CN111094356A - 一种蛋白质异二聚体及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了蛋白质异二聚体、包含所述异二聚体的药物组合物、药物和/或试剂盒、产生所述蛋白质异二聚体的方法和其用途。

Description

一种蛋白质异二聚体及其用途
背景技术
尽管可以检测针对肿瘤抗原的免疫反应(Disis等人(1997)J.Clin.Oncol.15:3363-3367)，但导致疾病的恶性细胞通常不能引发引起排斥的免疫反应。研究证实，可以通过向肿瘤细胞引入免疫调节分子(例如细胞因子和共刺激分子)来增强肿瘤细胞的免疫原性。然而，引入的免疫调节分子的表达和稳定性通常不尽如人意。由免疫系统细胞产生的免疫调节因子(例如细胞因子)能够直接或间接地活化具有适应性免疫反应的细胞并且能够在引起保护性抗肿瘤免疫中发挥重要作用。先天免疫系统可以由引起释放促炎性细胞因子(例如IFN-α、TNF-α和白介素)的细菌产物或“危险”信号触发。
多个研究已显示，免疫调节因子(例如白介素)可能适用于对动物模型和癌症患者发挥抗肿瘤作用。然而，白介素在体内具有相对较短的血清半衰期。例如，如通过体外生物检定或通过感染性休克模型系统中的功效所测量(参见Smith等人的Cellular Immunology173:207-214(1996))，IL10在小鼠中的半衰期为约2小时到6小时。白介素活性丧失可能因若干因素所致，包含肾清除率、蛋白质水解性降解和血流中的单体化。
因此，十分需要可以按工业规模以相对较高产率进行生产并且在体内具有相对较长半衰期以适用于治疗与细胞和/或组织的过度增殖相关的病症或疾病(例如，各种赘生物、不同类型的癌症和/或肿瘤)的长效免疫调节剂。另外，此类产品的产率应足够高，以避免复杂的纯化工艺和/或降低与不期望的杂质相关的风险。
发明内容
本申请解决这类需求同时提供相关优势。本申请涵盖适用于抑制肿瘤生长的蛋白质异二聚体，以及包括所述蛋白质异二聚体的组合物、药物和/或试剂盒。另外，本申请提供蛋白质混合物，包括所述蛋白质异二聚体并具有极少(如果有)不期望的杂质(例如不期望的蛋白质同二聚体或蛋白质聚集体)。本申请还提供产生蛋白质异二聚体或蛋白质混合物的方法，以及蛋白质异二聚体和/或蛋白质混合物在抑制肿瘤生长(包含但不限于治疗癌症)中的药学用途。
一方面，本申请提供一种蛋白质异二聚体，包括第一单体成员和不同于所述第一单体成员的第二单体成员，其中第一单体成员包括第一Fc亚基，第二单体成员包括第二Fc亚基，通过第一Fc亚基与第二Fc亚基的复合，第一单体成员与第二单体成员缔合形成异二聚体；其中蛋白质异二聚体进一步包括一个或多个与第一Fc亚基和/或第二Fc亚基融合的白介素；其中蛋白质异二聚体不包括展现对肿瘤抗原的结合特异性的任何抗体重链可变区或任何抗体轻链可变区。
在某些实施方式中，本申请所述的蛋白质异二聚体，其中一个或多个白介素与第一Fc亚基和/或第二Fc亚基的氨基端氨基酸和/或羧基端氨基酸融合。
在某些实施方式中，本申请所述的蛋白质异二聚体，包括两个或多个白介素，并且其中两个或多个白介素形成一个或多个白介素二聚体，每一个白介素二聚体包括彼此融合的两个白介素。
在某些实施方式中，本申请中任一项的蛋白质异二聚体，其中所述一个或多个白介素中的至少一个为IL10。
在某些实施方式中，本申请中任一项的蛋白质异二聚体，其中所述一个或多个白介素二聚体包括至少一个IL10二聚体，所述IL10二聚体包括两个IL10。
在某些实施方式中，本申请中任一项的蛋白质异二聚体，其中第一Fc亚基和/或所述第二Fc亚基来自IgG分子。在某些实施方式中，本申请的蛋白质异二聚体，其中所述IgG为人类IgG1。
在某些实施方式中，本申请中任一项的蛋白质异二聚体，其中第一Fc亚基不同于第二Fc亚基，第一和/或第二Fc亚基包括促进第一Fc亚基与第二Fc亚基之间的异二聚化的修饰。
在某些实施方式中，本申请所述的蛋白质异二聚体，其中第一Fc亚基包括第一修饰，第二Fc亚基包括第二修饰，第一修饰和第二修饰包括在选自以下任何组的位置处的氨基酸取代：1)第一修饰：Y349和T366；第二修饰：D356、T366、L368、Y407和F405；2)第一修饰：Y349、T366和F405；第二修饰：D356、T366、L368和Y407；3)第一修饰：Y349、T366和K409；第二修饰：D356、T366、L368、Y407和F405；4)第一修饰：Y349、T366、F405、K360和Q347；第二修饰：D356、T366、L368、Y407和Q347；5)第一修饰：Y349、T366、F405和Q347；第二修饰：D356、T366、L368、Y407、K360和Q347；6)第一修饰：Y349、T366、K409、K360和Q347；第二修饰：D356、T366、L368、Y407、F405和Q347；7)第一修饰：Y349、T366、K409和Q347；第二修饰：D356、T366、L368、Y407、F405、K360和Q347；8)第一修饰：T366、K409和K392；第二修饰：T366、L368、Y407、D399和F405；9)第一修饰：T366和K409；第二修饰：T366、L368、Y407和F405；10)第一修饰：T366、K409和Y349；第二修饰：T366、L368、Y407、F405和E357；11)第一修饰：T366、K409、Y349和S354；第二修饰：T366、L368、Y407、F405和E357；12)第一修饰：T366和F405；第二修饰：T366、L368、Y407和K409；13)第一修饰：T366、F405和D399；第二修饰：T366、L368、Y407、K409和K392；14)第一修饰：T366、F405和Y349；第二修饰：T366、L368、Y407、K409和E357；15)第一修饰：T366、F405、Y349和S354；第二修饰：T366、L368、Y407、K409和E357；其中氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
在某些实施方式中，本申请中任一项的蛋白质异二聚体，其中所述一个或多个白介素中的至少一个与第二Fc亚基的氨基端氨基酸融合。
在某些实施方式中，本申请所述的蛋白质异二聚体，其中在第二单体成员中，所述一个或多个白介素中的至少两个彼此融合以形成白介素二聚体，所述白介素二聚体进一步与第二Fc亚基的氨基端氨基酸融合。
在某些实施方式中，本申请所述中任一项的蛋白质异二聚体，其中在第二单体成员中，所述一个或多个白介素中的至少两个彼此融合以形成白介素二聚体，所述白介素二聚体进一步与第二Fc亚基的羧基端氨基酸融合。
在某些实施方式中，本申请中任一项的蛋白质异二聚体，其中第一单体成员不包括任何白介素。
在某些实施方式中，本申请中任一项的蛋白质异二聚体，其中第一单体成员由第一Fc亚基组成。
在某些实施方式中，本申请中任一项的蛋白质异二聚体，其中所述一个或多个白介素中的至少一个与第一Fc亚基的氨基端氨基酸融合。
在某些实施方式中，本申请所述的蛋白质异二聚体，其中在第一单体成员中，所述一个或多个白介素中的至少两个彼此融合以形成白介素二聚体，所述白介素二聚体进一步与第一Fc亚基的氨基端氨基酸融合。
在某些实施方式中，本申请中任一项的蛋白质异二聚体，其中第二单体成员不包括任何白介素。
在某些实施方式中，本申请中任一项的蛋白质异二聚体，其中第二单体成员由第二Fc亚基组成。
另一方面，本申请提供一种或多种分离的核酸，其编码本申请中所述的任一项蛋白质异二聚体。
另一方面，本申请提供一种或多种载体，其包含本申请所述的一种或多种分离的核酸。
另一方面，本申请提供一种分离的宿主细胞，其包含本申请所述的一种或多种分离的核酸或本申请所述的一种或多种载体。
另一方面，本申请提供一种蛋白质混合物，包括：1)本申请中所述的任一蛋白质异二聚体；2)由本申请中所述的任一第一单体成员的两个相同拷贝形成的第一同二聚体；以及3)由本申请中所述的任一第二单体成员的两个相同拷贝形成的第二同二聚体；其中所述蛋白质异二聚体在蛋白质混合物中的百分比为至少50％。
另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包括本申请中所述的任一蛋白质异二聚体或本申请中所述的蛋白质混合物以及可选可选的药学上可接受的赋形剂。
另一方面，本申请提供一种本申请中所述的任一蛋白质异二聚体或本申请所述的蛋白质混合物的用途，其用于制造用于抑制肿瘤或肿瘤细胞生长和/或用于治疗有需要的个体的癌症的药物和/或试剂盒。
另一方面，本申请提供一种产生本申请中所述的任一蛋白质异二聚体的方法，包括(i)在实现蛋白质异二聚体的表达的条件下培养本申请的宿主细胞，以及(ii)收集已表达的蛋白质异二聚体或包括所述蛋白质异二聚体的蛋白质混合物。
根据以下具体实施方式，本领域的技术人员将显而易知本申请的额外方面和优势，在具体实施方式中仅示出和描述本申请的说明性实施例。将认识到，本申请能够具有其它不同实施例，其若干细节可以在各种明显的方面进行修改，但均不脱离本申请。因此，附图和说明书在本质上均被视为是说明性的而不是限制性的。
以引用的方式并入
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在本文中以引用的方式并入，其程度如同各个单独的出版物、专利或专利申请被具体地并且分别地指出以引用的方式并入一样。
附图说明
本申请的新颖特征在所附权利要求书中详细阐述。通过参考使用本申请原理的说明性实施例的以下具体实施方式以及其附图，将更好地理解本申请的特征和优势：
图1A至图1D示出本申请的蛋白质异二聚体的实例；
图2A至图2F示出本申请的蛋白质异二聚体的如SDS-PAGE和SEC-HPLC分析所示的纯化结果；
图3示出与人类IL10R1蛋白的结合亲和力(ELISA)；
图4示出MC/9细胞的增殖的增强；
图5A至图5B示出本申请的蛋白质异二聚体的肿瘤控制作用；
图6A至图6B示出高浓度和低浓度的蛋白质异二聚体在肿瘤控制方面的比较。
具体实施方式
在描述本申请的实施例之前，应理解这些实施例仅以举例的方式提供，本文中描述的本申请实施例的各种替代方案可以用于实践本申请。本领域的技术人员将想到不脱离本申请的众多变化形式、改变和替换。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。虽然与本文中所描述的方法和材料类似或等效的方法和材料可以用于实践或测试本申请，但下文描述了合适的方法和材料。以防冲突，将以本专利说明书(包含定义)为准。另外，材料、方法和实例仅为说明性的且没有限制性的意图。本领域的技术人员将想到不脱离本申请的众多变化形式、改变和替换。
除非上下文另有清晰指示，否则本文所使用的单数形式“一”和“所述”通常包括复数指代物。
本文所使用的术语“蛋白质的(proteinaceous)”通常是指具有多肽或蛋白质性质、与多肽或蛋白质有关、类似于多肽或蛋白质或是多肽或蛋白质的材料或分子。例如，本申请的蛋白质异二聚体可以是异二聚体蛋白或包括两个或多个多肽的异二聚体。
本文所使用的术语“异二聚体”通常是指由两个不同成员构成的分子(例如，蛋白质分子)。异二聚体的两个成员可能在结构、功能、活性和/或组成方面不同。例如，两个不同成员可以包括在形成多肽的氨基酸残基的顺序、数目或种类方面不同的多肽。异二聚体的两个不同成员中的每一个可以单独包括一个、两个或多个单位、多肽链或部分。
本文所使用的术语“靶向部分(targeting moiety)”通常是指特异性地、选择性地或优先地结合于靶分子、靶细胞、靶粒子、靶组织或靶聚集体的分子、复合体或聚集体。例如，靶向部分可以是抗体、抗原结合抗体片段、双特异性抗体或其它基于抗体的分子或化合物。靶向部分的其它实例可以包含但不限于适体(aptamer)、高亲和性多聚体(avimer)、受体结合配体、核酸、生物素-亲和素结合对(biotin-avidin binding pair)、结合肽或结合蛋白等。术语“靶向部分”与“结合部分”在本文中可以互换使用。
本文所使用的术语“肿瘤抗原”通常是指肿瘤细胞中产生或由肿瘤细胞产生的抗原物质，其可能具有触发宿主的免疫反应的能力。例如，肿瘤抗原可以是蛋白质、多肽、肽，或它们的片段，其构成肿瘤细胞的部分并且能够诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞。肿瘤抗原肽可以是由于肿瘤细胞中的肿瘤抗原降解而产生的肽，且可以在通过与HLA分子结合而表达于细胞表面上时诱导或激活肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞。在某些实施方式中，术语“肿瘤抗原”可能还指排他地或优先地或差异性地表达于癌细胞上和/或发现与癌细胞缔合并从而提供对于癌症具有优先性或特异性的靶标的生物分子(例如蛋白质、碳水化合物、糖蛋白等)。例如，优先表达可以是与生物体中的任何其它细胞相比的优先表达，或者生物体的特定区域内(例如特定器官或组织内)的优先表达。
术语“肿瘤抗原表位”和“肿瘤抗原决定子”在本文中可互换使用，且通常是指肿瘤抗原中存在的诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的氨基酸序列的位点。
本文在蛋白质异二聚体的上下文中使用的术语“表达量(expression yield)”通常是指在表达时(例如由宿主细胞表达时)以功能形式产生的蛋白质异二聚体的量。
本文所使用的术语“二聚化序列”通常是指能够形成二聚体或进行二聚化的氨基酸序列。在某些实施方式中，二聚体是由两个不同成员形成的异二聚体。在一些情况下，异二聚体的两个不同成员可以包括不同的二聚化序列。
本文所使用的术语“异二聚化(heterodimerization)”通常是指在两个不同成员之间形成或不形成共价键的情况下，例如通过复合、缔合或聚集在两个不同成员(例如两个不同多肽)之间形成异二聚体的过程。
本文所使用的术语“共价键”通常是指通过共用电子在原子之间形成的化学键。例如，共价键可以是极性或非极性的。在某些实施方式中，共价键为二硫键。
本文所使用的术语“非共价成对亲和力”通常是指能够通过非共价相互作用(例如，通过离子对、氢键、偶极间相互作用、电荷转移相互作用、π-π相互作用、阳离子-π-电子相互作用、范德华相互作用以及分散相互作用、疏水性(亲脂性)相互作用、复合物形成(例如过度金属阳离子的复合物形成)或这些相互作用的组合)彼此结合的二聚化序列或异二聚化序列。
本文所使用的术语“连接子(linker)”通常是指连接或关连两个多肽序列(例如连接两个多肽域)的合成氨基酸序列。连接子可以通过肽键关连两个氨基酸序列。在某些实施方式中，本申请的连接子将生物活性部分连接到直链序列中的第二部分。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指代任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直链的或支链的，其可以包括经修饰氨基酸，且可能被非氨基酸打断。所述术语还涵盖例如通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它处理(例如与标记组分偶联)进行修饰的氨基酸聚合物。所述术语可以应用于其中的一个或多个氨基酸残基为对应天然存在氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物以及应用于天然存在的氨基酸聚合物。所述术语还可以包含接合氨基酸组成多肽的传统肽键的变异体。例如，“肽”、“多肽”和“蛋白质”可以是其α碳是通过肽键键联的氨基酸链。因此，所述链的一端(氨基端)处的末端氨基酸可以具有游离氨基，而所述链的另一端(羧基端)处的末端氨基酸可以具有游离羧基。如本文所使用，术语“氨基端”(缩写为N端)通常是指肽的氨基端处的氨基酸上的游离α氨基或指代肽内的任何其它位置处的氨基酸的α氨基(参与肽键的氨基)。类似地，术语“羧基端”通常指代肽的羧基端上的游离羧基或肽内的任何其它位置处的氨基酸的羧基。肽还可以包含基本上任何聚氨基酸，包含但不限于肽模拟物，例如由醚而不是酰胺键接合的氨基酸。
本文所使用的术语“氨基酸”通常是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包含但不限于D或L光学异构体或这两者、氨基酸类似物以及肽模拟物。将标准的单字母或三字母代码用于命名氨基酸。
本文所使用的术语“天然L氨基酸”通常指代甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、蛋氨酸(M)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的L光学异构体形式。
本文所使用的术语“非天然存在的”通常是指不与野生型或天然存在序列(例如，在个体中发现的那些序列)类似、不与其互补或与其不具有高度同源性的多肽或多核苷酸序列。例如，在适合比对时，非天然存在的多肽或片段可以与天然序列共有低于99％、98％、95％、90％、80％、70％、60％、50％或更低的氨基酸序列一致性。或者，在适合比对时，非天然存在的多肽或片段可以与天然序列共有高于99％、98％、95％、90％、80％、70％、60％、50％或更高的氨基酸序列一致性。
本文所使用的术语“亲水性”和“疏水性”通常是指物质与水的亲和程度。亲水性物质对水具有较强亲和力，倾向于溶解于水中、与水混合或被水润湿，而疏水性物质对水基本上缺乏亲和力，倾向于排斥水并且不吸收水，且不倾向于溶解于水中或与水混合或被水润湿。氨基酸可能基于其疏水性而进行表征。已制定一些衡量标志。例如由Levitt,M等人在JMol Biol(1976)104:59中制定的衡量标志，其列举在Hopp,TP等人的Proc Natl Acad SciU S A(1981)78:3824中。“亲水性氨基酸”的实例为精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。尤其关注的是亲水性氨基酸天冬氨酸盐、谷氨酸盐以及丝氨酸和甘氨酸。“疏水性氨基酸”的实例为色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。
在蛋白质分子(例如多肽或蛋白质)的上下文中使用的术语“片段”通常是指天然生物活性蛋白的截短形式，其可能保留或可能未保留具有治疗活性和/或生物活性的部分。
在蛋白质分子(例如多肽或蛋白质)的上下文中使用的术语“变体”通常是指与天然生物活性蛋白具有序列同源性的蛋白质分子，其至少保留生物活性蛋白的具有治疗活性和/或生物活性的部分。例如，变体蛋白可以与参考生物活性蛋白共有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性。在某些实施方式中，“变体”可以包含例如通过定点诱变、编码基因合成、插入而有意地修饰或通过突变随机地修饰的蛋白质。
术语“偶联(conjugated)”、“连接(linked)”和“融合(fused/fusion)”在本文中可互换使用，且通常指代两种或多种化学元件、序列或成分例如通过包含化学偶联或重组方式的方式接合在一起。例如，启动子或增强子在实现编码序列的转录时可操作地连接到所述编码序列。通常，“可操作地连接”意指连接的DNA序列是连续的并处于阅读相或框架内。“框内融合”是指两个或多个开放阅读框(ORF)按维持原始ORF的正确阅读框的方式接合以形成相连较长ORF。因此，所得的“融合多肽”是含有对应于由原始ORF编码的多肽的两个或多个片段(这些片段在自然界中一般不会如此接合)的单一蛋白质。“融合位点”是指两个或多个片段接合在一起处的序列。在一些情况下，融合位点可以是与所述两个或多个接合的片段中的序列一致的序列。在一些情况下，融合位点可以进一步包括与所述两个或多个接合的片段中任意一个的序列均不一致的空段。
在多肽的上下文中，“直链序列”或“序列”为多肽中的氨基酸在氨基端到羧基端方向上的顺序，其中所述序列中紧挨彼此的残基在所述多肽的一级结构中是连续的。“部分序列”为形成多肽的部分的已知在一个或两个方向上包括额外残基的的直链序列。
术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用，且其通常是指具有任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行任何已知或未知功能。以下为多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、根据连接分析定义的基因位(基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、具有任何序列的分离DNA、具有任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可以在聚合物组装之前或之后给予。核苷酸的序列可能由非核苷酸组分打断。多核苷酸可以在聚合后例如通过与标记组分偶联而进一步被修饰。
术语“基因”和“基因片段”在本文中可互换使用且通常是指含有至少一个能够在转录和转译后编码特定蛋白质的开放阅读框的多核苷酸。基因或基因片段可以是基因组或cDNA，只要所述多核苷酸含有至少一个可以覆盖整个编码区或其区段的开放阅读框。“融合基因”为由至少两个不同的多核苷酸连接在一起构成的基因。
本文所使用的术语“抗体”通常是指包括一种或多种实质上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的多肽的蛋白质。免疫球蛋白基因可以包含κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及无数免疫球蛋白可变区基因。如本文所使用，轻链可以分类为κ轻链或λ轻链。重链可以分类为γ、μ、α、δ或ε重链，其进而分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。本申请中使用的抗体可以具有包括四聚体的结构单位。每一个四聚体可以由两个相同的多肽链对构成，每一对具有一个“轻”链(约25KD)和一个“重”链(约50至70KD)。每一条链的N端可以定义具有主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。本文所使用的术语“轻链可变区”(VL)和“重链可变区”(VH)通常分别是指轻链和重链的所述区。抗体可能以完整免疫球蛋白形式或以通过由各种肽酶消化产生或重新表达的许多充分表征的片段形式存在。因此，例如，胃蛋白酶可以在铰链区中的二硫键下消化抗体以产生F(ab)’2(Fab的二聚体，Fab本身为通过二硫键轻链接合到VH-CH1)。F(ab)’2可以在温和条件下还原以打破铰链区中的二硫键，从而将F(ab')2二聚体转化成Fab’单体。Fab’单体实质上为具有铰链区的部分的Fab(关于其它抗体片段的更详细描述，参见Fundamental Immunology,W.E.Paul,编,Raven Press,N.Y.(1993))。虽然依据完整抗体的消化而定义了各种抗体片段，但本领域的普通技术人员将了解，这些Fab’片段可以以化学方式或通过利用重组DNA方法重新合成。因此，本文所使用的术语抗体还可以包含通过修饰完整抗体产生的或使用重组DNA方法重新合成的抗体片段，包含但不限于Fab’2、IgG、IgM、IgA、IgE、scFv、dAb、纳米抗体(nanobody)、单抗体(unibody)和双抗体(diabody)。在某些实施方式中，所述抗体包含但不限于Fab’2、IgG、IgM、IgA、IgE以及单链抗体，例如可变重链与可变轻链(直接地或通过肽连接子)接合在一起以形成相连多肽的单链Fv(scFv)抗体。
本文所使用的术语“抗原结合位点”或“结合部分”通常是指参与抗原结合的抗体部分。抗原结合位点可以由重(“H”)链和/或轻(“L”)链的N端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区内的三个高度不同的段被称为“高变区”，其插入称为“框架区”或“FR”的多个保守侧接段之间。因此，本文所使用的术语“FR”通常是指天然地在免疫球蛋白中的高变区之间和附近发现的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此设置以形成抗原结合“表面”。这个表面可以介导靶抗原的识别和结合。重链和轻链中的三个高变区的每一个被称为“互补决定区”或“CDR”并且例如由Kabat等人，具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of proteins of immunologicalinterest)，第4版，美国卫生及公共服务部(U.S.Dept.Health and Human Services)，公共卫生服务(Public Health Services)，马里兰州贝塞斯达(Bethesda,Md.)(1987)表征。
本文所使用的术语“宿主细胞”通常包含个别细胞、细胞系或细胞培养物，其可以接受或已经接受主题质粒或载体，包含本申请的多核苷酸或表达本申请的蛋白质异二聚体(例如异二聚体蛋白)。宿主细胞可以包含单个宿主细胞的后代。后代可能因天然、偶然或有意突变所致而不一定与原始亲本细胞完全一致(在形态方面或在总DNA补足的基因组方面)。宿主细胞可以包含用本申请的载体体外转染的细胞。宿主细胞可以是细菌细胞(例如大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞，例如COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、COS-1细胞、NS0细胞或骨髓瘤细胞。在某些实施方式中，宿主细胞为哺乳动物细胞。在某些实施方式中，哺乳动物细胞为HEK293细胞。
本文所使用的术语“载体”通常是指能够在适当宿主内自我复制的核苷酸分子，将插入的核苷酸分子转移到宿主细胞中和/或在宿主细胞之间转移。所述术语可以包含主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的复制载体以及用于转录和/或转译DNA或RNA的表达载体。还包含提供一个以上上述功能的载体。“表达载体”是在引入到适当宿主细胞中时可以转录和翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常意味着包含可以用于产生期望的表达产物的表达载体的合适宿主细胞。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现预期应用(包含但不限于疾病治疗)的组合物(例如本文所描述的蛋白质异二聚体)的量。治疗有效量可以取决于预期应用(例如体外或体内)或正在治疗的个体和疾病状况(例如可以由本领域的普通技术人员容易地确定的个体的体重和年龄、疾病状况的严重程度、施用方式等)而变化。术语还可能适用于将诱导靶细胞中的特定反应(例如靶基因诱导、增殖和/或细胞凋亡)的剂量。具体剂量将取决于所选的特定化合物、依循的给药方案、是否与其它化合物结合施用、施用时间、所施用到的组织以及进行携带的实体递送系统而变化。
术语“治疗(treatment或treating)”或“减轻(palliating)”或“改善(ameliorating)”在本文中可互换使用，且是指获得有益或期望的结果(包含但不限于治疗效益和/或预防效益)的途径。如本文所使用，治疗效益通常是指根除正在治疗的潜在病症或降低其严重程度。而且，如下达到治疗效益：根除，降低与潜在病症相关的一个或多个生理症状的严重程度或降低其发生率，以使得尽管个体可能仍受到潜在病症的困扰，但在个体内观察到改善。为了预防效益，可以向处于患上特定疾病的风险下的个体或向报告疾病的一个或多个生理症状但可能尚未进行所述疾病的诊断的个体施用组合物。
本文所使用的术语“治疗作用”通常涵盖上文所述的治疗效益和/或预防效益。预防效益包含延迟或消除疾病或病况的出现，延迟或消除疾病或病况的症状的发作，减缓、停止或逆转疾病或病况的进展，或其任何组合。
本文所使用的术语“药剂”或“生物活性剂”通常是指生物、药物或化学化合物或其它部分。非限制性实例包含简单或复杂有机或无机分子、肽、蛋白质、寡核苷酸、抗体、抗体衍生物、抗体片段、维生素衍生物、碳水化合物、毒素或化疗化合物。可以合成各种化合物，例如小分子和寡聚物(例如寡肽和寡核苷酸)以及基于各种核心结构的合成有机化合物。另外，各种天然来源可以提供用于筛选的化合物，例如植物或动物提取物等。
本文所使用的术语“细胞增殖”通常是指细胞数由于分裂而变化的现象。例如，细胞增殖可以引起细胞数增大。这个术语还涵盖与增殖信号一致的细胞形态变化(例如尺寸增大)的细胞生长。
本文所使用的术语“体内”通常是指在个体的身体内发生的事件。
本文所使用的术语“体外”通常是指在个体的身体外部发生的事件。例如，体外分析涵盖任何在个体外部进行的分析。体外分析涵盖采用死细胞或活细胞的基于细胞的分析。体外分析还涵盖不采用完整细胞的无细胞分析。
本文所使用的术语“白介素”通常是指能够促进T和/或B淋巴细胞和/或造血细胞的发育与分化的分泌性蛋白或信号分子。白介素可以通过辅助CD4 T淋巴细胞以及通过单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞合成。如本文所使用，白介素(IL)可以包含IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35和/或IL-36。如本文所使用，术语“白介素”可以包含实质上维持对应野生型白介素的生物活性(例如具有的生物活性为对应野生型白介素的生物活性的至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或甚至至少100％)的全长白介素或片段(例如截短形式)或其变异体。如本文所使用的白介素可以来自任何哺乳动物物种。在某些实施方式中，白介素来自选自由以下组成的群组的物种：人类、马、牛、鼠类、猪、兔、猫、狗、大鼠、山羊、绵羊和非人类灵长动物。在某些实施方式中，白介素可以呈突变形式，例如与其受体的亲和力增加或减少。在具体实施方式中，白介素可以是超级IL-2(也称为sIL2，参见Nature 484,529–533,2012年4月26日)，其可以通过修饰IL-2以增加其对IL-2Rβ的结合亲和力来获得。sIL-2中的突变主要在细胞因子的核心中，且分子动力学模拟表明，进化突变使IL-2稳定，将IL-2Rβ结合位点中螺旋的灵活性降低成为优化的受体结合构象，类似于与CD25结合时的构象。与IL-2相比，sIL-2诱导细胞毒性T细胞的优良扩增，使得体内抗肿瘤反应增强，sIL-2引起T调节细胞的扩增的按比例减少并减少了肺水肿。
本文所使用的术语“个体”通常是指人类或非人类动物，包含但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠或猴。
术语“抑制生长和/或增殖”在用于癌细胞时通常是指降低癌细胞的生长速率和/或增殖速率。例如，这个术语可以包含癌细胞的死亡(例如通过细胞凋亡)。在某些实施方式中，这个术语还可以是指抑制实体肿瘤的生长和/或增殖和/或诱导肿瘤尺寸减小或肿瘤的消除。
本文所使用的术语“癌细胞表面标记”或“癌细胞相关标记”通常是指排他地或优先地或差异性地表达于癌细胞上和/或发现与癌细胞缔合并从而提供对于癌症具有优先性或特异性的靶标的生物分子(例如蛋白质、碳水化合物、糖蛋白等)。在某些实施方式中，优先表达可以是与生物体中的任何其它细胞相比的优先表达，或者生物体的特定区域内(例如特定器官或组织内)的优先表达。
本文所使用的术语“单体成员”通常是指以单体形式存在且为蛋白质异二聚体的组分/亚基的多肽、亚基或部分。
本文所使用的术语“Fc亚基”通常是指能够结合Fc受体的免疫球蛋白重链恒定区的羧基端部分或其类似物或部分。众所周知，每一个免疫球蛋白重链恒定区包括四个或五个域。所述域如下依序命名：CH1-铰链-CH2-CH3(-CH4)。CH4以IgM形式存在，其不具有铰链区。用于本申请中的免疫球蛋白重链恒定区可以包括免疫球蛋白铰链区，并且还可以包含CH3域。例如，免疫球蛋白重链恒定区可以包括免疫球蛋白铰链区、CH2域和CH3域。在某些实施方式中，本申请所述的Fc亚基由铰链-CH2-CH3域组成。
本文所使用的术语“与…复合”或“复合”通常是指分子(例如蛋白质异二聚体)的一个成员/亚基与另一个成员/亚基的缔合(例如结合)。例如，第一Fc亚基可以与第二亚基复合以形成二聚体。
本文所使用的术语“结合特异性”通常是指特异性结合给定靶标(例如，与给定靶标免疫反应)(而不结合或实质上不结合非靶标)的能力。本申请的靶向部分可以是单特异性的且含有一个或多个特异性结合靶标的结合位点，或可以是多特异性的(例如双特异性或三特异性的)且含有两个或多个特异性结合相同或不同靶标的结合位点。
本文所使用的术语“与…缔合”或“使得与…缔合”通常是指一个实体与另一个实体有物理缔合或接触。例如，蛋白质异二聚体的第一单体成员可以共价地或非共价地“与第二单体成员缔合”。在某些实施方式中，蛋白质异二聚体的第一单体成员通过界面与第二单体成员缔合，所述界面是由分别来自第一单体成员和第二单体成员的氨基酸残基(即界面残基)形成的。
本文所使用的术语“修饰”通常是指对肽主链(例如氨基酸序列)的任何处理或对多肽的任何翻译后修饰(例如糖基化)。例如，修饰是相对于对应野生型多肽的序列而言的。修饰可以是一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或大于10个)的取代、添加和/或缺失。
本文所使用的术语“杵臼修饰(knob-and-hole modification)”通常是指在多肽界面处引入修饰以形成凸起(杵修饰)和在另一多肽的对应位置处引入修饰以形成空腔(臼修饰)，凸起的尺寸与空腔的尺寸相同或类似。例如，杵臼修饰使得形成异二聚体，同时抑制同二聚体的形成。参见文献美国专利第5,731,168号、美国专利第7,695,936号、Ridgway等人的Prot Eng 9,617-621(1996)以及Carter的J Immunol Meth 248,7-15(2001)。相应地，本文所使用的术语“杵修饰”通常是指在多肽界面处的修饰，其用具有较大侧链的氨基酸(例如酪氨酸或色氨酸)置换具有较小侧链的氨基酸(例如丙氨酸或苏氨酸)以形成凸起。本文所使用的术语“臼修饰”通常是指在另一多肽的对应位置处的修饰，其用具有较小侧链的氨基酸(例如丙氨酸或苏氨酸)置换具有较大侧链的氨基酸(例如酪氨酸或色氨酸)以形成空腔。杵修饰和臼修饰可以通过变更编码多肽的核苷酸(例如通过位点特异性诱变)或通过肽合成来进行。在具体实施例中，杵修饰包括Fc区的两个亚基中的一个中的氨基酸取代Y349C和T366W，臼修饰包括Fc区的两个亚基中的另一个中的氨基酸取代D356C、T366S、L368A和Y407V。
本文所使用的术语“HEK293细胞”通常是指来源于转化的人胚肾(HEK)细胞的克隆分离株。HEK293细胞株为293细胞系的变体，其在单层培养中展示较好粘附并且容易用于噬斑分析和其它锚着依赖应用。其已适应于无血清培养基中的悬浮培养，例如293SFM II。
本文所使用的术语“CHO细胞”通常是指中国仓鼠卵巢细胞，其为非分泌性永生成纤维细胞。CHO细胞极少分泌CHO内源性蛋白，因此有利于分离和纯化靶蛋白。
本文所使用的术语“COS-1细胞”通常是指来源于猴肾组织的成纤维细胞样细胞系。COS细胞是通过用可以产生较大T抗原但在基因组复制方面具有缺陷的某一型式的SV40病毒使CV-1细胞永生来获得。COS细胞系的一种常用形式为COS-1。
本文所使用的术语“NS0细胞”通常是指来源于非分泌性小鼠骨髓瘤的模型细胞系。所述细胞系是由NSI/1的支系产生的胆固醇依赖性细胞系。
本文所使用的术语“融合蛋白”通常是指如下多肽，其包括氨基酸序列或替代地由所述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列是一种多肽直接或间接地(例如通过连接子)与异源多肽(即与前一多肽或其域无关的多肽)的氨基酸序列融合的氨基酸序列。
本文所使用的术语“C端”通常是指多肽的羧基端。
本文所使用的术语“N端”通常是指多肽的氨基端。
本文所使用的术语“免疫球蛋白”通常是指由一个或多个实质上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。已识别的免疫球蛋白基因包含κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因以及无数免疫球蛋白可变区基因。一种形式的免疫球蛋白构成抗体的基本结构单位。这种形式为四聚体且由免疫球蛋白链的两个相同的对组成，每一对具有一个轻链和一个重链。在每一对中，轻链可变区和重链可变区共同负责结合抗原，而恒定区负责抗体效应功能。除抗体以外，免疫球蛋白可以以包括例如Fv、Fab、Fab’和(Fab’)2的各种其它形式存在。
本文所使用的术语“框内融合(fused in frame或in frame fused)”通常是指以维持原始ORFs的正确阅读框的方式接合两个或多个开放阅读框(ORF)以形成连续的的较长ORF。
本文所使用的术语“连接子”通常是指关连或连接两个多肽序列(例如连接两个多肽域)的合成氨基酸序列。连接子可以通过肽键关连两个氨基酸序列。在某些实施方式中，本申请的连接子将免疫调节因子连接到直链序列中的第二Fc区。
本文所使用的术语“位于…的N端”通常是指位于另一分子(例如另一多肽)的N端位置处。例如，本申请，两个或多个免疫调节因子可以位于第二Fc区的N端。
本文所使用的术语“氨基酸取代”通常是指多肽的特定位置处的氨基酸由另外氨基酸置换。
本文所使用的术语“KABAT编号的EU索引”通常是指根据Kabat等人(1971)Ann.NYAcad,Sci.190:382-391和Kabat，E.A.等人(1991)具有免疫学意义的蛋白质序列，第五版，美国卫生及公共服务部,NIH第91-3242号出版物的对应于氨基酸序列的EU编号的索引。
本文所使用的术语“分离的多核苷酸”通常是指从其天然环境分离的或人工合成的具有任何长度的聚合形式的核苷酸，可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。
本文所使用的术语“蛋白质混合物”通常是指两种或多种蛋白质的混合物。
本文所使用的术语“同二聚体”通常是指由两个相同单体(例如两个相同成员或亚基)形成的分子。所述两个单体可以通过共价和/或非共价相互作用彼此聚集、复合或缔合。例如，蛋白质同二聚体的两个单体可以通过来自所述两个单体中的每一个的界面氨基酸残基之间的相互作用而彼此缔合。
本文所使用的术语“实质上不包括”通常是指组合物(例如混合物)包括极少或几乎不包括某种物质。例如，所述物质以例如低于10％、低于9％、低于8％、低于7％、低于6％、低于5％、低于4％、低于3％、低于2％、低于1％、低于0.5％、低于0.1％或低于0.01％的百分比存在。
本文所使用的术语“药学上可接受的赋形剂”通常是指与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、等强吸收延迟剂等。
本文所使用的术语“富集”通常是指混合物或群体中靶成分的数目和/或浓度的增加。
蛋白质异二聚体、蛋白质混合物、分离的多核苷酸、载体及宿主细胞
一方面，本申请提供一种蛋白质异二聚体。蛋白质异二聚体可以包括第一单体成员和不同于第一单体成员的第二单体成员。第一单体成员可以包括第一Fc亚基。第二单体成员可以包括第二Fc亚基。通过第一Fc亚基与第二Fc亚基的复合，第一单体成员可以与第二单体成员缔合而形成异二聚体。
在某些实施方式中，第一单体成员的氨基酸序列不同于第二单体成员的氨基酸序列。
蛋白质异二聚体可以进一步包括一个或多个白介素。所述一个或多个白介素可以与第一Fc亚基和/或第二Fc亚基融合(例如框内融合)。例如，所述一个或多个白介素可以独立地与第一Fc亚基和/或第二Fc亚基在框内融合(例如框内融合)。在某些实施方式中，一个或多个白介素仅与第一Fc亚基融合(例如框内融合)。在某些实施方式中，一个或多个白介素仅与第二Fc亚基融合(例如框内融合)。在某些实施方式中，一个或多个白介素与第一Fc亚基和第二Fc亚基融合(例如框内融合)。
所述一个或多个白介素可以与第一Fc亚基和/或第二Fc亚基的氨基端氨基酸和/或羧基端氨基酸融合(例如框内融合)。在某些实施方式中，一个或多个白介素与第一Fc亚基的氨基端氨基酸融合(例如在框内)。在某些实施方式中，一个或多个白介素仅与第二Fc亚基的氨基端氨基酸融合(例如在框内)。在某些实施方式中，一个或多个白介素与第一Fc亚基的氨基端氨基酸和第二Fc亚基的氨基端氨基酸融合(例如在框内)。
在蛋白质异二聚体中，一个或多个白介素中的至少一个可以是白介素10。
所述一个或多个白介素可以直接或间接地与第一Fc亚基和/或第二Fc亚基融合(例如在框内)。例如，所述一个或多个白介素可以通过连接子(例如肽连接子)与第一Fc亚基和/或第二Fc亚基融合(例如在框内)。连接子可以是例如通过肽键关连或连接两个多肽序列的合成氨基酸序列。在某些实施方式中，连接子是包括例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或大于25个氨基酸的肽。例如，连接子可以包括1至10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或大于10个氨基酸)、1至15个氨基酸(例如1至11、12、13、14、15个氨基酸)、1至20个氨基酸、1至30个氨基酸或更多氨基酸。在某些实施方式中，连接子包括SEQ ID NO:37中所述的氨基酸序列。
在某些实施方式中，蛋白质异二聚体包括两个或多个白介素。所述两个或多个白介素可以相同或可以不同。在某些实施方式中，所述两个或多个白介素是相同的。在某些实施方式中，所述两个或多个白介素为白介素10。
所述两个或多个白介素可以形成一个或多个白介素二聚体，每一个白介素二聚体包括彼此融合(例如在框内)的两个白介素。每一个白介素二聚体可以包括两个相同或两个不同白介素。白介素可以直接或间接地融合(例如在框内)在一起。在某些实施方式中，一个或多个白介素二聚体包括至少一个白介素10二聚体，白介素10二聚体包括两个白介素10。
两个或多个白介素(例如每一个白介素二聚体中的两个白介素)可以通过连接子(例如肽连接子)融合(例如在框内)在一起。连接子可以是例如通过肽键连接或关连两个多肽序列的合成氨基酸序列。在某些实施方式中，连接子是包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或大于25个氨基酸的肽。例如，连接子可以包括1至10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或大于10个氨基酸)、1至15个氨基酸(例如1至11、12、13、14、15个氨基酸)、1至20个氨基酸、1至30个氨基酸或更多氨基酸。在某些实施方式中，连接子包括SEQ ID NO:37中所述的氨基酸序列。在某些实施方式中，连接子耐蛋白质水解或实质上耐蛋白质水解。
在一些情况下，两个以上白介素可以包括于蛋白质异二聚体中。两个以上白介素可以形成两个或多个白介素二聚体。例如，两个或多个白介素二聚体可以包括至少一个白介素10二聚体，白介素10二聚体包括两个白介素10。在某些实施方式中，蛋白质异二聚体包括两个或多个白介素10二聚体
融合的两个或多个白介素(例如白介素二聚体)可以进一步与第一Fc亚基和/或第二Fc亚基的氨基端氨基酸和/或羧基端氨基酸融合(例如在框内)。在某些实施方式中，融合的两个或多个白介素(例如白介素二聚体)可以进一步与第一Fc亚基和/或第二Fc亚基的氨基端氨基酸融合。在某些实施方式中，融合的两个或多个白介素(例如白介素二聚体)可以进一步与仅第一Fc亚基的氨基端氨基酸融合。在某些实施方式中，融合的两个或多个白介素(例如白介素二聚体)可以进一步与仅第二Fc亚基的氨基端氨基酸融合。在某些实施方式中，融合的两个或多个白介素(例如白介素二聚体)可以进一步与第一Fc亚基的氨基端氨基酸和第二Fc亚基的氨基端氨基酸融合。
当存在两个或多个白介素二聚体时，每一个白介素二聚体可以独立地与第一Fc亚基和/或第二Fc亚基的氨基端氨基酸和/或羧基端氨基酸融合。例如，两个或多个融合白介素(例如白介素10)可以进一步与第一Fc亚基(例如与其氨基端氨基酸)融合(例如在框内)，两个或多个融合白介素(例如白介素10)可以进一步与第二Fc亚基(例如与其氨基端氨基酸)融合(例如在框内)。
融合的两个或多个白介素(例如白介素二聚体)可以直接或间接地与第一Fc亚基和/或第二Fc亚基融合。例如，融合的两个或多个白介素(例如白介素二聚体)可以通过连接子(例如肽连接子)与第一Fc亚基和/或第二Fc亚基融合(例如在框内)。连接子可以是例如通过肽键关连或连接两个多肽序列的合成氨基酸序列。在某些实施方式中，连接子是包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或大于25个氨基酸的肽。例如，连接子可以包括1至10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或大于10个氨基酸)、1至15个氨基酸(例如1至11、12、13、14、15个氨基酸)、1至20个氨基酸、1至30个氨基酸或更多氨基酸。在某些实施方式中，连接子包括SEQ ID NO:37中所述的氨基酸序列。在某些实施方式中，连接子耐蛋白质水解或实质上耐蛋白质水解。
在某些实施方式中，一个或多个白介素中的至少一个与第二Fc亚基融合(例如在框内)。例如，一个或多个白介素中的至少一个可以与第二Fc亚基的氨基端氨基酸融合。
在某些实施方式中，在第二单体成员中，一个或多个白介素中的至少两个彼此融合(例如在框内)以形成白介素二聚体，所述白介素二聚体进一步与第二Fc亚基的氨基端氨基酸融合(在框内)。
在某些实施方式中，第一单体成员不包括任何白介素。
在某些实施方式中，第一单体成员由第一Fc亚基组成。
在某些实施方式中，一个或多个白介素中的至少一个与第一Fc亚基融合(例如在框内)。
在某些实施方式中，一个或多个白介素中的至少一个与第一Fc亚基的氨基端氨基酸融合(例如在框内)。
在某些实施方式中，在第一单体成员中，一个或多个白介素中的至少两个彼此融合(例如在框内)以形成白介素二聚体，所述白介素二聚体进一步与第一Fc亚基的氨基端氨基酸融合(例如在框内)。
在某些实施方式中，第二单体成员不包括任何白介素。
在某些实施方式中，第二单体成员由第二Fc亚基组成。
在某些实施方式中，第一单体成员不包括任何白介素，或第一单体成员由第一Fc亚基组成，一个或多个白介素中的至少一个与第二Fc亚基融合(例如在框内)。在一些情况下，在第二单体成员中，一个或多个白介素中的至少两个彼此融合(例如在框内)以形成白介素二聚体，所述白介素二聚体进一步与第二Fc亚基的氨基端氨基酸融合(在框内)。
在某些实施方式中，第二单体成员不包括任何白介素，或第二单体成员由第二Fc亚基组成，一个或多个白介素中的至少一个与第一Fc亚基融合(例如在框内)。在一些情况下，在第一单体成员中，一个或多个白介素中的至少两个彼此融合(例如在框内)以形成白介素二聚体，所述白介素二聚体进一步与第一Fc亚基的氨基端氨基酸融合(在框内)。
在某些实施方式中，第一单体成员包括与第一Fc亚基融合的一个或多个白介素，第二单体成员包括与第二Fc亚基融合的一个或多个白介素。
在某些实施方式中，第一单体成员包括与第一Fc亚基融合的一个或多个白介素二聚体，第二单体成员包括与第二Fc亚基融合的一个或多个白介素二聚体。每一个白介素二聚体可以包括彼此直接或间接地(例如通过连接子，例如肽连接子)融合(例如在框内)的两个相同白介素。
本申请的蛋白质异二聚体不包括展现对肿瘤抗原的结合特异性的任何抗体重链可变区或任何抗体轻链可变区。在某些实施方式中，本申请的蛋白质异二聚体不包括对肿瘤抗原展示结合特异性的任何抗体或其任何部分(例如抗原结合片段)。
在某些实施方式中，本申请的蛋白质异二聚体不包括任何抗体重链可变区或任何抗体轻链可变区。
在某些实施方式中，本申请的蛋白质异二聚体不包括任何抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，本申请的蛋白质异二聚体不包括对任何肿瘤抗原展示结合特异性的任何靶向部分。例如，在一些情况下，本申请的蛋白质异二聚体不包括能够特异性结合肿瘤抗原的任何抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，第一Fc亚基和/或第二Fc亚基独立地来自IgG分子。所述IgG可以选自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4组成的群组。例如，IgG可以是人类IgG1。
在某些实施方式中，第一Fc亚基不同于第二Fc亚基，第一和/或第二Fc亚基包括促进第一Fc亚基与第二Fc亚基之间的异源二聚化的修饰。
第一Fc亚基可以包括第一修饰，第二Fc亚基可以包括第二修饰。
在某些实施方式中，第一修饰包括位置T366处的氨基酸取代以及选自由以下组成的群组的一个或多个位置处的氨基酸取代：Y349、F405、K409、D399、K360、Q347、K392和S354，其中氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。例如，第一修饰所包括的氨基酸取代可以选自由以下组成的群组：Y349C、Y349D、D399S、F405K、K360E、K409A、K409E、Q347E、Q347R、S354D、K392D和T366W。
在某些实施方式中，第一修饰包括2至5个氨基酸取代。
在某些实施方式中，第一修饰包括选自以下任何群组的氨基酸取代的组：1)Y349和T366；2)Y349、T366和F405；3)Y349、T366和K409；4)Y349、T366、F405、K360和Q347；5)Y349、T366、F405和Q347；6)Y349、T366、K409、K360和Q347；7)Y349、T366、K409和Q347；8)T366、K409和K392；9)T366和K409；10)T366、K409、Y349和S354；11)T366和F405；12)T366、F405和D399；以及13)T366、F405、Y349和S354；其中氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
在某些实施方式中，第一修饰包括选自任何以下群组的一组氨基酸取代：1)Y349C和T366W；2)Y349C、T366W和F405K；3)Y349C、T366W和K409E；4)Y349C、T366W和K409A；5)Y349C、T366W、F405K、K360E和Q347E；6)Y349C、T366W、F405K和Q347R；7)Y349C、T366W、K409A、K360E和Q347E；8)Y349C、T366W、K409A和Q347R；9)T366W、K409A和K392D；10)T366W和K409A；11)T366W、K409A和Y349D；12)T366W、K409A、Y349D和S354D；13)T366W和F405K；14)T366W、F405K和D399S；15)T366W、F405K和Y349D；以及16)T366W、F405K、Y349D和S354D；其中氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
在某些实施方式中，第二修饰包括位置T366、L368和Y407处的氨基酸取代以及在选自由D356、D399、E357、F405、K360、K392、K409和Q347组成的群组的一个或多个位置处的氨基酸取代，其中氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
在某些实施方式中，第二修饰所包括的氨基酸取代选自由D356C、D399S、E357A、F405K、K360E、K392D、K409A、L368A、L368G、Q347E、Q347R、T366S、Y407A和Y407V组成的群组。
在某些实施方式中，第二修饰包括4至6个位置处的氨基酸取代。
在某些实施方式中，第二修饰包括在选自以下任何群组的位置处的组的氨基酸取代：1)D356、T366、L368、Y407和F405；2)D356、T366、L368和Y407；3)D356、T366、L368、Y407和Q347；4)D356、T366、L368、Y407、K360和Q347；5)D356、T366、L368、Y407、F405和Q347；6)D356、T366、L368、Y407、F405、K360和Q347；7)T366、L368、Y407、D399和F405；8)T366、L368、Y407和F405；9)T366、L368、Y407、F405和E357；10)T366、L368、Y407和K409；11)T366、L368、Y407、K409和K392；以及12)T366、L368、Y407、K409和E357；其中氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
在某些实施方式中，第二修饰包括选自任何以下群组的氨基酸取代的组：1)D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；2)D356C、T366S、L368A和Y407V；3)D356C、T366S、L368A、Y407V和Q347R；4)D356C、T366S、L368A、Y407V、K360E和Q347E；5)D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K和Q347R；6)D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K、K360E和Q347E；7)T366S、L368A、Y407V、D399S和F405K；8)T366S、L368G、Y407A和F405K；9)T366S、L368A、Y407V、F405K和E357A；10)T366S、L368A、Y407V和K409A；11)T366S、L368A、Y407V、K409A和K392D；12)T366S、L368G、Y407A和K409A；13)T366S、L368A、Y407V、K409A和E357A；其中氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
在某些实施方式中，第一Fc亚基包括第一修饰，第二Fc亚基包括第二修饰，第一修饰和第二修饰包括选自任何以下群组的位置的组的氨基酸取代：1)第一修饰：Y349和T366；第二修饰：D356、T366、L368、Y407和F405；2)第一修饰：Y349、T366和F405；第二修饰：D356、T366、L368和Y407；3)第一修饰：Y349、T366和K409；第二修饰：D356、T366、L368、Y407和F405；4)第一修饰：Y349、T366、F405、K360和Q347；第二修饰：D356、T366、L368、Y407和Q347；5)第一修饰：Y349、T366、F405和Q347；第二修饰：D356、T366、L368、Y407、K360和Q347；6)第一修饰：Y349、T366、K409、K360和Q347；第二修饰：D356、T366、L368、Y407、F405和Q347；7)第一修饰：Y349、T366、K409和Q347；第二修饰：D356、T366、L368、Y407、F405、K360和Q347；8)第一修饰：T366、K409和K392；第二修饰：T366、L368、Y407、D399和F405；9)第一修饰：T366和K409；第二修饰：T366、L368、Y407和F405；10)第一修饰：T366、K409和Y349；第二修饰：T366、L368、Y407、F405和E357；11)第一修饰：T366、K409、Y349和S354；第二修饰：T366、L368、Y407、F405和E357；12)第一修饰：T366和F405；第二修饰：T366、L368、Y407和K409；13)第一修饰：T366、F405和D399；第二修饰：T366、L368、Y407、K409和K392；14)第一修饰：T366、F405和Y349；第二修饰：T366、L368、Y407、K409和E357；15)第一修饰：T366、F405、Y349和S354；第二修饰：T366、L368、Y407、K409和E357；其中氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
在某些实施方式中，第一Fc亚基包括第一修饰，第二Fc亚基包括第二修饰，其中第一修饰和第二修饰包括选自任何以下群组的氨基酸取代的组：1)第一修饰：Y349C和T366W；第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；2)第一修饰：Y349C、T366W和F405K；第二修饰：D356C、T366S、L368A和Y407V；3)第一修饰：Y349C、T366W和K409E；第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；4)第一修饰：Y349C、T366W和K409A；第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；5)第一修饰：Y349C、T366W、F405K、K360E和Q347E；第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和Q347R；6)第一修饰：Y349C、T366W、F405K和Q347R；第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V、K360E和Q347E；7)第一修饰：Y349C、T366W、K409A、K360E和Q347E；第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K和Q347R；8)第一修饰：Y349C、T366W、K409A和Q347R；第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K、K360E和Q347E；9)第一修饰：T366W、K409A和K392D；第二修饰：T366S、L368A、Y407V、D399S和F405K；10)第一修饰：T366W和K409A；第二修饰：T366S、L368G、Y407A和F405K；11)第一修饰：T366W、K409A和Y349D；第二修饰：T366S、L368A、Y407V、F405K和E357A；12)第一修饰：T366W、K409A、Y349D和S354D；第二修饰：T366S、L368A、Y407V、F405K和E357A；13)第一修饰：T366W和F405K；第二修饰：T366S、L368A、Y407V和K409A；14)第一修饰：T366W、F405K和D399S；第二修饰：T366S、L368A、Y407V、K409A和K392D；15)第一修饰：T366W和F405K；第二修饰：T366S、L368G、Y407A和K409A；16)第一修饰：T366W、F405K和Y349D；第二修饰：T366S、L368A、Y407V、K409A和E357A；17)第一修饰：T366W、F405K、Y349D和S354D；第二修饰：T366S、L368A、Y407V、K409A和E357A；其中氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
在某些实施方式中，第一Fc亚基包括第一修饰，第二Fc亚基包括第二修饰，第一修饰包括氨基酸取代T366W和K409A，第二修饰包括氨基酸取代T366S、L368G、Y407A和F405K，其中氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
在某些实施方式中，第一和第二Fc亚基包括促进第一Fc亚基与第二Fc亚基之间的异源二聚化的修饰，例如杵臼修饰。例如，第一Fc亚基可以包括杵修饰，第二Fc亚基可以包括臼修饰。在一些情况下，第一Fc亚基可以包括臼修饰，第二Fc亚基可以包括杵修饰。
杵修饰可以包括氨基酸取代Y349C和T366W，臼修饰可以包括氨基酸取代D356C、T366S、L368A和Y407V，其中氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
在某些实施方式中，第一Fc亚基的氨基酸序列选自由以下组成的群组：SEQ IDNO:1、3、5、6、7、9、11、13、15、17、19、21、22、24、27、29和30。
在某些实施方式中，蛋白质异二聚体所包括的白介素的氨基酸序列选自由以下组成的群组：SEQ ID NO:49和51。
在某些实施方式中，第二Fc亚基的氨基酸序列选自由以下组成的群组：SEQ IDNO:2、4、8、10、12、14、16、18、20、23、25、26、28和30。
一方面，本申请提供一种或多种分离的核酸，其编码本申请所述的蛋白质异二聚体。在某些实施方式中，分离的核酸编码本申请所述的蛋白质异二聚体的单体成员(例如第一单体成员或第二单体成员)或片段。
核酸可以使用本领域已知的重组技术合成。例如，核酸可以使用自动化DNA合成仪合成。
标准重组DNA和分子克隆技术包含由Sambrook,J.、Fritsch,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,(1989)(Maniatis)及由T.J.Silhavy、M.L.Bennan和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,N.Y.(1984)以及由Greene出版协会和Wiley-Interscience出版的Ausubel,F.M.等人的Current Protocols in Molecular Biology 1987)描述的那些标准重组DNA和分子克隆技术。简而言之，本申请核酸可以由基因组DNA片段、cDNA和RNA制备，基因组DNA片段、cDNA和RNA都可以直接从细胞提取或通过包含但不限于PCR和RT-PCR的各种扩增工艺以重组方式产生。
核酸的直接化学合成通常涉及将3’封端和5’封端核苷酸单体依序添加到生长核苷酸聚合物链的5’羟基端，其中每一次添加均通过在所添加单体的3’位上对生长链的5’羟基端进行亲核攻击来实现，所添加单体通常为磷衍生物，例如磷酸三酯、亚磷酰胺等。例如参见Matteuci等人,Tet.Lett.521:719(1980)；Caruthers等人的美国专利第4,500,707号；以及Southern等人的美国专利第5,436,327号和第5,700,637号。
一方面，本申请提供一种或多种载体，包括本申请所述的一种或多种分离的核酸。
所述载体可以是任何直链核酸、质粒、噬菌粒、黏粒、RNA载体、病毒载体等。病毒载体的非限制性实例可以包含逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。在某些实施方式中，载体为表达载体，例如噬菌体呈现载体。
表达载体可以适用于特定类型的宿主细胞而不适用于其它类型。例如，表达载体可以引入到宿主生物体，接着监测载体内所含的任何基因/多核苷酸的活力和表达。
表达载体还可能含有一个或多个可选标记基因，可选标记基因在表达时赋予可用于选择或以其它方式识别携带表达载体的宿主细胞的一个或多个表型性状。适合于真核细胞的可选标记的非限制性实例包含二氢叶酸还原酶和新霉素抗性。
本申请载体可以通过各种已认可技术稳定地或暂时地引入宿主细胞中。例如，一个方法涉及氯化钙处理，其中通过钙沉淀来引入表达载体。还可以依循类似程序使用其它盐，例如磷酸钙。另外，可以使用电穿孔(即施加电流以增加细胞到核酸的渗透性)。转型方法的其它实例包含显微注射、DEAE葡聚糖介导的转型以及在醋酸锂的存在下的热休克。脂类复合物、脂质体和树状分子也可以用于转染宿主细胞。
在将异源序列引入到宿主细胞中时，可以实践各种方法以识别本申请载体已引入到其中的宿主细胞。一个示范性选择方法涉及传代培养个别细胞以形成个别菌落，接着测试所需蛋白质产物的表达。另一种方法包含基于表型性状选择含有异源序列的宿主细胞，所述表型性状通过表达载体内所含的可选标记基因的表达来赋予。
例如，本申请的各种异源序列到宿主细胞的引入可以通过例如PCR、Southern印迹或Northern印迹杂交的方法来确认。例如，核酸可以由所得宿主细胞制备，所关注的特定序列可以通过使用对所关注序列具有特异性的引物的PCR扩增。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳，接着用溴化乙锭、SYBR Green溶液等染色或用UV检测来检测DNA。或者，可以将对所关注序列具有特异性的核酸探针用于杂交反应中。特定基因序列的表达可以通过借助与PCR结合的反转录、Northern印迹杂交检测对应mRNA，或借助使用与编码基因产物反应的抗体的免疫分析而确定。示范性免疫分析包含但不限于ELISA、放射线免疫分析和夹心免疫分析。
此外，本申请的各种异源序列到宿主细胞中的引入可以通过异源序列所编码的酶(例如酶标记)的酶活性来确定。所述酶可以通过本领域中已知的各种方法来分析。一般来说，酶活性可以通过产物的形成或研究中的酶反应的底物的转化确认。所述反应可在体外或体内发生。
一方面，本申请提供一种分离的宿主细胞，包括本申请所述的一种或多种分离的核酸或一种或多种载体。
宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。适当宿主细胞可以用本申请的多核苷酸或载体转型或转染，且用于异二聚体蛋白和/或蛋白质混合物的表达和/或分泌。例如，所述细胞可以是大肠杆菌细胞、其它细菌宿主细胞、酵母细胞或各种较高的真核细胞(例如永生杂交瘤细胞、NS0骨髓瘤细胞、HEK293细胞、中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、COS细胞等)。在某些实施方式中，编码蛋白质异二聚体(例如异二聚体蛋白)的核酸可操作地连接到适合于在特定宿主细胞中表达的表达控制序列。
一方面，本申请提供一种蛋白质混合物。所述蛋白质混合物可以包括：1)本申请中的蛋白质异二聚体；2)由本申请所述的蛋白质异二聚体的第一单体成员的两个相同拷贝形成的第一同二聚体；以及3)由本申请所述的的蛋白质异二聚体的第二单体成员的两个相同拷贝形成的第二同二聚体。蛋白质异二聚体在蛋白质混合物中的百分比可能为至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
在蛋白质混合物中，第二同二聚体的百分比可能小于第一同二聚体的百分比。例如，第二同二聚体的百分比可能为最多约10％、最多约9％、最多约8％、最多约7％、最多约6％、最多约5％、最多约4％、最多约3％、最多约2％、最多约1％或最多约0.5％。例如，蛋白质混合物可能实质上不包括第二同源二聚体。
蛋白质混合物可以直接由本申请的宿主细胞产生，例如无需富集/纯化蛋白质异二聚体和/或去除第一或第二同源二聚体。
药物组合物
一方面，本申请提供一种药物组合物，包括本申请所述的蛋白质异二聚体或本申请所述的蛋白质混合物以及可选的药学上可接受的赋形剂。
药学上可接受的赋形剂的实例包含但不限于惰性固体稀释剂和填充剂、稀释剂、无菌水溶液以及各种有机溶剂、促渗剂、增溶剂和佐剂。
在某些实施方式中，蛋白质异二聚体被配制为用于经口施用、静脉内施用、肌肉内施用、肿瘤位点原位施用、吸入、直肠施用、阴道施用、经皮施用或经皮下储集施用。
药物组合物可以用于抑制肿瘤生长。例如，药物组合物可以抑制或延迟疾病的发展或进展，可以减小肿瘤尺寸(以及甚至基本上消除肿瘤)，且可以减轻和/或稳定疾病状况。
下文描述非限制性示范性药物组合物以及其制备方法。
本申请药物组合物可以例如呈适合于经口施用的形式，如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、持续释放制剂、溶液、悬浮液；呈适合于非经肠注射的形式，如无菌溶液、悬浮液或乳剂；呈适合于局部施用的形式，如药膏或乳膏；或呈适合于直肠施用的形式，如栓剂。药物组合物可以呈适合于单次施用精确剂量的单位剂型。药物组合物可以进一步包括本申请所述的蛋白质异二聚体(例如异二聚体蛋白)或蛋白质混合物来作为活性成分并且可以包含常规药物载剂或赋形剂。此外，药物组合物可以包含其它医药或药物试剂、载剂、佐剂等。
示范性非经肠施用形式包含但不限于活性蛋白质异二聚体(例如异二聚体蛋白)溶于无菌水溶液(例如丙二醇水溶液或葡萄糖溶液)中的溶液或悬浮液。在需要时，这些剂型可以适当地用例如组氨酸和/或磷酸盐的盐缓冲。
在某些实施方式中，本申请提供一种用于注射的药物组合物，其含有本申请的蛋白质异二聚体(异二聚体蛋白)或蛋白质混合物以及适合于注射的药物赋形剂。
可以合并本申请药物组合物所呈的形式以通过注射施用，包括水性或油性悬浮液或含有芝麻油、玉米油、棉籽油或花生油的乳剂，以及酏剂、甘露醇、葡萄糖或无菌水溶液和类似药物媒剂。
在某些实施方式中，本申请提供一种用于经口施用的药物组合物，其含有本申请的蛋白质异二聚体(异二聚体蛋白)或蛋白质混合物以及适合于经口施用的药物赋形剂。
在某些实施方式中，本申请提供一种用于经口施用的固体药物组合物，其含有：(i)一定量的本申请的蛋白质异二聚体(例如异二聚体蛋白)或蛋白质混合物；选用的(ii)一定量的第二药剂；以及(iii)适合于经口施用的药物赋形剂。在某些实施方式中，组合物进一步含有：(iv)一定量的第三药剂。在某些实施方式中，蛋白质异二聚体或蛋白质混合物、第二药剂以及可选的第三药剂的量为单独地或以组合方式有效治疗个体的病况的量。
在某些实施方式中，药物组合物可以是适合于口服的液体药物组合物。本申请的适合于经口施用的药物组合物可以以离散剂型形式存在，例如胶囊、扁囊剂或片剂，或分别含有预定量的有效成分(如粉末)的液体或喷雾剂，或呈颗粒、溶液或溶于水溶液或非水溶液中的悬浮液、水包油乳剂或油包水液体乳剂。这些剂型可以通过任何制药方法制备，但所有方法通常均包含使有效成分与包含一个或多个其它成分的载剂缔合的步骤。一般来说，所述组合物通过使有效成分与液体载剂或细分固体载剂或两种载剂均匀且密切掺混，并接着(如果有必要)将产物成型为所需型式来制备。
本申请进一步涵盖包括有效成分(例如本申请的蛋白质异二聚体或异二聚体蛋白)的无水药物组合物和剂型，因为水可能促进某些多肽降解。例如，在制药领域，水可能作为模拟长期储存以便确定特性(例如保存期或制剂随时间推移的稳定性)的手段而予以添加(例如5％)。本申请的无水药物组合物和剂型可以使用无水或低水分成分以及低水分或低湿度条件来制备。
本申请的蛋白质异二聚体(例如异二聚体蛋白)或蛋白质混合物可以根据常规药物复合技术以密切掺混物形式与药物载剂合并。载剂可以取决于施用所需的制剂形式而采取各种形式。在不采用乳糖的一些实施例中，在制备口服剂型的组合物时，就口服液体制剂(例如悬浮液、溶液和酏剂)或气雾剂而言，任何常用药物介质都可以用作载剂，例如水、乙二醇、油、醇、芳香剂、防腐剂、着色剂等；或就口服固体制剂而言，可以使用例如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂的载剂。在需要时，可以通过标准水性技术或非水性技术给片剂包覆包衣。
当需要水性悬浮液和/或酏剂以供经口施用时，其中的活性成分可以与各种甜味剂或芳香剂、色素或染料以及(在需要时)乳化剂和/或悬浮剂，连同例如水、乙醇、丙二醇、甘油和其各种组合的稀释剂合并在一起。
本申请的药物组合物可以包括治疗有效量的活性剂(例如本申请的蛋白质异二聚体或蛋白质混合物)。治疗有效量为本申请药物组合物的能够预防和/或治愈(至少部分)患有或有风险患上病况或病症(例如癌症)的个体的所述病况或病症和/或其任何并发症的量。所含活性剂的具体量/浓度可以根据施用方法和患者的需求而变化，并且可以基于例如体积、粘稠度和/或患者体重等确定。例如，适当的剂量可能为约0.1毫克/千克/天或l毫克/千克/天至约50毫克/千克/天；有时，所述剂量可以更高。应理解，这些具体剂量可以由本领域的技术人员(例如医生或药剂师)基于特定患者、制剂和/或疾病的情况而适宜地调节。
医疗用途和治疗方法
一方面，本申请提供一种本申请所述的蛋白质异二聚体或本申请所述的蛋白质混合物的用途，其用于制造用于抑制肿瘤或肿瘤细胞生长的药物和/或试剂盒。在某些实施方式中，药物和/或试剂盒用于特异性地和/或优先地抑制靶细胞(例如癌细胞)的生长或分化或杀死靶细胞(例如癌细胞)。
一方面，本申请提供一种本申请所述的蛋白质异二聚体或本申请所述的蛋白质混合物的用途，其用于制造用于治疗有需要的个体的癌症的药物。
一方面，本申请提供一种用于治疗有需要的个体的癌症的方法。所述方法可以包括向个体施用治疗有效量的本申请所述的蛋白质异二聚体或本申请所述的蛋白质混合物。
一方面，本申请提供一种用于抑制肿瘤或肿瘤细胞生长的方法，包括使肿瘤或肿瘤细胞与治疗有效量的本申请所述的蛋白质异二聚体或本申请所述的蛋白质混合物接触。所述接触可以在体外或体内发生。
在某些实施方式中，所述接触包含向个体(例如哺乳动物)全身性地或局部地施用本申请的蛋白质异二聚体(例如异二聚体蛋白)、蛋白质混合物、药物组合物或药物。在某些实施方式中，所述接触包含直接在肿瘤位点施用本申请的蛋白质异二聚体(例如异二聚体蛋白)、蛋白质混合物、药物组合物或药物。在某些实施方式中，所述施用通过经口施用、静脉内施用、肌肉内施用、肿瘤位点原位施用、吸入、直肠施用、阴道施用、经皮施用或经皮下储集施用来进行。
在某些实施方式中，肿瘤(例如癌症)或肿瘤细胞(例如癌细胞)是实体肿瘤或来自实体肿瘤。例如，癌症可以选自由以下组成的群组：B细胞淋巴瘤、肺癌、支气管癌、结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑癌或中枢神经系统癌、外周神经系统癌、食道癌、宫颈癌、黑色素瘤、子宫或子宫内膜癌、口腔及咽喉癌、肝癌、肾癌、胆管癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、脂肪肉瘤、睾丸癌和恶性纤维组织细胞瘤。
在某些实施方式中，癌症或癌细胞在个体体内，例如癌症或癌细胞在人类或非人类动物(例如哺乳动物)体内。
在某些实施方式中，哺乳动物是人类。在某些实施方式中，哺乳动物是小鼠、大鼠、猫、狗、兔、猪、绵羊、马、牛、山羊、沙鼠、仓鼠、豚鼠、猴或任何其它哺乳动物。许多这些哺乳动物可以是本领域已知作为某些疾病或病症(包含实体肿瘤和/或其它癌症)的临床前模型的个体(例如，Talmadge等人,2007 Am.J.Pathol.170:793；Kerbel,2003Canc.Biol.Therap.2(4 Suppl 1):S134；Man等人,2007 Canc.Met.Rev.26:737；Cespedes等人,2006 Clin.TransL Oncol.8:318)。
制备蛋白质异二聚体或蛋白质混合物的方法
一方面，本申请提供一种产生本申请所述的蛋白质异二聚体或本申请所述的蛋白质混合物的方法。所述方法可以包括(i)在实现蛋白质异二聚体的表达的条件下培养本申请所述的宿主细胞，以及(ii)收集已表达的蛋白质异二聚体或包括所述蛋白质异二聚体的蛋白质混合物。
在某些实施方式中，所述方法不包括富集本申请所述的宿主细胞表达的产物中的蛋白质异二聚体。
在某些实施方式中，所述方法不包括从由本申请所述的宿主细胞产生的蛋白质混合物除去第一或第二同二聚体。
在某些实施方式中，所述方法进一步包括分离和/或纯化蛋白质异二聚体或蛋白质混合物的步骤。
在某些实施方式中，所述方法进一步包括用编码/表达本申请的异二聚体、其一个或多个成员或其片段的多核苷酸/载体转染/转化宿主细胞。
在某些实施方式中，本申请的蛋白质异二聚体或蛋白质混合物是通过在适合于蛋白质表达的条件下使载体在细胞中表达而产生的。在某些实施方式中，本申请的蛋白质异二聚体或蛋白质混合物是通过单细胞克隆产生的。
可以在适合于蛋白质表达的条件之间变化的因素包括例如孵育时间、温度和介质，可以取决于细胞类型并且本领域的普通技术人员将容易确定。
在某些实施方式中，在产生本申请的蛋白质异二聚体或蛋白质混合物的过程期间，宿主细胞在培养物中或在可用于生长培养物的任何设备(包括发酵罐)中生长。细胞可以以单层形式生长或附着于表面。或者，宿主细胞可以在悬浮液中生长。细胞可以在无血清培养基中生长。所述培养基可以是市售培养基，例如但不限于补充有谷氨酰胺(例如8mM L-谷氨酰胺)的Opti-CHO(Invitrogen，目录号#12681)、补充有10％胎牛血清、10.5ng/mlmIL-3和L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基，或5％FCS培养基。
本申请还包含以下实施例：
1.一种蛋白质异二聚体，包括第一单体成员和不同于所述第一单体成员的第二单体成员，其中：所述第一单体成员包括第一Fc亚基，所述第二单体成员包括第二Fc亚基，所述第一单体成员与所述第二单体成员通过所述第一Fc亚基与所述第二Fc亚基的复合而缔合，形成所述异二聚体；其中所述蛋白质异二聚体进一步包括一个或多个与所述第一Fc亚基和/或所述第二Fc亚基融合的白介素；其中所述蛋白质异二聚体不包括展现对肿瘤抗原的结合特异性的任何抗体重链可变区或任何抗体轻链可变区。
2.根据实施例1所述的蛋白质异二聚体，其中所述一个或多个白介素与所述第一Fc亚基和/或所述第二Fc亚基的氨基端氨基酸和/或羧基端氨基酸融合。
3.根据实施例1至2中任一项所述的蛋白质异二聚体，其包括两个或多个白介素。
4.根据实施例3所述的蛋白质异二聚体，其中所述两个或多个白介素形成一个或多个白介素二聚体，每一个白介素二聚体包括两个彼此融合的白介素。
5.根据实施例4所述的蛋白质异二聚体，其中每一个白介素二聚体的所述两个白介素通过肽连接子彼此融合。
6.根据实施例4至5中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述白介素二聚体与所述第一Fc亚基和/或所述第二Fc亚基的氨基端氨基酸和/或羧基端氨基酸融合。
7.根据实施例1至6中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述白介素中的一个或多个通过肽连接子与所述第一Fc亚基和/或所述第二Fc亚基融合。
8.根据实施例1至7中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述一个或多个白介素中的至少一个为IL10。
9.根据实施例4至8中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述一个或多个白介素二聚体包括至少一个IL10二聚体，所述IL10二聚体包括两个IL10。
10.根据实施例1至9中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述第一Fc亚基和/或所述第二Fc亚基源自IgG分子。
11.根据实施例10所述的蛋白质异二聚体，其中所述IgG选自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4组成的群组。
12.根据实施例11所述的蛋白质异二聚体，其中所述IgG为人类IgG1。
13.根据实施例1至12中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述蛋白质异二聚体不包括展现与任何肿瘤抗原的结合特异性的任何靶向部分。
14.根据实施例1至13中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述第一Fc亚基不同于所述第二Fc亚基，所述第一和/或第二Fc亚基包括促进所述第一Fc亚基与所述第二Fc亚基之间的异二聚体化的修饰。
15.根据实施例14所述的蛋白质异二聚体，其中所述第一Fc亚基包括第一修饰，所述第二Fc亚基包括第二修饰。
16.根据实施例15所述的蛋白质异二聚体，其中所述第一修饰包括位置T366处的氨基酸取代以及选自由以下组成的群组的一个或多个位置处的氨基酸取代：Y349、F405、K409、D399、K360、Q347、K392和S354，其中氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
17.根据实施例16所述的蛋白质异二聚体，其中第一修饰所包括的氨基酸取代选自由以下组成的群组：Y349C、Y349D、D399S、F405K、K360E、K409A、K409E、Q347E、Q347R、S354D、K392D和T366W。
18.根据实施例15至17中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述第一修饰包括2至5个氨基酸取代。
19.根据实施例15至18中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述第一修饰包括在选自任何以下群组的位置的组的氨基酸取代：1)Y349和T366；2)Y349、T366和F405；3)Y349、T366和K409；4)Y349、T366、F405、K360和Q347；5)Y349、T366、F405和Q347；6)Y349、T366、K409、K360和Q347；7)Y349、T366、K409和Q347；8)T366、K409和K392；9)T366和K409；10)T366、K409、Y349和S354；11)T366和F405；12)T366、F405和D399；以及13)T366、F405、Y349和S354；其中氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
20.根据实施例15至19中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述第一修饰包括选自任何以下群组的氨基酸取代的组：1)Y349C和T366W；2)Y349C、T366W和F405K；3)Y349C、T366W和K409E；4)Y349C、T366W和K409A；5)Y349C、T366W、F405K、K360E和Q347E；6)Y349C、T366W、F405K和Q347R；7)Y349C、T366W、K409A、K360E和Q347E；8)Y349C、T366W、K409A和Q347R；9)T366W、K409A和K392D；10)T366W和K409A；11)T366W、K409A和Y349D；12)T366W、K409A、Y349D和S354D；13)T366W和F405K；14)T366W、F405K和D399S；15)T366W、F405K和Y349D；以及16)T366W、F405K、Y349D和S354D；其中氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
21.根据实施例15至20中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述第二修饰包括位置T366、L368和Y407处的氨基酸取代以及在选自由D356、D399、E357、F405、K360、K392、K409和Q347组成的群组的一个或多个位置处的氨基酸取代，其中氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
22.根据实施例21所述的蛋白质异二聚体，其中第二修饰所包括的氨基酸取代选自由D356C、D399S、E357A、F405K、K360E、K392D、K409A、L368A、L368G、Q347E、Q347R、T366S、Y407A和Y407V组成的群组。
23.根据实施例15至22中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述第二修饰包括4至6个位置处的氨基酸取代。
24.根据实施例15至23中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述第二修饰包括在选自任何以下群组的位置的组的氨基酸取代：1)D356、T366、L368、Y407和F405；2)D356、T366、L368和Y407；3)D356、T366、L368、Y407和Q347；4)D356、T366、L368、Y407、K360和Q347；5)D356、T366、L368、Y407、F405和Q347；6)D356、T366、L368、Y407、F405、K360和Q347；7)T366、L368、Y407、D399和F405；8)T366、L368、Y407和F405；9)T366、L368、Y407、F405和E357；10)T366、L368、Y407和K409；11)T366、L368、Y407、K409和K392；以及12)T366、L368、Y407、K409和E357；其中氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
25.根据实施例15至24中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述第二修饰包括选自任何以下群组的氨基酸取代的组：1)D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；2)D356C、T366S、L368A和Y407V；3)D356C、T366S、L368A、Y407V和Q347R；4)D356C、T366S、L368A、Y407V、K360E和Q347E；5)D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K和Q347R；6)D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K、K360E和Q347E；7)T366S、L368A、Y407V、D399S和F405K；8)T366S、L368G、Y407A和F405K；9)T366S、L368A、Y407V、F405K和E357A；10)T366S、L368A、Y407V和K409A；11)T366S、L368A、Y407V、K409A和K392D；12)T366S、L368G、Y407A和K409A；13)T366S、L368A、Y407V、K409A和E357A；其中氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
26.根据实施例15至25中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中第一Fc亚基包括第一修饰，第二Fc亚基包括第二修饰，且第一修饰和第二修饰包括选自任何以下群组的位置的组的氨基酸取代：1)第一修饰：Y349和T366；第二修饰：D356、T366、L368、Y407和F405；2)第一修饰：Y349、T366和F405；第二修饰：D356、T366、L368和Y407；3)第一修饰：Y349、T366和K409；第二修饰：D356、T366、L368、Y407和F405；4)第一修饰：Y349、T366、F405、K360和Q347；第二修饰：D356、T366、L368、Y407和Q347；5)第一修饰：Y349、T366、F405和Q347；第二修饰：D356、T366、L368、Y407、K360和Q347；6)第一修饰：Y349、T366、K409、K360和Q347；第二修饰：D356、T366、L368、Y407、F405和Q347；7)第一修饰：Y349、T366、K409和Q347；第二修饰：D356、T366、L368、Y407、F405、K360和Q347；8)第一修饰：T366、K409和K392；第二修饰：T366、L368、Y407、D399和F405；9)第一修饰：T366和K409；第二修饰：T366、L368、Y407和F405；10)第一修饰：T366、K409和Y349；第二修饰：T366、L368、Y407、F405和E357；11)第一修饰：T366、K409、Y349和S354；第二修饰：T366、L368、Y407、F405和E357；12)第一修饰：T366和F405；第二修饰：T366、L368、Y407和K409；13)第一修饰：T366、F405和D399；第二修饰：T366、L368、Y407、K409和K392；14)第一修饰：T366、F405和Y349；第二修饰：T366、L368、Y407、K409和E357；15)第一修饰：T366、F405、Y349和S354；第二修饰：T366、L368、Y407、K409和E357；其中氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
27.根据实施例15至26中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中第一Fc亚基包括第一修饰，第二Fc亚基包括第二修饰，其中第一修饰和第二修饰包括选自任何以下群组的氨基酸取代的组：1)第一修饰：Y349C和T366W；第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；2)第一修饰：Y349C、T366W和F405K；第二修饰：D356C、T366S、L368A和Y407V；3)第一修饰：Y349C、T366W和K409E；第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；4)第一修饰：Y349C、T366W和K409A；第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和F405K；5)第一修饰：Y349C、T366W、F405K、K360E和Q347E；第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V和Q347R；6)第一修饰：Y349C、T366W、F405K和Q347R；第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V、K360E和Q347E；7)第一修饰：Y349C、T366W、K409A、K360E和Q347E；第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K和Q347R；8)第一修饰：Y349C、T366W、K409A和Q347R；第二修饰：D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K、K360E和Q347E；9)第一修饰：T366W、K409A和K392D；第二修饰：T366S、L368A、Y407V、D399S和F405K；10)第一修饰：T366W和K409A；第二修饰：T366S、L368G、Y407A和F405K；11)第一修饰：T366W、K409A和Y349D；第二修饰：T366S、L368A、Y407V、F405K和E357A；12)第一修饰：T366W、K409A、Y349D和S354D；第二修饰：T366S、L368A、Y407V、F405K和E357A；13)第一修饰：T366W和F405K；第二修饰：T366S、L368A、Y407V和K409A；14)第一修饰：T366W、F405K和D399S；第二修饰：T366S、L368A、Y407V、K409A和K392D；15)第一修饰：T366W和F405K；第二修饰：T366S、L368G、Y407A和K409A；16)第一修饰：T366W、F405K和Y349D；第二修饰：T366S、L368A、Y407V、K409A和E357A；17)第一修饰：T366W、F405K、Y349D和S354D；第二修饰：T366S、L368A、Y407V、K409A和E357A；其中氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
28.根据实施例27所述的蛋白质异二聚体，其中第一Fc亚基包括第一修饰，第二Fc亚基包括第二修饰，第一修饰包括氨基酸取代T366W和K409A，第二修饰包括氨基酸取代T366S、L368G、Y407A和F405K，其中氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
29.根据实施例1至28中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述一个或多个白介素中的至少一个与所述第二Fc亚基融合。
30.根据实施例29所述的蛋白质异二聚体，其中所述一个或多个白介素中的至少一个与所述第二Fc亚基的氨基端氨基酸融合。
31.根据实施例30所述的蛋白质异二聚体，其中在所述第二单体成员中，所述一个或多个白介素中的至少两个彼此融合以形成白介素二聚体，所述白介素二聚体进一步与所述第二Fc亚基的所述氨基端氨基酸融合。
32.根据实施例1至31中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述第一单体成员不包括任何白介素。
33.根据实施例1至32中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述第一单体成员由所述第一Fc亚基组成。
34.根据实施例1至31中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述一个或多个白介素中的至少一个与所述第一Fc亚基融合。
35.根据实施例34所述的蛋白质异二聚体，其中所述一个或多个白介素中的至少一个与所述第一Fc亚基的氨基端氨基酸融合。
36.根据实施例35所述的蛋白质异二聚体，其中在所述第一单体成员中，所述一个或多个白介素中的至少两个彼此融合以形成白介素二聚体，所述白介素二聚体进一步与所述第一Fc亚基的所述氨基端氨基酸融合。
37.根据实施例34至36中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述第二单体成员不包括任何白介素。
38.根据实施例34至37中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述第二单体成员由所述第二Fc亚基组成。
39.一种或多种分离的核酸，其编码实施例1至38中任一项所述的蛋白质异二聚体。
40.一种或多种载体，包括实施例39所述的一种或多种分离的核酸。
41.一种分离的宿主细胞，包括实施例39所述的一种或多种分离的核酸或实施例40所述的一种或多种载体。
42.一种蛋白质混合物，包括：1)实施例1至38中任一项所述的蛋白质异二聚体；2)由实施例1至38中任一项所述的第一单体成员的两个相同拷贝形成的第一同源二聚体；以及3)由实施例1至38中任一项所述的第二单体成员的两个相同拷贝形成的第二同源二聚体；其中所述蛋白质异二聚体在所述蛋白质混合物中的百分比为至少50％。
43.根据实施例42所述的蛋白质混合物，其中第二同二聚体的百分比小于第一同二聚体的百分比。
44.根据实施例42至43中任一项所述的蛋白质混合物，其中所述第二同二聚体的百分比为最多10％。
45.根据实施例42至44中任一项所述的蛋白质混合物，其中所述蛋白质混合物实质上不包括所述第二同二聚体。
46根据实施例42至45中任一项所述的蛋白质混合物，其中所述蛋白质混合物由宿主细胞直接产生，无需富集所述蛋白质异二聚体和/或去除所述第一或所述第二同二聚体。
47.一种药物组合物，包括实施例1至38中任一项所述的蛋白质异二聚体或实施例42至46中任一项所述的蛋白质混合物以及可选的药学上可接受的赋形剂。
48.根据实施例47所述的药物组合物，其中蛋白质异二聚体被配制为用于经口施用、静脉内施用、肌肉内施用、肿瘤位点原位施用、吸入、直肠施用、阴道施用、经皮施用或经皮下储集施用。
49.一种实施例1至38中任一项所述的蛋白质异二聚体或实施例42至46中任一项所述的蛋白质混合物的用途，其用于制造用于抑制肿瘤或肿瘤细胞生长的药物和/或试剂盒。
50.一种实施例1至38中任一项所述的蛋白质异二聚体或实施例42至46中任一项所述的蛋白质混合物的用途，其用于制造用于治疗有需要的个体的癌症的药物。
51.一种用于抑制肿瘤或肿瘤细胞生长的方法，包括使所述肿瘤或肿瘤细胞与治疗有效量的实施例1至38中任一项所述的蛋白质异二聚体或实施例42至46中任一项所述的蛋白质混合物接触。
52.根据实施例51所述的方法，其中所述接触在体外或体内发生。
53.一种用于治疗有需要的个体的癌症的方法，包括向个体施用治疗有效量的实施例1至38中任一项所述的蛋白质异二聚体或实施例42至46中任一项所述的蛋白质混合物。
54.一种产生实施例1至38中任一项所述的蛋白质异二聚体或实施例42至46中任一项所述的蛋白质混合物的方法，其包括(i)在实现蛋白质异二聚体的表达的条件下培养实施例41所述的宿主细胞，以及(ii)收集表达的蛋白质异二聚体或包括所述蛋白质异二聚体的蛋白质混合物。
虽然本文已展示和描述本申请的优选实施例，但本领域的技术人员将显而易见，这些实施例仅仅通过实例的方式提供。本领域的技术人员将想到不脱离本申请的众多变化形式、改变和替换。应理解，本文所描述的本申请实施例的各种替代方案可以用于实践本申请。下文权利要求书旨在限定本申请的范围，并且借此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构以及其等效物。
实例
下文提供的实例和制备进一步说明和例示本申请的蛋白质异二聚体以及其使用和制备方法。应理解，本申请的范围不以任何方式受以下实例和制备的范围限制。
实例1 核酸的修饰和制备
1.1 Fc修饰
对人类IgG1 Fc域的界面残基进行氨基酸修饰(例如氨基酸取代)以获得以下修饰群组(如下表1中所示)，本申请中链A也称为Fc9或第一Fc亚基，链B也称为Fc6或第二Fc亚基：
Figure BDA0002410428100000361
Figure BDA0002410428100000371
表1氨基酸修饰群组
随后，如下文详细说明，使用ScFv-Fc/Fc系统检查包括上表1中所列的修饰群组的异二聚体蛋白的形成。
首先，从数据库Uniprot获得人类免疫球蛋白γ1(IgG1)恒定区氨基酸序列(P01857)，以得到野生型人类IgG1-Fc区氨基酸序列(SEQ ID NO:30)。通过RT-PCR从人类PBMC总RNA获得编码野生型人类IgG1-Fc的多核苷酸片段(SEQ ID NO:31，命名为Fc基因片段)。通过重叠PCR将编码小鼠κIII信号肽的多核苷酸片段(SEQ ID NO:32)添加到Fc基因的5’端，随后亚克隆到载体pcDNA4(Invitrogen，Cat V86220)，以获得在哺乳动物细胞中表达人类IgG1-Fc的重组表达载体。
合成编码ScFv-Fc融合蛋白的核酸分子(SEQ ID NO:33)，其中ScFv是指抗HER2单链抗体，ScFv-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:34中所示。随后将ScFv-Fc基因片段亚克隆到载体pcDNA4(Invitrogen，Cat V86220)，以获得用于在哺乳动物细胞中表达ScFv-Fc融合蛋白的重组表达载体。
在一些情况下，使编码骆驼单域抗体(VhH)的可变区的多肽与Fc基因片段的N端融合，以获得编码融合蛋白VhH-Fc(如SEQ ID NO:36中所示)的融合基因片段(如SEQ ID NO:35中所示)。随后将其亚克隆到载体pcDNA4(Invitrogen，Cat V86220)，以获得用于在哺乳动物细胞中表达融合蛋白VhH-Fc的重组表达载体。
接着，通过重叠PCR分别将上表1中所列的氨基酸修饰引入到ScFv-Fc(第1至17组)、VhH-Fc(第9至12组、第14组、第15组和第17组)和Fc基因片段(第1至8组)，其中链A是指ScFv-Fc中的Fc亚基，链B是指单独的Fc亚基或VhH-Fc中的Fc亚基。将具有氨基酸修饰的基因片段分别亚克隆到载体pcDNA4(Invitrogen，Cat V86220)以获得用于在哺乳动物细胞中表达经修饰ScFv-Fc融合蛋白、经修饰Fc蛋白和经修饰VhH-Fc融合蛋白的重组表达载体。
接着，用PEI将构筑的表达载体转染悬浮培养的HEK293细胞(ATCC CRL-1573TM)转染。对于每一群组，以1:1的比率共转染表达A链(ScFv-Fc融合蛋白)和表达B链(Fc蛋白或VhH-Fc融合蛋白)的表达载体。在培养5到6天后，收集瞬时表达产物的上清液，并且使用ProteinA亲和色谱初步纯化包括对应蛋白质异二聚体的表达产物。每一种初步纯化的表达产物包括分别以各种百分比存在的同二聚体蛋白ScFv-Fc/ScFv-Fc、同二聚体蛋白Fc/Fc(或同二聚体蛋白VhH-Fc/VhH-Fc)和异二聚体蛋白ScFv-Fc/Fc(或异二聚体蛋白ScFv-Fc/VhH-Fc)。由于这些蛋白质(即，同二聚体和异二聚体)的分子量不同，所以其对应百分比可以根据非还原性SDS-PAGE凝胶上所反映的对应谱带强度来确定。所述强度经过量化，结果汇总在下文表2至表5中。
群组 ScFv-Fc同二聚体(％) ScFv-Fc/Fc异二聚体(％) Fc同二聚体(％)
1 24 58 18
2 10 70 20
3 25 57 18
4 10 77 13
表2同二聚体和异二聚体在表达产物中的百分比
Figure BDA0002410428100000381
Figure BDA0002410428100000391
表3同二聚体和异二聚体在表达产物中的百分比
群组 ScFv-Fc同源二聚体(％) ScFv-Fc/VhH-Fc异二聚体(％) VhH-Fc同源二聚体(％)
4 13 68 19
9 7 80 13
10 15 85 0
11 14 83 3
12 10 84 6
表4同二聚体和异二聚体在表达产物中的百分比
群组 ScFv-Fc同源二聚体(％) ScFv-Fc/VhH-Fc异二聚体(％) VhH-Fc同源二聚体(％)
2 9 64 27
14 6 81 13
15 5 88 7
17 9 84 7
表5同二聚体和异二聚体在表达产物中的百分比
如上文表2至表5中可见，所有修饰群组都十分有效地促进了异二聚体形成。出于说明目的，第10组中的修饰(链A中的修饰：T366W+K409A；链B中的修饰：T366S+L368G+Y407A+F405K)用于以下实例中以产生本申请的免疫偶联物或蛋白质混合物。
1.2 (IL10)2-Fc6的制备
首先，从美国国家生物技术信息中心(NCBI)获得人类白介素10(IL10)的序列信息(P22301)，且获得编码其的全长多核苷酸序列。接着，根据来自蛋白质数据库Uniprot的人类免疫球蛋白γ1(IgG1)恒定区的氨基酸序列(P01857)获得人类IgG1-Fc的氨基酸序列(即，P01857的残基104至残基330)。然后，将点突变(T366S、L368G、Y407A和F405K)引入到IgG1-Fc片段，由此获得的多肽被称为Fc6。接着，将连接子序列“(GGGGS)3”(SEQ ID NO:37)添加到Fc6的N端，以获得连接子-Fc6。接着，使用在线工具DNAworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计编码其的对应DNA序列。接着，将连接子序列“(GGGGS)3”(SEQ ID NO:37)添加在IL10的两个拷贝之间，以获得(IL10)2。接着，将编码(IL10)2的多核苷酸序列添加到编码连接子-Fc6的多核苷酸序列的5’端，从而获得并合成编码融合蛋白(IL10)2-Fc6的多核苷酸序列。(IL10)2-Fc6的氨基酸序列如SEQ ID NO:38中所示，编码其的多核苷酸序列如SEQ ID NO:39中所示。
1.3 IL10-Fc的制备
首先，从美国国家生物技术信息中心(NCBI)获得人类白介素10(IL10)的序列信息(P22301)，且获得编码其的全长多核苷酸序列。接着，根据来自蛋白质数据库Uniprot的人类免疫球蛋白γ1(IgG1)恒定区的氨基酸序列(P01857)获得人类IgG1-Fc的氨基酸序列(即，P01857的残基104至残基330)。接着，将连接子序列“(GGGGS)3”(SEQ ID NO:37)添加到IgG1-Fc的N端，以获得连接子-Fc。接着，使用在线工具DNAworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计编码其的对应DNA序列。将编码IL10的多核苷酸序列添加到编码连接子-Fc的多核苷酸序列的5’端，从而获得并合成编码融合蛋白IL10-Fc的多核苷酸序列。IL10-Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:40中所示，编码其的多核苷酸序列如SEQ ID NO:41中所示。
1.4 Fc9的制备
根据来自蛋白质数据库Uniprot的人类免疫球蛋白γ1(IgG1)恒定区的氨基酸序列(P01857)获得人类IgG1-Fc的氨基酸序列(即，P01857的残基104至残基330)。然后，将点突变(T366W和K409A)引入到IgG1Fc片段，由此获得的多肽被称为Fc9。Fc9的氨基酸序列如SEQ ID NO:17中所示，编码其的多核苷酸序列如SEQ ID NO:42中所示。
1.5 抗EGFR(西妥昔单抗(Cetuximab))的制备
获得西妥昔单抗(也称为爱必妥或Erb，其为抗表皮生长因子受体EGFR的抗体)的重链和轻链的全长氨基酸序列，使用在线工具DNAworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)获得编码这些氨基酸序列的对应DNA序列。接着，合成编码西妥昔单抗的轻链(Erb-LC)的核酸分子。Erb-LC的氨基酸序列如SEQ ID NO:43中所示，编码其的对应多核苷酸序列如SEQ IDNO:44所示。接着，将点突变(T366W和K409A)引入到编码西妥昔单抗重链基因的Fc区的多核苷酸序列，合成编码经修饰西妥昔单抗重链的核酸分子(在本文中称为Erb-Fc9)，编码其的对应多肽命名为Erb-Fc9。Erb-Fc9的氨基酸序列如SEQ ID NO:45中所述，编码其的多核苷酸序列如SEQ ID NO:46中所述。
1.6 (IL10)2-Fc的制备
首先，从美国国家生物技术信息中心(NCBI)获得人类白介素10(IL10)的序列信息(P22301)，接着将连接子序列“(GGGGS)3”添加在两个IL10之间，以得到(IL10)2，且获得编码其的全长多核苷酸序列。接着，根据来自蛋白质数据库Uniprot的人类免疫球蛋白γ1(IgG1)恒定区的氨基酸序列(P01857)获得人类IgG1-Fc的氨基酸序列(即，P01857的残基104至残基330)。接着，将连接子序列“(GGGGS)3”(SEQ ID NO:37)添加到IgG1-Fc的N端，以获得连接子-Fc。接着，使用在线工具DNAworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计编码其的对应DNA序列。将编码(IL10)2的多核苷酸序列添加到编码连接子-Fc的多核苷酸序列的5’端，从而获得并合成编码融合蛋白(IL10)2-Fc的多核苷酸序列。(IL10)2-Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:47中所示，编码其的多核苷酸序列如SEQ ID NO:48中所示。
1.7 Fc6-(IL10)2的制备
首先，从美国国家生物技术信息中心(NCBI)获得人类白介素10(IL10)的序列信息(P22301)，且获得编码其的全长多核苷酸序列。接着，根据来自蛋白质数据库Uniprot的人类免疫球蛋白γ1(IgG1)恒定区的氨基酸序列(P01857)获得人类IgG1-Fc的氨基酸序列(即，P01857的残基104至残基330)。然后，将点突变(T366S、L368G、Y407A和F405K)引入到IgG1-Fc片段，由此获得的多肽被称为Fc6。
接着，将连接子序列“(GGGGS)3”(SEQ ID NO:37)添加到Fc6的C端，以获得连接子Fc6-连接子。接着，使用在线工具DNAworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计编码其的对应DNA序列。接着，将连接子序列“(GGGGS)3”(SEQ ID NO:37)添加在IL10的两个拷贝之间，以获得(IL10)2。接着，将编码(IL10)2的多核苷酸序列添加到编码Fc6-连接子的多核苷酸序列的3’端，从而获得并合成编码融合蛋白Fc6-(IL10)2的多核苷酸序列。Fc6-(IL10)2的氨基酸序列如SEQ ID NO:55中所示，编码其的多核苷酸序列如SEQ ID NO:56中所示。
1.8 IL10-Fc6的制备
首先，从美国国家生物技术信息中心(NCBI)获得人类白介素10(IL10)的序列信息(P22301)，且获得编码其的全长多核苷酸序列。接着，根据来自蛋白质数据库Uniprot的人类免疫球蛋白γ1(IgG1)恒定区的氨基酸序列(P01857)获得人类IgG1-Fc的氨基酸序列(即，P01857的残基104至残基330)。然后，将点突变(T366S、L368G、Y407A和F405K)引入到IgG1-Fc片段，由此获得的多肽被称为Fc6。接着，将连接子序列“(GGGGS)3”(SEQ ID NO:37)添加到Fc6的N端，以获得连接子-Fc6。接着，使用在线工具DNAworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计编码其的对应DNA序列。将编码IL10的多核苷酸序列添加到编码连接子-Fc6的多核苷酸序列的5’端，从而获得并合成编码融合蛋白IL10-Fc6的多核苷酸序列。IL10-Fc6的氨基酸序列如SEQ ID NO:53中所示，编码其的多核苷酸序列如SEQ ID NO:54中所示。
1.9 (IL10)2-Fc9的制备
首先，从美国国家生物技术信息中心(NCBI)获得人类白介素10(IL10)的序列信息(P22301)，且获得编码其的全长多核苷酸序列。接着，根据来自蛋白质数据库Uniprot的人类免疫球蛋白γ1(IgG1)恒定区的氨基酸序列(P01857)获得IgG1-Fc的氨基酸序列(即，P01857的残基104至残基330)。然后，将点突变(T366W和K409A)引入到IgG1Fc片段，由此获得的多肽被称为Fc9。接着，将连接子序列“(GGGGS)3”(SEQ ID NO:37)添加到Fc9的N端，以获得连接子-Fc9。接着，使用在线工具DNAworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计编码其的对应DNA序列。接着，将连接子序列“(GGGGS)3”(SEQ ID NO:37)添加在IL10的两个拷贝之间，以获得(IL10)2。接着，将编码(IL10)2的多核苷酸序列添加到编码连接子-Fc9的多核苷酸序列的5’端，从而获得并合成编码融合蛋白(IL10)2-Fc9的多核苷酸序列。(IL10)2-Fc9的氨基酸序列如SEQ ID NO:57中所示，编码其的多核苷酸序列如SEQ ID NO:58中所示。
1.10 Fc6的制备
根据来自蛋白质数据库Uniprot的人类免疫球蛋白γ1(IgG1)恒定区的氨基酸序列(P01857)获得人类IgG1-Fc的氨基酸序列(即，P01857的残基104至残基330)。然后，将点突变(T366S、L368G、Y407A和F405K)引入到IgG1Fc片段，由此获得的多肽被称为Fc6。Fc6的氨基酸序列如SEQ ID NO:18中所示，编码其的多核苷酸序列如SEQ ID NO:59中所示。
实例2 重组质粒的构筑
用HindIII和EcoRI(Takara)消化根据实例1获得的核酸分子(编码(IL10)2-Fc6、IL10-Fc、Fc9、Erb-Fc9、Erb-LC、(IL10)2-Fc、Fc6-(IL10)2、IL10-Fc6、(IL10)2-Fc9和Fc6)，接着分别亚克隆到载体pcDNA4/myc-HisA(Invitrogen,V863-20)。通过测序验证所获得的质粒，正确的重组质粒分别命名为：pcDNA4-(IL10)2-Fc6、pcDNA4-IL10-Fc、pcDNA4-Fc9、pcDNA4-Erb-Fc9、pcDNA4-Erb-LC、pcDNA4-(IL10)2-Fc、pcDNA4-Fc6-(IL10)2、pcDNA4-IL10-Fc6、pcDNA4-(IL10)2-Fc9和pcDNA4-Fc6。
实例3 蛋白质异二聚体的表达和纯化
在转染前两天，准备12×600mL悬浮驯化的HEK293(ATCC，CRL-1573TM)细胞以供瞬时转染，以0.8×106个细胞/毫升的密度接种细胞。两天后，将三等份细胞悬浮液离心，随后在600mL Freestyle293培养基中再次悬浮。
将从实例2获得的重组表达载体分成以下各组：
A组：pcDNA4-IL10-Fc6(200μg)+pcDNA4-Fc9(200μg)
B组：pcDNA4-(IL10)2-Fc6(200μg)+pcDNA4-Fc9(200μg)
C组：pcDNA4-Fc6-(IL10)2(200μg)+pcDNA4-Fc9(200μg)
D组：pcDNA4-(IL10)2-Fc9(200μg)+pcDNA4-Fc6(200μg)
E组：pcDNA4-Erb-Fc9(200μg)+pcDNA4-Erb-LC(200μg)+pcDNA4-(IL10)2-Fc6(200μg)
F组：pcDNA4-IL10-Fc(200μg)
G组：pcDNA4-(IL10)2-Fc(200μg)
在瞬时转染的293F细胞中产生所有蛋白质。简而言之，使FreeStyle 293F细胞(Invitrogen)在293F培养基(Invitrogen)中生长，用非线性质粒DNA和293Fectin试剂(Invitrogen)转染，并以80至100毫升/瓶的体积在37℃、5％CO2下在摇瓶中分批生长6天。通过一步proteinA色谱纯化所有蛋白质。通过SDS-PAGE和SEC-HPLC确定每种蛋白质的质量。类似地，用SDS-PAGE验证并确认本申请的其它蛋白质异二聚体的表达和纯化结果。
由此获得的蛋白质异二聚体命名为(从A组到E组分别为)：IL10-Fc9、(IL10)2-Fc9、反向(IL10)2-Fc9、(IL10)2-Fc6(分别如图1A到图1D所示)和Erb-(IL10)2，从F组到G组获得的蛋白质异二聚体命名为(IL10-Fc)2和(IL10)2-Fc。
作为实例，图2A到图2F展示，蛋白质异二聚体(IL10)2-Fc9和Erb-(IL10)2已成功表达和纯化。同样类似地获得所有其它蛋白质。
在图2A中，泳道1装载Erb-(IL10)2(还原的)；泳道2装载标记(marker)；泳道3装载Erb-(IL10)2(非还原的)。
在图2B中，泳道1装载(IL10-Fc)2(原始样本)；泳道2装载(IL10-Fc)2(流通)；泳道3装载(IL10-Fc)2(洗脱)；泳道4装载标记(marker)；泳道5装载(IL10)2-Fc(洗脱)；泳道6装载(IL10)2-Fc(原始样本)；泳道7装载(IL10)2-Fc(流通)；泳道8装载BSA；泳道9装载空白缓冲剂；泳道10为空白；泳道11装载(IL10)2-Fc(洗脱；非还原的)；泳道12装载(IL10)2-Fc(洗脱；非还原的)。
在图2C中，泳道1装载(IL10)2-Fc9(原始样本)；泳道2装载(IL10)2-Fc9(流通)；泳道3装载(IL10)2-Fc9(洗脱)；泳道4装载标记(marker)；泳道5装载BSA；泳道6装载空白缓冲剂；泳道7为空白；泳道8装载(IL10)2-Fc9(洗脱；非还原的)。
图2D展示SEC-HPLC结果，可以看出非期望的寡聚物在(IL10-Fc)2的表达产物中的百分比为约27％。
图2E展示SEC-HPLC结果，可以看出非期望的寡聚物在(IL10)2-Fc9的表达产物中的百分比为约3.3％。
图2F展示SEC-HPLC结果，可以看出非期望的寡聚物在(IL10)2-Fc的表达产物中的百分比为约26％。
根据这些结果，可以看出已成功产生本申请的蛋白质异二聚体。有趣的是，与同二聚体对照(IL10-Fc)2和(IL10)2-Fc相比，(IL10)2-Fc9的表达产物含有少得多的非期望的寡聚物。
实例4 异二聚体蛋白的特性的识别
4.1 对结合人类IL10R1蛋白的能力的检测(ELISA)
用包被缓冲液((50mM Na2CO3，NaHCO3 pH 9.6)将人类IL10R1(R&D，9100-R1-050)稀释成5μg/mL，100微升/孔，在4℃下过夜。洗涤后，在37℃下用3％BSA-PBS密封培养板1小时。接着，将所有样本从10000ng/mL进行稀释且稀释3倍至总共11个浓度，其中稀释剂(1％BSA-PBS)作为对照，在37℃下培育2小时。洗涤后，添加山羊抗hIgG-HRP(Sigma，A0170)在37℃下培育1小时。添加可溶单组分TMB底物显影液，在室温下于暗处进行显影5至10分钟。添加2N H2SO4 50微升/孔，以终止显色反应。在MD SpectraMax Plus 384酶标仪上读取OD450 nm值，将SoftMax Pro v5.4用于数据处理和作图分析，其中结果展示于图3和表6中。
异二聚体蛋白的名称 EC<sub>50</sub>(ng/ml)
Erb-(IL10)<sub>2</sub> 2.940
反向(IL10)<sub>2</sub>-Fc9 12.31
(IL10)<sub>2</sub>-Fc6 7.166
(IL10)<sub>2</sub>-Fc9 9.683
表6异二聚体蛋白与人类IL10R1蛋白结合的EC50
如图3中所示，Erb-(IL10)2与hIL10R1之间的亲和力最高。反向(IL10)2-Fc9、(IL10)2-Fc6和(IL10)2-Fc9与hIL10R1的结合亲和力彼此类似。
4.2 MC/9细胞增殖的增强
以100微升/孔将MC/9(ATCC CRL-8306)细胞接种到96孔板中。MC/9的量为5×104/孔。将所有样本稀释到最大浓度为2×104pM。接着，将样本稀释4倍至总共9个浓度，100微升/孔。对于对照组，添加100μL的DMEM培养基。每个样本一式两份。接着在37℃和5％CO2下培育2天。接着，丢弃140微升/孔的上清液，并添加60微升/孔的CellTiter-Glo细胞活力分析剂(Promega G7571)。用定轨摇床在暗处培育15分钟(100rpm)。接着，将100微升/孔上清液转移到新的96孔白色板中，用MD Spectra Max Plus 384酶标仪在全波长下测量发光，其中结果展示于图4中。
如图4中所示，(IL10)2-Fc9和(IL10)2-Fc6在MC/9细胞系中体外以几乎相同的水平增殖。与(IL10)2-Fc9相比，反向(IL10)2-Fc9具有较好的增殖效果。使用MC/9细胞的体外功能研究显示，(IL10)2-Fc9与(IL10)2-Fc6的生物活性类似，而反向(IL10)2-Fc9展示较高生物活性。
实例5 肿瘤控制
5.1 动物和细胞培养
从中国科学院实验动物中心(中国上海)获得8周大的雌性C57BL/6小鼠并保持在特定无病原体条件下。根据当地伦理委员会使用所有动物。这项研究受到《医学实验动物的护理与使用指南》(Guide for the Care and Use of Medical Laboratory Animals)(中华人民共和国卫生部，1998)中的推荐规范的认可。内部产生B16F10黑色素瘤细胞系并在补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100单位/毫升青霉素和100μg/ml链霉素(GibcoInvitrogen)的DMEM培养基中生长。
5.2 肿瘤生长
将B16F10细胞(5×106)皮下(s.c.)接种到小鼠侧腹并让其生长约7天。肿瘤体积记录为两个垂直直径(长度和宽度)并计算为V＝ab2/2，其中a和b分别为最长和最短直径。7天后，测量到肿瘤体积为大约70mm3。
5.3 治疗
在植入B16F10细胞7天后，分别以0.5mg/kg和2.5mg/kg的剂量腹膜内(i.p.)或瘤内(i.t.)注射(IL10)2-Fc9或同种型(hIgG)。每星期实施给药两次，总共3次。每星期测量肿瘤尺寸两次，计算肿瘤的体积以获得肿瘤生长曲线。结果展示于图5A到图5B中。在图5A中，横坐标为植入B16F10细胞后的天数，纵坐标为平均肿瘤体积，可以看出，(IL10)2-Fc9在i.p.或i.t.施用时可以在体内有效减小肿瘤体积，而对照的同种型不能。图5B展示用不同剂量的(IL10)2-Fc9治疗(i.p.和i.t.)第22天的肿瘤体积。重复测量肿瘤尺寸5次。可以看出，(IL10)2-Fc9在以不同剂量i.p.和i.t.施用时在体内减小肿瘤体积。
实例6 蛋白质异二聚体对肿瘤控制的作用
6.1 本申请的(IL10)2-Fc9(高浓度)的作用
如上文在实例5中所述获得C57BL/6肿瘤控制模型。将小鼠分为两组，每组5只小鼠：同种型对照组用0.65mg/kg人类IgG1处理；(IL10)2-Fc9组用0.65mg/kg(IL10)2-Fc9处理。在第0天用B16F10-EGFR5细胞s.c.对C57BL/6小鼠进行接种；分别在第7天、第10天和第14天i.p.注射(IL10)2-Fc9或人类IgG1。
图6A展示同种型对照和本申请的(IL10)2-Fc9对肿瘤生长的作用。可以看出，(IL10)2-Fc9在体内有效减小肿瘤体积，而同种型对照不能。
6.2 本申请的(IL10)2-Fc9(低浓度)的作用
如上文在实例5中所述获得C57BL/6肿瘤控制模型。将小鼠分为两组，每组5只小鼠：同种型对照组用0.5mg/kg人类IgG1处理；(IL10)2-Fc9组用0.13mg/kg(IL10)2-Fc9处理。在第0天用B16F10-EGFR5细胞s.c.对C57BL/6小鼠进行接种；分别在第7天、第10天和第14天i.p.注射(IL10)2-Fc9或人类IgG1。
图6B展示同种型对照和本申请的(IL10)2-Fc9对肿瘤生长的作用。可以看出，(IL10)2-Fc9在体内有效减小肿瘤体积，而同种型对照不能。与实例6.1中的结果相比，(IL10)2-Fc9的低浓度未影响肿瘤控制作用的结果。
虽然本文已展示和描述本申请的优选实施例，但本领域的技术人员将显而易见，这些实施例仅仅通过实例的方式提供。本申请不打算受说明书中提供的具体实例限制。虽然已参考前述说明书描述本申请，但本文实施例的描述和说明不打算以限制性意义进行。本领域的技术人员将想到不脱离本申请的众多变化形式、改变和替换。此外，将理解，取决于各种条件和变量，本申请的所有方面不限于本文中所述的具体叙述、配置或相对比例。应理解，本文所描述的本申请实施例的各种替代方案可以用于实践本申请。因此，设想本申请应同样涵盖任何这类替代方案、修改、变化形式或等效物。下文权利要求书旨在限定本申请的范围，并且借此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构以及其等效物。
序列表
<110> 苏州丁孚靶点生物技术有限公司
<120> 一种蛋白质异二聚体及其用途
<130> 0027-PA-018CN
<160> 59
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Ala Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 14
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Glu Val
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130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
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165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 15
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
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Pro Gly Lys
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<211> 227
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Pro Gly Lys
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<212> PRT
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210 215 220
Pro Gly Lys
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<211> 227
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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195 200 205
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Pro Gly Lys
225
<210> 21
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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115 120 125
Asp Thr Leu Pro Pro Asp Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
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Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
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180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 22
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 23
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> T366S+L368A+Y407V+K409A
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
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Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 24
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<400> 24
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Pro Gly Lys
225
<210> 25
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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195 200 205
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210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 26
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> T366W+F405K
<400> 26
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195 200 205
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210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 27
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> T366S+L368G+Y407A+K409A
<400> 27
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
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180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
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210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 28
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> T366W +F405K +Y349D
<400> 28
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
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130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Ala Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 29
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> T366S+L368A+Y407V +K409A +E357A
<400> 29
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asn Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Asp Thr Leu Pro Pro Asp Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 30
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> wildtype human IgG1-Fc region amino acid
<400> 30
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 31
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Fc gene fragment
<400> 31
gacaagaccc acacctgccc cccctgcccc gcccccgagc tgctgggcgg ccccagcgtg 60
ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatca gccgcacccc cgaggtgacc 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgagaac cccgaggtga agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag ccccgcgagg agcagtacaa cagcacctac 240
cgcgtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtga gcaacaaggc cctgcccgcc cccatcgaga agaccatcag caaggccaag 360
ggccagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcccccca gccgcgacga gctgaccaag 420
aaccaggtga gcctgacctg cctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccccgt gctggacagc 540
gacggcagct tcttcctgta cagcaagctg accgtggaca agagccgctg gcagcagggc 600
aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagagc 660
ctgagcctga gccccggcaa g 681
<210> 32
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> polynucleotide fragment encoding a mouse kappaIII signal peptide
<400> 32
atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60
gacaagaccc acacctgccc cccctgcccc gcccccgagc tgctgggcgg ccccagcgtg 120
ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatca gccgcacccc cgaggtgacc 180
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgagaac cccgaggtga agttcaactg gtacgtggac 240
ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag ccccgcgagg agcagtacaa cagcacctac 300
cgcgtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 360
tgcaaggtga gcaacaaggc cctgcccgcc cccatcgaga agaccatcag caaggccaag 420
ggccagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcccccca gccgcgacga gctgaccaag 480
aaccaggtga gcctgacctg cctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 540
tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccccgt gctggacagc 600
gacggcagct tcttcctgta cagcaagctg accgtggaca agagccgctg gcagcagggc 660
aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagagc 720
ctgagcctga gccccggcaa g 741
<210> 33
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> gene of ScFv-Fc fusion protein
<400> 33
atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60
gaggtgcagc tgctggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggccgcag cctgcgcctg 120
agctgcatcg ccagcggctt caccttcagc agctacccca tgacctgggt gcgccaggcc 180
cccggcaagg gcctggagtg ggtggccagc atcagctacg acggcagcta caagtacaag 240
gccgacagca tgaagggccg cctgaccatc agccgcgaca acagcaagaa caccctgtac 300
ctggagatga acagcctgac cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcaccgcc 360
ttcttcaacg cctacgactt ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagcgccagc 420
accaagggcc ccagcgtggg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcga gatcgtgatg 480
acccagagcc ccgccaccct gagcgtgagc cccggcgagc gcgccaccct gagctgccgc 540
gccagccaga gcgtgcgcag caacctggcc tggtaccagc agaagcccgg ccaggccccc 600
cgcctgctga tctacgccgc cagcacccgc gccaccggca tccccgcccg cttcagcggc 660
agcggcagcg gcaccgagtt caccctgacc atcagcagcc tgcagagcga ggacttcgcc 720
gtgtactact gccagcagta caacgagtgg ttccgcacca gcggccaggg caccaaggtg 780
gagatcaagc gcgacaagac ccacacctgc cccccctgcc ccgcccccga gctgctgggc 840
ggccccagcg tgttcctgtt cccccccaag cccaaggaca ccctgatgat cagccgcacc 900
cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg agccacgaga accccgaggt gaagttcaac 960
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agccccgcga ggagcagtac 1020
aacagcacct accgcgtggt gagcgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 1080
aaggagtaca agtgcaaggt gagcaacaag gccctgcccg cccccatcga gaagaccatc 1140
agcaaggcca agggccagcc ccgcgagccc caggtgtaca ccctgccccc cagccgcgac 1200
gagctgacca agaaccaggt gagcctgacc tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac 1260
atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac cacccccccc 1320
gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagagccgc 1380
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1440
acccagaaga gcctgagcct gagccccggc aag 1473
<210> 34
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ScFv-Fc fusion protein
<400> 34
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Pro Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Lys Ala Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Ala Phe Phe Asn Ala Tyr Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
145 150 155 160
Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Arg Ala Thr
180 185 190
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Tyr Asn Glu Trp Phe Arg Thr Ser Gly Gln Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys Arg Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asn Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305 310 315 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 35
<211> 1121
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> a fusion gene fragment encoding the fusion protein VhH-Fc
<400> 35
atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 120
tcctgtgcag cctctgaata catctacagt agctactgca tggcctggtt ccgccaggct 180
ccagggaagg agcgcgaggg ggtcgcagtt attgggagtg atggtagcac aagctacgca 240
gactccgtga aaggccgatt caccatctcc aaagacaacg ccaagaacac tctgtatctg 300
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccatgtact actgtgcggc catcggtggt 360
tactgctacc aaccacccta tgagtaccag tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 420
tcccagaacc gaaaagcagc gacaagaccc acacctgccc cccctgcccc gcccccgagc 480
tgctgggcgg ccccagcgtg ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatca 540
gccgcacccc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgagaac cccgaggtga 600
agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag ccccgcgagg 660
agcagtacaa cagcacctac cgcgtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc 720
tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtga gcaacaaggc cctgcccgcc cccatcgaga 780
agaccatcag caaggccaag ggccagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcccccca 840
gccgcgacga gctgaccaag aaccaggtga gcctgacctg cctggtgaag ggcttctacc 900
ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca 960
ccccccccgt gctggacagc gacggcagct tcttcctgta cagcaagctg accgtggaca 1020
agagccgctg gcagcagggc aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca 1080
accactacac ccagaagagc ctgagcctga gccccggcaa g 1121
<210> 36
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> fusion protein VhH-Fc
<400> 36
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Tyr Ser Ser Tyr
20 25 30
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Val Ile Gly Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ile Gly Gly Tyr Cys Tyr Gln Pro Pro Tyr Glu Tyr Gln Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp
115 120 125
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
145 150 155 160
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
165 170 175
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
180 185 190
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
195 200 205
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
210 215 220
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
225 230 235 240
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
245 250 255
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
260 265 270
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
275 280 285
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
290 295 300
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
305 310 315 320
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
325 330 335
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
340 345 350
Gly Lys
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> linker 1
<400> 37
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 38
<211> 582
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> amino acid sequence of (IL10)2-Fc6
<400> 38
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser
165 170 175
Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly
180 185 190
Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val
195 200 205
Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys
210 215 220
Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu
225 230 235 240
Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu
245 250 255
Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn
260 265 270
Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro
275 280 285
Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn
290 295 300
Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile
305 310 315 320
Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn Gly
325 330 335
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro
340 345 350
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
355 360 365
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
370 375 380
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
385 390 395 400
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
405 410 415
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
420 425 430
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
435 440 445
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
450 455 460
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
465 470 475 480
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
485 490 495
Gln Val Ser Leu Ser Cys Gly Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
500 505 510
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
515 520 525
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Ala Ser Lys
530 535 540
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
545 550 555 560
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
565 570 575
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580
<210> 39
<211> 1746
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> gene of (IL10)2-Fc6
<400> 39
agccccggcc agggcacaca gtccgagaac agctgcaccc actttcccgg caacctgcct 60
aacatgctga gggacctgag ggacgccttc agcagggtga agaccttctt ccagatgaag 120
gaccagctgg ataacctgct gctgaaggag agcctgctgg aggacttcaa gggctacctg 180
ggctgccagg ccctgagcga gatgatccag ttctacctgg aggaggtgat gccccaggcc 240
gagaaccagg accccgacat caaggcccac gtgaacagcc tgggcgagaa cctgaagacc 300
ctgaggctga ggctgaggag gtgccacagg ttcctgccct gtgagaacaa atccaaggcc 360
gtggagcagg tgaagaacgc cttcaacaag ctgcaggaaa agggcatcta caaggccatg 420
agcgagttcg acatctttat caactatatc gaggcctaca tgacaatgaa gatcaggaac 480
ggcggcggcg gcagcggggg cggcggcagc ggaggaggcg gcagcagccc cggccagggc 540
acacagtccg agaacagctg cacccacttt cccggcaacc tgcctaacat gctgagggac 600
ctgagggacg ccttcagcag ggtgaagacc ttcttccaga tgaaggacca gctggataac 660
ctgctgctga aggagagcct gctggaggac ttcaagggct acctgggctg ccaggccctg 720
agcgagatga tccagttcta cctggaggag gtgatgcccc aggccgagaa ccaggacccc 780
gacatcaagg cccacgtgaa cagcctgggc gagaacctga agaccctgag gctgaggctg 840
aggaggtgcc acaggttcct gccctgtgag aacaaatcca aggccgtgga gcaggtgaag 900
aacgccttca acaagctgca ggaaaagggc atctacaagg ccatgagcga gttcgacatc 960
tttatcaact atatcgaggc ctacatgaca atgaagatca ggaacggcgg cggcggcagc 1020
gggggcggcg gcagcggagg aggcggcagc gagcctaagt ccagcgacaa gacccacacc 1080
tgcccccctt gccccgctcc ggaactcctg ggcggaccgt cagtcttcct cttcccccca 1140
aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 1200
gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 1260
aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1320
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1380
aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1440
ccacaggtgt ataccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1500
agttgcgggg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1560
cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgttgg actccgacgg ctccttcaag 1620
ctcgccagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1680
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1740
ggtaaa 1746
<210> 40
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> amino acid sequence of IL10-Fc
<400> 40
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
165 170 175
Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
180 185 190
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
195 200 205
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
210 215 220
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
225 230 235 240
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
245 250 255
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
260 265 270
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
275 280 285
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
290 295 300
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
305 310 315 320
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
325 330 335
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
340 345 350
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
355 360 365
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
370 375 380
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
385 390 395 400
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405
<210> 41
<211> 1221
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> gene of IL10-Fc
<400> 41
agccccggcc agggcacaca gtccgagaac agctgcaccc actttcccgg caacctgcct 60
aacatgctga gggacctgag ggacgccttc agcagggtga agaccttctt ccagatgaag 120
gaccagctgg ataacctgct gctgaaggag agcctgctgg aggacttcaa gggctacctg 180
ggctgccagg ccctgagcga gatgatccag ttctacctgg aggaggtgat gccccaggcc 240
gagaaccagg accccgacat caaggcccac gtgaacagcc tgggcgagaa cctgaagacc 300
ctgaggctga ggctgaggag gtgccacagg ttcctgccct gtgagaacaa atccaaggcc 360
gtggagcagg tgaagaacgc cttcaacaag ctgcaggaaa agggcatcta caaggccatg 420
agcgagttcg acatctttat caactatatc gaggcctaca tgacaatgaa gatcaggaac 480
ggcggcggcg gcagcggggg cggcggcagc ggaggaggcg gcagcgagcc taagtccagc 540
gacaagaccc acacctgccc cccttgcccc gctccggaac tcctgggcgg accgtcagtc 600
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 660
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 720
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 780
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 840
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 900
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 960
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1020
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gttggactcc 1080
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1140
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1200
ctctccctgt ctccgggtaa a 1221
<210> 42
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> gene of Fc9
<400> 42
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gctccggaac tcctgggcgg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccaa gtcgggatga gctgaccaag 420
aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gttggactcc 540
gacggctcct tcttcctcta cagcgcgctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggtaa a 681
<210> 43
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> amino acid sequence of Erb-LC
<400> 43
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 44
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> gene of Erb-LC
<400> 44
gacatcctgc tgacccagag ccccgtgatc ctgagcgtga gccccggcga gcgcgtgagc 60
ttcagctgcc gcgccagcca gagcatcggc accaacatcc actggtacca gcagcgcacc 120
aacggcagcc cccgcctgct gatcaagtac gccagcgaga gcatcagcgg catccccagc 180
cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga gcatcaacag cgtggagagc 240
gaggacatcg ccgactacta ctgccagcag aacaacaact ggcccaccac cttcggcgcc 300
ggcaccaagc tggagctgaa gcgcaccgtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctgagcagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cgcggcgagt gc 642
<210> 45
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> amino acid sequences of Erb-Fc9
<400> 45
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 46
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> gene of Erb-Fc9
<400> 46
caggtgcagc tgaagcagag cggccccggc ctggtgcagc ccagccagag cctgagcatc 60
acctgcaccg tgagcggctt cagcctgacc aactacggcg tgcactgggt gcgccagagc 120
cccggcaagg gcctggagtg gctgggcgtg atctggagcg gcggcaacac cgactacaac 180
acccccttca ccagccgcct gagcatcaac aaggacaaca gcaagagcca ggtgttcttc 240
aagatgaaca gcctgcagag caacgacacc gccatctact actgcgcccg cgccctgacc 300
tactacgact acgagttcgc ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcgccgcc 360
agcactaagg ggccctctgt gtttccactc gccccttcta gcaaaagcac ttccggagga 420
actgccgctc tgggctgtct ggtgaaagat tacttccccg aaccagtcac tgtgtcatgg 480
aactctggag cactgacatc tggagttcac acctttcctg ctgtgctgca gagttctgga 540
ctgtactccc tgtcatctgt ggtcaccgtg ccatcttcat ctctggggac ccagacctac 600
atctgtaacg tgaaccacaa accctccaac acaaaagtgg acaaacgagt cgaaccaaaa 660
tcttgtgaca aaacccacac atgcccaccg tgcccagctc cggaactcct gggcggaccg 720
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccaagtcg ggatgagctg 1080
accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgttg 1200
gactccgacg gctccttctt cctctacagc gcgctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347
<210> 47
<211> 582
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> amino acid sequence of (IL10)2-Fc
<400> 47
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser
165 170 175
Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly
180 185 190
Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val
195 200 205
Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys
210 215 220
Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu
225 230 235 240
Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu
245 250 255
Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn
260 265 270
Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro
275 280 285
Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn
290 295 300
Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile
305 310 315 320
Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn Gly
325 330 335
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro
340 345 350
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
355 360 365
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
370 375 380
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
385 390 395 400
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
405 410 415
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
420 425 430
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
435 440 445
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
450 455 460
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
465 470 475 480
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
485 490 495
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
500 505 510
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
515 520 525
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
530 535 540
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
545 550 555 560
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
565 570 575
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580
<210> 48
<211> 1746
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> gene of (IL10)2-Fc
<400> 48
agccccggcc agggcacaca gtccgagaac agctgcaccc actttcccgg caacctgcct 60
aacatgctga gggacctgag ggacgccttc agcagggtga agaccttctt ccagatgaag 120
gaccagctgg ataacctgct gctgaaggag agcctgctgg aggacttcaa gggctacctg 180
ggctgccagg ccctgagcga gatgatccag ttctacctgg aggaggtgat gccccaggcc 240
gagaaccagg accccgacat caaggcccac gtgaacagcc tgggcgagaa cctgaagacc 300
ctgaggctga ggctgaggag gtgccacagg ttcctgccct gtgagaacaa atccaaggcc 360
gtggagcagg tgaagaacgc cttcaacaag ctgcaggaaa agggcatcta caaggccatg 420
agcgagttcg acatctttat caactatatc gaggcctaca tgacaatgaa gatcaggaac 480
ggcggcggcg gcagcggggg cggcggcagc ggaggaggcg gcagcagccc cggccagggc 540
acacagtccg agaacagctg cacccacttt cccggcaacc tgcctaacat gctgagggac 600
ctgagggacg ccttcagcag ggtgaagacc ttcttccaga tgaaggacca gctggataac 660
ctgctgctga aggagagcct gctggaggac ttcaagggct acctgggctg ccaggccctg 720
agcgagatga tccagttcta cctggaggag gtgatgcccc aggccgagaa ccaggacccc 780
gacatcaagg cccacgtgaa cagcctgggc gagaacctga agaccctgag gctgaggctg 840
aggaggtgcc acaggttcct gccctgtgag aacaaatcca aggccgtgga gcaggtgaag 900
aacgccttca acaagctgca ggaaaagggc atctacaagg ccatgagcga gttcgacatc 960
tttatcaact atatcgaggc ctacatgaca atgaagatca ggaacggcgg cggcggcagc 1020
gggggcggcg gcagcggagg aggcggcagc gagcctaagt ccagcgacaa gacccacacc 1080
tgcccccctt gccccgctcc ggaactcctg ggcggaccgt cagtcttcct cttcccccca 1140
aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 1200
gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 1260
aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1320
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1380
aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1440
ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1500
acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1560
cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgttgg actccgacgg ctccttcttc 1620
ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1680
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1740
ggtaaa 1746
<210> 49
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> amino acid sequence of IL10
<400> 49
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 50
<211> 480
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> gene of IL10
<400> 50
agccccggcc agggcacaca gtccgagaac agctgcaccc actttcccgg caacctgcct 60
aacatgctga gggacctgag ggacgccttc agcagggtga agaccttctt ccagatgaag 120
gaccagctgg ataacctgct gctgaaggag agcctgctgg aggacttcaa gggctacctg 180
ggctgccagg ccctgagcga gatgatccag ttctacctgg aggaggtgat gccccaggcc 240
gagaaccagg accccgacat caaggcccac gtgaacagcc tgggcgagaa cctgaagacc 300
ctgaggctga ggctgaggag gtgccacagg ttcctgccct gtgagaacaa atccaaggcc 360
gtggagcagg tgaagaacgc cttcaacaag ctgcaggaaa agggcatcta caaggccatg 420
agcgagttcg acatctttat caactatatc gaggcctaca tgacaatgaa gatcaggaac 480
<210> 51
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> amino acid sequences of (IL10)2
<400> 51
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser
165 170 175
Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly
180 185 190
Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val
195 200 205
Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys
210 215 220
Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu
225 230 235 240
Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu
245 250 255
Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn
260 265 270
Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro
275 280 285
Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn
290 295 300
Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile
305 310 315 320
Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
325 330 335
<210> 52
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> gene of (IL10)2
<400> 52
agccccggcc agggcacaca gtccgagaac agctgcaccc actttcccgg caacctgcct 60
aacatgctga gggacctgag ggacgccttc agcagggtga agaccttctt ccagatgaag 120
gaccagctgg ataacctgct gctgaaggag agcctgctgg aggacttcaa gggctacctg 180
ggctgccagg ccctgagcga gatgatccag ttctacctgg aggaggtgat gccccaggcc 240
gagaaccagg accccgacat caaggcccac gtgaacagcc tgggcgagaa cctgaagacc 300
ctgaggctga ggctgaggag gtgccacagg ttcctgccct gtgagaacaa atccaaggcc 360
gtggagcagg tgaagaacgc cttcaacaag ctgcaggaaa agggcatcta caaggccatg 420
agcgagttcg acatctttat caactatatc gaggcctaca tgacaatgaa gatcaggaac 480
ggcggcggcg gcagcggggg cggcggcagc ggaggaggcg gcagcagccc cggccagggc 540
acacagtccg agaacagctg cacccacttt cccggcaacc tgcctaacat gctgagggac 600
ctgagggacg ccttcagcag ggtgaagacc ttcttccaga tgaaggacca gctggataac 660
ctgctgctga aggagagcct gctggaggac ttcaagggct acctgggctg ccaggccctg 720
agcgagatga tccagttcta cctggaggag gtgatgcccc aggccgagaa ccaggacccc 780
gacatcaagg cccacgtgaa cagcctgggc gagaacctga agaccctgag gctgaggctg 840
aggaggtgcc acaggttcct gccctgtgag aacaaatcca aggccgtgga gcaggtgaag 900
aacgccttca acaagctgca ggaaaagggc atctacaagg ccatgagcga gttcgacatc 960
tttatcaact atatcgaggc ctacatgaca atgaagatca ggaac 1005
<210> 53
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> amino acid sequence of IL10-Fc6
<400> 53
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
165 170 175
Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
180 185 190
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
195 200 205
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
210 215 220
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
225 230 235 240
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
245 250 255
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
260 265 270
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
275 280 285
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
290 295 300
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
305 310 315 320
Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Gly Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
325 330 335
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
340 345 350
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Ala Ser
355 360 365
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
370 375 380
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
385 390 395 400
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405
<210> 54
<211> 1221
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> gene of IL10-Fc6
<400> 54
agccccggcc agggcacaca gtccgagaac agctgcaccc actttcccgg caacctgcct 60
aacatgctga gggacctgag ggacgccttc agcagggtga agaccttctt ccagatgaag 120
gaccagctgg ataacctgct gctgaaggag agcctgctgg aggacttcaa gggctacctg 180
ggctgccagg ccctgagcga gatgatccag ttctacctgg aggaggtgat gccccaggcc 240
gagaaccagg accccgacat caaggcccac gtgaacagcc tgggcgagaa cctgaagacc 300
ctgaggctga ggctgaggag gtgccacagg ttcctgccct gtgagaacaa atccaaggcc 360
gtggagcagg tgaagaacgc cttcaacaag ctgcaggaaa agggcatcta caaggccatg 420
agcgagttcg acatctttat caactatatc gaggcctaca tgacaatgaa gatcaggaac 480
ggcggcggcg gcagcggggg cggcggcagc ggaggaggcg gcagcgagcc taagtccagc 540
gacaagaccc acacctgccc cccttgcccc gctccggaac tcctgggcgg accgtcagtc 600
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 660
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 720
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 780
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 840
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 900
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtatacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 960
aaccaggtca gcctgagttg cggggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1020
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gttggactcc 1080
gacggctcct tcaagctcgc cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1140
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1200
ctctccctgt ctccgggtaa a 1221
<210> 55
<211> 582
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> amino acid sequence of Fc6-(IL10)2
<400> 55
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Gly Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Ala
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu
245 250 255
Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp
260 265 270
Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp
275 280 285
Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys
290 295 300
Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu
305 310 315 320
Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala
325 330 335
His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu
340 345 350
Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val
355 360 365
Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr
370 375 380
Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr
385 390 395 400
Met Thr Met Lys Ile Arg Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
405 410 415
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn
420 425 430
Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu
435 440 445
Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln
450 455 460
Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly
465 470 475 480
Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu
485 490 495
Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His
500 505 510
Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg
515 520 525
Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu
530 535 540
Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys
545 550 555 560
Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met
565 570 575
Thr Met Lys Ile Arg Asn
580
<210> 56
<211> 1746
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> gene of Fc6-(IL10)2
<400> 56
gagcctaagt ccagcgacaa gacccacacc tgcccccctt gccccgctcc ggaactcctg 60
ggcggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt ataccctgcc cccatcccgg 420
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg agttgcgggg tcaaaggctt ctatcccagc 480
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540
cccgtgttgg actccgacgg ctccttcaag ctcgccagca agctcaccgt ggacaagagc 600
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaggcg gcggcggcag cgggggcggc 720
ggcagcggag gaggcggcag cagccccggc cagggcacac agtccgagaa cagctgcacc 780
cactttcccg gcaacctgcc taacatgctg agggacctga gggacgcctt cagcagggtg 840
aagaccttct tccagatgaa ggaccagctg gataacctgc tgctgaagga gagcctgctg 900
gaggacttca agggctacct gggctgccag gccctgagcg agatgatcca gttctacctg 960
gaggaggtga tgccccaggc cgagaaccag gaccccgaca tcaaggccca cgtgaacagc 1020
ctgggcgaga acctgaagac cctgaggctg aggctgagga ggtgccacag gttcctgccc 1080
tgtgagaaca aatccaaggc cgtggagcag gtgaagaacg ccttcaacaa gctgcaggaa 1140
aagggcatct acaaggccat gagcgagttc gacatcttta tcaactatat cgaggcctac 1200
atgacaatga agatcaggaa cggcggcggc ggcagcgggg gcggcggcag cggaggaggc 1260
ggcagcagcc ccggccaggg cacacagtcc gagaacagct gcacccactt tcccggcaac 1320
ctgcctaaca tgctgaggga cctgagggac gccttcagca gggtgaagac cttcttccag 1380
atgaaggacc agctggataa cctgctgctg aaggagagcc tgctggagga cttcaagggc 1440
tacctgggct gccaggccct gagcgagatg atccagttct acctggagga ggtgatgccc 1500
caggccgaga accaggaccc cgacatcaag gcccacgtga acagcctggg cgagaacctg 1560
aagaccctga ggctgaggct gaggaggtgc cacaggttcc tgccctgtga gaacaaatcc 1620
aaggccgtgg agcaggtgaa gaacgccttc aacaagctgc aggaaaaggg catctacaag 1680
gccatgagcg agttcgacat ctttatcaac tatatcgagg cctacatgac aatgaagatc 1740
aggaac 1746
<210> 57
<211> 577
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> amino acid sequence of (IL10)2-Fc9
<400> 57
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser
165 170 175
Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly
180 185 190
Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val
195 200 205
Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys
210 215 220
Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu
225 230 235 240
Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu
245 250 255
Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn
260 265 270
Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro
275 280 285
Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn
290 295 300
Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile
305 310 315 320
Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn Gly
325 330 335
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys
340 345 350
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
355 360 365
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
370 375 380
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
385 390 395 400
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
405 410 415
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
420 425 430
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
435 440 445
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
450 455 460
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
465 470 475 480
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
485 490 495
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
500 505 510
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
515 520 525
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys
530 535 540
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
545 550 555 560
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565 570 575
Lys
<210> 58
<211> 1731
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> gene of (IL10)2-Fc9
<400> 58
agccccggcc agggcacaca gtccgagaac agctgcaccc actttcccgg caacctgcct 60
aacatgctga gggacctgag ggacgccttc agcagggtga agaccttctt ccagatgaag 120
gaccagctgg ataacctgct gctgaaggag agcctgctgg aggacttcaa gggctacctg 180
ggctgccagg ccctgagcga gatgatccag ttctacctgg aggaggtgat gccccaggcc 240
gagaaccagg accccgacat caaggcccac gtgaacagcc tgggcgagaa cctgaagacc 300
ctgaggctga ggctgaggag gtgccacagg ttcctgccct gtgagaacaa atccaaggcc 360
gtggagcagg tgaagaacgc cttcaacaag ctgcaggaaa agggcatcta caaggccatg 420
agcgagttcg acatctttat caactatatc gaggcctaca tgacaatgaa gatcaggaac 480
ggcggcggcg gcagcggggg cggcggcagc ggaggaggcg gcagcagccc cggccagggc 540
acacagtccg agaacagctg cacccacttt cccggcaacc tgcctaacat gctgagggac 600
ctgagggacg ccttcagcag ggtgaagacc ttcttccaga tgaaggacca gctggataac 660
ctgctgctga aggagagcct gctggaggac ttcaagggct acctgggctg ccaggccctg 720
agcgagatga tccagttcta cctggaggag gtgatgcccc aggccgagaa ccaggacccc 780
gacatcaagg cccacgtgaa cagcctgggc gagaacctga agaccctgag gctgaggctg 840
aggaggtgcc acaggttcct gccctgtgag aacaaatcca aggccgtgga gcaggtgaag 900
aacgccttca acaagctgca ggaaaagggc atctacaagg ccatgagcga gttcgacatc 960
tttatcaact atatcgaggc ctacatgaca atgaagatca ggaacggcgg cggcggcagc 1020
gggggcggcg gcagcggagg aggcggcagc gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 1080
gctccggaac tcctgggcgg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 1140
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 1200
cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1260
ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1320
caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1380
cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1440
ctgcccccaa gtcgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa 1500
ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1560
tacaagacca cgcctcccgt gttggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcgcgctc 1620
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1680
gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 1731
<210> 59
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> gene of Fc6
<400> 59
gacaagaccc acacctgccc cccttgcccc gctccggaac tcctgggcgg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtatacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420
aaccaggtca gcctgagttg cggggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gttggactcc 540
gacggctcct tcaagctcgc cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggtaa a 681

Claims (25)

1.一种蛋白质异二聚体，包括第一单体成员和不同于所述第一单体成员的第二单体成员，其中：
所述第一单体成员包括第一Fc亚基，所述第二单体成员包括第二Fc亚基，所述第一单体成员与所述第二单体成员通过所述第一Fc亚基与所述第二Fc亚基的复合而缔合，形成所述异二聚体；
其中所述蛋白质异二聚体进一步包括一个或多个与所述第一Fc亚基和/或所述第二Fc亚基融合的白介素；
其中所述蛋白质异二聚体不包括展现对肿瘤抗原的结合特异性的任何抗体重链可变区或任何抗体轻链可变区。
2.根据权利要求1所述的蛋白质异二聚体，其中所述一个或多个白介素与所述第一Fc亚基和/或所述第二Fc亚基的氨基端氨基酸和/或羧基端氨基酸融合。
3.根据权利要求2所述的蛋白质异二聚体，其包括两个或多个白介素，其中所述两个或多个白介素形成一个或多个白介素二聚体，每一个白介素二聚体包括两个彼此融合的白介素。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述一个或多个白介素中的至少一个为IL10。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述一个或多个白介素二聚体包括至少一个IL10二聚体，所述IL10二聚体包括两个IL10。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述第一Fc亚基和/或所述第二Fc亚基源自IgG分子。
7.根据权利要求6所述的蛋白质异二聚体，其中所述IgG为人IgG1。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述第一Fc亚基不同于所述第二Fc亚基，所述第一和/或第二Fc亚基包括促进所述第一Fc亚基与所述第二Fc亚基之间的异二聚体化的修饰。
9.根据权利要求8所述的蛋白质异二聚体，其中所述第一Fc亚基包括第一修饰，所述第二Fc亚基包括第二修饰，所述第一修饰和所述第二修饰包括以下任意一组位置处的氨基酸取代：
1)所述第一修饰：Y349和T366；且第二修饰：D356、T366、L368、Y407和F405；
2)所述第一修饰：Y349、T366和F405；且第二修饰：D356、T366、L368和Y407；
3)所述第一修饰：Y349、T366和K409；且第二修饰：D356、T366、L368、Y407和F405；
4)所述第一修饰：Y349、T366、F405、K360和Q347；且第二修饰：D356、T366、L368、Y407和Q347；
5)所述第一修饰：Y349、T366、F405和Q347；且第二修饰：D356、T366、L368、Y407、K360和Q347；
6)所述第一修饰：Y349、T366、K409、K360和Q347；且第二修饰：D356、T366、L368、Y407、F405和Q347；
7)所述第一修饰：Y349、T366、K409和Q347；且第二修饰：D356、T366、L368、Y407、F405、K360和Q347；
8)所述第一修饰：T366、K409和K392；且第二修饰：T366、L368、Y407、D399和F405；
9)所述第一修饰：T366和K409；且第二修饰：T366、L368、Y407和F405；
10)所述第一修饰：T366、K409和Y349；且第二修饰：T366、L368、Y407、F405和E357；
11)所述第一修饰：T366、K409、Y349和S354；且第二修饰：T366、L368、Y407、F405和E357；
12)所述第一修饰：T366和F405；且第二修饰：T366、L368、Y407和K409；
13)所述第一修饰：T366、F405和D399；且第二修饰：T366、L368、Y407、K409和K392；
14)所述第一修饰：T366、F405和Y349；且第二修饰：T366、L368、Y407、K409和E357；
15)所述第一修饰：T366、F405、Y349和S354；且第二修饰：T366、L368、Y407、K409和E357；
其中所述氨基酸的所述位置根据KABAT编号的EU索引确定。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述一个或多个白介素中的至少一个与所述第二Fc亚基的氨基端氨基酸融合。
11.根据权利要求10所述的蛋白质异二聚体，其中在所述第二单体成员中，所述一个或多个白介素中的至少两个彼此融合以形成白介素二聚体，所述白介素二聚体进一步与所述第二Fc亚基的所述氨基端氨基酸融合。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中在所述第二单体成员中，所述一个或多个白介素中的至少两个彼此融合以形成白介素二聚体，所述白介素二聚体进一步与所述第二Fc亚基的所述羧基端氨基酸融合。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述第一单体成员不包括任何白介素。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述第一单体成员由所述第一Fc亚基组成。
15.根据权利要求1至12中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述一个或多个白介素中的至少一个与所述第一Fc亚基的氨基端氨基酸融合。
16.根据权利要求15所述的蛋白质异二聚体，其中在所述第一单体成员中，所述一个或多个白介素中的至少两个彼此融合以形成白介素二聚体，所述白介素二聚体进一步与所述第一Fc亚基的所述氨基端氨基酸融合。
17.根据权利要求15至16中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述第二单体成员不包括任何白介素。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的蛋白质异二聚体，其中所述第二单体成员由所述第二Fc亚基组成。
19.一种或多种分离的核酸，其编码权利要求1至18中任一项所述的蛋白质异二聚体。
20.一种或多种载体，包括权利要求19所述的一种或多种分离的核酸。
21.一种分离的宿主细胞，包括权利要求19所述的一种或多种分离的核酸或权利要求20所述的一种或多种载体。
22.一种蛋白质混合物，包括：
1)权利要求1至18中任一项所述的蛋白质异二聚体；
2)由权利要求1至18中任一项所述的第一单体成员的两个相同拷贝形成的第一同源二聚体；以及
3)由权利要求1至18中任一项所述的第二单体成员的两个相同拷贝形成的第二同源二聚体；
其中所述蛋白质异二聚体在所述蛋白质混合物中的百分比为至少50％。
23.一种药物组合物，包括权利要求1至18中任一项所述的蛋白质异二聚体或权利要求22所述的蛋白质混合物以及可选的药学上可接受的赋形剂。
24.一种权利要求1至18中任一项所述的蛋白质异二聚体或权利要求22所述的蛋白质混合物用于制造药物和/或试剂盒的用途，所述药物和/或试剂盒用于抑制肿瘤或肿瘤细胞生长和/或用于治疗有需要的个体的癌症。
25.一种产生权利要求1至18中任一项所述的蛋白质异二聚体的方法，包括(i)在实现所述蛋白质异二聚体的表达的条件下培养权利要求21所述的宿主细胞，以及(ii)收集已表达的蛋白质异二聚体或包括所述蛋白质异二聚体的蛋白质混合物。
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