CN116063564A - 一种纯化融合蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种纯化融合蛋白的方法。本发明通过改进纯化条件,对上样pH和载量等进行考量和筛选,工艺过程中去除多聚体的效果较好,最终得到了纯度高、稳定性好的融合蛋白,有利于提高产品的质量控制水平及药物稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种有效提纯融合蛋白,减少多聚体杂质的纯化工艺。
背景技术
融合蛋白是包括一种、两种或更多种源自不同天然存在的蛋白质或者工程化改造后的蛋白质的多肽被人为地组合以形成一种蛋白质的蛋白质,包括但不限于以下例举的形式:1、对于一条多肽链组成的融合蛋白,其由相同或不同的多肽彼此融合,以形成包含所述不同的多肽的一条多肽链;2、对于两条或以上多肽链组成的融合蛋白,其中任选的一条或多条多肽链由相同或不同的多肽彼此融合,以形成包含所述相同或不同的多肽的多肽链,这些多肽链以共价或非共价的形式彼此组合形成蛋白。
多聚体是指以二聚体或多聚体形式存在的聚集体。多聚体主要在细胞培养、蛋白纯化、制剂处方和药物储存的工艺过程中由于受培养工艺、纯化条件以及制剂存储过程中某些因素的影响,从而导致蛋白质部分分解折叠或者错误折叠,暴露的相关区域相互作用引发聚集,形成多聚体。
多聚体不仅可能会使得药物活性降低甚至失去生物活性,从而影响药效,更有可能使得受体发生过敏性免疫原反应,从而影响了受体的健康。因此,多聚体是抗体蛋白类药物在制备过程中需要监控和去除的杂质,药物中的多聚体含量被认为是产品的一个重要的质量指标。
在融合蛋白药物生产的过程中,虽然可以通过改变操作条件来控制多聚体的产生,但没有办法达到产品中完全没有多聚体的控制效果,所以有效的多聚体的去除手段对于多聚体的控制就显得至关重要。
目前融合蛋白类药物去除多聚体的纯化工艺,主要包括凝胶过滤层析、亲和层析、离子层析和疏水层析,其中阴离子层析是常用的的纯化方法。然而,通用的层析方法往往多聚体去除不彻底,药品质量不稳定,给药品安全造成一定的影响。
发明内容
为了克服这一技术难题,本发明通过改进纯化条件,对上样pH、保留时间和载量等进行考量和筛选,得到了合适的纯化工艺。在本工艺中,一定的载量条件下,能使层析得到的产品多聚体含量低到检测不到的水平,最终得到了纯度高、稳定性好的融合蛋白,有利于提高产品的质量控制水平、药物稳定性。
本发明提供一种纯化融合蛋白的方法,所述融合蛋白的第一重链氨基酸序列选自SEQ ID NO:1,对应轻链的氨基酸序列选自SEQ ID NO:3,第二重链氨基酸序列选自SEQ IDNO:2,所述方法包括以下步骤:步骤(1),处理层析填料,所述层析填料为博格隆Diamond Q;步骤(2),上样;步骤(3),使用平衡缓冲液再平衡,并收集融合蛋白。
在一个实施方案中,所述步骤(1)包括用2-8倍柱体积平衡缓冲液以流速1.5-2.5mL/min平衡层析柱,所述平衡缓冲液为10-30mM PB,20-40mM NaCl,pH为6.8-7.2。
在一个实施方案中,所述步骤(2)中上样载量在40mg/mL填料以内。在一个实施方案中,所述步骤(2)中上样载量在35mg/mL填料以内。在一个实施方案中,所述步骤(2)中上样载量在20-30mg/mL填料的范围内。
在一个实施方案中,所述步骤(2)中上样pH为6.5-7.5。在一个实施方案中,所述步骤(2)中上样pH为6.8-7.2。
在一个实施方案中,所述步骤(2)中上样电导为1-8mS/cm。在一个实施方案中,所述步骤(2)中上样电导为2-6mS/cm。
在一个实施方案中,所述步骤(3)包括用2-8倍柱体积平衡缓冲液以流速1.0-1.5mL/min再平衡,所述平衡缓冲液为10-30mM PB,pH为6.8-7.2。
具体实施方式
本发明未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1核苷酸序列
将目标氨基酸序列转化为核苷酸序列,获得核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1(第一重链)、SEQ ID NO:2((IL10)2-Fc)(第二重链)、SEQ ID NO:3(轻链)。
实施例2基因合成与表达载体的构建
分别采用pcDNA3.4-G418和pcDNA3.1-G418载体作为表达所述融合蛋白的轻链和重链的专用载体。pcDNA3.4-G418含有轻链所使用的启动子CMVPromoter、真核筛选标记G418标签和原核筛选标签Ampicilline。pcDNA3.1-G418载体含有重链所使用的启动子CMVPromoter、真核筛选标记G418标签和原核筛选标签Ampicilline。基因合成得到表达轻链和重链的核苷酸序列,用HindIII和XhoI对载体和目的片段进行双酶切,回收后通过DNA连接酶进行酶连,并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,挑选出阳性克隆并进行质粒提取和酶切验证,获得含所述第一重链、第二重链、轻链重组质粒,分别为pcDNA3.1-G418-1、pcDNA3.1-G418-2和pcDNA3.4-G418-3。
实施例3质粒抽提
根据《分子克隆实验指南》(2002年,科学出版社)所述方法将含有上述各目的基因的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中,将转化细菌涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上培养,挑选质粒克隆至液体LB培养基中培养,260rpm摇菌14小时,由无内毒素质粒大抽试剂盒抽提质粒,用无菌水溶解并用核酸蛋白定量仪进行浓度测定。
实施例4质粒转染、瞬转表达与纯化
在37℃、8%CO2、100rpm下培养ExpiCHO至细胞密度6×106cells/mL。使用脂质体分别将构建的载体PCDNA3.1-G418-6-1、PCDNA3.1-G418-6-2、PCDNA3.4-G418-6-3转染到上述细胞中,转染质粒浓度为1μg/mL,脂质体浓度参照ExpiCHOTM Expression System试剂盒确定,在32℃、5%CO2,100rpm下培养7-10天。转染18-22h之后和5-8天之间分别补料一次。4000rpm离心上述培养产物,0.22μm滤膜过滤并收集培养基上清液。
实施例5上样pH优化
分别检测博格隆Diamond Q填料在保留时间5min,样品pH分别为5.5和7.0时相同载量条件下的宿主细胞蛋白(HCP)去除情况,研究确认最合适的上样pH。
层析条件:
样品来源:实施例4中的培养基上清液
层析柱及填料:Omnifit 6.6mm/330mm层析柱,填料:Diamond Q,装柱体积:6.16mL
平衡缓冲液:20mM PB,30mM NaCl,pH7.0
再生缓冲液:0.1M NaOH
样品调pH至7.0,用注水稀释至电导2-6mS/cm。纯化仪开机预热,将层析柱连接至柱位阀。管路预先用平衡缓冲液润洗。用平衡缓冲液平衡层析柱5倍柱体积,至基线平稳,流速2mL/min。上样,在载量达到50mg/mL,70mg/mL,90mg/mL,110mg/mL时收集穿透峰。用平衡缓冲液再平衡2倍柱体积,流速1.2mL/min,至基线平稳。用再生缓冲液进行清洗,清洗3倍柱体积,流速1.2mL/min。
使用平衡缓冲液(50mM NaAc-HAc,30mM NaCl,pH5.5)重复上述实验,步骤同上,区别在于样品调pH至5.5。
所有样品检测HCP残留,结果如表1所示。
表1
从表1结果可以看出,样品pH 7.0时的HCP残留量明显低于样品pH 5.5时的HCP残留量。因此,阴离子交换层析上样pH控制在7.0左右比较合适。
实施例6载量测试
考察博格隆博格隆Diamond Q填料在保留时间5min,样品pH 7.0时不同载量条件下的聚体去除情况,以便选择最合适的上样载量。
样品来源:实施例4中的培养基上清液
层析柱:Omnifit 6.6mm/330mm层析柱,填料:Diamond Q,装柱体积:6.5mL
平衡缓冲液:20mM PB,30mM NaCl,pH7.0
再生缓冲液:0.1M NaOH
样品调节pH至7.0,用注水稀释至电导2-6mS/cm。纯化仪开机预热,将层析柱连接至柱位阀。管路预先用平衡缓冲液润洗。用平衡缓冲液平衡层析柱3倍柱体积,至基线平稳,流速2mL/min。上样,在载量达到20mg/mL,30mg/mL,40mg/mL,50mg/mL,60mg/mL,70mg/mL时收集穿透峰。用平衡缓冲液再平衡2倍柱体积,流速1.2mL/min,至基线平稳。用再生缓冲液进行清洗,清洗2倍柱体积,流速1.2mL/min。
所有样品检测SEC-HPLC,结果如表2所示。
表2
填料载量(mg/mL) | SEC-HPLC HMW(%) | SEC-HPLC纯度(%) |
20 | 未检出 | 84.72 |
30 | 未检出 | 86.15 |
40 | 8.20 | 78.14 |
50 | 13.80 | 74.30 |
60 | 14.65 | 73.09 |
70 | 14.67 | 72.64 |
从表2结果可以看出,载量20-30mg/mL填料的聚体含量均未检出,随着载量的不断增加,开始流穿出现聚体。因此,阴离子交换层析的载量控制在40mg/mL填料以内比较合理。
应当说明的是,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用于限制本发明的范围,凡在本发明的精神和原则之内所作出的任何修改、等同的替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种纯化融合蛋白的方法,其特征在于,所述融合蛋白的第一重链氨基酸序列选自SEQ ID NO:1,对应轻链的氨基酸序列选自SEQ ID NO:3,第二重链氨基酸序列选自SEQ IDNO:2,所述方法包括以下步骤:步骤(1),处理层析填料,所述层析填料为博格隆Diamond Q;步骤(2),上样;步骤(3),使用平衡缓冲液再平衡,并收集融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)包括用2-8倍柱体积平衡缓冲液以流速1.5-2.5mL/min平衡层析柱,所述平衡缓冲液为10-30mM PB,20-40mMmM NaCl,pH为6.8-7.2。
3.根据权利要求1任一项所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中上样载量在40mg/mL填料以内。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中上样载量在35mg/mL填料以内。
5.根据权利要求3-4任一项所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中上样载量在20-30mg/mL填料的范围内。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中上样pH为6.5-7.5。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中上样pH为6.8-7.2。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中上样电导为1-8mS/cm。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中上样电导为2-6mS/cm。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)包括用2-8倍柱体积平衡缓冲液以流速1.0-1.5mL/min再平衡,所述平衡缓冲液为10-30mM PB,pH为6.8-7.2。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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