記の成分を加えたものを用いた。 ペニシリン（Gibco 社製） １００Ｕ／ｍｌ ストレプトマイシン（Gibco 社製） １００Ｕ／ｍｌ ＨＥＰＥＳ（和光純薬社製） ３．５ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ3 （和光純薬社製） １．２ｇ／Ｌ ＦＢＳ（Bocknek 社製） １０％（ｖ／ｖ）
【００１５】［細胞播種］滅菌したマイクロキャリア
を、５０ｍｌスピナーフラスコに入れ上記培地を加えて
２４時間浸漬した。動物細胞は、前培養として組織培養
フラスコ（SUMILON 社製）で静置培養したものを用い
た。トリプシンでもって上記組織培養フラスコからＣＨ
Ｏ細胞を剥して、トリパンブルー染色を行ない、染まら
ないものを生細胞とし、血球計算盤で生細胞数及び死細
胞数をそれぞれ計測し、生細胞濃度が１×１０5 cells/
mlになるように播種した。
を、５０ｍｌスピナーフラスコに入れ上記培地を加えて
２４時間浸漬した。動物細胞は、前培養として組織培養
フラスコ（SUMILON 社製）で静置培養したものを用い
た。トリプシンでもって上記組織培養フラスコからＣＨ
Ｏ細胞を剥して、トリパンブルー染色を行ない、染まら
ないものを生細胞とし、血球計算盤で生細胞数及び死細
胞数をそれぞれ計測し、生細胞濃度が１×１０5 cells/
mlになるように播種した。
【００１６】［細胞付着操作］マイクロキャリアの表面
にＣＨＯ細胞を付着させる際に、撹拌スピードが高いと
ＣＨＯ細胞とマイクロキャリアとの接触頻度は高くなる
が接触時間が短くなるためＣＨＯ細胞をマイクロキャリ
ア表面に十分に付着させることができず、逆に撹拌スピ
ードを遅くするとＣＨＯ細胞とマイクロキャリアとの接
触時間は長くなるが接触頻度が低くなるため、やはり高
い付着率は期待できない。そこで、マイクロキャリアへ
の細胞付着操作において最適撹拌回転数を調べるため
に、０，５，１０，１５及び２０ｒｐｍの各撹拌回転数
においてＣＨＯ細胞の付着率を調べた。この際、濃度１
ｇ／Ｌのマイクロキャリアに、ＣＨＯ細胞を１．０×１
０5 cells/ml播種し、細胞播種直後の浮遊細胞率を１０
０％とした。また、培地を２５ｍｌ加え、マイクロキャ
リアへの細胞付着率を高めるために、１０秒の振盪と、
２９分５０秒の撹拌を４回繰り返した。
にＣＨＯ細胞を付着させる際に、撹拌スピードが高いと
ＣＨＯ細胞とマイクロキャリアとの接触頻度は高くなる
が接触時間が短くなるためＣＨＯ細胞をマイクロキャリ
ア表面に十分に付着させることができず、逆に撹拌スピ
ードを遅くするとＣＨＯ細胞とマイクロキャリアとの接
触時間は長くなるが接触頻度が低くなるため、やはり高
い付着率は期待できない。そこで、マイクロキャリアへ
の細胞付着操作において最適撹拌回転数を調べるため
に、０，５，１０，１５及び２０ｒｐｍの各撹拌回転数
においてＣＨＯ細胞の付着率を調べた。この際、濃度１
ｇ／Ｌのマイクロキャリアに、ＣＨＯ細胞を１．０×１
０5 cells/ml播種し、細胞播種直後の浮遊細胞率を１０
０％とした。また、培地を２５ｍｌ加え、マイクロキャ
リアへの細胞付着率を高めるために、１０秒の振盪と、
２９分５０秒の撹拌を４回繰り返した。
【００１７】結果を図３のグラフに示す。このグラフか
ら理解されるように、付着操作開始から４時間経過した
時点における培養液中の浮遊細胞が、２０ｒｐｍで行な
った場合はまだ８０％存在しているが、１５ｒｐｍでは
１０％程度にまで減少し、０及び５ｒｐｍでは約４０％
存在し、１０ｒｐｍで行なった場合には約１５％存在し
ていた。これを踏まえて、マイクロキャリアへの細胞付
着操作を、撹拌スピード１５ｒｐｍで、２４時間行なっ
た後に培養を開始した。
ら理解されるように、付着操作開始から４時間経過した
時点における培養液中の浮遊細胞が、２０ｒｐｍで行な
った場合はまだ８０％存在しているが、１５ｒｐｍでは
１０％程度にまで減少し、０及び５ｒｐｍでは約４０％
存在し、１０ｒｐｍで行なった場合には約１５％存在し
ていた。これを踏まえて、マイクロキャリアへの細胞付
着操作を、撹拌スピード１５ｒｐｍで、２４時間行なっ
た後に培養を開始した。
【００１８】［細胞濃度］培養開始後、２４時間ごとに
サンプリングし、マイクロキャリア表面に付着した細胞
数と浮遊細胞数を測定した。付着細胞数の測定では、マ
イクロキャリアを含む懸濁液を１ｍｌサンプリングし
た。それを遠心分離機で遠沈した後、上清を除き、ＰＢ
Ｓ２ｍｌを添加し、再び遠沈した後上清を除き、この操
作をもう一度繰り返し、培養液中に存在した浮遊細胞を
除いた。その後、トリプシン処理を行い、マイクロキャ
リアからＣＨＯ細胞を剥離させた。次に、マイクロキャ
リアとＣＨＯ細胞を培地に再懸濁し、トリパンブルー染
色を行い、血球計算盤を用いて生細胞数を測定した。浮
遊細胞数の測定では、懸濁液１００μｌをサンプリング
し、トリパンブルー染色を行い、付着細胞数の測定と同
様の操作を行った。生細胞数は、付着細胞と浮遊細胞の
生細胞数の和によって求め、細胞濃度を計算した。細胞
生存率は全細胞数に占める死細胞数の割合とし、付着細
胞と浮遊細胞のそれぞれの細胞生存率も求めた。
サンプリングし、マイクロキャリア表面に付着した細胞
数と浮遊細胞数を測定した。付着細胞数の測定では、マ
イクロキャリアを含む懸濁液を１ｍｌサンプリングし
た。それを遠心分離機で遠沈した後、上清を除き、ＰＢ
Ｓ２ｍｌを添加し、再び遠沈した後上清を除き、この操
作をもう一度繰り返し、培養液中に存在した浮遊細胞を
除いた。その後、トリプシン処理を行い、マイクロキャ
リアからＣＨＯ細胞を剥離させた。次に、マイクロキャ
リアとＣＨＯ細胞を培地に再懸濁し、トリパンブルー染
色を行い、血球計算盤を用いて生細胞数を測定した。浮
遊細胞数の測定では、懸濁液１００μｌをサンプリング
し、トリパンブルー染色を行い、付着細胞数の測定と同
様の操作を行った。生細胞数は、付着細胞と浮遊細胞の
生細胞数の和によって求め、細胞濃度を計算した。細胞
生存率は全細胞数に占める死細胞数の割合とし、付着細
胞と浮遊細胞のそれぞれの細胞生存率も求めた。
【００１９】［顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）
の測定］培養液中に含まれる顆粒球コロニー刺激因子
（Ｇ−ＣＳＦ）濃度の測定には、逆相クロマトグラフィ
法を用いた高速液体クロマトグラフィを使用した。その
際、分析カラムとしては、球状シリカゲル担体に官能基
としてオクチル基（（−ＣＨ2 ）7 −ＣＨ3 ）が化学結
合した逆相系充填剤を充填せしめた分析用パックドカラ
ムを使用した。移動相は３０％１−プロパノールと６０
％１−プロパノールの２液による溶媒グラジェントで分
析した。それぞれの溶媒には０．１％のトリフルオロ酢
酸が含まれている。既知濃度のスタンダードサンプルを
２回測定し、ピーク面積の平均値をスタンダード面積と
し、この面積と未知のサンプルのピーク面積との比較に
より培養液中のＧ−ＣＳＦ濃度を決定した。インジェク
ションボリュームは３００μｌのサンプルを使用し、５
００μｌ以上のサンプルを注入した。
の測定］培養液中に含まれる顆粒球コロニー刺激因子
（Ｇ−ＣＳＦ）濃度の測定には、逆相クロマトグラフィ
法を用いた高速液体クロマトグラフィを使用した。その
際、分析カラムとしては、球状シリカゲル担体に官能基
としてオクチル基（（−ＣＨ2 ）7 −ＣＨ3 ）が化学結
合した逆相系充填剤を充填せしめた分析用パックドカラ
ムを使用した。移動相は３０％１−プロパノールと６０
％１−プロパノールの２液による溶媒グラジェントで分
析した。それぞれの溶媒には０．１％のトリフルオロ酢
酸が含まれている。既知濃度のスタンダードサンプルを
２回測定し、ピーク面積の平均値をスタンダード面積と
し、この面積と未知のサンプルのピーク面積との比較に
より培養液中のＧ−ＣＳＦ濃度を決定した。インジェク
ションボリュームは３００μｌのサンプルを使用し、５
００μｌ以上のサンプルを注入した。
【００２０】［浮遊状態のＣＨＯ細胞の懸濁培養］而し
て、上述した培養槽（バイオリアクター）でもって浮遊
状態のＣＨＯ細胞の懸濁培養を行い、細胞増殖を調べ
た。この時、円筒回転子２を１００ｒｐｍで回転させ、
ＣＨＯ細胞を１．０×１０5 cells/ml播種し、培養体積
を５０ｍｌとし、３７℃，５％ＣＯ2 の環境下で培養を
開始した。ＣＨＯ細胞の増殖曲線を図４に、ＣＨＯ細胞
の生存率を図５にそれぞれ示す。尚、図２に示した従来
の培養槽（バイオリアクター）においても、本発明と同
じ条件でもって操作した（以下同じ）。また、図４以降
のグラフにおいて、「cylindricai 」とは本発明による
ものであり、「stirred 」は従来例によるものである。
て、上述した培養槽（バイオリアクター）でもって浮遊
状態のＣＨＯ細胞の懸濁培養を行い、細胞増殖を調べ
た。この時、円筒回転子２を１００ｒｐｍで回転させ、
ＣＨＯ細胞を１．０×１０5 cells/ml播種し、培養体積
を５０ｍｌとし、３７℃，５％ＣＯ2 の環境下で培養を
開始した。ＣＨＯ細胞の増殖曲線を図４に、ＣＨＯ細胞
の生存率を図５にそれぞれ示す。尚、図２に示した従来
の培養槽（バイオリアクター）においても、本発明と同
じ条件でもって操作した（以下同じ）。また、図４以降
のグラフにおいて、「cylindricai 」とは本発明による
ものであり、「stirred 」は従来例によるものである。
【００２１】図４及び図５のグラフから理解されるよう
に、対数増殖期にあっては本培養法と従来の培養法とも
に同様な細胞増殖を示したが、培養後期においては本培
養法の方が従来の培養法よりも細胞濃度が高く維持でき
た。また細胞生存率に関しても、培養後期において本培
養法の方が従来の培養法よりも高く維持できた。
に、対数増殖期にあっては本培養法と従来の培養法とも
に同様な細胞増殖を示したが、培養後期においては本培
養法の方が従来の培養法よりも細胞濃度が高く維持でき
た。また細胞生存率に関しても、培養後期において本培
養法の方が従来の培養法よりも高く維持できた。
【００２２】これは、本培養法の場合には、培養槽１内
で円筒回転子２を周方向に回転させることにより、動物
細胞を付着させたマイクロキャリア及び培養液等Ｂによ
る渦流が、上述した通りテイラー渦と称される安定した
層流となり、これにより各層同士並びに円筒回転子２と
ＣＨＯ細胞がゆるやかに接触しているのに対し、従来の
培養法においては撹拌にともなう乱流によって撹拌子ｂ
とＣＨＯ細胞が衝突してＣＨＯ細胞を損傷させた結果、
細胞増殖と細胞生存率が培養後期において低下したもの
と考えられる。
で円筒回転子２を周方向に回転させることにより、動物
細胞を付着させたマイクロキャリア及び培養液等Ｂによ
る渦流が、上述した通りテイラー渦と称される安定した
層流となり、これにより各層同士並びに円筒回転子２と
ＣＨＯ細胞がゆるやかに接触しているのに対し、従来の
培養法においては撹拌にともなう乱流によって撹拌子ｂ
とＣＨＯ細胞が衝突してＣＨＯ細胞を損傷させた結果、
細胞増殖と細胞生存率が培養後期において低下したもの
と考えられる。
【００２３】これらの結果から、本培養法は浮遊状態の
ＣＨＯ細胞の懸濁培養が可能であり、培養後期において
細胞濃度及び細胞生存率が従来の培養法よりも高く維持
できるという点から、浮遊性細胞の懸濁培養において本
培養法を使用した方が有効であるものと考えられる。
ＣＨＯ細胞の懸濁培養が可能であり、培養後期において
細胞濃度及び細胞生存率が従来の培養法よりも高く維持
できるという点から、浮遊性細胞の懸濁培養において本
培養法を使用した方が有効であるものと考えられる。
【００２４】次に、ＣＨＯ細胞の増殖に及ぼすマイクロ
キャリア濃度の影響を調べた。マイクロキャリアの濃度
を１ｇ／Ｌ，５ｇ／Ｌ及び１０ｇ／Ｌに設定し、円筒回
転子２の回転数を１００ｒｐｍに設定した。ただし、マ
イクロキャリア濃度が１０ｇ／Ｌの場合にはマイクロキ
ャリアが高密度となるため、マイクロキャリア濃度５ｇ
／Ｌのものを４８時間培養してＣＨＯ細胞をマイクロキ
ャリア表面に十分増殖させた後、さらにマイクロキャリ
アを５ｇ／Ｌ添加した。
キャリア濃度の影響を調べた。マイクロキャリアの濃度
を１ｇ／Ｌ，５ｇ／Ｌ及び１０ｇ／Ｌに設定し、円筒回
転子２の回転数を１００ｒｐｍに設定した。ただし、マ
イクロキャリア濃度が１０ｇ／Ｌの場合にはマイクロキ
ャリアが高密度となるため、マイクロキャリア濃度５ｇ
／Ｌのものを４８時間培養してＣＨＯ細胞をマイクロキ
ャリア表面に十分増殖させた後、さらにマイクロキャリ
アを５ｇ／Ｌ添加した。
【００２５】マイクロキャリア濃度増加に伴う細胞増殖
の影響を図６に、細胞生存率の影響を図７に、浮遊細胞
率の影響を図８に、Ｇ−ＣＳＦ生産量の影響を図９に、
そして単位時間・単位細胞数当たりのＧ−ＣＳＦ生産量
の影響を図１０に夫々示す。
の影響を図６に、細胞生存率の影響を図７に、浮遊細胞
率の影響を図８に、Ｇ−ＣＳＦ生産量の影響を図９に、
そして単位時間・単位細胞数当たりのＧ−ＣＳＦ生産量
の影響を図１０に夫々示す。
【００２６】図６ないし図１０のグラフから理解される
ように、いずれのマイクロキャリア濃度においても、本
培養法と従来の培養法ともに同じ増殖を示した。細胞生
存率に関しても、マイクロキャリアが高密度になるにつ
れて本培養法と従来の培養法ともに若干低くなる傾向が
あるが、共に同じ生存率で変化している。
ように、いずれのマイクロキャリア濃度においても、本
培養法と従来の培養法ともに同じ増殖を示した。細胞生
存率に関しても、マイクロキャリアが高密度になるにつ
れて本培養法と従来の培養法ともに若干低くなる傾向が
あるが、共に同じ生存率で変化している。
【００２７】マイクロキャリアが高密度となっても細胞
増殖が減少せず、細胞生存率が維持できたのは、マイク
ロキャリアの密度（１．０２ｇ／ｃｍ3 ）が通常のマイ
クロキャリア培養で使用される密度（１．０４ｇ／ｃｍ
3 ）よりも小さかった為に、マイクロキャリア同士の衝
突の影響が軽減され、その結果、細胞増殖が減少せず、
細胞生存率の変化の影響も低く抑えられたものと考えら
れる。
増殖が減少せず、細胞生存率が維持できたのは、マイク
ロキャリアの密度（１．０２ｇ／ｃｍ3 ）が通常のマイ
クロキャリア培養で使用される密度（１．０４ｇ／ｃｍ
3 ）よりも小さかった為に、マイクロキャリア同士の衝
突の影響が軽減され、その結果、細胞増殖が減少せず、
細胞生存率の変化の影響も低く抑えられたものと考えら
れる。
【００２８】また、浮遊細胞率は培養後期において本培
養法と従来の培養法ともにマイクロキャリア濃度１ｇ／
Ｌの場合７０％以上となっているが、マイクロキャリア
濃度１０ｇ／Ｌの場合はともに２０％程度となってい
る。これは、マイクロキャリア濃度が高くなると培養液
の単位体積当たりの接着面積（Ｓ／Ｖ）が大きくなり、
細胞数当たりのマイクロキャリア接着面積が増加したた
め浮遊細胞が減少したものと考えられる。
養法と従来の培養法ともにマイクロキャリア濃度１ｇ／
Ｌの場合７０％以上となっているが、マイクロキャリア
濃度１０ｇ／Ｌの場合はともに２０％程度となってい
る。これは、マイクロキャリア濃度が高くなると培養液
の単位体積当たりの接着面積（Ｓ／Ｖ）が大きくなり、
細胞数当たりのマイクロキャリア接着面積が増加したた
め浮遊細胞が減少したものと考えられる。
【００２９】Ｇ−ＣＳＦ生産量の影響に関しては、マイ
クロキャリア濃度が増加するにつれてＧ−ＣＳＦ生産量
は高くなっている。また単位細胞当たりの単位時間当た
りのＧ−ＣＳＦ生産量は、各マイクロキャリア濃度にお
いて、ＣＨＯ細胞が対数増殖する培養時間５０〜１００
時間にピークを示し、培養後期では低くなった。
クロキャリア濃度が増加するにつれてＧ−ＣＳＦ生産量
は高くなっている。また単位細胞当たりの単位時間当た
りのＧ−ＣＳＦ生産量は、各マイクロキャリア濃度にお
いて、ＣＨＯ細胞が対数増殖する培養時間５０〜１００
時間にピークを示し、培養後期では低くなった。
【００３０】尚、このＣＨＯ細胞は足場依存性細胞とし
ても浮遊性細胞としても増殖でき、どちらの培養系でも
Ｇ−ＣＳＦを生産することができるが、足場依存性細胞
として用いた方がＧ−ＣＳＦ生産性はよいことが知られ
ている。
ても浮遊性細胞としても増殖でき、どちらの培養系でも
Ｇ−ＣＳＦを生産することができるが、足場依存性細胞
として用いた方がＧ−ＣＳＦ生産性はよいことが知られ
ている。
【００３１】また、マイクロキャリア濃度が１ｇ／Ｌの
場合、浮遊細胞率が約７０％と高くなるが、マイクロキ
ャリア濃度が１０ｇ／Ｌの場合は、浮遊細胞率が約２０
％と低くなるので、マイクロキャリア濃度が高い場合に
は足場依存性のＣＨＯ細胞の割合が高くなり、その結果
Ｇ−ＣＳＦ生産量が大きくなったものと考えられる。こ
れらの結果から、本培養法はマイクロキャリアが高密度
になっても細胞増殖が減少しないことから動物細胞の高
密度培養が可能であることが示された。
場合、浮遊細胞率が約７０％と高くなるが、マイクロキ
ャリア濃度が１０ｇ／Ｌの場合は、浮遊細胞率が約２０
％と低くなるので、マイクロキャリア濃度が高い場合に
は足場依存性のＣＨＯ細胞の割合が高くなり、その結果
Ｇ−ＣＳＦ生産量が大きくなったものと考えられる。こ
れらの結果から、本培養法はマイクロキャリアが高密度
になっても細胞増殖が減少しないことから動物細胞の高
密度培養が可能であることが示された。
【００３２】次に、円筒回転子２の回転数の増加が細胞
増殖に与える影響を調べた。ＣＨＯ細胞をマイクロキャ
リア濃度５ｇ／Ｌで１００ｒｐｍ，４８時間培養して、
マイクロキャリアの表面に十分に増殖させた後、円筒回
転子２及び撹拌子ｂの回転数をそれぞれ１４０ｒｐｍに
増加させた。ＣＨＯ細胞の増殖曲線を図１１に、細胞生
存率を図１２にそれぞれ示す。
増殖に与える影響を調べた。ＣＨＯ細胞をマイクロキャ
リア濃度５ｇ／Ｌで１００ｒｐｍ，４８時間培養して、
マイクロキャリアの表面に十分に増殖させた後、円筒回
転子２及び撹拌子ｂの回転数をそれぞれ１４０ｒｐｍに
増加させた。ＣＨＯ細胞の増殖曲線を図１１に、細胞生
存率を図１２にそれぞれ示す。
【００３３】円筒回転子２及び撹拌子ｂの回転数をそれ
ぞれ１４０ｒｐｍに増加させると、細胞濃度が、従来の
培養法では回転数を増加させた後大きく低下したのに対
し、本培養法では回転数を増加させた後も増加した。ま
た、細胞生存率についても、従来の培養法では回転数を
増加させた後に大きく低下したのに対して、本培養法で
は回転数を増加させた後も維持できた。
ぞれ１４０ｒｐｍに増加させると、細胞濃度が、従来の
培養法では回転数を増加させた後大きく低下したのに対
し、本培養法では回転数を増加させた後も増加した。ま
た、細胞生存率についても、従来の培養法では回転数を
増加させた後に大きく低下したのに対して、本培養法で
は回転数を増加させた後も維持できた。
【００３４】この結果から、本培養法では動物細胞を付
着させたマイクロキャリア及び培養液等Ｂによる渦流
が、上述した通りテイラー渦と称される安定した層流と
なり、これによってマイクロキャリア同士の衝突頻度が
低く抑えられ、その結果、細胞増殖に影響を与えること
がなく、細胞生存率も維持できたものと考えられる。他
方、従来の培養法では撹拌子の回転数の増加によって動
物細胞を付着させたマイクロキャリア及び培養液等Ｂの
流れの乱流状態が一層激しくなり、その結果、マイクロ
キャリア同士の衝突頻度が高くなったため、培養４８時
間後の細胞濃度及び細胞生存率が大きく低下したものと
考えられる。
着させたマイクロキャリア及び培養液等Ｂによる渦流
が、上述した通りテイラー渦と称される安定した層流と
なり、これによってマイクロキャリア同士の衝突頻度が
低く抑えられ、その結果、細胞増殖に影響を与えること
がなく、細胞生存率も維持できたものと考えられる。他
方、従来の培養法では撹拌子の回転数の増加によって動
物細胞を付着させたマイクロキャリア及び培養液等Ｂの
流れの乱流状態が一層激しくなり、その結果、マイクロ
キャリア同士の衝突頻度が高くなったため、培養４８時
間後の細胞濃度及び細胞生存率が大きく低下したものと
考えられる。
【００３５】また、本培養法においては、テイラー渦と
称される安定した層流の流れによってマイクロキャリア
と円筒回転子２は緩やかに接触しているために、ＣＨＯ
細胞に損傷を与えることはないが、従来の培養法におい
ては乱流によって回転する撹拌子とマイクロキャリアと
の衝突が激しくなり、ＣＨＯ細胞にダメージを与えるこ
とになる。
称される安定した層流の流れによってマイクロキャリア
と円筒回転子２は緩やかに接触しているために、ＣＨＯ
細胞に損傷を与えることはないが、従来の培養法におい
ては乱流によって回転する撹拌子とマイクロキャリアと
の衝突が激しくなり、ＣＨＯ細胞にダメージを与えるこ
とになる。
【００３６】
【発明の効果】本発明に係る動物細胞のマイクロキャリ
ア培養法によれば、マイクロキャリアが高密度の場合で
も細胞が増殖し、動物細胞の高密度培養が可能となる。
ア培養法によれば、マイクロキャリアが高密度の場合で
も細胞が増殖し、動物細胞の高密度培養が可能となる。
【００３７】しかも、高い撹拌回転数での高密度培養で
も細胞が増殖し、高い細胞生存率を維持することがで
き、効率的に動物細胞を培養することができる。
も細胞が増殖し、高い細胞生存率を維持することがで
き、効率的に動物細胞を培養することができる。
【００３８】また、連続培養を考えた場合、従来のＴ型
撹拌子による撹拌培養ではマイクロキャリアと細胞生産
物，老廃物の分離が困難であるが、本培養法によれば、
円筒回転子を膜を用いて形成することにより、連続培養
が可能となる。即ち、培養槽内に連続して新鮮な培地を
供給すると共に、膜を用いて形成した円筒回転子を通し
て細胞生産物や老廃物を含む古い培地を取出すことによ
って、マイクロキャリアと細胞生産物の分離操作を容易
にすることができるものである。
撹拌子による撹拌培養ではマイクロキャリアと細胞生産
物，老廃物の分離が困難であるが、本培養法によれば、
円筒回転子を膜を用いて形成することにより、連続培養
が可能となる。即ち、培養槽内に連続して新鮮な培地を
供給すると共に、膜を用いて形成した円筒回転子を通し
て細胞生産物や老廃物を含む古い培地を取出すことによ
って、マイクロキャリアと細胞生産物の分離操作を容易
にすることができるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明に係る培養法を実施するための培養
反応器を示す模式図。
反応器を示す模式図。
【図２】 従来の培養反応器を示す模式図。
【図３】 マイクロキャリア表面への細胞付着率を示
すグラフ図。
すグラフ図。
【図４】 ＣＨＯ細胞の増殖曲線を示すグラフ図。
【図５】 ＣＨＯ細胞の生存率を示すグラフ図。
【図６】 マイクロキャリア濃度の増加に伴う細胞増
殖の影響を示すグラフ図。
殖の影響を示すグラフ図。
【図７】 マイクロキャリア濃度の増加に伴う細胞生
存率の影響を示すグラフ図。
存率の影響を示すグラフ図。
【図８】 マイクロキャリア濃度の増加に伴う浮遊細
胞率の影響を示すグラフ図。
胞率の影響を示すグラフ図。
【図９】 マイクロキャリア濃度の増加に伴うＧ−Ｃ
ＳＦ生産量の影響を示すグラフ図。
ＳＦ生産量の影響を示すグラフ図。
【図１０】 マイクロキャリア濃度の増加に伴う単位時
間・単位細胞数当たりのＧ−ＣＳＦ生産量の影響を示す
グラフ図。
間・単位細胞数当たりのＧ−ＣＳＦ生産量の影響を示す
グラフ図。
【図１１】 円筒回転子２及び撹拌子ｂの回転数をそ
れぞれ１４０ｒｐｍに増加させたときのＣＨＯ細胞の増
殖曲線を示すグラフ図。
れぞれ１４０ｒｐｍに増加させたときのＣＨＯ細胞の増
殖曲線を示すグラフ図。
【図１２】 円筒回転子２及び撹拌子ｂの回転数をそ
れぞれ１４０ｒｐｍに増加させたときの細胞生存率を示
すグラフ図。
れぞれ１４０ｒｐｍに増加させたときの細胞生存率を示
すグラフ図。
１……培養槽 ２……円筒回転子 ３……空間部 Ｂ……培養液等 ａ……培養槽 ｂ……Ｔ型撹拌子
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 5/06 - 5/28
Claims (2)
- 【請求項１】 培養槽の内部に、動物細胞を付着させた
マイクロキャリア及び培養液等を入れると共に円筒回転
子を同心同軸状に配置せしめ、該円筒回転子を周方向に
回転させることにより、上記動物細胞を付着させたマイ
クロキャリア及び培養液等による渦流を生じさせるよう
にした事を特徴とする動物細胞のマイクロキャリア培養
法。 - 【請求項２】 前記渦流がテイラー渦と称される層流で
ある請求項１記載の動物細胞のマイクロキャリア培養
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7117088A JP2752918B2 (ja) | 1995-05-16 | 1995-05-16 | 動物細胞のマイクロキャリア培養法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7117088A JP2752918B2 (ja) | 1995-05-16 | 1995-05-16 | 動物細胞のマイクロキャリア培養法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08308560A JPH08308560A (ja) | 1996-11-26 |
| JP2752918B2 true JP2752918B2 (ja) | 1998-05-18 |
Family
ID=14703103
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7117088A Expired - Lifetime JP2752918B2 (ja) | 1995-05-16 | 1995-05-16 | 動物細胞のマイクロキャリア培養法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2752918B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8206981B2 (en) * | 2004-03-05 | 2012-06-26 | Dsm Ip Assets B.V. | Process for cell culturing by continuous perfusion and alternating tangential flow |
| JP5309305B2 (ja) * | 2008-01-07 | 2013-10-09 | 福岡県 | 培養バッグ及び細胞培養方法 |
-
1995
- 1995-05-16 JP JP7117088A patent/JP2752918B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08308560A (ja) | 1996-11-26 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |