KR101980164B1 - 재조합 ｆｖｉｉｉ의 생산에서 진핵 세포의 생산성을 증가시키는 방법 - Google Patents

재조합 ｆｖｉｉｉ의 생산에서 진핵 세포의 생산성을 증가시키는 방법 Download PDF

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Abstract

500 μM 이하의 CaCl2, 적어도 비-이온성 디터전트, 및 진핵 세포가 증식하고 rFVIII를 생산하기 위해 필요한 기타 영양 성분을 포함하는 배양 배지에서 진핵 세포 현탁액의 배양 동안 진핵 세포 현탁액에서 생산되는 재조합 인자 VIII (rFVIII)의 생산성, 특히, 세포-특이적 생산성을 증가시키는 방법으로서, 상기 세포 현탁액은 3 W/m3 이상의 동력 밀도(power density)를 더하는 것에 의해 상기 진핵 세포 현탁액에 기계적 수단에 의해 전단 응력을 유도하는 조건 하에서 배양되는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 ＦＶＩＩＩ의 생산에서 진핵 세포의 생산성을 증가시키는 방법{A method of increasing the productivity of eucaryotic cells in the production of recombinant FVIII}
본 발명은 세포 배양 동안 재조합 인간 인자 VIII(rFVIII)의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 배양된 세포, 특히, 포유동물 세포에 의한 단백질 생산에서 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 단백질 제품, 예를 들면, 당단백질 제품을 제조하는 방법으로서, 상기 단백질 제품 특징은 세포에 적용된 응력(stress)를 증가시키기 위해 세포 배양 환경을 조작하는 것에 의해 제어되는 것인 방법에 관한 것이다.
상업적으로 이용가능하거나 또는 개발 중인지 여부에 관계없이, 생물공학 제품의 다수는 단백질 치료제이다. 포유동물 세포 배양에서의 단백질의 생산 및 그와 같은 생산과 관련된 개선된 방법에 대한 높고 증가하는 요구가 있다. 그와 같은 개선된 방법은 특히 낮은 세포 발현 수준을 갖는 큰 당단백질이 생산되는 경우 필요하다. 하나의 그러한 단백질, FVIII은 포유동물 세포에서 생산되는 다른 재조합 단백질보다 100 내지 1000배 이상(two to three orders) 낮은 발현 수준을 갖는다. 치료 단백질의 양산의 후기 개발에서 부딪히는 공통된 문제는 보다 큰 규모의 임상 시험 및 용량(capacity)을 감소시키는 세포 배양 생산 플랜트에서의 오염에 따른 증가되는 수요이다. 증가된 수요를 충족시키기 위해, 총 생산 수준은 여러 방식으로 증가될 수 있다. 그러나, 보다 우수한 세포 클론을 발견하거나 또는 배양 배지를 개선시키는 것과 같은 대부분의 방식은 매우 지루한 작업이고 따라서, 종종 충분히 신속한 옵션이 아니다. 생산성을 증가시키는 다른 방식은 생산 규모를 증가시키거나 유가 배양(fed-batch) 또는 관류 방식 배양(perfusion mode culture)에서 세포의 밀도를 증가시키는 것이다. 또한, 이러한 공정 변화는 큰 투자 비용을 수반하고, 고밀도 배양의 경우, 배양 탱크 중 산소 제한이 일반적으로 생산을 위해 이용될 수 있는 최대 세포 밀도에 대한 한계를 정할 것이다. 따라서, 생산성을 증가시키는 새로운 방법에 대한 요구가 있다.
Keane J.T. et al. Effect of shear stress on expression of a recombinant proetine by chinese hamster ovary cells; Biotechnology and Bioengineering, 81:211-220, 2003은 부착된 CHO 세포를 32시간 동안 전단력(shear force)에 노출시키고 재조합 인간 성장 호르몬 생산 및 글루코오스 대사를 모니터링했다. 그들은 전단력을 0.005 N/m2 (0.02 W/m3)에서 0.80 N/m2 (6.4 x 102 W/m3)까지 증가시켰을 때, 재조합 단백질 생산율은 51% 감소되었고, 글루코오스 흡수율(glucose uptake rate)은 42% 증가되었으며, 락테이트 생산은 50% 감소했다는 것을 관찰했다.
Godoy-Silva R et al. Physiological responses of CHO cells to repetitive hydrodynamic stress; Biotechnology and Bioengineering, Vol. 103, No. 6, August 15, 2009는 CHO 세포에 대한 반복적인 유체역학 응력(hydrodynamic stress)의 효과를 조사하고 6.4 x 106 W/m3 까지의 에너지 소산율(energy dissipation rate)은 세포 성장, 사망, 및 생산성에 영향을 미치지 않았다는 결론에 도달했다.
J.A. Frangos et al. Shear stress induced stimulation of mammalian cell metabolism; Biotechnology and Bioengineering, Vol. 32, Pp. 1053-1060(1988)은 잘 제어된 조건 하에서 광범위한 안정한 박동성 전단응력(steady and pulsatile shear stress)에 대한 부착성(anchorage-dependent) 세포의 대사적 반응의 연구를 위한 유체 장치(flow apparatus)를 개시한다. 데이터는 안정한 전단 응력의 생리적 수준과 전단 응력의 개시가 배양된 인간 내피 세포에서 프로스타사이클린(prostacyclin) 생산을 크게 촉진한다는 것을 보여준다.
Giard와 그의 동료들은 회전 병(roller bottle) 중 세포보다 교반 플라스크(spinner flask) 중 마이크로캐리어(microcarrier) 상에 유지될 때, 인간 섬유아세포가 최대 30배 더 많은 양의 인터페론을 분비한다는 것을 관찰했다 (D.J. Giard, D. H. Loeb, W. G. Thilly, D. 1. C. Wang, and D.W. Levine, Biotechnol. Bioeng., 21, 433(1979)). 교반 플라스크 중 세포가 노출되는 전단 응력은 회전병 중 세포에 비해 훨씬 더 크기 때문에, 증가된 생산은 인터페론 합성의 전단-유도 자극(shear-induced stimulation)에서 기인될 수 있다.
Timm Tanzeglock et al, Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows; Biotechnology and Bioengineering, Vol. 104, No. 2, October 1, 2009은 세포가 노출되는 전단 흐름(shear flow)의 타입이 세포 사멸의 개시에 영향을 미치는지 여부를 개시한다. 실제로, 포유동물 세포는 흐름의 개별적 타입을 구별하고 상이하게 반응한다는 것이 확인되었다. 정확한 유체역학적 흐름 장(hydrodynamic flow field)을 도입하기 위해 두 개의 흐름 장치(flow device)를 이용했다: 균일하고 안정한 단순 전단 흐름(uniform steady simple shear flow) 및 진동 연신 흐름(uniform steady simple shear flow). 괴사성 세포 사망(necrotic cell death)과 아포톱시스 세포 사망(apoptotic cell death)을 구별하기 위해, 형광 활성화 세포 분류(fluorescensce activated cell sorting)와 배양 상층액 중 DNA의 방출을 이용했다. 결과는 CHO(chinese hamster ovary) 세포 및 인간 배아 신장 세포가 진동, 연신 흐름 중 낮은 수준의 유체역학적 응력(약 2 Pa)을 받게 되는 경우, 아폽토시스 경로로 들어갈 것이라는 것을 보여준다. 대조적으로, 세포가 단순 전단 흐름 중 약 1 Pa 또는 연신 흐름 중 약 500 Pa의 유체역학적 응력에 노출되는 경우 괴사성 사망이 우세하다. 배양물 수명 및 생산성을 증가시키기 위해 재조합 단백질 생산을 위해 세포가 배양되는 경우, 세포가 개별적인 사망 경로로 들어가게 되는 이러한 역치값(threshold value)은 피해야 한다.
WO 2006/103258A1은 진핵 세포를 배양하고, 단백질의 회수 전에 배양 배지에 이온성 물질을 첨가하는 것에 의해 생산되는 단백질의 수율을 증가시키는 방법을 개시한다. 적합한 이온성 물질은 Hofmeister 계열의 염 및 아미노산이다.
WO 2008/006494A1은 반응기에서 세포 배양 배지 중 현탁액으로 세포, 바람직하게는 E1-불멸화(immortalized) HER 세포, 보다 바람직하게는 PER.C6 세포를 배양하는 방법으로서, 상기 세포는 생물학적 물질, 바람직하게는 항체를 생산하고, 하나 이상의 세포 배양 배지 성분이 세포 배양물에 공급(feed)되고, 상기 세포, 생물학적 물질, 및 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양액이 분리 시스템(separation system)을 통해 순환되고, 상기 분리 시스템은 상기 생물학적 물질을 그보다 더 낮은 분자량을 갖는 물질들로부터 분리하고, 상기 생물학적 물질은 상기 반응기에 유지되거나, 상기 반응기 내로 다시 공급되는 것인 방법을 개시한다. 바람직하게는 , 보다 낮은 분자량의 물질 중 일부는 세포 배양물로부터 연속적으로 제거된다.
Zhang, Hu 등은 Current Pharmaceutical Biotechnology, Volume 11,　Number 1, January 2010, pp. 103-112(10)에서 최근 수십년 동안 포유동물 세포 배양이 단백질 치료제의 생산에서 중요한 역할을 수행한다고 보고한다. 다수의 공학적 파라미터(engineering parameter)가 포유동물 세포 배양에서 공정 개발 동안 최적화를 위해 고려되고, 이 논문에서는 전단(shear)과 혼합이 특히 강조된다. 교반에 의한 전단 응력이 세포 손상에 대해 과다 평가되었으나, 전단은 치명적이지 않은(nonlethal) 생리적 반응을 초래할 수 있는 것으로 사료된다. 거품이 형성되고, 깨지고, 합쳐지는 영역에서는 세포 손상이 없으나, 상승하는 기포의 반류(wake)에서 전단 응력이 상당해지고, 기포 파괴 영역(bubble burst region)에서 세포에 큰 손상을 유발한다. 혼합은 대규모 생물반응기에서 균일한 용존 산소 농도(dissolved oxygen tension), pH, CO2 및 영양분을 제공하기에 충분하지 않고, 이는 세포 성장, 생산물 형성 및 공정 제어에 심각한 문제를 가져올 수 있다. 병렬 작동(parallel operation)을 위해 혼합과 전단 문제를 해소하기 위해 규모-축소(scale-down) 반응기가 개발되었다. 통상적인 규모-축소 생물반응기 및 최근에 개발된 규모-축소 생물반응기에서 공학적 특성 규명(engineering characterization)이 짧게 소개되었다. 높은 세포 밀도로 산업적 세포주의 배양 및 재생 의약, 조직 공학 및 유전자 요법을 위한 줄기 세포 및 기타 인간 세포의 배양에 대한 공정 과제(process challenge)가 예상된다. 중요한 기법, 예를 들면, 단일세포 분석을 위한 미세조작(micromanipulation) 및 나노조작(광학적 핀셋), 전단 및 혼합 특성 규명을 위한 CFD(computational fluid dynamics), 및 소형화 생물반응기(miniaturized bioreactor)가 이러한 과제를 해소하기 위해 개발되고 있다.
Timothy A. Barrett et al. in Biotechnology and Bioengineering, Vol. 105, No. 2, pages 260-275은 세포 배양 조건의 신속한 평가 및 최적화를 위한 잠재적인 플랫폼 기술(platform technology)을 제공하는, 진탕 마이크로플레이트(shaken microplate)에서의 실험에 관해 보고한다. 마이크로웰 시스템 중 액체 혼합 및 기체-액체 질량 전달의 상세한 공학적 특성규명 및 현탁된 세포 배양물에 대한 그의 효과가 기재된다.
세포 성장 및 항체 생산 동역학(kinetics)이 현재 사용되고 있는 진탕 플라스크 시스템에서 관찰되는 것과 유사하다면, 마이크로웰 방식은 보다 비용 효과적으로, 및 감소된 원료 요구로, 초기 공정 설계 데이터를 수득할 가능성을 제시한다. 이 연구는 마이크로웰 시스템 중 액체 혼합 및 기체-액체 질량 전달의 상세한 공학적 특성규명 및 현탁 세포 배양물에 대한 효과를 기재한다. IgG1을 생산하는 마우스 하이브리도마 세포의 성장에 대해, 24-웰 플레이트를 진동 주파수(shaking frequency) 및 액체 충진 부피(liquid fill volume)의 함수로서, 에너지 소산(energy dissipation)(P/V)(CFD(Computational Fluid Dynamics)를 통함), 유체 흐름, 혼합 및 산소 전달 속도의 측면에서 그 특성을 규명하였다. 예측된 k L a 값 1.3 내지 29h-1 사이에서 변했고; 요오드 탈색(iodine decolorization) 실험을 이용하여 측정된, 액상 혼합 시간은 1.7 s 내지 3.5 h로 변했으며; 예측된 PlV는 5 내지 35 W m-3의 범위였다. 전단 속도(shear rate)의 CFD 시뮬레이션은 유체역학적 힘이 세포에 유해하지 않을 것이라는 것을 예측했다. 하이브리도마 배양을 위해, 그러나, 높은 진탕 속도 (>250 rpm)는 세포 성장에 대한 부정적 효과를 갖는 것으로 확인되었으나, 낮은 진탕 속도와 높은 웰 충진 용량(well fill volume) (120 rpm; 2,000 ㎕)의 조합은 산소 제한적인 조건을 초래했다. 이러한 발견에 근거하여, 마이크로웰 및 진탕 플라스크 포맷의 세포 배양 동역학(cell culture kinetics)의 제1 공학적 비교(engineering comparison)는 일치시킨(matched) 평균 에너지 소산률에서 수행되었다. 세포 성장 동역학 및 항체 역가는 24 웰 마이크로타이터 플레이트 및 250 mL 진탕 플라스크에서 유사한 것으로 확인되었다. 전체적으로, 이 연구는 진탕된 마이크로웰 플레이트에서 수행된 세포 배양이 작업 규모 및 재료 요구의 약 30배 이상의 감소를 가져오면서, 현재 이용되는 플라스크 시스템과 유사하고 재현가능한 데이터를 제공할 수 있다는 것을 입증했다. 자동화와 관련하여, 이는 현실적인 현탁 배양 조건 하에서 강건한 세포주(robust cell line)의 고처리율(through-put) 평가 경로를 제공한다.
William G. Whitford 및 John S. Cadwell은 BioProcess International 2009, Vol. 7, No. 9, pages 54-64에서 공동-섬유 관류 생물반응기(hollow-fiber perfusion bioreactor)에 대한 증가하는 관심에 관해 보고한다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 500 μM 이하의 CaCl2, 적어도 비-이온성 디터전트, 및 진핵 세포가 증식하고 rFVIII를 생산하기 위해 필요한 기타 영양 성분을 포함하는 배양 배지에서 진핵 세포 현탁액의 배양 동안 진핵 세포 현탁액에서 생산되는 재조합 인자 VIII (rFVIII), 특히, 인간 rFVIII의 생산성, 특히, 세포-특이적 생산성을 증가시키는 방법으로서, 상기 세포 현탁액은 상기 진핵 세포 현탁액에 기계적 수단에 의해 전단 응력을 유도하는 조건 하에서 배양되는 것을 특징으로 하는 것인 방법을 제공하는 것이다. 전단 응력은 세포 현탁액에 3 W/m3 보다 높은 동력 밀도(power density)의 입력을 추가하는 것에 의해 달성된다. 전단 응력을 유도하는 조건은 세포 현탁액 또는 상기 현탁액 중 세포의 기계적 운동(mechanical movement)을 유도하는 사건이다. 통상적으로, 전단 응력은 배양된 세포에 직접 적용된다. 기계적 수단은 구체적으로 세포 배양 현탁액을 교반시킬 수 있는 것들이다.
본 발명의 효과는 HEK293 세포를 이용하여 연구되었으나, 이 세포들은 전형적인 인간 세포이고, 당업자는 HEK293 세포를 이용하여 수득된 결과가 인간 세포주의 다른 세포를 이용하여 또한 달성될 것으로 예상한다.
기계적 수단에 의해 도입된 동력 입력(power input)(에너지 소산률, ε과 동등한 용어인 동력 밀도(power density))은 하기 식에 따라 계산된다: ε=Np·n3·di5)/V, 식 중에서, Np는 임펠러(impeller)의 난류 동력 수(turbulent power number)이고, n은 초당 임펠러 회전으로 측정된 교반 속도(stirring rate)이며, di는 미터로 측정된 임펠러 직경이고, V는 입방 미터(cubic meter)로 표시된 배양 용량이다. 전단 응력을 도입하기 위해 세포 현탁액에 첨가된 동력은 세포가 파괴되는 값을 초과해서는 안 되고, 통상적으로 2000 W/m3 에 상응하는 최대값을 초과해서는 안 된다. 특히, 전단 응력을 도입하기 위해 세포 현탁액에 첨가되는 동력 밀도는 3W/m3 내지 2000 W/m3의 범위, 바람직하게는, 15 W/m3 내지 1500 W/m3, 보다 바람직하게는 30 W/m3 내지 1250 W/m3, 훨씬 더 바람직하게는 50 W/m3 내지 1000 W/m3의 범위이다.
본 발명의 일 구체예에서, 동력은 세포 현탁액의 기계적 운동에 의해 도입된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 세포 현탁액의 기계적 운동은 상기 세포 현탁액을 공동 섬유 막(hollow fiber membrane)과 같은 탄젠셜 필터 막(tangential filter membrane)을 통해 펌핑시키는 것에 의해 수행되거나, 또는 상기 세포 현탁액의 기계적 운동은 교반기(stirrer), 프로펠러(propeller), 또는 임펠러(impeller)와 같은 회전 요소(rotating element)에 의해 수행된다.
구체적으로, rFVIII는 B-도메인 결실(B-domain deleted) rFVIII이고, 특히, 인간 B-도메인 결실 FVIII이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 진핵 세포는 HEK293 세포이다. rFVIII 분자는 구체적으로 HEK293 세포에서 생산되고 그의 표면에 축적된다. rFVIII의 단리를 위해, rFVIII를 세포 표면으로부터 방출시키는 조건을 이용하거나, 예를 들면, 세포를 둘러싼 배지의 이온 강도를 증가시키거나, 또는 rFVIII와 HEK293 세포표면 간의 인력을 약화시키는 기타 수단을 이용하는 것이 유리하다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 비-이온성 디터전트는 플루로닉(Pluronic)-F68, Tween 20 및 Tween 80으로부터 선택된다. 통상적으로, 비-이온성 디터전트는 0.00001wt% 내지 1wt%, 특히, 0.0001wt% 내지 0.1wt%, 가장 적합하게는 0.001wt% 내지 0.01wt%의 농도를 갖는다.
본 발명의 방법의 또 다른 구체예에서, 배양 배지 중 낮은 CaCl2 농도는 세포 응집(cell aggregation)을 제어하기 위해, 예를 들면, 세포 응집을 최소화하기 위해 조정된다.
본 발명에 따르면, 동력은 세포 현탁액의 기계적 운동에 의해 세포 배양 내로 도입될 수 있다. 세포 현탁액의 기계적 운동은 예를 들면, 교반기 또는 예를 들면, 진탕 장치와 같은 개별적인 기계적 유사체(mechanical analogue)에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 특정한 구체예에서, 동력 밀도 입력(power density input), 예를 들면, 세포 현탁액의 기계적 운동에 의한 동력 밀도 입력은 임펠러 장착 배양 용기 또는 배양 용기, 예를 들면, 임펠러 등이 없이, 대신 지구의 중력 중 백을 이동시키는 것에 의한 (예를 들면, 록킹기(rocking machine)에 의해) 일회용 wave® 배양 백과 같은 배양 용기에 의해 개시되어, 상기 세포 현탁액 용기에 전단 응력을 유도하거나, 또는 세포 현탁액 용기 중 전단 응력은 세포 현탁액을 스태틱 믹서(static mixer) 또는 필터 장치를 통해 펌핑시키는 것에 의해 유도된다.
본 발명의 방법에서, 통상적인 방법에 비해, 보다 높은 동력을 도입하는 것에 의한 보다 높은 기계적 에너지가 성장하고 rFVIII를 생산하는 진핵 세포 현탁액을 담은 배양 용기에 적용된다. 다른 파라미터가 동력 입력과 상관될 수 있으나, 동력의 양은 에너지 소산의 측면에서 결정될 수 있다. 본 발명은 세포가 진탕 병(shaker bottle) 또는 교반 탱크 생물반응기(stirred tank bioreactor)에서 높은 교반 속도로 교반되는 경우, 특이적으로 높은 rFVIII 생산성의 결과에 기초한다.
본 발명에 따르면, 진핵 세포 또는 세포주가 사용될 수 있고, 특히, 진핵 세포는 HEK293 세포이다. 유전적으로 조작된 세포는 rFVIII, 특히, B-도메인 결실 rFVIII, 예를 들면, WO-A-2001/070968 및 WO-A-2007/003582에 개시된 것과 같은 rFVIII이다.
HEK293 세포에서 rFVIII 분자의 제조의 조합은 본 발명의 방법의 특정한 구체예이고, 하기 실시예에서 더 설명된다.
본 발명의 방법에서, HEK293 세포에서 생산된 rFVIII 분자는 세포 내에서 생산된 후 세포와 회합(associate)되고 세포 표면에 부착되는 것으로 확인되었고, 이는 WO-A-2006/103258, Kohlind 2010 (Kohlind et.al., The B-domain of Factor VIII reduces cell membrane attachment to host cells under serum free conditions. Journal of Biotechnology, 147 (2010), 198-204.) 및 Kohlind 2011 (Kohlind et.al., Optimisation of the Factor VIII yield in mammalian cell cultures by reducing the membrane bound fraction. Journal of Biotechnology, 151 (2011), 357-362.)에 더 설명된다.
본 발명의 방법에서, 세포의 성장 및 rFVIII 생산을 위한 배양 배지는 비-이온성 디터전트(non-ionic detergent), 통상적으로, 소르비탄 모노라우레이트의 폴리옥시에틸렌 유도체, 예를 들면, 폴리옥시에틸렌 사슬과 지방산 에스테르 모이어티의 길이에 의해 구별되는 다수의 제품의 패밀리인 Tween®을 포함한다. 또 다른 유용한 비-이온성 디터전트는 폴리옥시에틸렌 (폴리(에틸렌 옥시드))의 2개의 친수성 사슬에 의해 둘러싸인(flank) 폴리옥시프로필렌 (폴리(프로필렌 옥시드))의 중심 소수성 사슬로 구성된 비-이온성 트리블록 공중합체(triblock copolymer)인 폴록사머(poloxamer)이다. 폴록사머는 또한 상품명 Pluronics®으로 알려져 있다. 비-이온성 디터전트는 Pluronic-F68, Tween 20 및 Tween 80으로부터 선택되고, 특히, 0.00001wt% 내지　1wt%, 또는 0.0001wt% 내지 0.1wt%, 또는 0.001wt% 내지 0.01wt%의 농도의 Pluronic-F68, Tween 20 및 Tween 80으로부터 선택된다.
하기는 본 발명의 방법을 보다 상세하게 설명한다. 세포를 125 mL 배플 장착 E-보틀(baffled E-bottle)에서 상이한 진탕기 주파수에서 배양시켰다. 세포 성장 프로파일은 낮은 교반 배양 및 높은 교반 배양에서 유사하고(도 1), 누적 생산성(accumulated productivity)은 3일의 회분 배양(batch cultivation) 후 높은 교반 배양에서 놀랍게도 83% 더 높았다(도 2).
본 발명의 또 다른 구체예는 병렬 제어 교반 탱크 생물반응기(parallel controlled stirred tank bioreactor)에서 회분식 배양(batch mode culture)으로 수행되었다. 보다 높은 기계적 응력에 노출되었던 배양물은 낮은 교반 배양에 비해 더 높은 생산성을 보였다. 이는 pH, DOT (dissolve oxygen tension) 및 온도와 같은 기타 배양 파라미터가 일정하게 유지시키는 동안, 보다 높은 교반이 증가된 생산성을 유발한다는 것을 보여주었다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 2 L 교반 탱크 생물반응기 중 관류식 배양(perfusion mode culture)에서 실험적으로 실시되었다. 배양은 정상 상태(steady-state) 관류 방식으로 수행되어, 반응기 중의 세포 밀도를 일정하게 유지시키는 속도로 상기 반응기로부터 세포를 제거시키는 것에 의해 지수 성장기의 세포를 원하는 세포 밀도로 유지시켰다. 기타 배양 파라미터를 일정하게 유지시키는 동안, 보다 높은 교반 속도는 세포 특이적 생산성을 증가시켰다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 보다 높은 세포 밀도를 달성하기 위해 관류식으로 수행된, 100 L 생산-규모 생물반응기에서 실험적으로 실시되었다. 이 실험은 교반을 증가시키는 것에 의해 전단력 및 에너지를 증가시키는 것에 의해 대규모 배양에서 증가된 생산성이 달성될 수 있다는 것을 확인한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 연속 원심분리기(continuous centrifuge) 또는 ATF(alternating tangential flow)로 작동된 공동 섬유 유닛(hollow fiber unit)에 의해 관류식으로 작동된 2 L 교반 탱크 생물반응기에서 실험적으로 실시되었다. 놀랍게도, ATF 유닛에 의해 배양에 추가된 증가된 전단이 또한 FVIII 생산성을 증가시킨다는 것이 확인되었다.
도 1: 생존 세포(viable cell) 밀도 프로파일.
도 2: 축적된 FVIII:C 프로파일.
도 3: 세포 특이적 성장 속도
도 4: 상이한 교반 속도의 연속 배양 수행에서 세포 특이적 생산성.
도 5: 연속 원심분리(continuous centrifuge)를 ATF 공동 섬유 장치(hollow fiber device)와 비교하는, 연속 배양 중 세포-특이적 생산성.
실시예 1
BDDrFVIII를 생산하는, 지수적 성장기(exponentially growing) HEK293F 세포를 원심분리하고, 그 후, 세포 펠릿(pellet)을 무혈청 세포 배양 배지에 0.5x106 세포/mL의 생존 세포 밀도까지 재현탁시켰다. 그 후에, 세포를 37℃에서 5%/95% CO2/공기 오버레이(overlay) 하에 진탕 인큐베이터에서 100 rpm 또는 200 rpm으로 125 mL 배플 장착 엘렌마이어 병(baffled Erlenmeyer bottle)에서 배양했다. 자동 Cedex (Innovatis) 세포 카운터에 의한 트리판 블루 배제(trypan blue exclusion) 방법에 의해 매일 모든 배양물에서 세포 밀도를 측정했다. 축적된 FVIII를 세포 현탁액 중 이온 농도를 1 M NaCl + 30 mM CaCl2까지 증가시키는 것에 의해 세포로부터 방출시켰다. 원심분리에 의해 세포를 제거하고, FVIII를 발색 기질 방법(Chromogenic substrate method)(Coatest® SP FVIII)에 의해 결정했다. 성장 프로파일은 유사했으나(도 1), 높은 교반 배양물이 3일의 회분 배양 후 83% 더 높은 축적된 FVIII:C 농도를 보였다(도 2).
실시예 2
BDDrFVIII를 생산하는 HEK293F 세포를 6개의 0.4L 생물반응기를 갖는 장치(Multifors, Infors)에서 상이한 교반 속도로 회분식으로 동시에 배양했다. 목적은 다른 세포 배양 파라미터가 일정하게 유지되는 제어된 환경에서 교반 속도가 어떻게 생산성에 영향을 미치는지를 조사하는 것이었다. 높은 교반 속도(>300 rpm)를 조사할 수 있도록 하기 위해, 통상적으로 세포 배양 적용을 위해 사용되는, 생물반응기 전기 교반기 모터(electric stirrer motor)를 통상적으로 세균 배양 적용을 위해 사용되는, 1200 rpm까지 작동될 수 있는, 보다 강력한 교반기 모터로 교체했다. 용존 산소 농도(DOT) 설정은 90 %였고, 세포 현탁액 중 스파저 스톤(sparger stone)으로부터의 공기 첨가에 의해 조절하였다. 생존 세포 밀도, 생존력(viability) 및 응집율(aggregate rate)을 Cedex (Innovatis) 세포 카운터로 측정했다. 축적된 FVIII를 세포 현탁액 중 이온 농도를 1 M NaCl + 30 mM CaCl2까지 증가시키는 것에 의해 세포로부터 방출시켰다. 원심분리에 의해 세포를 제거하고, FVIII를 발색 기질 방법(Coatest® SP FVIII)에 의해 결정했다. 조사된 교반 속도, 본 명세서에서 사용된 동력 밀도와 동일한 용어인 에너지 소산률(ε), 교반 속도 및 세포 특이적 생산성(qp)가 표 1에 표시된다. 200 내지 950 rpm의 증가된 교반 속도는 증가된 세포 특이적 생산성을 보였다. 생산성 증가는 950 rpm 대비 1200 rpm에서 더 낮은 qp에 의해 알 수 있는 바와 같이, 950 rpm 이상에서는 안정되었다.
교반 속도 [rpm] ε [W/m3] qp [IU/1E6 세포/일]
200 3 0.83
450 33 1.27
700 125 1.9
950 267 2.45
1200 632 2.14
실시예 3
BDDrFVIII를 생산하는 HEK293F 세포를 2 L 교반 탱크 생물반응기에서 연속 정상-상태 관류 배양으로 배양시켰다. 생물반응기는 교반을 달성하기 위해 90 mm 피치 블레이드 임펠러(90 mm pitched blade impeller)를 사용한다. 배지 교환은 세포 현탁액에 전단을 형성하기도 하는 공동 섬유 필터를 이용하여 달성했다. 교반 속도를 제외한 모든 세포 배양 파라미터를 실험 동안 일정하게 유지시켰다. 생존 세포 밀도, 생존력, 및 응집률을 Cedex (Innovatis) 세포 카운터로 측정했다. 축적된 FVIII를 세포 현탁액 중 이온 농도를 1 M NaCl + 30 mM CaCl2까지 증가시키는 것에 의해 세포로부터 방출시켰다. 원심분리에 의해 세포를 제거하고, FVIII를 발색 기질 방법(Coatest® SP FVIII)에 의해 결정했다. 조사된 교반 속도는 185; 255 및 325 rpm이었고, 이는 각각 배양물에 113, 210 및 610 W/m3의 동력을 더했다. 교반 속도는 세포 특이적 성장 속도에 영향을 미치지 않았다 (도 3). 그러나, 증가된 교반 속도는 세포 특이적 생산성을 증가시켰다 (도 4).
실시예 4
BDDrFVIII를 생산하는 HEK293F 세포를 15개의 상이한 100 L 생산-규모 교반 탱크 생물반응기 회분으로 배양했고, 이들 중 2개는 대조군으로서 낮은 에너지 소산율 (6 W/m3)을 이용하고, 13개는 증가된 전단력의 효과를 연구하기 위해 높은 에너지 소산율 (29 W/m3)을 이용했다. 세포 밀도의 평균값은 두 개의 낮은 에너지 회분에서 29.2 106 세포/ml였고, 13개의 높은 에너지 회분에서는 27.6 106 세포/ml였다. 생물반응기는 교반을 달성하기 위해 225 mm 피치 블레이드 임펠러를 사용한다. 배지 교환은 연속 원심분리기를 이용하여 달성했다. 생존 세포 밀도 및 생존력은 Cedex (Innovatis) 세포 카운터로 측정했다. 축적된 FVIII를 세포 현탁액 중 이온 농도를 0.3 M NaCl + 30 mM CaCl2까지 증가시키는 것에 의해 세포로부터 방출시켰다. 원심분리에 의해 세포를 제거하고, FVIII를 발색 기질 방법(Coatest® SP FVIII)에 의해 결정했다. 조사된 교반 속도는 45 및 75 rpm이었고, 이들은 각각 6 및 29 W/m3의 에너지를 배양에 첨가했다. 이 실험은 교반 속도를 증가시키는 것에 의해 배양물에 에너지 입력(에너지 소산율, ε)을 증가시키는 것은 생산성을 증가시켰다는 것을 보여주었다 (표 2). 결론적으로, 소규모 배양에서 관찰되는 것과 동일한 방식으로 대규모 생산 배양에서도 전단력을 증가시키는 것에 의해 증가된 생산성을 달성할 수 있었다.
교반 속도 [rpm] ε [W/m3] 축적된 FVIII:C 평균값[IU/mL]
45 6 45 (n=2)
75 29 59 (n=13)
실시예 5
BDDrFVIII를 생산하는 HEK293F 세포를 90 mm, 45°피치 블레이드 임펠러에 의해 185 rpm으로 일정하게 교반되는 2 L 교반 탱크 생물반응기에서 관류식으로 배양했다. 생물반응기의 작동의 정상 방식은 관류에 의한 배지 교환을 달성하기 위해 연속 원심분리기를 이용하는 것이었다. 비교로서, 배지 교환에 의한 관류를 달성하기 위해 공동 섬유 유닛을 사용했다. 공동 섬유 유닛은 탄젠셜 흐름(tangential flow)을 교대시키는 것에 의해 작동되고, 이는 세포가 세포 배양물에 연속적으로 전단력을 첨가하는 필터막의 내외부로 펌핑된다는 것을 의미한다. 교반 속도, pH, 용존 산소 농도, 및 온도와 같은 기타 세포 배양 파라미터를 두 배양에서 동일한 값에서 일정하게 유지시켰다. 놀랍게도, 전단력을 달성하기 위해 공동 섬유막(hollow fiber membrane)을 이용하는 것에 의해 배양물에 에너지 입력을 증가시켜 전단력을 증가시키는 경우, 세포 특이적 FVIII 생산율을 유의성 있게 증가시킬 수 있다는 것을 발견했다 (도 5). 축적된 FVIII를 세포 현탁액 중 이온 농도를 1 M NaCl + 30 mM CaCl2까지 증가시키는 것에 의해 세포로부터 방출시켰다. 원심분리에 의해 세포를 제거하고, FVIII를 발색 기질 방법(Coatest® SP FVIII)에 의해 결정했다.

Claims (17)

  1. 0 μM 초과 내지 500 μM 이하의 CaCl2, 적어도 비-이온성 디터전트, 및 진핵 세포가 성장하고 재조합 인자 VIII (rFVIII)을 생산하기 위해 필요한 기타 영양 성분을 포함하는 배양 배지에서 진핵 세포 현탁액의 배양 동안 진핵 세포 현탁액에서 생산되는 rFVIII의 생산성을 증가시키는 방법으로서, 상기 진핵 세포 현탁액에 15 내지 1500 W/m3의 동력 밀도(power density)를 첨가하는 것에 의해 전단 응력이 유도되는 것을 특징으로 하고, 상기 동력 밀도는 세포 현탁액의 기계적 운동에 의해 세포 배양 배지 내로 도입되는 것이고, 상기 진핵 세포는 HEK293 세포인 것인 방법.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 세포 현탁액의 기계적 운동은 상기 세포 현탁액을 탄젠셜 필터 막(tangential filter membrane)을 통해 펌핑시키는 것에 의해 수행되는 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 세포 현탁액의 기계적 운동은 교반기(stirrer), 프로펠러(propeller), 또는 임펠러(impeller)와 같은 회전 요소(rotating element)에 의해 수행되는 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 rFVIII은 B-도메인 결실 rFVIII인 것인 방법.
  6. 삭제
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 rFVIII 분자는 HEK293 세포에서 생산되고 그와 회합되는(associated) 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 비-이온성 디터전트는 Pluronic-F68, Tween 20 및 Tween 80으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 비-이온성 디터전트는 0.00001wt% 내지 1wt%의 농도를 갖는 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 배양 배지 중 0 μM 초과 내지 500 μM 이하의 CaCl2 농도를 유지시킴으로써, 또한 전단력(shear)을 증가시키는 것에 의해 배양 환경으로부터 상기 세포로의 CaCl2 수송을 증가시킴으로써 세포 응집이 최소화되는 것인 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 임펠러 장착 배양 용기(impeller equipped culturing container)가 상기 세포 현탁액에 전단 응력을 유도하거나, 또는 상기 세포 현탁액의 기계적 운동은 상기 세포 현탁액을 스태틱 믹서(static mixer) 또는 필터 장치를 통해 펌핑시키는 것에 의해 개시되어 상기 세포 현탁액 용기 중 전단 응력을 유도하는 것인 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 세포-특이적 생산성을 증가시키는 것인 방법.
  15. 청구항 3에 있어서, 상기 탄젠셜 필터 막은 중공 섬유 막(hollow fiber membrane)인 것인 방법.
  16. 청구항 9에 있어서, 상기 비-이온성 디터전트는 0.0001wt% 내지 0.1wt%의 농도를 갖는 것인 방법.
  17. 청구항 9에 있어서, 상기 비-이온성 디터전트는 0.001wt% 내지 0.01wt%의 농도를 갖는 것인 방법.
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