KR101050585B1 - 연속식 살포 및 교호 접선 흐름에 의한 세포 배양 방법 - Google Patents

연속식 살포 및 교호 접선 흐름에 의한 세포 배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 배양 배지 및 세포를 포함하는 세포 배양액을 연속식 살포 배양함으로써 세포를 배양하는 방법에 관한 것이고, 이때 세포 배양 배지를 세포 배양액에 첨가하고, 세포 배양액보다 낮은 세포 밀도를 갖는 액체의 유출을 초래하는 중공사(hollow fiber)를 포함하는 필터 모듈 상에서 세포 배양액을 순환시키고, 필터 모듈내의 흐름이 교호 접선 흐름이다. 바람직하게, 배양 배지를 특정한 살포 속도로 첨가하고/하거나 바이오매스를 1회 이상 배양액으로부터 제거한다. 상기 방법은 응집 세포를 배양하기에 특히 적합하다. 또한, 본 발명은 생물학적 물질, 바람직하게는 항체가 세포에 의해 생성되는 방법에 관한 것으로, 이때 생물학적 물질이 하류 공정에서 추가로 정제될 수 있다.

Description

연속식 살포 및 교호 접선 흐름에 의한 세포 배양 방법{PROCESS FOR CELL CULTURING BY CONTINUOUS PERFUSION AND ALTERNATING TANGENTIAL FLOW}
본 발명은 세포의 살포 배양에 관한 것이다.
본 발명은 세포 배양 배지 및 세포를 포함하는 세포 배양액의 살포 배양에 의한 세포의 배양방법을 개시하고, 이때 세포 배양 배지를 세포 배양액에 첨가하고, 세포 배양액보다 낮은 세포 밀도를 갖는 액체의 유출을 초래하는 중공사(hollow fiber)를 포함하는 필터 모듈상에서 세포 배양액을 순환시키고, 필터 모듈내의 흐름은 교호 접선 흐름이다.
놀랍게도 본 발명에 따라 동물 세포, 특히 포유동물 세포, 또는 효모 세포를 살포 배양함에 의해서, 매우 높은 생존 세포 밀도를 수득할 수 있으며, 세포 배양이 추가로 매우 높은 세포 생존율을 나타내는 것을 관찰하였다. 게다가, 본 발명의 살포 방법이 배양액에서 보다 적은 세포 응집을 야기하고, 심지어 가시적 응집체 없이 단일 세포의 현탁액인 배양액을 초래함을 관찰하였다. 저 전단 조건, 예컨대 살포 세포 배양을 이용하면 전형적으로 세포의 분해를 초래하지 않기 때문에, 이는 놀라운 발견이다. 살포 세포 배양 동안의 세포 응집은, 예를 들어 세포 응집체 내에서 세포의 대사 프로필이 비균질함으로 인해 공정 조절이 보다 어렵기 때문에, 불리하다. 5개 이상의 세포가 응집체를 형성하는 경우 및 응집체가 세포의 총량의 5% 이상으로 포함될 때 특히 문제가 된다.
살포 공정이 미국 특허 제 6,544,424 호에서 기술된다. 상기 문헌에서는 상기 방법이 동물 세포의 살포 배양에 대해 사용될 수 있다고 언급하고 있긴 하지만 본 발명에서 관찰되는 매우 높은 세포 밀도를 개시하거나 제안하지는 않는다. 게다가, 미국 특허 제 6,544,424 B1 호는 살포 공정이 중공사의 막 표면상에 방해물이 부착 및 성장하는 것을 감소시킬 수 있음을 개시하지만, 세포 배양액 자체에서 세포가 보다 덜 응집되는 것을 개시하거나 제안하지 않는다.
보이저(Voisier) 등(문헌[Biotechnol. Bioeng. 82(2003), 751-765])은 현탁된 포유동물 세포의 고밀도 살포 배양에서 다양한 세포 유지 기법을 개괄한다. 개괄된 세포 유지 시스템중 어떤 것도 본 발명의 매우 높은 세포 생존율과 조합된 매우 높은 생존 세포 밀도를 제공할 수 있다.
도 1은 스핀필터 분리 장치를 사용하여 IgG1을 생성하는 PER.C6(등록상표) 클론 2개의 상이한 연속식 살포 발효에 대한 생존 세포 밀도(x 106세포/㎖) 대 배양 시간(일)의 도면이다. 1ℓ 애플리콘 발효기의 설정 교반기 속도는 100 내지 150rpm이었다. 살포 실행을 1ℓ 작업 체적으로 수행하였다. 2가지 살포 실행 모두를 위한 비 살포 속도(SPR)는 0.1 내지 0.3nℓ/(세포·일)이었다. 둘다의 경우에서, 살포 실행은 스핀필터 막힘 때문에 종결해야만했다.
도 2는 세포 유지 시스템으로서 탄성파 장치를 갖는 연속식 살포 시스템에서 IgG1을 생산하는 PER.C6(등록상표) 세포의 성장의 도면이다. 1ℓ 애플리콘 발효기의 설정 교반기 속도는 100 내지 150rpm이었다. 실행/정지 주기에서 사용되는 설정은 전방으로 300초 및 후방으로 4.5초였다. 실행 동안, 300초/3초 주기(15일)로 조정하였다. 살포 실행에 대한 비 살포 속도(SPR)는 0.1 내지 0.3nℓ/(세포·일)이었다.
도 3은 세포 유지 시스템으로서 ATF-4 유닛을 갖는 연속식 살포 시스템에서 IgG1을 생산하는 PER.C6(등록상표) 세포의 성장의 도면이다. 4ℓ들이 애플리콘 발효기에서 실험을 수행하였다. 교반기 속도 설정은 125rpm이었다. ATF-4를 1일 당 작업 체적 0.5 내지 3으로 조작하였다. SPR을 0.03 내지 0.08nℓ/(세포·일)로 설정하였다. 유입은 배양액의 높은 세포 밀도를 나타내고 세포의 응집이 완전히 없었다.
도 4는 스핀필터 분리 장치를 사용하는 IgG1을 생산하는 PER.C6(등록상표) 세포의 2개의 상이한 연속식 살포 배양에 대한 IgG1의 생산성 대 배양 시간(일)의 도면이다.
도 5는 세포 유지 시스템으로서 탄성파 장치를 갖는 연속식 살포 시스템에서 IgG1을 생산하는 PER.C6(등록상표) 세포의 생산성의 도면이다.
도 6은 세포 유지 시스템으로서 ATF 유닛을 갖는 연속식 살포 시스템에서 IgG1을 생산하는 PER.C6(등록상표) 세포의 생산성의 도면이다.
도 7은 살포 공정을 사용하여 배양된 PER.C6(등록상표) 세포에 대한 배양 시간(일) 대 흐름(ℓ/일) 및 비 살포 속도(nℓ/(세포·일))의 도면이다.
도 8은 실시예 2에서 기술된 과정을 사용한 생존 세포 밀도 및 세포 생존율의 도면이다.
세포의 살포 배양은 당분야에서 통상적인 의미를 갖는다. 즉 세포 배양 동안, 분리 이전 보다 낮은 세포 밀도를 갖는 액체가 유출되고 세포 배양 배지가 유입되는 분리 장치에 세포가 보유됨을 의미한다. 본 발명의 공정에서, 분리 장치는 중공사를 포함하는 필터 모듈이다.
살포 배양은 연속식 흐름 및 반연속식 흐름, 예를 들어 단계식 흐름 또는 지그재그 흐름을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
용어 "중공사"는 튜브 모양 막을 의미한다. 튜브의 내경은 바람직하게 0.3 내지 6.0mm, 보다 바람직하게는 0.5 내지 3.0mm, 가장 바람직하게는 0.5 내지 2.0mm이다. 바람직하게, 세포 파편은 필터를 통과할 수 있지만 세포의 높은 보유율을 보증하도록, 메쉬에서 공극 크기가 세포의 직경에 가깝도록 막의 메쉬 크기를 선택한다. 바람직하게, 메쉬 크기는 3 내지 30㎛이다.
중공사를 포함하는 필터 모듈은 예를 들어 제너럴 일렉트릭(General Electric)(이전에는 아머샴(Amersham))에서 상업적으로 이용가능하다.
"필터 모듈내의 교호 접선 흐름"은 중공사의 막 표면과 동일한 방향의(즉, 이에 대해 접선) 하나의 흐름(이 흐름은 후방으로 및 전방으로 진행한다)이 있고, 상기 필터 표면에 대해 실질적으로 직각을 이루는 방향으로의 다른 흐름이 있음을 의미한다. 접선 흐름은 당업자에서 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,544,424 호에서는, 하나의 펌프를 사용하여 중공사를 포함하는 필터 모듈상에서 세포 배양액을 순환시키고 또다른 펌프를 사용하여 필터 분리 이전 보다 낮은 세포 밀도를 갖는 액체를 제거함으로써 교호 접선 흐름을 수득할 수 있다는 것을 기술하고 있다.
본 발명의 방법에서, 세포의 배양에 적합한 임의의 유형의 세포 배양 배지가기본적으로 사용될 수 있다. 세포 배양 배지 및 세포 배양 조건을 선택하는 지침은 당분야에 널리 공지되어 있고 예를 들어 문헌[Chapter 8 and 9 of Freshney, R.I. Culture of animal cells(a manual of basic techniques), 4th edition 2000, Wiley-Liss and in Doyle, A., Griffiths, J. B., Newell, D. G. Cell & Tissue culture: Laboratory Procedures 1993, John Wiley & Sons]에서 제공된다.
일반적으로, 포유동물 세포를 위한 세포 배양 배지는 염, 아미노산, 비타민, 지방, 세정제, 완충액, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 미량 원소 및 탄수화물을 포함한다. 염의 예로는 마그네슘 염, 예를 들어 MgCl2.6H20, MgS04 및 MgS04.7H20 철 이온, 예를 들어 FeS04.7H20, 칼륨 염, 예를 들어 KH2PO4, KCl; 나트륨 염, 예를 들어 NaH2PO4, Na2HPO4 및 칼슘 염, 예를 들어 CaCl2.2H2O를 포함한다. 아미노산의 예는 모든 20개의 공지된 단백질유래의 아미노산, 예를 들어 히스티딘, 글루타민, 트레오닌, 세린, 메티오닌이다. 비타민의 예로는 아스코르베이트, 바이오틴, 콜린.Cl, 미오-이노시톨, D-판토테네이트, 리보플라빈을 포함한다. 지방의 예로는 지방산, 예를 들어 리놀레산 및 올레산; 소이 펩톤 및 에탄올 아민을 포함한다. 세정제의 예로는 트윈 80 및 플루론 F68을 포함한다. 완충액의 예는 HEPES이다. 성장 인자/호르몬/사이토카인의 예로는 IGF, 히드로코티손 및 (재조합)인슐린을 포함한다. 미량 원소의 예는 당업자에게 공지되어 있고 Zn, Mg 및 Se를 포함한다. 탄수화물의 예로는 글루코스, 프락토스, 갈락토스 및 피루베이트를 포함한다.
세포 배양 배지의 pH, 온도, 용존 산소 농도 및 삼투압은 기본적으로 중요하지 않고 선택된 세포의 유형에 따른다. 바람직하게, pH, 온도, 용존 산소 농도 및 삼투압은 세포의 성장 및 생산성을 최적화하도록 선택된다. 당업자는 살포 배양을 위한 최적의 pH, 온도, 용존 산소 농도 및 삼투압을 발견하는 방법을 알고 있다. 주로, 최적의 pH는 6.6 내지 7.6이고, 최적의 온도는 30 내지 39℃이고, 최적 삼투압은 260 내지 400mOsm/kg이다.
본 발명의 공정에 유리하게 수행되는 세포는 본 공정으로부터 이익을 얻는 임의의 세포 유형, 즉 매우 높은 생존 세포 밀도 및 매우 높은 세포 생존율로 배양되는 세포일 수 있다.
본 발명의 공정에 따르면, 매우 높은 생존 세포 밀도는 80 x 106세포/㎖ 이상, 바람직하게는 100 x 106세포/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 110 x 106세포/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 120 x 106세포/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 130 x 106세포/㎖ 이상, 가장 바람직하게는 140 x 106세포/㎖ 이상이다. 전형적으로, 세포 밀도에서 적합한 상한은 약 500 x 106세포/㎖ 일 수 있다.
놀랍게도, 본 발명의 공정의 매우 높은 세포 밀도는 매우 높은 세포 생존율을 수반한다. 매우 높은 세포 생존율은 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상이다.
특정 기간의 살포 배양 후, 일반적으로 세포가 정상 상태에 도달하였을때, 포유동물 세포의 경우 전형적으로 살포 배양 개시 후 12 내지 25일에 매우 높은 세포 밀도 및 매우 높은 세포 생존율이 도달되는 것으로 이해된다.
본 발명의 방법은 동물 세포 또는 효모 세포, 특히 포유동물 세포의 배양에 적합하다.
추가로, 본 발명의 방법은 배양 동안, 특히 살포 배양 동안 용이하게 또는 고유하게 응집체를 형성하는 세포(소위 응집 세포) 배양에 특히 적합하다. 놀랍게도, 본 발명의 방법은 필터 막상에 응집체 배출을 감소시킬 뿐만 아니라, 살포 배양 공정 동안 세포의 응집을, 심지어 응집체를 형성하는 고유의 경향을 갖는 세포의 응집을 감소시킨다. 본 발명에 따른 응집 세포 배양법은 5개 이상의 세포의 응집체가 세포 총량의 5% 이하, 바람직하게는 4% 이하, 보다 바람직하게는 3% 이하, 보다 바람직하게는 2% 이상을 구성하는 배양액을 생성한다. 특히 바람직하게, 본 발명에 따른 응집 세포 배양법은 진정한 단일 세포 현탁액인 배양액을 초래한다.
응집 세포는 5개 이상의 세포의 응집체를 형성하고, 응집체가 세포의 총량의 5% 이상을 구성하는 세포이다. 바람직하게, 응집체는 세포 6개 이상, 바람직하게는 7개 이상, 보다 바람직하게는 8개 이상, 보다 바람직하게는 9개 이상, 보다 바람직하게는 10개 이상으로 구성된다. 바람직하게는, 응집체는 세포의 총량의 7% 이상, 보다 바람직하게는 10% 이상, 가장 바람직하게는 15% 이상을 구성한다.
포유동물 세포의 예로는 CHO(차이니즈 햄스터 난소) 세포, 하이브리도마, BHK(햄스터 새끼 신장) 세포, 골수종 세포, 인간 세포, 예를 들어 HEK-293 세포, 인간 림포블라스토이드 세포, PER.C6(등록상표) 세포, 마우스 세포, 예를 들어 NS0 세포를 포함한다. 효모 세포의 예로는 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae), 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 클루이버로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 또는 피키아(Pichia) 속의 효모 세포를 포함한다.
바람직하게, 포유동물 세포가 사용되고, 보다 바람직하게는 CHO, NS0, PER.C6(등록상표) 세포가 사용된다. 또한 바람직하게, 배양동안의 응집 거동이 공지된 세포(응집 세포)가 사용된다. 가장 바람직하게, PER.C6(등록상표) 세포가 사용된다.
세포 응집은 예를 들어 현미경 하에서 측정될 수 있다.
세포 배양 배지의 배양액에 첨가하는 속도(유입 속도 및 살포 속도)는 세포의 생존율 및 밀도에 영향을 준다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 세포 배양 배지의 하기 화학식 1에 따른 살포 속도로 첨가된다:
Figure 112006064110125-pct00001
상기 식에서,
살포 속도는 ℓ/일로 표현되고;
SPR은 비 살포 속도, 즉 세포 배양 배지의 세포 배양액에 첨가하는 속도로서, 시간 단위 당 생존 세포 당 첨가되는 배지의 체적으로 표현되고;
생존 세포 밀도는 체적 단위 당 생존 세포의 수이다.
생존 세포의 수는 당업자에 의해, 예를 들어 트리판 블루 배제 방법에 의해 측정될 수 있다.
비 살포 속도는 바람직하게 0.01 내지 0.3nℓ/(세포·일), 보다 바람직하게는 0.01 내지 0.2nℓ/(세포·일)로 선택된다.
살포 속도를 조절할 때 추가의 매개변수, 예를 들어 배양액에 공급되는 글루코스 양 및/또는 산소 농도를 고려하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, PER.C6(등록상표)의 경우, 글루코스 살포 속도는 매질 살포 속도의 일부로서 바람직하게 3 내지 20mmoles/ℓ, 보다 바람직하게는 5 내지 15mmoles/ℓ에서 선택된다.
당업자는 유출 속도를 측정하는 방법을 알고 있다. 액체의 유출 속도는 살포 속도에 의해 측정되고 일반적으로 등가의 값에서 선택된다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 유출 액에는 실질적으로 생존 세포가 없다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 바이오매스(biomass, 즉, 세포 배양액중의 세포)를 세포 배양액으로부터 1회 이상 제거하고 추가의 세포 배양 배지을 세포 배양액에 첨가하여 바이오매스 제거에 대해 보충한다. 바이오매스 제거는 보다 높은 세포 밀도를 초래할 수 있다. 바이오매스를 연속식으로 또는 단계식으로 제거할 수 있다.
단계식 접근에서, 바이오매스를 규정된 시간 동안 연속식으로 제거한다. 단계식 접근이 사용되는 경우, 바이오매스 제거를 세포가 정상 상태에 도달하기 직전 또는 도달한 직후에 시작한다.
단계식 접근이 사용되는 경우, 바이오매스 제거 단계 당 바람직하게 1일 당 작업 체적의 2 내지 40%, 보다 바람직하게 5 내지 30%, 보다 바람직하게 5 내지 30%, 보다 바람직하게 10 내지 25%의 바이오매스의 체적을 제거한다.
"작업 체적"은 세포 배양액의 총 체적을 의미한다.
"바이오매스 제거 단계"는 바이오매스 제거의 시작에서 중지까지의 시간을 의미한다. 연속식 접근이 사용되는 경우, 세포 배양의 마지막까지 연속식으로 바이오매스를 제거한다. 바람직하게, 바이오매스의 연속식 제거를 세포가 정상 상태에 도달하기 직전 또는 도달한 직후에 시작한다. 바람직하게, 1일 당 작업 체적의 2 내지 40%, 보다 바람직하게는 3 내지 30%, 보다 바람직하게는 4 내지 15%의 체적의 바이오매스를 제거한다.
추가의 세포 배양 배지을 첨가하여 바이오매스 제거를 보충한다. 추가의 세포 배양 배지을 세포 배양액에 첨가하는 공급물은 살포 공급물로 합쳐지지만, 분리된 공급물로 첨가될 수 있다. 당업자는 얼마나 많은 추가의 세포 배양 배지가 바이오매스 제거를 보충하기 위해 필요한지를 알고 있다. 일반적으로, 세포 배양액에 대한 추가의 세포 배양 배지 첨가 속도는 바이오매스 제거 속도와 동일할 것이다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 생물학적 물질이 세포에 의해 생산된다. 세포의 살포 배양에서 적합하게 생산될 수 있는 생물학적 물질은 대체로 동물 세포, 특히 포유동물 세포 및 효모 세포에 의해 생산될 수 있는 모든 생물학적 물질, 예를 들어 치료 및 진단 단백질, 예컨대 단클론 항체, 성장 인자 또는 펩타이드 호르몬, 효소, 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 유전자 치료에서 사용되는 바이러스 벡터, 백신 등이다.
본 발명의 살포 배양 공정에서, 유출 액체는 분리 이전의 액체 보다 보다 낮은 세포 밀도를 갖지만 동일한 농도의 생물학적 물질을 갖는다.
바람직하게, 본 발명에 따른 공정은 생약학적 생성물의 생산에 사용되고, 이는 의학 용도를 갖는 생물학적 물질이다. 생약학적 제품의 예는 다음(괄호안은 상응하는 생약학적 제품의 상품명의 예)과 같다: 테넥케플라세(TN 카제(Kase), 상표명), (재조합) 항혈우병 인자(레팩토(ReFacto), 상표명), 림프아세포성 인터페론 α-n1(웰페론(Wellferon), 상표명), (재조합) 항응고 인자(노보세븐(NovoSeven), 상표명), 에타너셉트(엔브렐(Enbrel), 상표명), 트라츠즈맵(허셉틴(Herceptin), 상표명), 인플릭시맵(레미캐드(Remicade), 상표명), 바실릭시맵(시물렉트(Simulect), 상표명), 다실주맵(제나파즈(Zenapaz), 상표명), (재조합) 항응고 인자 IX(베네픽스(Benefix), 상표명), 에리트로포이에틴 알파(에포겐(Epogen), 등록상표), G-CSF(뉴포겐(Neupogen, 등록상표)필그라스팀(Filgrastim)), 인터페론 알파-2b(인퍼겐(infergen), 등록상표), 재조합 인슐린(휴무린(Humulin), 등록상표), 인터페론 베타 1a(아보넥스(Avonex), 등록상표), 인자 VIII(코게네이트(KoGENate), 등록상표), 글루코세레브로시다제(케레자임(Cerezyme), 상표명), 인터페론 베타 1b(베타세론(Getaseron), 등록상표), TNF 알파 수용체(엔브렐(Enbrel), 등록상표), 난포 자극 호르몬(고날(Gonal)-F, 등록상표), 맵 아브식스맵(시나기스(Synagis), 등록상표, 레오프로(ReoPro), 등록상표), 맵 리틱시맵(리투산(Rituxan), 등록상표), 조직 플라스미노겐 활성제(액티바제(Activase, 등록상표), 액틸리아제(Actilyase, 등록상표)), 인간 성장 호르몬(프로트로핀(Protropin, 등록상표), 노르디트로핀(Norditropin, 등록상표), 제노트로핀(GenoTropin, 상표명)). 가능한 의학적 용도를 갖는 폴리뉴클레오타이드의 예는 유전자 치료 플라스미드 DNA이다. 일부의 유전자 치료 DNA는 이들의 의학 적용을 위해 임상 시도에서 현재 시험되고 있다. 백신의 예는 생, 경구, 4가의 로타바이러스 백신(로타쉘드(RotaShield), 상표명), 광견병 백신(랜애벌트(RanAvert), 상표명), B형 간염 백신(레콤비박스(RECOMBIVAX) HB(등록상표), 엔거릭스(Engerix, 등록상표)) 및 불활성화된 A형 간염 백신(VAQTA, 상표명)이다.
유출액 중의 생물학적 물질을 소위 하류 공정에서 추가로 정제할 수 있다. 하류 공정은 주로 다양한 조합 및 순서의 몇가지 정제 단계를 포함한다. 하류 공정에서 정제 단계의 예는 분리 단계(예를 들어, 친화성 크로마토그래피 및/또는 이온 교환 크로마토그래피), 생물학적 물질의 농축을 위한 단계(예를 들어, 한외여과 또는 여과에 의해서), 완충액을 교환하는 단계 및/또는 바이러스를 제거하거나 불활시키는 단계(예를 들어, 바이러스여과, pH 이동 또는 용매 세정제 처리)이다.
본 발명은 이제 다음 실시예의 방법에 의해 설명될 것이나, 이에 의해 제한되지 않을 것이다.
실시예 1
생약제의 생산을 위한 인간 세포주 PER.C6(등록상표)의 공정 최적화
도입
많은 발현 플랫폼(platform)이 현재 생약제의 생산을 위해 존재한다. 대부분의 신규한 제품은 주로 포유동물 세포는 포함하고 있지만 나머지에는 없는 글리코실화 기작으로 인해 포유동물 시스템을 선택해야한다. 그러나, 이제까지 세포 질량 및 이들 세포의 결과적인 생산성은 상응하는 미생물 시스템(이들 세포가 이런 생성물을 제조하는 기작을 갖고 있다면) 보다 10 내지 100배 더 낮다.
살포 배양 셋업(setup)은 생약제를 생산하기 유리하게 만들어진 많은 특징을 갖는 인간 세포주인 PER.C6(등록상표) 세포주에서 개발되었다. 살포 셋업은 세포가 보유되고, 수확물이 포획되고, 배지 재공급이 일어나도록 배양액 액체 배지의 다양한 성분의 분리를 포함한다. PER.C6(등록상표) 세포주의 연속식 살포 배양액 내의 스핀필터, 탄성파 장치 및 교호 접선 흐름(ATF) 유닛의 성능을 평가하였다.
재료 및 방법
세포주 및 유지
PRE.C6(등록상표) 세포주를 인간 IgG을 생산하는 본 연구에서 사용하였다. 세포는 6mM L-글루타민(깁코(Gibco))이 보충된 혈청이 없는 시판되는 배지(EX-CELL, 상표명 VPRO 매질, JRH 바이오사이언스(Bioscience))에서 유지되었다. PER.C6(등록상표) 세포주는 포스포글리세라테키나제 프로모터를 사용하는 아데노바이러스 5형(ad5) E1 유전자로 무한증식화된 인간 배아 세포주이다.
생물반응기 설정:
1ℓ 및 4ℓ의 작업 체적 반응기(애플리콘(Applikon), 네덜란드 및 비.브라운(B.Braun), 독일)를 본 연구동안 사용하였다. 브라운 DCU3 조절기(비.브라운, 독일)을 사용하여 특정된 설정값에서 공정을 조작하였다. 온도를 36.5℃(35 내지 37.5℃ 범위)에서 유지하였다. 용존 산소 농도는 상부공간을 통한 주입 기체 조성의 자동 조절 및 미세공극의 스파저(sparger)를 통한 간헐적 스파징에 의해 공기 포화의 50%(40 내지 60% 범위)로 조절되었다. pH 설정값은 7.1(6.7 내지 7.5 범위)이고 상부공간을 통해 CO2의 흐름을 조절하였다. 세포를 접종량 0.2 내지 0.5 x 106세포/㎖의 생존 세포 밀도 범위로 발효기에 접종하였다. 살포는 1 내지 3 x 106 세포/㎖ 범위의 생존 세포 범위에서 시작하였다.
세포 유지:
세포를 3개의 상이한 장치를 사용하여 반응기에서 유지하였다. 먼저, 10㎛ 공극 크기(GKD, 디렌(Duren) 독일)를 갖는 스핀필터를 사용하였다. 둘째로, 바이오셉(Biosep) ADI1015 세포 유지 시스템 및 조절기(애플리센스(AppliSens), 네덜란드)를 사용하였다. 마지막으로, ATF-4 조절 유닛 및 중공사 막 모듈과 관련된 하우징(housing)(리파인 테크놀로지(Refine Technology), 미국)을 평가하였다. 사용된 중공사 필터는 모델 CFP-2-E-8SIP(0.2마이크론, 면적: 4600cm2, 마젤란 인스트루먼트(Magellan instrument)에서 수득된 아머샴 바이오사이언스(Amersham Bioscience), 미국)이었다. 일정한 배양액 체적을 유지하기 위해서, 레벨 센서 조절 루프를 이동하였다.
분석 방법
생물반응기로부터 세포 계수는 트리판 블루 배제 방법을 사용하여 수행하였다. 생존 세포의 수는 다음과 같이 측정하였다: 트리판 블루로 염색된 일정양의세포를 푸츠스 로젠탈(Fuchs Rosenthal) 혈구계로 옮겼다. 혈구계의 챔버를 현미경 하에 위치시키고 적절한 수의 상자를 계수하였다. 생존 세포 밀도를 다음 수학식 2를 사용하여 계산하였다:
Figure 112006064110125-pct00002
상기 식에서,
A는 평방 A에서 비-염색된 세포의 수이고,
B는 평방 B에서 비-염색된 세포의 수이고,
E는 희석 인자이다.
항체 농도를 자외선 280nm 흡수 검출기를 갖춘 HPLC를 사용하여 분석용 단백질 A 컬럼으로 측정하고; 실제 농도는 IgG1 참조 표준물질의 보정 곡선에 근거하여 측정하였다.
결과
살포 배양
상기 재료 및 방법으로 수득된 결과를 도 1 내지 6에 제시한다.
요약
상이한 유형의 살포에 대해 수득된 데이터의 개괄에 대해서 다음 표 1을 참조하시오.
Figure 112010013921034-pct00017
ATF 유닛 사용한 연속식 살포 실험은 매우 높은 세포 밀도 및 생성물 농도(100 x 106 세포/㎖ 및 0.9g/ℓ/일)를 달성하는 현저한 잠재성을 나타내는 반면, PER.C6(등록상표) 세포의 어떤 응집도 관찰되지 않았다.
실시예 2
살포에 의한 PER.C6(등록상표) 세포의 배양
기구:
비.브라운 발효기 조절 유닛(브라운, 독일), 7ℓ들이 브라운 용기 및 관련된 pH, 용존 산소(DO) 및 레벨 센서 프로브(브라운, 독일)가 있는 상판, ATF-4 조절 유닛 및 중공사 막 모듈과 관련된 하우징(리파인 테크놀로지, 미국).
필터
필터 모델: CFP-2-E-8SIP
유형: 0.2마이크론
면적: 4600cm2
아머샴 바이오사이언스
작업 체적
설정값: 4.1ℓ
범위: 3.8 내지 4.7ℓ
AFT 설정
Figure 112006064110125-pct00004
방혈(bleed) 속도
바이오매스 제거가 본 방법에서는 적용되지 않았다.
재료:
Ex-셀(Ex-Cell, 상표명) VPRP 배지(JRH 바이오사이언스, 미국)중의 6mM(최종 체적) L-글루타민(깁코), 12% Na2CO3를 사용하여 pH를 조절하였다.
세포주 및 배양 조건
모델 IgG를 발현하는 PER.C6(등록상표) 세포주를 본 연구에서 조사하였다. PER.C6(등록상표) 세포주는 망막-유래의 1차 인간 세포로부터 유래하였다. PER.C6(등록상표) 세포주는 완전 인간 단클론 항체(글리칸을 포함함)(참조 1, 참조 2)를 생산할 수 있다. 세포를 얼렌마이어(Erlenmyer) 플라스크중에서 110rpm 및 36.5℃에서 진탕하였다. 이들 플라스크의 상부공간은 5% CO2/공기의 혼합물을 사용하여 조절하였다.
참조 1: 문헌[Jones, D. H., van Berkel, P.H.C., Logtenberg, T. and Bout, A., 2002, 'PER.C6 cell line for human antibody production', Gen. Eng. News 22, 50-54].
참조 2: 문헌[Jones, D. et al., 2003, 'High-level expression of recombinant IgG in the human cell line PER.C6', Biotechnol. Prog. 19, 163-168].
발효기의 조작
세포를 용존 산소 강도, pH, 온도 및 교반 속도가 하기 개시된 바와 같이 조절된 발효기에서 배양하였다.
Figure 112010013921034-pct00018
공정 설명:
세포를 0.2 내지 0.5 x 106 세포/㎖의 생존 세포 밀도 범위 및 0.3 x 106 세포/㎖의 설정값의 접종량으로 발효기에 접종하였다. 생존 세포 밀도가 2 x 106 세포/㎖ 초과일때 또는 배양 5일째중 먼저 달성된 때에 살포를 시작하였다. 살포 속도는 배양액의 세포 밀도에 의존하고 사용된 속도는 하기 표에 기술하였다. 유속 및 희석 속도 둘다를 발효기 중의 세포 밀도가 증가함에 따라 조정하였다.
PER.C6(등록상표) 세포의 배양에 이용된 살포 속도
Figure 112010013921034-pct00019
(이 실시예에서 사용된 나머지 유속 및 고유 살포 속도중) 이 실시예에서 나온 실제 데이터 및 결과는 하기 표 2 및 도 7 및 8에 제시되어있다.
Figure 112010013921034-pct00020

Claims (22)

  1. 세포 배양액 중 응집체를 형성하는 고유의 경향을 갖는 세포의 응집 정도를 감소시키는 방법으로서,
    세포 배양 배지 및 응집체를 형성하는 고유의 경향을 갖는 세포의 현탁액을 포함하는 세포 배양액이 연속식 살포(perfusion) 배양계에서 유지되고, 세포 배양 배지를 세포 배양액에 첨가하고, 세포 배양액보다 낮은 세포 밀도를 갖는 액체의 유출을 초래하는 중공사(hollow fiber)를 포함하는 필터 모듈상에서 세포 배양액을 순환시키고, 필터 모듈내의 흐름이 교호 접선 흐름이며, 목적하는 세포 밀도에 도달하는 동안 상기 배양이 계속되는, 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    바이오매스가 세포 배양액으로부터 1회 이상 제거되고 추가의 세포 배양 배지를 세포 배양액에 첨가하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    바이오매스 제거를, 세포가 정상 상태(steady state)에 도달하기 직전 또는 도달한 직후에 시작하는 방법.
  6. 제 4 항에 있어서,
    바이오매스의 체적이 1일 당 세포 배양액의 총 체적의 2 내지 40%로 제거되는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    하나의 펌프를 사용하여 중공사를 포함하는 섬유 모듈상에서 세포 배양액을 순환시키고 또다른 펌프를 사용하여 필터 분리 이전의 세포 배양액 보다 낮은 세포 밀도를 갖는 액체를 제거함으로써, 교호 접선 흐름을 수행하는 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 1 항에 있어서,
    응집체를 형성하는 고유의 경향을 갖는 세포가 포유동물 세포인 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    응집체를 형성하는 고유의 경향을 갖는 세포가 PER.C6 세포인 방법.
  13. 제 1 항, 제 4 항 내지 제 7 항, 제 11 항 또는 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 생물학적 물질을 생산하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    생물학적 물질이 치료 또는 진단 단백질인 방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    생물학적 물질이 세포 배양액을 순환시키는 단계 후의 하류 공정에서 추가로 정제되는 방법.
  16. 세포 배양 배지 및 응집체를 형성하는 고유의 경향을 갖는 동물 세포의 현탁액을 포함하는 살포 배양액으로서, 상기 동물 세포가 상기 살포 배양액 중 80 x 106세포/㎖ 이상의 밀도로 존재하고 5개 이상의 세포의 응집체가 세포 총량의 5% 이하로 포함된 살포 배양액.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 동물 세포가 상기 살포 배양액 중 100 x 106세포/㎖ 이상의 밀도로 존재하는 살포 배양액.
  18. 제 16 항에 있어서,
    상기 동물 세포가 상기 살포 배양액 중 110 x 106세포/㎖ 이상의 밀도로 존재하는 살포 배양액.
  19. 제 16 항에 있어서,
    상기 동물 세포가 상기 살포 배양액 중 120 x 106세포/㎖ 이상의 밀도로 존재하는 살포 배양액.
  20. 제 16 항에 있어서,
    상기 동물 세포가 상기 살포 배양액 중 130 x 106세포/㎖ 이상의 밀도로 존재하는 살포 배양액.
  21. 제 16 항에 있어서,
    상기 동물 세포가 상기 살포 배양액 중 140 x 106세포/㎖ 이상의 밀도로 존재하는 살포 배양액.
  22. 제 16 항 또는 제 21 항에 있어서,
    상기 동물 세포가 PER.C6 세포인 살포 배양액.
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