CN115819608A - 一种纯化融合蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种纯化融合蛋白的方法。本发明通过改进纯化条件，对层析填料种类、载量、淋洗缓冲液、洗脱pH等进行考量和筛选，纯化工艺去除多聚体的效果较好，蛋白回收率较高，最终得到了纯度高、稳定性好的融合蛋白，有利于提高产品的质量控制水平及药物稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种有效提纯融合蛋白，减少多聚体杂质的纯化工艺。
背景技术
融合蛋白是包括一种、两种或更多种源自不同天然存在的蛋白质或者工程化改造后的蛋白质的多肽被人为地组合以形成一种蛋白质的蛋白质，包括但不限于以下例举的形式：1、对于一条多肽链组成的融合蛋白，其由相同或不同的多肽彼此融合，以形成包含所述不同的多肽的一条多肽链；2、对于两条或以上多肽链组成的融合蛋白，其中任选的一条或多条多肽链由相同或不同的多肽彼此融合，以形成包含所述相同或不同的多肽的多肽链，这些多肽链以共价或非共价的形式彼此组合形成蛋白。
多聚体是指以二聚体或多聚体形式存在的聚集体。多聚体主要在细胞培养、蛋白纯化、制剂处方和药物储存的工艺过程中产生，由于受培养工艺、纯化条件以及制剂存储过程中某些因素的影响，从而导致蛋白质部分分解折叠或者错误折叠，暴露的相关区域相互作用引发聚集，形成多聚体。
多聚体不仅可能会使得药物活性降低甚至失去生物活性，从而影响药效，更有可能使得受体发生过敏性免疫原反应，从而影响了受体的健康。因此，多聚体是抗体蛋白类药物在制备过程中需要监控和去除的杂质，药物中的多聚体含量被认为是产品的一个重要的质量指标。
在抗体融合蛋白药物生产的过程中，虽然可以通过改变操作条件来控制多聚体的产生，但没有办法达到产品中完全没有多聚体的控制效果，所以有效的多聚体的去除手段对于多聚体的控制就显得至关重要。
目前融合蛋白类药物去除多聚体的纯化工艺，主要包括凝胶过滤层析、亲和层析、离子层析和疏水层析，其中亲和层析作为最主要的纯化方法，在洗脱过程中最常用的是线性洗脱法。一般的线性洗脱法的效果优于等度洗脱法。然而，线性洗脱法也存在一定的弊端，由于涉及到产品的分管收集，在生产过程中收集产品繁琐，可操作性不高。另外，在实际生产过程中，线性梯度的条件也不容易操作，导致不适合工业化生产。
发明内容
为了克服这一技术难题，本发明通过改进纯化条件，对层析填料种类、载量、淋洗缓冲液、洗脱pH等进行考量和筛选，得到了合适的纯化工艺，使得融合蛋白中去除多聚体的效果较好，蛋白回收率较高，最终得到了纯度高、稳定性好的融合蛋白，有利于提高产品的质量控制水平、药物稳定性。
本发明涉及一种纯化融合蛋白的方法，所述融合蛋白的第一重链氨基酸序列选自SEQ ID NO:1，对应轻链的氨基酸序列选自SEQ ID NO:3，第二重链氨基酸序列选自SEQ IDNO:2，所述方法包括以下步骤：步骤(1)，处理层析填料，上样；步骤(2)，使用淋洗缓冲液淋洗；步骤(3)使用洗脱缓冲液洗脱并收集融合蛋白。
在一个实施方案中，所述步骤(1)中层析填料为AT Protein A Diamond。
在一个实施方案中，所述步骤(1)上样载量在20mg/mL填料以内，优选在15mg/mL填料以内。
在一个实施方案中，所述步骤(2)中淋洗缓冲液包含第一淋洗缓冲液和第二淋洗缓冲液。
在一个实施方案中，所述第一淋洗缓冲液为15-25mM NaAc-HAc，450-550mM NaCl，pH为5.8-6.2。
在一个实施方案中，所述第二淋洗缓冲液为40-60mM NaAc-HAc，pH为4.7-5.3。
在一个实施方案中，所述步骤(3)中洗脱缓冲液为40-60mM NaAc-HAc，pH为3.4-3.8，优选pH为3.65-3.75。
在一个实施方案中，所述步骤(1)包括用2-4倍柱体积平衡缓冲液以流速1.0-1.4mL/min冲洗平衡层析柱，用培养基上清液以流速1.0-1.4mL/min进行上样，其中所述平衡缓冲液为10-30mM PB，120-160mM NaCl，pH为7.2-7.6。
在一个实施方案中，所述步骤(2)包括用2-4倍柱体积平衡缓冲液以流速1.0-1.4mL/min冲洗，然后用2-4倍柱体积第一淋洗缓冲液以流速1.0-1.4mL/min冲洗，最后用2-4倍柱体积第二淋洗缓冲液以流速1.0-1.4mL/min冲洗，其中所述平衡缓冲液为10-30mMPB，120-160mM NaCl，pH为7.2-7.6，所述第一淋洗缓冲液为15-25mM NaAc-HAc，500-1000mMNaCl，pH为6.0-7.0，所述第二淋洗缓冲液为40-60mM NaAc-HAc，pH为4.7-5.3。
在一个实施方案中，所述步骤(3)使用等度洗脱法，优选包括用3-5倍柱体积的洗脱缓冲液以流速1.0-1.4mL/min洗脱。
具体实施方式
本发明未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1核苷酸序列的获得与优化
本发明融合蛋白的氨基酸序列如下：第一重链为SEQ ID NO:1，对应的轻链为SEQID NO:3，第二重链为SEQ ID NO:2。将上述各目标氨基酸序列转化为核苷酸序列，并设计得到分别编码上述抗体的重链基因和轻链基因，另外在重链和轻链的5’端分别设计上根据氨基酸序列优化而得的编码信号肽的核苷酸序列；此外，还对轻链和重链核苷酸序列的3’端分别加上终止密码子。最终获得优化后编码抗体的核苷酸序列如下：编码第一重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:4，编码第二重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:5，编码轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:6。
实施例2基因合成与表达载体的构建
采用pcDNA3.1-G418载体作为表达所述多功能抗体的轻链和重链的专用载体。pcDNA3.1-G418载体含有重链所使用的启动子CMV Promoter、真核筛选标记G418标签和原核筛选标签Ampicilline。基因合成分别得到抗体表达的第一重链、第二重链、轻链编码基因的核苷酸序列(即目的基因)，用HindIII和XhoI对载体和目的片段进行双酶切，回收后通过DNA连接酶进行酶连，并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑选出阳性克隆并进行质粒提取和酶切验证，获得含所述抗体第一重链、第二重链、轻链编码基因的重组质粒。
实施例3质粒抽提
根据《分子克隆实验指南》(2002年，科学出版社)所述方法，将含有上述各目的基因的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，将转化细菌涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上培养，挑选质粒克隆至液体LB培养基中培养，260rpm摇菌14h，由无内毒素质粒大抽试剂盒抽提质粒，用无菌水溶解并用核酸蛋白定量仪进行浓度测定。
实施例4质粒转染、瞬转表达与抗体纯化
在37℃、8％CO2、100rpm下培养ExpiCHO至细胞密度6×106个/mL。使用脂质体分别将构建的载体质粒按照质量浓度1:1:1转染到上述细胞中，转染质粒浓度为1mg/mL，脂质体浓度参照ExpiCHOTM Expression System试剂盒确定，在32℃、5％CO2，100rpm下培养7-10天。转染18-22h之后和第5天之间分别补料一次。将上述培养产物置于离心机中，以4000g转速离心，0.22μm滤膜过滤并收集培养基上清液，采用ProteinA、离子柱纯化所得的抗体蛋白并收集洗脱液。
ProteinA、离子柱纯化的具体操作步骤为：细胞培养液经过高速离心后取上清，利用GE的ProteinA层析柱进行亲和层析。层析使用平衡缓冲液为1×PBS(pH 7.4)，细胞上清上样结合后利用PBS洗涤至紫外线回到基线，然后利用洗脱缓冲液0.1M甘氨酸(pH 3.0)洗脱本发明融合蛋白，利用Tris调节pH至中性保存。将亲和层析所得产物调节pH至低于或者高于等电点pI 1-2个pH单位，适当稀释以控制样本电导在5ms/cm以下。利用合适的对应pH缓冲液如磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等条件，利用本领域内常规的离子交换层析方法如阴离子交换或者阳离子交换进行对应pH条件下NaCl梯度洗脱，根据SDS-PAGE选择本发明融合蛋白所在的收集管用于后续纯化实验。
实施例5载量测试
考察博格隆AT ProteinA Diamond在不同保留时间(5-6min)下的载量区别，确认合适的上样保留时间。
样品来源：实施例4中的蛋白样品
层析柱：Omnifit 6.6mm/330mm层析柱，填料：博格隆AT ProteinA Diamond，装柱体积：6.158mL
平衡缓冲液：20mM PB+140mM NaCl，pH7.4
淋洗缓冲液1：20mM PB+500mM NaCl，pH6.0
淋洗缓冲液2：50mM NaAc-HAc，pH5.0
洗脱缓冲液：25mM NaAc-HAc，pH3.5
再生缓冲液：0.1M NaOH
pH调节缓冲液：2M Tris
用平衡缓冲液平衡层析柱2倍柱体积，至基线平稳，流速1.5mL/min。用实施例4中的蛋白样品上样，上样体积125mL，上样时分管收集流穿液，每管收集1mL。上样完成后，用平衡缓冲液再平衡2倍柱体积，至基线平稳，流速1.5mL/min。用淋洗缓冲液1进行淋洗，淋洗2倍柱体积，流速1.5mL/min。用淋洗缓冲液2进行淋洗，淋洗2倍柱体积，流速1.5mL/min。用洗脱缓冲液进行洗脱，流速1.5mL/min，收集洗脱峰。用再生缓冲液进行清洗，清洗2倍柱体积，流速1mL/min。用pH调节缓冲液调节洗脱样品pH至5.5。第一次：上样保留时间5min，上样流速1.23mL/min。第二次：上样保留时间6min，上样流速1.02mL/min。检测收集的流穿液的浓度。结果如表1所示，并根据数据统计制图，如图1。
表1
从数据结果可以看出，当保留时间为5min(RT5)时，DBC5％＝21.00mg/mL填料；当保留时间为6min(RT6)时，DBC5％＝19.88mg/mL填料。因此，当保留时间5-6min时，动态结合载量接近20mg/mL填料，乘以0.8的保险系数，实际载量控制在15mg/mL填料以内比较合适。
实施例6淋洗缓冲液的优化
在亲和层析蛋白捕获后，用不同盐浓度和pH的淋洗液进行淋洗，以便选择一个适合本发明融合蛋白的淋洗条件。
样品来源：实施例4中的蛋白样品
层析柱：Omnifit 6.6mm/330mm层析柱，填料：博格隆耐碱ProteinA Diamond，装柱体积：6.158mL
平衡缓冲液：20mM PB+140mM NaCl，pH7.4
淋洗缓冲液1：20mM PB，500mM NaCl，pH6.0
淋洗缓冲液2：20mM PB，1M NaCl，pH6.0
淋洗缓冲液3：20mM PB，500mM NaCl，pH7.0
淋洗缓冲液4：20mM PB，1M NaCl，pH7.0
淋洗缓冲液5：50mM NaAc-HAc，pH5.0
洗脱缓冲液：50mM NaAc-HAc，pH3.5
再生缓冲液：0.1M NaOH
pH调节缓冲液：2M Tris
管路预先用平衡缓冲液润洗好。用平衡缓冲液平衡层析柱3倍柱体积，至基线平稳，流速1.2mL/min。将实施例4收集的蛋白样品上样，上样体积45mL，流速1.2mL/min。上样完成后，用平衡缓冲液再平衡2倍柱体积，至基线平稳，流速1.2mL/min。用淋洗缓冲液1、2、3或4进行淋洗，淋洗2倍柱体积，流速1.2mL/min。用淋洗缓冲液5进行淋洗，淋洗2倍柱体积，流速1.2mL/min。用洗脱缓冲液进行洗脱，流速1.2mL/min，收集洗脱峰。用再生缓冲液进行清洗，清洗2倍柱体积，流速0.5mL/min。不同淋洗缓冲液获得的SEC-HPLC结果如表2所示。
表2
| 淋洗缓冲液编号 | 淋洗条件 | SEC-HPLC纯度 |
| 淋洗缓冲液1 | 20mM PB，500mM NaCl，pH6.0 | 74.01％ |
| 淋洗缓冲液2 | 20mM PB，1M NaCl，pH6.0 | 73.22％ |
| 淋洗缓冲液3 | 20mM PB，500mM NaCl，pH7.0 | 72.69％ |
| 淋洗缓冲液4 | 20mM PB，1M NaCl，pH7.0 | 70.96％ |
从实验结果可以看出，在这四种实验条件下，最终的洗脱液样品的SEC纯度都比较高，均可以选择作为淋洗缓冲液的条件，其中，用淋洗缓冲液1(20mM PB，500mM NaCl，pH6.0)淋洗后，最终的洗脱液SEC纯度最高。
实施例7洗脱液pH的优化
通过不同pH值的洗脱液，来考察对本发明融合蛋白的洗脱的影响。
样品来源：实施例4中的蛋白样品
层析柱：Omnifit 6.6mm/330mm层析柱，填料：博格隆耐碱ProteinA Diamond，装柱体积：6.158mL
平衡缓冲液：20mM PB+140mM NaCl，pH7.4
淋洗缓冲液1：20mM PB+500mM NaCl，pH6.0
淋洗缓冲液2：50mM NaAc-HAc，pH5.0
洗脱缓冲液1：50mM NaAc-HAc，pH3.4
洗脱缓冲液2：50mM NaAc-HAc，pH3.5
洗脱缓冲液3：50mM NaAc-HAc，pH3.6
洗脱缓冲液4：50mM NaAc-HAc，pH3.7
洗脱缓冲液5：50mM NaAc-HAc，pH3.8
再生缓冲液：0.1M NaOH
pH调节缓冲液：2M Tris
管路预先用平衡缓冲液润洗好。用平衡缓冲液平衡层析柱2倍柱体积，至基线平稳，流速1.2mL/min。将实施例4收集的蛋白样品上样，上样体积45mL，流速1.2mL/min。上样完成后，用平衡缓冲液再平衡2倍柱体积，至基线平稳，流速1.2mL/min。用淋洗缓冲液1进行淋洗，淋洗2倍柱体积，流速1.2mL/min。用淋洗缓冲液2进行淋洗，淋洗2倍柱体积，流速1.2mL/min。用洗脱缓冲液1、2、3、4或5进行洗脱，流速1.2mL/min，收集洗脱峰。用再生缓冲液进行清洗，清洗3倍柱体积，流速2mL/min。不同pH洗脱缓冲液条件下的洗脱样品检测浓度、SEC-HPLC、HCP残留等结果如表3所示。
表3
从实验结果可以看出，当洗脱pH在3.4-3.7时，本发明融合蛋白回收率没有明显差别，可以达到70％以上，而洗脱pH为3.8时，本发明融合蛋白回收率偏低。当洗脱pH在3.7-3.8时，洗脱样品的SEC纯度较高。综上，洗脱pH的范围优选为3.65-3.75。
应当说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明的范围，凡在本发明的精神和原则之内所作出的任何修改、等同的替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种纯化融合蛋白的方法，其特征在于，所述融合蛋白的第一重链氨基酸序列选自SEQ ID NO:1，对应轻链的氨基酸序列选自SEQ ID NO:3，第二重链氨基酸序列选自SEQ IDNO:2，所述方法包括以下步骤：步骤(1)，处理层析填料，上样；步骤(2)，使用淋洗缓冲液淋洗；步骤(3)使用洗脱缓冲液洗脱并收集融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中层析填料为AT Protein ADiamond。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)上样载量在20mg/mL填料以内，优选在15mg/mL填料以内。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中淋洗缓冲液包含第一淋洗缓冲液和第二淋洗缓冲液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一淋洗缓冲液为15-25mM NaAc-HAc，500-1000mM NaCl，pH为6.0-7.0。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二淋洗缓冲液为40-60mM NaAc-HAc，pH为4.7-5.3。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中洗脱缓冲液为40-60mMNaAc-HAc，pH为3.4-3.8，优选pH为3.65-3.75。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括用2-4倍柱体积平衡缓冲液以流速1.0-1.4mL/min冲洗平衡层析柱，用培养基上清液以流速1.0-1.4mL/min进行上样，其中所述平衡缓冲液为10-30mM PB，120-160mM NaCl，pH为7.2-7.6。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)包括用2-4倍柱体积平衡缓冲液以流速1.0-1.4mL/min冲洗，然后用2-4倍柱体积第一淋洗缓冲液以流速1.0-1.4mL/min冲洗，最后用2-4倍柱体积第二淋洗缓冲液以流速1.0-1.4mL/min冲洗，其中所述平衡缓冲液为10-30mM PB，120-160mM NaCl，pH为7.2-7.6，所述第一淋洗缓冲液为15-25mMNaAc-HAc，500-1000mM NaCl，pH为6.0-7.0，所述第二淋洗缓冲液为40-60mM NaAc-HAc，pH为4.7-5.3。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)使用等度洗脱法，优选包括用3-5倍柱体积的洗脱缓冲液以流速1.0-1.4mL/min洗脱。
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