RU2600886C2 - Способ повышения продуктивности эукариотических клеток в продуцировании рекомбинантного fviii - Google Patents

Способ повышения продуктивности эукариотических клеток в продуцировании рекомбинантного fviii Download PDF

Info

Publication number
RU2600886C2
RU2600886C2 RU2013155382/10A RU2013155382A RU2600886C2 RU 2600886 C2 RU2600886 C2 RU 2600886C2 RU 2013155382/10 A RU2013155382/10 A RU 2013155382/10A RU 2013155382 A RU2013155382 A RU 2013155382A RU 2600886 C2 RU2600886 C2 RU 2600886C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cell
cell suspension
cells
culture
suspension
Prior art date
Application number
RU2013155382/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2013155382A (ru
Inventor
Петер АИЗАВА
Ирене АГЕРКВИСТ
Original Assignee
Октафарма Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=45470754&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2600886(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Октафарма Аг filed Critical Октафарма Аг
Publication of RU2013155382A publication Critical patent/RU2013155382A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2600886C2 publication Critical patent/RU2600886C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/42—Apparatus for the treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2511/00—Cells for large scale production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2521/00—Culture process characterised by the use of hydrostatic pressure, flow or shear forces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2527/00—Culture process characterised by the use of mechanical forces, e.g. strain, vibration

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ повышения клеточно-специфичной продуктивности рекомбинантного фактора VIII (rFVIII), продуцируемого в суспензионной культуре клеток млекопитающих в процессе культивирования указанной суспензионной культуры клеток млекопитающих в культуральной среде. Способ включает культивирование клеточной суспензии при индуцировании механического сдвигового усилия на суспензионную культуру клеток млекопитающих путем приложения к ним удельной мощности 3 Вт/м3. Культуральная среда содержит не более чем 500 мкМ CaCl2, неионный детергент. Изобретение обеспечивает повышение выхода белка, продуцируемого культивирующимися клетками. 13 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 4 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к способу повышения выхода рекомбинантного человеческого фактора VIII (rFVIII) в процессе культивирования клеток.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область техники
В настоящем изобретении предлагаются способы повышения выхода белка, продуцируемого культивирующимися клетками, особенно клетками млекопитающих. В частности, настоящее изобретение относится к способам получения белкового продукта(ов), например гликопротеинового продукта(ов), где характеристики белкового продукта контролируются путем манипуляций с культуральной средой с повышением усилия, применяемого к клеткам.
Уровень техники
Большое количество биотехнологических продуктов, которые либо коммерчески доступны, либо находятся в разработке, представляют собой белковые лекарственные средства. Существует большой и растущий спрос на продуцирование белков в клеточных культурах млекопитающих и на улучшенные способы, связанные с таким продуцированием. Такие улучшенные способы необходимы, особенно когда продуцируются крупные гликопротеины с низким уровнем клеточной экспрессии. Один такой белок, FVIII, имеет уровень экспрессии, по меньшей мере, на два-три порядка ниже, чем другие рекомбинантные белки, продуцирующиеся в клетках млекопитающих. Общая проблема, возникающая на поздней фазе крупномасштабного продуцирования лекарственных белковых продуктов, это повышенные требования, связанные с более масштабными клиническими испытаниями и загрязнениями на производстве продуцентов клеточных культур, что снижает производительность. Для выполнения повышенных требований общий уровень продуцирования может быть повышен несколькими путями. Однако большинство из них, такие как выбор лучшего клеточного клона или улучшение культуральной среды, представляют собой трудоемкие задачи, и, таким образом, не являются в достаточной степени быстрыми операциями. Другие пути повышения продуктивности - это повышение масштаба производства или повышение плотности клеток в подпитываемой культуре или в перфузионной культуре. Также эти изменения способа сопровождаются большими капитальными затратами, и в случае культур с высокой плотностью ограничение кислорода в культуральной емкости будет, как правило, устанавливать ограничение для максимальной клеточной плотности, которая может использоваться для продуцирования. Таким образом, настоящим состоянием данной области продиктована необходимость разработки новых способов повышения продуктивности.
Keane J.T. et al. Effect of shear stress on expression of a recombinant proetine by chinese hamster ovary cells; Biotechnology and Bioengineering, 81:211-220, 2003, подвергали воздействию прикрепленные клетки CHO сдвиговому усилию в течение 32 ч и отслеживали продуцирование рекомбинантного человеческого гормона и метаболизм глюкозы. Они наблюдали, что когда сдвиговое усилие увеличивалось с 0,005 Н/м2 (0,02 Вт/м3) до 0,8 Н/м2 (6,4×102 Вт/м3), то степень продуцирования рекомбинантного белка снижалась на 51%, степень усвоения глюкозы повышалась на 42%, и продуцирование лактата снижалось на 50%.
Godoy-Silva R et al. Physiological responses of CHO cells to repetitive hydrodynamic stress; Biotechnology and Bioengineering, Vol. 103, No. 6, August 15, 2009, изучали эффект повторяющегося гидродинамического воздействия на клетки CHO и пришли к заключению, что степень диссипации энергии до 6,4×106 Вт/м3 не влияет на клеточный рост, клеточную смерть и продуктивность.
J.A. Frangos et al. Shear stress induced stimulation of mammalian cell metabolism; Biotechnology and Bioengineering, Vol. 32, Pp. 1053-1060 (1988) раскрывают проточный аппарат для изучения метаболического ответа субстратзависимых клеток на широкий спектр стабильных и периодических сдвиговых усилий при хорошо контролируемых условиях. Данные продемонстрировали, что физиологический уровень постоянного сдвигового усилия и проявление сдвигового усилия существенно стимулируют продуцирование простациклина в человеческих культивируемых эндотелиальных клетках.
Giard и сотр. наблюдали, что человеческие фибробласты секретируют интерферон в количествах в 30 раз выше при поддержании на микроносителе в центрифужных пробирках по сравнению с клетками в роллерных флаконах (D.J. Giard, D. H. Loeb, W. G. Thilly, D. 1. C. Wang, and D.W. Levine, Biotechnol. Bioeng., 21, 433(1979)). Так как сдвиговое усилие, которому подвергаются клетки в центрифужных пробирках, гораздо выше, чем в роллерных флаконах, то повышенное продуцирование может вносить вклад в стимулирование синтеза интерферона, индуцированное сдвигом.
Timm Tanzeglock et al, Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows; Biotechnology and Bioengineering, Vol. 104, No. 2, October 1, 2009, раскрыли, влияет ли тип сдвигового потока, которому экспонированы клетки, на инициирование клеточной смерти. Показано, что клетки млекопитающего действительно различают между дискретными типами потока и отвечают дифференцированно. Применяли два питателя для задания точных областей гидродинамических потоков: неизменного постоянного простого сдвигового потока и колеблющегося протяженного потока. Чтобы различить некротическую и апоптотическую клеточную смерть, использовали клеточный сортер с возбуждением флуоресценции и высвобождение ДНК в надосадочной жидкости культуры. Результаты демонстрируют, что клетки яичника китайского хомячка и человеческие эмбриональные почечные клетки будут вступать на путь апоптоза при воздействии на них низкого уровня гидродинамического усилия (около 2 Па) в колеблющемся протяженном потоке. Напротив, некротическая смерть превалирует, когда клетки экспонированы гидродинамическим усилиям около 1 Па в простом сдвиговом потоке или около 500 Па в протяженном потоке. Этих пороговых значений, при которых клетки вступают на соответствующий путь клеточной смерти, следует избегать при культивировании клеток во время продуцирования рекомбинантного белка для усиления продолжительности жизни и продуктивности культуры.
WO 2006/103258 A1 раскрывает способ повышения выхода белка, продуцируемого культивирующимися эукариотическими клетками и путем добавления ионного агента к культуральной среде перед сбором белка. Подходящие ионные агенты представляют собой соли рядов Hofmeister и аминокислоты.
WO 2008/006494 A1 раскрывает способ культивирования клеток, предпочтительно E1-иммортализованных HER-клеток, более предпочтительно PER.C6-клеток в реакторе, в виде суспензии в клеточной культуральной среде, где клетки продуцируют биологическое вещество, предпочтительно, антитело, где, по меньшей мере, один компонент клеточной культуральной среды подается в клеточную культуру, и где клеточная культура, включающая клетки, биологическое вещество и клеточную культуральную среду, культивируется в системе разделения, и где система разделения отделяет биологическое вещество от веществ, имеющих более низкую молекулярную массу, чем у биологического вещества, и где биологическое вещество сохраняется в реакторе или рециркулирует там. Предпочтительно, часть веществ более низкой молекулярной массы непрерывно удаляется из клеточной культуры.
Zhang, Hu et al. сообщают в Current Pharmaceutical Biotechnology, Volume 11, Number 1, January 2010, pp. 103-112(10), что в последние десятилетия культивирование клеток млекопитающих играет важную роль в получении белковых лекарственных средств. Многие конструктивные параметры рассматриваются для оптимизации в процессе разработки культивирования клеток млекопитающих, причем в этой статье особенно освещены сдвиг и смешивание. Считается, что сдвиговое усилие, вызванное вращением, было переоценено по отношению к разрушению клеток, но сдвиг может приводить в результате к нелетальным физиологическим ответам. Клеточные повреждения отсутствуют в областях, где пузырьки образуются, разрушаются и слипаются, но сдвиговое усилие становится значительным после поднятия пузырьков и вызывает сильное разрушение клеток в областях разрывов пузырьков. Смешивания недостаточно для обеспечения гомогенного давления растворенного кислорода, pH, CO2 и питательных элементов в крупномасштабных биореакторах, что может привносить существенные проблемы в клеточный рост, образование продукта и процесс контроля. Были разработаны мелкомасштабные реакторы, для разрешения проблем смешивания и сдвига в параллельных операциях. Вкратце, вводятся определенные технические характеристики в стандартных и недавно разработанных мелкомасштабных биореакторах. Проводятся изыскания сложностей процесса культивирования промышленных клеточных линий в высокой клеточной плотности, а также культивирование стволовых клеток и других человеческих клеток для регенеративной медицины, тканевой инженерии и генной терапии. Важные методы, такие как микроманипуляция и наноманипуляция (оптические микропинцеты) для анализа единичных клеток, расчетная гидродинамика (CFD) для характеристики сдвига и смешивания, и для разрешения этих проблем были разработаны миниатюрные биореакторы.
Timothy A. Barrett et al. in Biotechnology and Bioengineering, Vol. 105, No. 2, pages 260-275, сообщают об эксперименте в формате встряхиваемых микропланшетов, предлагая потенциальную технологическую платформу для быстрой оценки и оптимизации состояния клеточной культуры. Описано подробное определение технических характеристик переноса массы смешиваемой жидкости и газо-жидкостной массы в системы микролунок и их влияние на суспензионные клеточные культуры.
При условии, что кинетика клеточного роста и продуцирования антител сравнима с теми, что обнаружены в системах для встряхивания флаконов, использующихся в настоящее время, тогда микролуночный способ предлагает возможность получения ранних данных по разработке технологического процесса более эффективным по затратам способом и с меньшей потребностью в материалах. В данной работе подробно описано определение технических характеристик переноса массы смешиваемой жидкости и газо-жидкостной массы в системы микролунок и их влияние на суспензионные клеточные культуры. Для роста мышиных гибридомных клеток, продуцирующих IgGl, 24-луночные планшеты характеризовали по показателю диссипации энергии (P/V) (посредством Расчетной гидродинамики, CFD), потока жидкости, скорости смешивания и скорости переноса кислорода в виде функции от частоты встряхивания и объема, наполненного жидкостью. Предсказанные значения kLa варьировались между 1,3 и 29 ч-1; время смешивания жидкой фазы, которое оценивали количественно с использованием эксперимента изменения цвета йода, варьировалось от 1,7 с до 3,5 ч; в то время как предсказанные значения PlV находились в интервале от 5 до 35 Вт/м-3. CFD-стимулирования гидродинамических усилий, предсказанных на основе скорости сдвига, не губительны для клеток. Однако для гибридомных культур было показано, что высокие скорости встряхивания (>250 об./мин) имеют отрицательное влияние на клеточный рост, в то время как комбинация низкой скорости встряхивания и большого объема наполнения лунки (120 об./мин; 2000 мкл) приводит в результате к условиям ограничения по кислороду. На основе этих открытий было сделано первое техническое сравнение кинетики клеточной культуры в микролунке, а также формат встряхиваемой колбы при дублированных средних скоростях диссипации энергии. Было обнаружено, что кинетика клеточного роста и титр антитела были похожи для 24-луночных микропланшетов и для 250-мл встряхиваемых колб. В целом данная работа продемонстрировала, что клеточная культура, которую получили на встряхиваемых микропланшетах, может предоставить данные, которые являются одновременно воспроизводимыми и сравнимыми с используемыми в настоящее время системами встряхиваемых колб, предлагая при этом, по меньшей мере, 30-кратное уменьшение масштаба операции и потребности в материалах. Вместе с автоматизацией процесса это обеспечивает путь к оценке высокой пропускной способности надежных клеточных линий в реальных условиях суспензионной клеточной культуры.
William G. Whitford and John S. Cadwell in BioProcess International 2009, Vol. 7, No. 9, pages 54-64, сообщают о повышенном интересе к биореакторам с системой полых волокон.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью настоящего изобретения является предложение способа повышения продуктивности, в частности, клеточно-специфичной продуктивности рекомбинантного фактора VIII (rFVIII), в частности человеческого rFVIII, продуцируемого в суспензионной культуре эукариотических клеток в процессе культивироания указанной суспензионной культуры эукариотических клеток в культуральной среде, содержащей не более чем 500 мкМ CaCl2, по меньшей мере, один неионный детергент и другие питательные компоненты, необходимые для роста клеток и продуцирования rFVIII, причем указанный способ отличается тем, что суспензионная культура культивируется при условиях сдвигового усилия, производимого с помощью механических воздействий по отношению к суспензионной культуре эукариотических клеток. Сдвиговое усилие достигается путем приложения на входе удельной мощности более чем 3 Вт/м3 по отношению к суспензионной клеточной культуре. Условия, индуцирующие сдвиговое усилие, представляют собой события, которые индуцируют механические движения клеточной суспензии или клеток в суспензии. Как правило, сдвиговое усилие применяется непосредственно к культивируемым клеткам. Механические воздействия, в частности, представляют собой такие воздействия, которые способны перемешивать клеточную суспензию.
Хотя эффекты по настоящему изобретению изучали на клетках HEK293, эти клетки представляют собой типичные человеческие клетки, и специалисту в данной области известно, что результаты, полученные для клеток HEK293, также будут достигнуты с другими клетками человеческих клеточных линий.
Входная мощность (удельная мощность, которая эквивалентна степени диссипации энергии, ε), прилагаемая с помощью механического воздействия, рассчитывается согласно следующей формуле: ε=Np·n3·di5)/V, где Np представляет собой количество турбулентных мощностей для лопастной мешалки, n представляет собой скорость перемешивания, измеренную как количество поворотов турбинной мешалки в секунду, di представляет собой диаметр лопастной мешалки, измеренный в метрах, и V представляет собой объем культуры в кубических метрах. Мощность, прилагаемая к клеточной суспензии для введения сдвигового усилия, не должна превышать значения, при котором клетки разрушаются, как правило, не должно превышаться максимальное значение, соответствующее 2000 Вт/м3. В частности, удельная мощность, прилагаемая к клеточной суспензии для введения сдвигового усилия, находится в интервале от 3 Вт/м3 до 2000 Вт/м3, предпочтительно 15 Вт/м3 - 1500 Вт/м3, более предпочтительно 30 Вт/м3 - 1250 Вт/м3, еще более предпочтительно 50 Вт/м3 - 1000 Вт/м3.
В одном воплощении изобретения, мощность вводится путем механического движения клеточной суспензии. В следующем воплощении изобретения механическое движение клеточной суспензии осуществляется посредством прокачивания клеточной суспензии через тангенциальную фильтрационную мембрану, такую как половолоконная мембрана, или механическое движение клеточной суспензии осуществляется посредством вращательного элемента, такого как мешалка, пропеллерная или лопастная.
В частности, rFVIII представляет собой rFVIII с делетированным В-доменом, в частности человеческий rFVIII с делетированным В-доменом.
Еще в одном воплощении изобретения, эукариотические клетки представляют собой клетки HEK293. В частности, молекула rFVIII продуцируется и аккумулируется на поверхности клеток HEK293. Для выделения rFVIII могут преимущественно применяться условия для высвобождения rFVIII с клеточных поверхностей, например, путем повышения ионной силы среды, окружающей клетки, или с помощью других средств для ослабления сил притяжения rFVIII и поверхности клеток HEK293.
Еще в одном воплощении изобретения неионные детергенты выбирают из Pluronic-F68, Tween 20 и Tween 80. Как правило, неионные детергенты имеют концентрацию 0,00001-1 масс.%, в частности 0,0001-0,1 масс.%, наиболее подходящими являются 0,001-0,01 масс.%.
В другом воплощении способа по изобретению низкая концентрация CaCl2 в культуральной среде регулируется для контроля агрегации клеток, например для минимизации клеточной агрегации.
Согласно изобретению мощность может вводиться в процесс культивирования клеток посредством механического движения клеточной суспензии. Механическое движение клеточной суспензии может, например, осуществляться посредством мешалки или с помощью соответствующего механического аналога, такого как встряхивающее устройство.
В конкретном воплощении изобретения входная удельная мощность, например, с механическим происхождением движения клеточной суспензии, инициируется с помощью культуральной емкости, оборудованной лопастной мешалкой, или культуральной емкостью, такой как, например, "disposable wave®" без лопастной мешалки, или аналогично вместо движения емкости в гравитации (например, с использованием вибрационной машины), таким образом индуцирующим сдвиговое усилие в указанной клеточной суспензии, или сдвиговое усилие в емкости с клеточной суспензией индуцируется посредством прокачивания клеточной суспензии через статический миксер или фильтровальное устройство.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1: Профили плотности жизнеспособных клеток.
Фигура 2: Аккумулированный FVIII:C профили.
Фигура 3: Скорость клеточно-специфичного роста.
Фигура 4: Клеточно-специфичная продуктивность в непрерывной культуре при различных скоростях перемешивания.
Фигура 5: Клеточно-специфичная продуктивность в непрерывной культуре по сравнению с непрерывным центрифугированием с использованием половолоконного устройства ATF.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В способе по изобретению более высокая механическая энергия с помощью введения более высокой мощности применяется к культуральному флакону, содержащему суспензионную культуру эукариотических клеток, которые растут и продуцируют rFVIII, по сравнению со стандартными способами. Количество мощности может определяться по показателю диссипации энергии, хотя и другие параметры могут коррелировать с входной мощностью. Изобретение основано на результате получения необычно высокой продуктивности FVIII, когда клетки перемешиваются с высокой скоростью перемешивания во встряхиваемой колбе или в биореакторе с механическим перемешиванием.
Согласно изобретению может использоваться любая эукариотическая клетка или клеточная линия, в частности, эукариотические клетки представляют собой клетки HEK293. Клетки, полученные с использованием генетических манипуляций, продуцируют rFVIII, в частности rFVIII с делетированным В-доменом, как, например, раскрыто в WO-A-2001/070968 и WO-A-2007/003582.
Комбинация получения молекулы rFVIII в клетках HEK293 представляет собой конкретное воплощение способа по изобретению и объясняется далее в примерах, представленных ниже.
В способе по изобретению было показано, что молекула rFVIII, продуцируемая в клетках HEK293, ассоциирована с клетками и прикрепляется к клеточной поверхности после продуцирования внутри клетки, как дополнительно описано в WO-A-2006/103258, Kohlind 2010 (Kohlind et al., The B-domain of Factor VIII reduces cell membrane attachment to host cells under serum free conditions. Journal of Biotechnology, 147 (2010), 198-204) и в Kohlind 2011 (Kohlind et al., Optimisation of the Factor VIII yield in mammalian cell cultures by reducing the membrane bound fraction. Journal of Biotechnology, 151 (2011), 357-362).
В способе по изобретению культуральная среда для роста клеток и продуцирования rFVIII содержит неионные детергенты. Как правило, полиоксиэтиленовое производное сорбитан монолаурата, такое как Tween®, которое относится к семейству множества продуктов, отличающихся длиной полиоксиэтиленовой цепи и эфирным компонентом жирной кислоты. Другие применяемые неионные детергенты представляют собой Полоксамеры, которые являются неионными три-блок-сополимерами, состоящими из центральной гидрофобной цепи полиоксипропилена (поли(пропиленоксид)), фланкированной двумя гидрофильными цепями полиоксиэтилена (поли(этиленоксид)). Полоксамеры известны под торговым названием Pluronics®. Неионные детергенты могут быть выбраны из Pluronic-F68, Tween 20 и Tween 80, в частности, в концентрации 0,00001-1 масс.%, или 0,0001-0,1 масс.%, или 0,001-0,01 масс.%.
Далее описан способ по изобретению более подробно. Клетки культивировали с различной частотой встряхивания в 125 мл перемешиваемых E-колбах. В то время как профили клеточного роста были похожи в культурах со слабым и с сильным перемешиванием (Фигура 1), аккумулированная продуктивность неожиданно оказалась на 83% выше в культурах с более сильным перемешиванием через 3 дня периодического культивирования (Фигура 2).
Другое воплощение изобретения осуществляли в периодических культурах в параллельных контролируемых биореакторах с механическим перемешиванием. Культура, которая экспонировалась с более сильным механическим усилием, демонстрировала более высокую продуктивность по сравнению с культурами с низким перемешиванием. Это показало, что в то время как другие параметры культуры, такие как pH, DOT (давление растворенного кислорода) и температура поддерживали постоянными, при этом более сильное перемешивание вызывало повышенную продуктивность.
Еще в одном воплощении изобретение экспериментально проверяли в перфузионной культуре в 2 л биореакторе с механическим перемешиванием. Культуру получили в установившемся режиме перфузионным способом с экспоненциально растущими клетками, которые поддерживали при целевой плотности путем отвода клеток из биореактора со скоростью, которая поддерживала клеточную плотность в реакторе постоянной. В то время как другие параметры культуры поддерживали постоянными, более высокая скорость перемешивания повышала клеточно-специфичную продуктивность.
Еще в одном воплощении изобретения изобретение проверяли экспериментально в биореакторе с масштабом производства 100 л, культуру, полученную перфузионным способом для достижения более высоких клеточных плотностей. Эксперимент подтвердил, что повышенная продуктивность также может быть достигнута в крупномасштабных культурах путем повышения сдвиговых усилий и входной энергии путем усиления перемешивания.
Еще в одном воплощении изобретения изобретение проверяли экспериментально в 2 л биореакторе с механическим перемешиванием, осуществлением перфузионного способа либо с использованием непрерывного центрифугирования, либо половолоконного элемента с изменением тангенциального потока (ATF). Неожиданно было показано, что повышенное сдвиговое усилие, которое прилагали к культуре с помощью элемента ATF, также повышало продуктивность FVIII.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Экспоненциально растущие клетки HEK293F, продуцирующие BDDrFVIII, центрифугировали, и клеточный осадок ресупендировали в бессывороточной культуральной среде до жизнеспособной клеточной плотности 0,5×106 клеток/мл. Клетки затем культивировали в 125 мл перемешиваемых колбах Эрленмейера при 100 об./мин или при 200 об./мин в шейкерных инкубаторах при 5%/95% CO2/слой воздуха при 37°C. Клеточную плотность измеряли во всех культурах каждый день с помощью метода исключения с использованием трипанового синего на автоматизированном счетчике клеток Cedex (Innovatis). Аккумулированный FVIII высвобождался из клеток с помощью повышения ионной концентрации в клеточной суспензии до 1 M NaCl + 30 мМ CaCl2. Клетки удаляли путем центрифугирования, и FVIII определяли с помощью метода с использованием хромогенного субстрата (Coatest®SP FVIII). Профили роста были похожи (Фигура 1), в то время как культуры с сильным перемешиванием демонстрировали на 83% большее аккумулирование FVIII:C концентрация через три дня периодического культивирования (Фигура 2).
Пример 2
Клетки HEK293F, продуцирующие BDDrFVIII, культивировали параллельно периодическим способом при различных скоростях перемешивания на оборудовании с использованием шести 0,4 л биореакторов (Multifors, Infors). Целью было проверить, как скорость перемешивания влияет на продуктивность в контролируемой среде, где другие параметры клеточной культуры поддерживаются постоянными. Для возможности проверки высокой скорости перемешивания (>300 об./мин), моторы биореактора с электрической мешалкой, обычно используемые для применений к клеточным культурам, меняли на более мощные моторы для мешалок, обычно используемые для применений к бактериальным культурам, которые могут работать при оборотах до 1200 об./мин. Заданное значение давления растворенного кислорода (DOT) устанавливали на 90% и регулировали путем добавления воздуха из аэратора в клеточной суспензии. Плотность жизнеспособных клеток, жизнеспособность и степень агрегации измеряли с помощью счетчика клеток Cedex (Innovatis). Аккумулированный FVIII высвобождался из клеток с помощью повышения ионной концентрации в клеточной суспензии до 1 M NaCl + 30 мМ CaCl2. Клетки удаляли путем центрифугирования, и FVIII определяли с помощью метода с использованием хромогенного субстрата (Coatest®SP FVIII). В таблице 1 представлены проверенные скорости перемешивания, диссипация энергии, которая является эквивалентным термином удельной мощности, при использовании в данном документе скорость (ε) и клеточно-специфичная продуктивность (qp). Повышенная скорость перемешивания от 200 до 950 об./мин демонстрировала повышенную клеточно-специфичную продуктивность. Повышение продуктивности нивелировалось выше 950 об./мин более низким qp при 1200 об./мин по сравнению с 950 об./мин.
Таблица 1
Скорость перемешивания
[об./мин]		 ε [Вт/м3] qp
[М.Е./1E6 клеток/в день]
200 3 0,83
450 33 1,27
700 125 1,9
950 267 2,45
1200 632 2,14
Пример 3
Клетки HEK293F, продуцирующие BDDrFVIII, культивировали в непрерывной перфузионной культуре с установившимся режимом в 2 л биореакторе с механическим перемешиванием. Биореактор использует 90 мм лопастную мешалку с наклоном для достижения перемешивания. Замену среды осуществляли путем использования половолоконного фильтра, который также создавал сдвиг по отношению к клеточной суспензии. Все параметры клеточной культуры за исключением скорости перемешивания поддерживали постоянными на протяжении эксперимента. Плотность жизнеспособных клеток, жизнеспособность и степень агрегации измеряли с помощью счетчика клеток Cedex (Innovatis). Аккумулированный FVIII высвобождался из клеток с помощью повышения ионной концентрации в клеточной суспензии до 1 M NaCl + 30 мМ CaCl2. Клетки удаляли путем центрифугирования, и FVIII определяли с помощью метода с использованием хромогенного субстрата (Coatest®SP FVIII). Проверяемые скорости перемешивания составили 185; 255 и 325 об./мин, которые придавали культуре мощность 113, 210 и 610 Вт/м3, соответственно. Скорость перемешивания не влияла на клеточно-специфичную скорость роста (Фигура 3). Однако повышенная скорость перемешивания повышала клеточно-специфичную продуктивность (Фигура 4).
Пример 4
Клетки HEK293F, продуцирующие BDDrFVIII, культивировали в 15 различных биореакторах с механическим перемешиванием с масштабом производства 100 л, два из которых использовали низкую скорость диссипации энергии (6 Вт/м3) в качестве контроля, и 13 с высокой скоростью диссипации энергии (29 Вт/м3) для исследования эффекта повышенных сдвиговых усилий. Среднее значение клеточной плотности составило 29,2 106 клеток/мл в двух партиях с низкой энергией, и 27,6 106 клеток/мл в 13 партиях с высокой энергией. Биореактор использует 225 мм лопастную мешалку с наклоном для достижения перемешивания. Замену среды осуществляли путем использования непрерывного центрифугирования. Плотность жизнеспособных клеток и жизнеспособность измеряли с помощью счетчика клеток Cedex (Innovatis). Аккумулированный FVIII высвобождался из клеток с помощью повышения ионной концентрации в клеточной суспензии до 0,3 M NaCl + 30 мМ CaCl2. Клетки удаляли путем центрифугирования, и FVIII определяли с помощью метода с использованием хромогенного субстрата (Coatest®SP FVIII). Проверяемые скорости перемешивания составили 45 и 75 об./мин, которые придавали культуре мощности 6 и 29 Вт/м3 соответственно. Эксперимент показал, что повышение входной энергии (скорость диссипации энергии, ε) по отношению к культуре путем повышения скорости перемешивания повышало продуктивность (Таблица 2). В заключение также оказалось возможным достижение повышения продуктивности путем повышения сдвиговых усилий в культурах крупномасштабного производства таким же образом, как наблюдали для культур мелкомасштабного производства.
Таблица 2
Скорость перемешивания [об./мин] ε [Вт/м3] Аккумулированный FVIII:C.
Среднее значение[МЕ/мл]
45 6 45 (n=2)
75 29 59 (n=13)
Пример 5
Клетки HEK293F, продуцирующие BDDrFVIII, культивировали перфузионным способом в 2 л биореакторах с механическим перемешиванием, которые перемешивали постоянно при 185 об./мин с использованием 90 мм лопастной мешалки с наклоном 45°. Обычный режим операций для биореактора использовали с применением непрерывного центрифугирования для осуществления замены среды путем перфузии. Для сравнения половолоконный элемент использовали для достижения перфузии с помощью замены среды. Половолоконный элемент работал при изменении тангенциального потока, что означает, что клетки прокачивали внутрь и обратно из мембраны фильтра, что непрерывно придавало сдвиговые усилия клеточной культуре. Другие параметры клеточной культуры, такие как скорость перемешивания, pH, давление растворенного кислорода и температура, поддерживали постоянными при одних и тех же значениях в обеих культурах. Неожиданно было обнаружено, что если сдвиговые усилия повышаются с повышением входной энергии по отношению к культуре с помощью использования половолоконной мембраны для достижения сдвиговых усилий, то степень клеточно-специфичного продуцирования FVIII может значительно повыситься (Фигура 5). Аккумулированный FVIII высвобождался из клеток с помощью повышения ионной концентрации в клеточной суспензии до 0,3 M NaCl + 30 мМ CaCl2. Клетки удаляли путем центрифугирования, и FVIII определяли с помощью метода с использованием хромогенного субстрата (Coatest®SP FVIII).

Claims (14)

1. Способ повышения клеточно-специфичной продуктивности рекомбинантного фактора VIII (rFVIII), продуцируемого в суспензионной культуре клеток млекопитающих в процессе культивирования указанной суспензионной культуры клеток млекопитающих в культуральной среде, содержащей не более чем 500 мкМ CaCl2, по меньшей мере один неионный детергент, причем способ отличается тем, что указанная клеточная суспензия культивируется при индуцировании механического сдвигового усилия на суспензионную культуру клеток млекопитающих путем приложения к ним удельной мощности, составляющей по меньшей мере 3 Вт/м3.
2. Способ по п. 1, где удельная мощность вводится в клеточную культуральную среду посредством механического движения клеточной суспензии.
3. Способ по п. 2, где механическое движение клеточной суспензии осуществляется посредством прокачивания клеточной суспензии через мембрану тангенциального фильтра.
4. Способ по п. 3, где мембрана тангенциального фильтра представляет собой половолоконную мембрану.
5. Способ по п. 2, где механическое движение клеточной суспензии осуществляется посредством вращающего элемента, такого как мешалка, пропеллерная мешалка или лопастная мешалка.
6. Способ по п. 1, где rFVIII представляет собой rFVIII с делетированным В-доменом.
7. Способ по п. 1, где клетки млекопитающих представляют собой клетки HEK293.
8. Способ по п. 1, где молекула rFVIII продуцируется в клетках HEK293 и ассоциирована с ними.
9. Способ по п. 1, где неионные детергенты выбирают из Pluronic-F68, Tween 20 и Tween 80.
10. Способ по пп. 1 и 9, где неионные детергенты имеют концентрацию 0,00001-1 мас.%, в частности 0,0001-0,1 мас.%, наиболее подходящая концентрация 0,001-0,01 мас.%.
11. Способ по п. 1, где агрегация клеток минимизирована посредством поддержания низкой концентрации CaCl2 в культуральной среде и путем повышения переноса CaCl2 из окружающей среды в клетки посредством увеличения сдвига.
12. Способ по пп. 2-9, 11, где механическое движение клеточной суспензии инициируется в культуральной емкости, оборудованной лопастной мешалкой, или в культуральной емкости с гравитационным движением, индуцирующим сдвиговое усилие в указанной клеточной суспензии, или сдвиговое усилие в посуде с клеточной суспензией индуцируется посредством прокачивания клеточной суспензии через статический миксер или фильтровальное устройство.
13. Способ по пп. 1, 2, где удельная мощность, прилагаемая к клеточной суспензии для введения сдвигового усилия, составляет максимум 2000 Вт/м3.
14. Способ по п. 13, где удельная мощность, прилагаемая к клеточной суспензии для введения сдвигового усилия, составляет от 3 до 2000 Вт/м3.
RU2013155382/10A 2011-05-13 2012-05-14 Способ повышения продуктивности эукариотических клеток в продуцировании рекомбинантного fviii RU2600886C2 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11166071.8 2011-05-13
EP11166071 2011-05-13
US201161489406P 2011-05-24 2011-05-24
US61/489,406 2011-05-24
PCT/EP2012/058899 WO2012156356A1 (en) 2011-05-13 2012-05-14 A method of increasing the productivity of eucaryotic cells in the production of recombinant fviii

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2013155382A RU2013155382A (ru) 2015-06-20
RU2600886C2 true RU2600886C2 (ru) 2016-10-27

Family

ID=45470754

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2013155382/10A RU2600886C2 (ru) 2011-05-13 2012-05-14 Способ повышения продуктивности эукариотических клеток в продуцировании рекомбинантного fviii

Country Status (13)

Country Link
US (1) US9115381B2 (ru)
EP (3) EP4353743A3 (ru)
JP (1) JP6178786B2 (ru)
KR (1) KR101980164B1 (ru)
CN (1) CN103517919B (ru)
AU (1) AU2012257736B2 (ru)
BR (1) BR112013028006A2 (ru)
CA (1) CA2835053C (ru)
DK (1) DK3626737T3 (ru)
ES (1) ES2970057T3 (ru)
IL (1) IL229058A (ru)
RU (1) RU2600886C2 (ru)
WO (1) WO2012156356A1 (ru)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6591609B2 (en) 1997-07-15 2003-07-15 New Power Concepts Llc Regenerator for a Stirling Engine
US11384378B2 (en) 2014-06-04 2022-07-12 Amgen Inc. Methods for harvesting mammalian cell cultures
CN107287265B (zh) * 2016-03-31 2018-09-14 正大天晴药业集团南京顺欣制药有限公司 一种制备重组人凝血因子ⅷ的方法
CN112469821B (zh) * 2018-07-26 2021-12-14 正大天晴药业集团股份有限公司 一种制备重组人凝血因子ⅷ的方法
WO2023242238A1 (en) * 2022-06-15 2023-12-21 UCB Biopharma SRL Cell culture processes

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2249041C2 (ru) * 1998-12-10 2005-03-27 Байер Корпорейшн Способ получения и выделения белка, обладающего активностью фактора viii, линия клеток нкв, экспрессирующая белок, обладающий активностью фактора viii (варианты)
WO2006103258A1 (en) * 2005-03-29 2006-10-05 Octapharma Ag Method for improved isolation of recombinantly produced proteins
WO2007003582A2 (en) * 2005-06-30 2007-01-11 Octapharma Ag Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines
WO2008006494A1 (en) * 2006-07-14 2008-01-17 Dsm Ip Assets B.V. Improved process for the culturing of cells

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5804420A (en) 1997-04-18 1998-09-08 Bayer Corporation Preparation of recombinant Factor VIII in a protein free medium
AU780415B2 (en) * 1999-07-13 2005-03-17 Biovitrum Ab Stable Factor VIII compositions
US7572619B2 (en) 2000-03-22 2009-08-11 Octagene Gmbh Recombinant blood clotting factors
CN1930281A (zh) * 2004-03-05 2007-03-14 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于通过连续灌注和交互切向流来培养细胞的方法
JP2006296423A (ja) * 2005-03-24 2006-11-02 Hitachi Ltd 培養槽の制御装置及び培養装置
WO2006103298A2 (en) * 2005-04-01 2006-10-05 Novo Nordisk Health Care Ag Blood coagulation fviii analogues
CN101490239A (zh) * 2006-07-14 2009-07-22 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 改进的细胞培养方法
WO2009090787A1 (ja) * 2008-01-15 2009-07-23 Toray Industries, Inc. 生理活性ペプチドまたはタンパク質製造方法、および組換え動物細胞
JP5619738B2 (ja) * 2008-06-24 2014-11-05 オクタファルマ アクチェンゲゼルシャフト 凝固第ｖｉｉｉ因子の精製方法
MX2011001624A (es) 2008-08-21 2011-03-28 Octapharma Ag Factor viii y ix humano producido en forma recombinante.
DE102008049120A1 (de) 2008-09-26 2010-04-01 Bayer Technology Services Gmbh Verfahren zur Reduzierung von Ablagerungen bei der Kultivierung von Organismen
EP2216395A1 (en) * 2009-02-09 2010-08-11 Lonza Biologics plc. Bioreactor for the cultivation of mammalian cells
US8580554B2 (en) 2009-07-31 2013-11-12 Baxter International Inc. Method of producing a polypeptide or virus of interest in a continuous cell culture

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2249041C2 (ru) * 1998-12-10 2005-03-27 Байер Корпорейшн Способ получения и выделения белка, обладающего активностью фактора viii, линия клеток нкв, экспрессирующая белок, обладающий активностью фактора viii (варианты)
WO2006103258A1 (en) * 2005-03-29 2006-10-05 Octapharma Ag Method for improved isolation of recombinantly produced proteins
WO2007003582A2 (en) * 2005-06-30 2007-01-11 Octapharma Ag Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines
WO2008006494A1 (en) * 2006-07-14 2008-01-17 Dsm Ip Assets B.V. Improved process for the culturing of cells

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUN B. AND ET AL., Enhanced production of recombinant B-domain deleted factor VIII from Chinese hamster ovary cells by propionic and butyric acids // Biotechnology Letters, 2003, 25, стр.315-;319. *

Also Published As

Publication number Publication date
ES2970057T3 (es) 2024-05-24
US20140051123A1 (en) 2014-02-20
EP4353743A2 (en) 2024-04-17
CN103517919B (zh) 2016-11-16
AU2012257736A1 (en) 2013-10-10
EP3626737A1 (en) 2020-03-25
CA2835053A1 (en) 2012-11-22
KR20140021009A (ko) 2014-02-19
EP2707387A1 (en) 2014-03-19
IL229058A (en) 2017-03-30
EP2707387B1 (en) 2019-12-25
EP4353743A3 (en) 2024-07-17
JP2014513545A (ja) 2014-06-05
WO2012156356A1 (en) 2012-11-22
CA2835053C (en) 2020-07-07
KR101980164B1 (ko) 2019-05-20
RU2013155382A (ru) 2015-06-20
JP6178786B2 (ja) 2017-08-09
CN103517919A (zh) 2014-01-15
DK3626737T3 (da) 2024-02-05
BR112013028006A2 (pt) 2016-09-06
EP3626737B1 (en) 2023-11-29
IL229058A0 (en) 2013-12-31
AU2012257736B2 (en) 2015-12-10
US9115381B2 (en) 2015-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6001642A (en) Bioreactor and cell culturing processes using the bioreactor
RU2600886C2 (ru) Способ повышения продуктивности эукариотических клеток в продуцировании рекомбинантного fviii
Eaker et al. Bioreactors for cell therapies: Current status and future advances
Reuveny Microcarrier culture systems
Junne et al. How scalable and suitable are single-use bioreactors?
US20240247218A1 (en) Large scale pei-mediated plasmid transfection
EA022219B1 (ru) Способ получения полипептида или вируса, представляющих интерес, в непрерывной клеточной культуре
Jossen et al. Single‐use bioreactors–an overview
Peng et al. Development of small scale cell culture models for screening poloxamer 188 lot‐to‐lot variation
Fenge et al. Cell culture bioreactors
Kuystermans et al. Bioreactor systems for producing antibody from mammalian cells
US8440800B2 (en) Compositions for reducing cell adhesion to bubbles
GPROCESS Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing
Malik et al. Large-Scale Culture of Mammalian Cells for Various Industrial Purposes
Jossen et al. Single-Use Systems in Biopharmaceutical Manufacture: State of the Art and Recent Trends
Nilsson et al. [35] Entrapment of animal cells
ES2777173T3 (es) Un procedimiento para aumentar la productividad de células eucarióticas en la producción de FVIII recombinante
Heathman et al. The Scale‐up of Human Mesenchymal Stem Cell Expansion and Recovery
Hu Cell culture bioreactors
Halsall et al. Systems for cell culture scale-up
Salvador et al. Bringing cellular agriculture to the table: The role of animal cell bioreactors
Ryan Growing more cells: A simple guide to small volume cell culture scale-up
Sharma Development of a novel bioreactor and systems for suspension cell culture in biopharmaceutical production
RAY et al. PETER W. RUNSTADLER JR., AMAR S. TUNG, EDWARD G. HAYMAN
Ahmed Application of hydrocyclone for cell separation in mammalian cell perfusion cultures