CN112469821B - 一种制备重组人凝血因子ⅷ的方法 - Google Patents
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Abstract
一种制备重组人凝血因子Ⅷ的方法，包括利用波浪式生物反应器培养表达重组人凝血因子Ⅷ的人胚肾细胞293/N27‑7以及从细胞培养液中分离并纯化重组人凝血Ⅷ因子。波浪生物反应器混合效率高，气液交换充分，泡沫少且剪切力低，避免了搅拌式不锈钢反应器浆叶端和气泡对细胞的伤害。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种制备重组人凝血因子VIII的方法，具体涉及利用筛选的人胚肾细胞，通过波浪式生物反应器培养表达重组人凝血因子VIII的细胞以及从细胞培养液中分离并纯化重组人凝血VIII因子。
背景技术
血友病为一种先天性凝血因子基因缺陷或突变导致凝血功能障碍的遗传出血性疾病。根据相应的凝血因子将血友病分为甲型、乙型、丙型血友病(即血友病A、B、C)，其中血友病A占80％-85％。目前替代疗法如输注血浆、凝血因子VIII或IX是治疗血友病有效措施，但由于血浆来源的凝血制品极易造成血源性病毒污染，基因重组类凝血因子因其安全性及有效性成为治疗血友病的主要产品。重组人凝血因子VIII与天然凝血因子VIII具有相似的生化、免疫及药理学特性，能有效纠正血友病患者的出血倾向，具有良好的治疗效果。目前上市的重组人凝血因子VIII有Recombinate(Baxter公司)、Advate(Baxter公司)、KogenateFS(Bayer公司)、ReFacto(pfizer公司)、Xyntha(pfizer公司)、Eloctate(Biogen公司，B结构域缺失的因子VIII与IgG1Fc结构域的融合蛋白)以及Octanate(Octapharma公司)等。
作为哺乳动物表达细胞的一种，人胚肾细胞(HEK293)表达系统已经被用于制备许多包含重组凝血八因子的治疗蛋白，其表达的重组蛋白的蛋白翻译后修饰完全且免疫反应低，但常用的HEK293细胞培养工艺技术壁垒高，细胞结团严重，细胞状态难以维持。此外，目前重组八因子的细胞株的规模化培养主要采用的是传统搅拌式反应器，如中国专利申请CN103517919采用搅拌式反应器通过施加较大的剪切应力(即较大的搅拌速率)悬浮培养HEK293细胞，培养产生的重组人凝血八因子最高活性仅达到16IU/ml；中国专利申请CN102776260通过在培养过程中控制细胞培养液中血管性血友病因子与人凝血八因子的活性比为1-10∶1，获得的重组人凝血八因子的表达量最高也仅达到10-20国际单位/天/106细胞。因此，仍需要高效培养重组人凝血因子VIII的方法。
WAVE波浪生物反应器混合效率高，气液交换充分，泡沫少且剪切力低，避免了搅拌式不锈钢反应器浆叶端和气泡对细胞的伤害，因此细胞状态、细胞活率及蛋白活性均高于搅拌式不锈钢反应器。CN107287265公开了制备重组人凝血因子VIII的方法，通过波浪式生物反应器培养表达重组人凝血因子VIII的细胞以及从细胞培养液中分离并纯化重组人凝血VIII因子。
发明内容
本发明一方面提供一种制备重组人凝血因子VIII的方法，包括：
(1)采用波浪式生物反应器培养表达重组人凝血因子VIII的细胞，所述细胞处于对数生长期且细胞状态良好，所述反应器培养的温度为36.5℃，转速16-18rpm，角度6-8度，CO2浓度6-10％，空气3-5lpm，0-48±3小时溶解氧(DO)设定为40％、48±3至66±3小时DO设定为25％、66±3小时至培养结束DO设定为40％，培养时间为66-96小时，培养方式为流加培养；
(2)从步骤(1)的细胞培养液中收获重组人凝血因子VIII。
在一些方案中，所述重组人凝血因子VIII选自全长的重组人凝血因子VIII，或者B结构域缺失的重组人凝血因子VIII(BDDrFVIII，其序列可参见专利文献CN107287265A的SEQ ID NO：1)。在本发明的一个优选实施方案中，所述重组人凝血因子VIII选自B结构域缺失的重组人凝血因子VIII。
在一些方案中，步骤(1)的细胞为经筛选的表达重组人凝血因子VIII的人胚肾细胞293(HEK293)。
在一些方案中，步骤(1)的细胞为经悬浮驯化的表达重组人凝血因子VIII的人胚肾细胞293(HEK293)。
在一些方案中，步骤(1)的细胞为人胚肾细胞293/N27-7，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：C201828。上述人胚肾细胞293/N27-7经悬浮驯化筛选得来，已于2017年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏登记号为CCTCC NO：C201828。
在一些方案中，步骤(1)中波浪式生物反应器的转速为16-18rpm。在本发明的一些具体实施方案中，所述波浪式生物反应器的转速为17rpm。
在一些方案中，步骤(1)中波浪式生物反应器的角度为6-8度。在本发明的一个实施方案中，所述波浪式生物反应器的角度为7度。
在一些方案中，步骤(1)中CO2浓度为6-10％，更优选为10％。
在一些方案中，步骤(1)中空气设置为3-5lpm，更优选为3lpm。
在一些方案中，其中步骤(1)中培养时间为66-96小时，更优选为72-78小时。
其中步骤(1)中所使用的培养基不特别限制，只要适合细胞生长即可，在本发明的一个优选实施方案中，所使用的培养基为含4mmol/L谷氨酰胺、0.02％antifoam C、1g/LKolliphor P188的CD OptiCHO AGT培养基。
在一些方案中，其中步骤(1)中流加培养是在培养周期的24-72小时内补加200mmol/L谷氨酰胺至其浓度为4mmol/L。
在一些方案中，步骤(1)的波浪式生物反应器包括但不限于WAVE生物反应器(GEHealthcare)、AppliFlex(Applikon)、BIOSTAT RM(Sartorius Stedim Biotech)、Celltainer(Celltainer Biotech)、ReadyToProcess WAVE25(GE Healthcare)、Xuri细胞扩增系统W25(GE Healthcare)、XRS20(PallLife Sciences)。更优选的，步骤(1)的波浪式生物反应器选自WAVE生物反应器(GE Healthcare)。在本发明的一个具体实施方案中，步骤(1)的波浪式生物反应器选自WAVE波浪式反应器(GE Healthcare，型号WAVE200)。
在一些方案中，步骤(2)收获重组人凝血因子VIII是在含有Na+的溶液中进行的。
在本发明的一个具体实施方案中，重组人凝血因子VIII的制备方法包括以下步骤：
(1)一级种子液制备：从液氮罐中取冻存的重组人凝血因子VIII工作细胞库细胞一支(装量1ml)，37℃水浴解冻，转移至含约19ml种子培养基CD OptiCHO AGT(含4mmol/L谷氨酰胺、50μg/ml zeocin)的125ml细胞培养摇瓶中，放置于36.5℃、10％CO2二氧化碳恒温培养箱中130-170rpm培养。细胞密度约3.0-4.8×106cells/ml时传代培养，传代密度约为0.8-1.2×106cells/ml，4-5次传代后将一级种子液接种于WAVE波浪式反应器(GEHealthcare，型号WAVE25)。
(2)二级种子液制备：WAVE波浪式反应器培养二级种子液，接种比例为约1/4，接种密度为约0.75-1.2×106cells/ml，培养基为约CD OptiCHO AGT(含约4mmol/L谷氨酰胺、约0.02％antifoam C、约1g/L Kolliphor P188)，二级种子液培养参数设置：培养温度36.5℃，转速13-16rpm，角度6度，CO2浓度6-10％，空气约0.3-0.5lpm，培养体积为约8L。二级种子液的细胞密度处于约3.0-4.8×106cells/ml时传代培养且细胞状态良好时接种于WAVE200波浪式反应器。
(3)三级种子液制备：WAVE200波浪式反应器培养，接种比例为约1/4，接种密度为约0.75-1.2×106cells/ml，培养基为CD OptiCHO AGT(含约4mmol/L谷氨酰胺、约0.02％antifoam C、约1g/L Kolliphor P188)，三级种子液培养参数设置：培养温度约36.5℃，转速12-14rpm，角度4-6度，CO2浓度6-10％，空气约1-2lpm，培养体积为30-35L，优选约32L。三级种子液的细胞密度处于约3.0-4.6×106cells/ml时传代培养且细胞状态良好时，于WAVE200波浪式反应器扩种进行终极培养。
(4)WAVE200波浪式反应器培养：接种比例为约1/4-1/3，培养基为CD OptiCHO AGT(含约4mmol/L谷氨酰胺、约0.02％antifoam C、约1g/L Kolliphor P188)，培养体积为约100L，流加培养，在培养周期的第24-72小时补加200mmol/L谷氨酰胺至其浓度为4mmol/L，培养周期第72-78小时收获，WAVE波浪反应器细胞培养主控参数设定：培养温度36.5℃，转速16-18rpm，角度6-8度，CO2浓度6-10％以及空气3-5lpm。
(5)从步骤(4)的细胞培养液中收获重组人凝血因子VIII，收获条件为终浓度约0.5mol/L的NaCl，2-8℃下电导为约40-50mS/cm，溶液混合后静置45分钟。
本发明的制备方法进一步包括将步骤(5)收获的重组人凝血因子VIII进一步纯化的步骤，其中所述纯化步骤包括：深层过滤、单向流浓缩、S/D病毒灭活、亲和层析、阴离子交换层析、疏水层析、纳滤和超滤置换缓冲液。
本发明再一方面提供一种用于制备重组人凝血因子VIII的人胚肾细胞，具体的，人胚肾细胞是人胚肾细胞293/N27-7，上述人胚肾细胞293/N27-7经悬浮驯化筛选得来，已于2017年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏登记号为CCTCC NO：C201828。
本发明再一方面提供人胚肾细胞在制备重组人凝血因子VIII中的应用，所述人胚肾细胞是人胚肾细胞293/N27-7，保藏登记号为CCTCC NO：C201828，所述应用方法，包括：
(1)采用波浪式生物反应器培养表达重组人凝血因子VIII的人胚肾细胞293/N27-7，所述细胞处于对数生长期且细胞状态良好，所述反应器培养的温度为约36.5℃，转速16-18rpm，角度6-8度，CO2浓度6-10％，空气3-5lpm，0-48±3小时溶解氧(DO)设定为约40％、48±3至66±3小时DO设定为约25％、66±3小时至培养结束DO设定为约40％，培养时间为66-96小时，培养方式为流加培养；
(2)从步骤(1)的细胞培养液中收获重组人凝血因子VIII。
本发明再一方面提供一种含有重组人凝血因子VIII的组合物，其中所述重组人凝血因子VIII由本发明的任一项制备方法获得。
术语“流加培养”指反应器培养过程中细胞不断生长及产物不断形成，而在此过程中随着营养物质的消耗，不断地向系统中补充新的营养成分，使细胞进一步生长代谢，直到整个培养结束后取出产物。流加培养的特点就是能够调节培养环境中营养物质的浓度，一方面，它可以避免在某种营养成分的初始浓度过高时影响细胞的生长代谢以及产物的形成；另一方面，它还能防止某些限制性营养成分在培养过程中被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。
本发明的制备方法具有如下有益效果：
(一)经悬浮驯化筛选的人胚肾细胞293/N27-7与常用人胚肾细胞293相比，降低了培养工艺技术壁垒，细胞悬浮性提高，降低了细胞结团及贴壁现象，细胞状态易于维持，利于在波浪式生物反应器中培养，相对CN107287265A记载的方法，本发明的细胞株在生产规模扩大至100L和/或培养周期缩短至72小时时仍保持较高蛋白表达量；
(二)WAVE波浪生物反应器混合效率高，气液交换充分，泡沫少且剪切力低，避免了搅拌式不锈钢反应器浆叶端和气泡对细胞的伤害，因此细胞状态、细胞活率及蛋白活性均高于搅拌式不锈钢反应器；
(三)WAVE波浪生物反应器采用较低的转速(例如16rpm-18rpm)培养细胞时，细胞活率和蛋白表达量也获得了出乎意料的提高。另外，进一步的纯化有效去除了宿主蛋白、DNA、亲和配基、聚合物、降解物以及细胞培养过程中带入的污染物，大大提高了重组人凝血因子VIII的产量及蛋白活性。
附图说明
图1：WAVE波浪生物反应器不同培养周期的细胞生长曲线图。
图2：WAVE波浪生物反应器不同培养周期的蛋白表达量图。
图3：重组人凝血因子VIII的纯化流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述，然而，本发明中的这些和其他实施例仅用于阐明而不限制本发明的范围。本领域技术人员应该理解，对本发明技术特征所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
细胞：人胚肾细胞293/N27-7，保藏登记号为CCTCC NO：C201828。
细胞来源：正大天晴药业集团股份有限公司，自制。
实施例1考察WAVE波浪生物反应器与搅拌式不锈钢反应器细胞培养效果
一级种子液制备：从液氮罐中取冻存的重组人凝血因子VIII工作细胞库细胞一支(人胚肾细胞293/N27-7，自制，装量1ml)，37℃水浴解冻，转移至含20ml种子培养基CDOptiCHO AGT(含4mmol/L谷氨酰胺(Life technologies公司)、50μg/ml zeocin(Invotrogen公司)，Life technologies公司)的125ml细胞培养摇瓶中，放置于37℃、6-10％CO2二氧化碳恒温培养箱中110-130rpm培养。每天观察细胞状态，取样进行细胞计数和检测细胞活率(台盼蓝法)，细胞密度约3.0-4.0×106cells/ml时传代培养，传代密度约为0.6-1.0×106cells/ml，3-4次传代后将一级种子液接种于WAVE波浪式反应器(GEHealthcare，型号20/50EHT)。
二级种子液制备：WAVE波浪式反应器培养二级种子液，接种比例为1/4-1/3，接种密度为0.6-1.0×106cells/ml，培养基为CD OptiCHO AGT(含4mmol/L谷氨酰胺(Lifetechnologies公司)、0.02％antifoam C(SIGMA公司)、1g/L Kolliphor P188(sigma公司)，Life technologies公司)，二级种子液培养参数设置：培养温度36.5℃，转速13-16rpm，角度5-8度，CO2浓度6-10％，空气0.3-0.5lpm。二级种子液的细胞处于对数生长期且细胞状态良好时接种于WAVE波浪式反应器和30L搅拌式不锈钢反应器(Applikon公司，型号EZ-CONTROL)。
WAVE波浪式反应器细胞培养工艺：接种比例为1/4-1/3，接种密度为0.6-1.0×106cells/ml，培养基为CD OptiCHO AGT(含4mmol/L谷氨酰胺(Life technologies公司)、0.02％antifoam C(SIGMA公司)、1g/L Kolliphor P188(sigma公司)，Life technologies公司)，流加培养，在培养周期的第24-72小时补加200mmol/L谷氨酰胺至其浓度为2-4mmol/L，补加200g/L葡萄糖(sigma公司)溶液至葡萄糖含量为2-4g/L，培养周期第72小时收获。培养过程中每24小时取样进行细胞计数检测细胞活率(台盼蓝法)，以及检测蛋白活性(一期法)。WAVE波浪反应器细胞培养主控参数设定：培养温度36.5℃，转速16-18rpm，角度6-8度，CO2浓度6-10％以及空气3-5lpm。
WAVE波浪生物反应器不同培养周期的细胞生长曲线图如图1所示；WAVE波浪生物反应器不同培养周期的蛋白表达量如图2所示。
30L搅拌式不锈钢反应器细胞培养工艺：接种比例为1/4-1/3，接种密度为0.6-1.0×106cells/ml，培养基为CD OptiCHO AGT(含4mmol/L谷氨酰胺(Life technologies公司)、0.02％antifoam C(SIGMA公司)、1g/L Kolliphor P188(sigma公司)，Lifetechnologies公司)，流加培养，在培养周期的第24-72小时补加200mmol/L谷氨酰胺至其浓度为2-4mmol/L，补加200g/L葡萄糖(sigma公司)溶液至葡萄糖含量为2-4g/L，培养周期第96小时收获。培养过程中每24小时取样进行细胞计数检测细胞活率(台盼蓝法)，以及检测蛋白活性(一期法)。搅拌式不锈钢反应器主控参数设定：培养温度37℃；搅拌转速100-130rpm；DO通过补加O2自控维持在40％；pH值通过补加CO2及0.5mol/L氢氧化钠溶液自控维持在7.00±0.20；空气持续通气，通气量为500ml/min。
WAVE波浪生物反应器与搅拌式不锈钢反应器工艺过程及培养效果对比如表1所示。
表1：WAVE波浪生物反应器与搅拌式不锈钢反应器工艺过程及培养效果对比
WAVE波浪生物反应器混合效率高，气液交换充分，泡沫少且剪切力低，避免了搅拌式不锈钢反应器浆叶端和气泡对细胞的伤害，因此细胞状态、细胞活率及蛋白活性均高于搅拌式不锈钢反应器。此外，WAVE波浪生物反应器采用较低的转速(例如16rpm-18rpm)培养细胞时，细胞活率和蛋白表达量也获得了出乎意料的提高。
实施例2重组人凝血因子VIII的纯化
(1)收获细胞培养液
向实施例1获得的细胞悬液(WAVE波浪式反应器培养)中加入含有氯化钠和氯化钙的缓冲液(10mmol/L Hepes，5mmol/L二水氯化钙，4mol/L氯化钠，pH7.2)，使氯化钠的终浓度约为0.5mol/L，在2-8℃下，将溶液混合后静置约45分钟，通过深层过滤将细胞移除之后进行过滤(0.22μm)以除去任何残留的细胞碎片和颗粒物。
(2)单向流浓缩
将细胞澄清液进行单向流浓缩，浓缩约3-4倍，浓缩液经0.2μm过滤器过滤。
(3)S/D病毒灭活
使用0.3％的磷酸三丁脂(TNBP)(v/v)和1％的Triton X-100对步骤(2)获得的澄清细胞收获液进行病毒灭活。在20-25℃下进行病毒灭活45分钟。
(4)亲和层析
将步骤(3)获得的细胞收获液使用Quik Scale140/550层析柱(柱床高度3.5cm，直径14cm，体积约540ml，填料为VIIISelect凝胶(GE Healthcare公司)进行纯化。用于亲和层析的缓冲液和步骤如表2和表3所示。
表2：用于亲和层析的缓冲液
表3：亲和层析步骤
| 步骤 | 缓冲液 | 柱体积或时间 |
| 水洗 | WFI | 3CV |
| 平衡 | 平衡缓冲液 | 5CV |
| 上样 | - | - |
| 上样后平衡 | 平衡缓冲液 | 6CV |
| 淋洗 | 淋洗缓冲液 | 10CV |
| 再平衡 | 平衡缓冲液 | 6CV |
| 洗脱 | 洗脱缓冲液 | 4CV(出峰后开始收集) |
| 平衡 | 平衡缓冲液 | 6CV |
| 清洁1 | 清洁1缓冲液 | 6CV |
| 清洁2 | 清洁2缓冲液 | 60分钟 |
| 水洗 | 去离子水 | -- |
| 保存 | 20％乙醇 | 3CV |
(5)阴离子层析
将Q-Sepharose High Performance填料(GE Healthcare公司)装填至Quik Scale140/550层析柱中，使柱床高度为3.5cm，直径为14cm，体积约为540ml。
对步骤(4)的洗脱液进行约10倍稀释(2-8℃)，从而使凝血因子VIII能与凝胶结合。用于阴离子层析的缓冲液和层析步骤如表4和表5所示。
表4：用于阴离子层析的缓冲液
表5：阴离子柱层析步骤
| 步骤 | 缓冲液 | 柱体积或时间 |
| CIP | 0.5mol/LNaOH | 30分钟 |
| 平衡 | 平衡缓冲液 | 6CV |
| 上样 | - | - |
| 平衡 | 平衡缓冲液 | 6CV |
| 再平衡 | 清洗缓冲液 | 6CV |
| 洗脱 | 洗脱缓冲液 | 整峰收集 |
| 清洗1 | 清洗1缓冲液 | 60分钟 |
| 平衡 | 平衡缓冲液 | 6CV |
| 清洗2 | 清洗2缓冲液 | 60分钟 |
| 水洗 | WFI | -- |
| 保存 | 20％乙醇 | 3CV |
(6)疏水柱层析
将Butyl Sepharose High Performance填料(GE Healthcare公司)装填至层析柱(SAC-Bio-100-500G-10)中，使柱床高度为3.5cm，直径为10cm，体积约为110ml。使用电导调节缓冲液稀释步骤(5)的洗脱液使其电导值为62mS/cm(2-8℃)。用于疏水柱层析的缓冲液和层析步骤如表6和表7所示。
表6：用于疏水层析的缓冲液
表7：疏水层析步骤
| 步骤 | 缓冲液 | 柱体积或时间 |
| CIP | 0.5mol/LNaOH | 30分钟 |
| 活化 | 再生缓冲液 | 4CV |
| 平衡 | 平衡缓冲液 | 3CV |
| 上样 | - | 流穿模式，整峰收集 |
| 平衡 | 平衡缓冲液 | -- |
| 再生 | 再生缓冲液 | 3CV |
| 水洗 | WFI | 3CV |
| 清洁1 | 清洁1缓冲液 | 60分钟 |
| 水洗 | WFI | 6CV |
| 清洁2 | 清洁2缓冲液 | 60 |
| 水洗 | WFI | |
| 保存 | 20％乙醇 | 3CV |
(7)纳滤(除病毒过滤)
使用平衡缓冲液(10mmol/L Hepes，5mmol/L二水氯化钙，0.7mol/L氯化钠，pH7.2)平衡纳滤膜(PlanovaBioEx，Asahi-Kasei公司)，过滤步骤(6)获得的的疏水流穿液以除去无包膜病毒。
(8)超滤置换缓冲液
通过10kDa纤维素超滤膜(Millipore公司)对步骤(7)所得滤出液进行缓冲液置换。先对滤出液浓缩至0.1～0.25mg/ml，然后进行换液，换液过程控制TMP为0.6bar，用置换缓冲液(3mg/ml L-组氨酸，0.7mol/L氯化钠，5mmol/L氯化钙，pH7.0)置换约7个样品体积，对样品进行回收，最后加入终浓度为6mg/ml的蔗糖，控制最终蛋白浓度不小于0.1mg/ml，用0.2μm减菌过滤获到原液，并于不高于-70℃保存。
Claims (3)
1.一种制备重组人凝血因子Ⅷ的方法，包括：
（1）采用波浪式生物反应器培养表达重组人凝血因子Ⅷ的细胞，所述细胞处于对数生长期，培养方式为流加培养，
（2）从步骤（1）的细胞培养液中收获重组人凝血因子Ⅷ，
其中步骤（1）所述细胞为人胚肾细胞293/N27-7，保藏号为CCTCC NO:C201828。
2.根据权利要求1的制备方法，其中步骤（1）中培养时间为72-78小时。
3.一种用于制备重组人凝血因子Ⅷ的人胚肾细胞，所述人胚肾细胞是人胚肾细胞293/N27-7，保藏登记号为CCTCC NO:C201828。
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