CN104540848A - 白介素-10融合蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明一般涉及抗体和白介素-10(IL-10)的融合蛋白。另外，本发明涉及编码这类融合蛋白的多核苷酸，和包含这类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成本发明融合蛋白的方法，以及在疾病治疗中使用它们的方法。

Description

白介素-10融合蛋白及其用途
发明领域
本发明一般涉及抗体和白介素-10(IL-10)的融合蛋白。另外，本发明涉及编码这类融合蛋白的多核苷酸，以及包含这类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成本发明融合蛋白的方法，以及在疾病治疗中使用它们的方法。
发明背景
IL-10的生物学功能
IL-10是一种α-螺旋细胞因子，作为约37kDa的非共价连接的同二聚体表达。它在耐受诱导和维持中发挥关键作用。已经有很长时间知道它的支配性抗炎特性。IL-10阻抑促炎性细胞因子的分泌，像TNFα、IL-1、IL-6、IL-12，以及Th1细胞因子，诸如IL-2和INFγ，并控制巨噬细胞、B细胞和T细胞的分化和增殖(Glocker,E.O.et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.1246,102-107(2011)；Moore,K.W.et al.,Annu.Rev.Immunol.19,683-765(2001)；de Waal Malefyt,R.et al.,J.Exp.Med.174,915-924(1991)；Williams,L.M.et al.,Immunology113,281-292(2004))。此外，它是抗原呈递的有力抑制剂，抑制MHC II表达以及共刺激分子CD80和CD86上调(Mosser,D.M.&Yhang,X.,ImmunologicalReviews 226,205-218(2008))。
不过，还已经报告了免疫刺激特性。IL-10能共刺激B细胞激活、延长B细胞存活、及帮助B细胞中的类别转换。此外，它能共刺激天然杀伤(NK)细胞增殖和细胞因子生成且起生长因子的作用刺激某些CD8+T细胞子集增殖(Mosser,D.M.&Yhang,X.,Immunological Reviews 226,205-218(2008)；Cai,G.et al.,Eur.J.Immunol.29,2658-2665(1999)；Santin,A.D.et al.,J.Virol.74,4729-4737(2000)；Rowbottom,A.W.et al.,Immunology 98,80-89(1999)；Groux,H.et al.,J.Immunol.160,3188-3193(1998))。重要的是，高剂量的IL-10(分别为20和25μg/kg)在人中能引起INFγ生成升高(Lauw,F.N.et al.,J.Immunol.165,2783-2789(2000)；Tilg,H.et al.,Gut 50,191-195(2002))。
IL-10经由两受体复合物发信号，该两受体复合物由IL-10受体1(IL-10R1)和IL-10R2各两拷贝组成。IL-10R1以相对较高亲和力(约35-200pM)结合IL-10(Moore,K.W.et al.,Annu.Rev.Immunol.19,683-765(2001))，而且IL-10R2募集至受体复合物对配体结合只有边缘性贡献。然而，这第二种受体衔接至复合物使得配体结合后能够发生信号转导。如此，功能性受体由IL-10R1和IL-10R2异二聚体的二聚体组成。大多数造血细胞组成性表达低水平的IL-10R1，而且受体表达常常能通过多种刺激而显著上调。非造血细胞(诸如成纤维细胞和上皮细胞)也能通过上调IL-10R1来响应刺激。相反，IL-10R2在大多数细胞上表达。IL-10对受体复合物的结合激活Janus酪氨酸激酶、JAK1和Tyk2，它们分别与IL-10R1和IL-10R2相关联，磷酸化受体的胞质尾。这导致STAT3募集至IL-10R1。STAT3的同二聚化导致它自受体释放及磷酸化STAT同二聚体移位入核，在那里它结合多种基因的启动子中的STAT3结合元件。这些基因之一是IL-10自身，它受到STAT3的正面调节。STAT3还激活细胞因子信号传导3(SOCS3)的抑制基因，SOCS3控制STAT激活的质量和数量。SOCS3受IL-10诱导，而且对多种细胞因子基因发挥负面调节效果(Mosser,D.M.&Yhang,X.,Immunological Reviews 226,205.218(2008))。
遗传连锁分析和候选基因测序揭示了IL-10R1和IL-10R2中的突变和早期发作小肠结肠炎(炎性肠病(IBD)的一种形式)之间的直接联系(Glocker,E.O.et al.,N.Engl.J.Med.361(21),2033-2045(2009))。最近的数据提示早期发作IBD甚至可能是单基因的。IL-10细胞因子或其受体中的突变导致IL-10功能丧失并在婴幼儿和低龄儿童中引起严重小肠结肠炎(Glocker,E.O.et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.1246,102-107(2011))。而且，具有严重形式的克罗恩氏病的患者在全血细胞培养物和单核细胞衍生树突细胞中具有缺陷的IL-10生成(Correa,I.et al.,J.Leukoc.Biol.85(5),896-903(2009))。IBD在美国影响约140万人，在欧洲影响约220万人(Carter,M.J.et al.,Gut 53(Suppl.5),V1-V16(2004)；Engel,M.A.&Neurath,M.F.,J.Gastroenterol.45,571-583(2010))。
使用IL-10的治疗办法
已经对健康志愿者以及特定患者群体在多种设置中在调查静脉内或皮下施用的单剂或多剂的安全性、耐受、药动学、药效学、免疫学和血液学影响的I期和II期临床试验中评估了重组IL-10在炎性病症和自身免疫性疾病中的治疗好处(Moore,K.W.et al.,Annu.Rev.Immunol.19,683-765(2001)；Chernoff,A.E.et al.,J.Immunol.154,5492-5499(1995)；Huhn,R.D.et al.,Blood 87,699-705(1996)；Huhn,R.D.et al.,Clin.Pharmacol.Ther.62,171-180(1997))。IL-10以直到25μg/kg的剂量得到较好耐受，没有严重副作用，而且以直到100μg/kg的剂量只在一部分接受者中观察到温和至中等的流感样症状(Moore,K.W.et al.,Annu.Rev.Immunol.19,683-765(2001)；Chernoff,A.E.et al.,J.Immunol.154,5492-5499(1995))。在银屑病(临床研究的汇编可见于Mosser,D.M.&Yhang,X.,Immunological Reviews 226,205-218(2008))、克罗恩氏病(Van Deventer S.J.et al,Gastroenterology 113,383-389(1997)；Fedorak,R.N.et al.,Gastroenterology 119,1473-1482(2000)；Schreiber,S.et al.,Gastroenterolotgy 119,1461-1472(2000)；Colombel J.F.et al.,Gut 49,42-46(2001))和类风湿性关节炎(Keystone,E.et al.,Rheum.Dis.Clin.N.Am.24,629-639(1998)；Mosser,D.M.&Yhang,X.,Immunological Reviews 226,205-218(2008))中最经常地看到朝向临床改善的倾向。
总之，临床结果并不令人满意，而且除了氨基末端处甲硫氨酸残基以外与内源人IL-10相同的重组人IL-10(ilodecakin，TENOVIL，Schering-PloughResearch Institue，Kenilworth，NJ)的临床开发因缺乏功效而中断。最近关于重组人IL-10用于在克罗恩氏病中诱导消退的功效和可耐受性的一项系统性综述没有发现IL-10和安慰剂之间关于完全或临床消退的统计学显著差异，并且声明相对于安慰剂，用IL-10治疗的患者因不利事件而退出研究的可能性显著更高(Buruiana,F.E.et al.,Cochrane Database Syst.Rev.11,CD005109(2010))。关于克罗恩氏病，讨论了这些不令人满意的结果的数个原因(Herfarth,H.&J.,Gut 50,146-147(2002))：1)肠中的局部细胞因子浓度低得无法介导持续的抗炎效应，2)系统性施用IL-10的剂量扩大受到副作用的限制，及3)IL-10对B细胞和对CD4+、CD8+、和/或天然杀伤细胞生成INFγ的免疫刺激特性抵消了它的免疫抑制特性(Asadullah,K.et al.,Pharmacol.Rev.55,241-269(2003)；Tilg,H.et al.,Gut 50,191-195(2002)；Lauw,F.N.et al.,J.Immunol.165,2783-2789(2000))。
由于它约37kDa的较小尺寸导致快速肾清除，IL-10展现很短的血浆半衰期。事实上，它在系统隔室中的半衰期为2.5小时，这限制了粘膜生物利用度(Braat,H.et al.,Expert Opin.Biol.Ther.3(5),725-731(2003))。为了改进循环时间、暴露、功效及降低肾摄取，数篇出版物报告了这种细胞因子的PEG化(Mattos,A.et al.,J.Control Release 162,84-91(2012)；Mumm,J.B.et al.,Cancer Cell 20(6),781-796(2011)；Alvarez,H.M.et al.,Drug Metab.Dispos.40(2),360-373(2012))。不过，PEG化非靶向性IL-10更长的系统半衰期能加剧这种分子的已知不利事件。
已经变得清楚的是，使用重组人IL-10的系统性治疗并非充分有效，而且焦点必须放在细胞因子的局部投递上。有数种方式来实现这个目标：1)免疫细胞的IL-10基因疗法，2)经遗传修饰的、非致病性的IL-10表达细菌，和3)用于将细胞因子靶向发炎组织及在发炎组织中积累细胞因子的抗体-IL-10融合蛋白。
免疫细胞的IL-10基因疗法已经在实验性结肠炎中证明有效性，但是关于这种办法对非致命性疾病的安全性的担心妨碍了临床试验(Bract,H.et al.,Expert Opin.Biol.Ther.3(5),725-731(2003))。表达IL-10的转基因细菌(乳酸乳球菌(Lactococcus lactis))代表了一种备选投递路径，而且发表了克罗恩氏病中的I期试验的结果，要求避免局部投递入粘膜隔室所致系统性副作用及生物学包含的(Braat,H.et al.,Gastroenterol.Hepatol.4,754-759(2006)；Steidler,L.et al.,Science 289,1352-1355(2000))。一项评估经遗传修饰、分泌人IL-10的乳酸乳球菌(AG011，ActoGeniX)在具有中等活性溃疡性结肠炎的患者中的安全性、可耐受性、药效学和功效的IIa期随机化、以安慰剂为对照、双盲、多中心、剂量扩大研究是得到较好耐受的且安全的。然而，与安慰剂相比，接受AG011的患者中的粘膜炎症(如通过改良Baron得分测量的)或临床症状没有显著改善(Vermeire,S.et al.,abstract 46presented at theDigestive Disease Week Annual Meeting in New Orleans 02May 2010)。
抗体-细胞因子融合蛋白(也称作免疫细胞因子)在药物投递和药物自身的型式方面提供数项优点。通过与对合适疾病标志物特异性的抗体或其片段融合，实现了细胞因子(例如IL-10)的局部投递。如此，能减少/减轻系统性副作用，而且能实现化合物在炎症部位的局部积累和保持。此外，根据融合型式及使用的抗体或抗体片段，能改善像血浆半衰期、稳定性和可开发性等特性。虽然是肿瘤学中早就建立的办法，但是它最近才适应用于治疗炎性病症和自身免疫性。通过与对纤连蛋白外域B特异性的scFv抗体片段融合，将数种细胞因子(其中有IL-10)和光敏剂靶向银屑病损害(Trachsel,E.et al.,J.Invest.Dermatol.127(4),881-886(2007))。而且，将对纤连蛋白外域A特异性的抗体片段(F8，DEKAVIL，Philogen SpA)-IL-10融合蛋白在临床前用于抑制已建立的、胶原诱发的关节炎的进展(Trachsel,E.et al.,Arthritis Res.Ther.9(1),R 9(2007)；Schwager,K.et al.,Arthritis Res.Ther.11(5),R142(2009))，并进入临床试验。最近，在同基因小鼠模型中将相同的F8-IL-10融合蛋白用于靶向子宫内膜炎损害，并且与盐水对照组相比缩小平均损害尺寸(Schwager,K.et al.,Hum.Reprod.26(9),2344-2352(2011))。
本发明的IgG-IL-10融合蛋白具有数项胜过基于已知抗体片段(scFv、双抗体、Fab)的IL-10融合蛋白的优点，包括改善的可生产性、稳定性、血清半衰期、和令人惊讶的在结合靶抗原后显著升高的生物学活性。
发明概述
一方面，本发明提供IgG类抗体和IL-10分子的融合蛋白，其中该融合蛋白包含两条相同的重链多肽和两条相同的轻链多肽。在一个实施方案中，每一条所述重链多肽包含IgG类抗体重链和IL-10单体。在一个更加具体实施方案中，所述IL-10单体在它的N末端融合至所述IgG类抗体重链的C末端，任选经由肽接头。在一个实施方案中，所述重链抗体每一条基本上由IgG类抗体重链、IL-10单体和任选的肽接头组成。在一个实施方案中，每一条所述轻链多肽包含IgG类抗体轻链。在一个实施方案中，所述轻链多肽每一条基本上由IgG类抗体轻链组成。
在一些实施方案中，所述IL-10单体为天然IL-10单体，特别是天然人IL-10单体。在一个具体实施方案中，所述IL-10单体包含SEQ ID NO：1的多肽序列。在一个实施方案中，所述重链多肽中包含的所述IL-10单体形成功能性同二聚体IL-10分子。
在其它实施方案中，所述IL-10单体为经修饰IL-10单体，特别是经修饰人IL-10单体。在一个实施方案中，所述经修饰IL-10单体以单体形式在pH 7.0、37℃是稳定的。在一个实施方案中，所述经修饰IL-10单体在pH 7.0、37℃具有与天然IL-10单体相比改善的稳定性。在一个具体实施方案中，所述IL-10单体包含SEQ ID NO：5的多肽序列。在一个实施方案中，所述重链多肽中包含的所述IL-10单体不彼此同二聚化。
在一个实施方案中，所述IgG类抗体包含修饰，与没有所述修饰的相应IgG类抗体相比，该修饰降低抗体对Fc受体的结合亲和力。在一个具体实施方案中，所述Fc受体为Fcγ受体，特别是人Fcγ受体。在一个实施方案中，所述Fc受体为激活性Fc受体，特别是激活性Fcγ受体。在一个具体实施方案中，所述Fc受体选自下组：FcγRIIIa(CD16a)，FcγRI(CD64)，FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。在一个甚至更加具体实施方案中，所述Fc受体为FcγIIIa，特别是人FcγIIIa。在一个实施方案中，所述修饰降低IgG类抗体的效应器功能。在一个具体实施方案中，所述效应器功能为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一个实施方案中，所述修饰在所述IgG类抗体的Fc区中，特别是在CH2区中。在一个实施方案中，所述IgG类抗体在抗体重链第329位(EU编号方式)处包含氨基酸替代。在一个具体实施方案中，所述氨基酸替代为P329G。在一个实施方案中，所述IgG类抗体在抗体重链第234位和第235位(EU编号方式)处包含氨基酸替代。在一个具体实施方案中，所述氨基酸替代为L234A和L235A(LALA)。在一个特定实施方案中，所述IgG类抗体在抗体重链中包含氨基酸替代L234A、L235A和P329G(EU编号方式)。
在一个实施方案中，所述IgG类抗体为IgG1亚类抗体。在一个实施方案中，所述IgG类抗体为全长抗体。在一个实施方案中，所述IgG类抗体为人抗体。在一个实施方案中，所述IgG类抗体为单克隆抗体。
在一个实施方案中，所述IgG类抗体能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)。在一个具体实施方案中，当于25℃通过表面等离振子共振(SPR)测量时，该融合蛋白能够以小于1nM、特别是小于100pM的亲和常数(KD)结合FAP。在一个实施方案中，所述FAP为人、小鼠和/或食蟹猴FAP。在一个具体实施方案中，所述IgG类抗体包含SEQ ID NO：37的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO：41的HCDR 2、SEQ ID NO：49的HCDR 3、SEQ ID NO：53的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO：57的LCDR 2和SEQ ID NO：61的LCDR3。在一个甚至更加具体实施方案中，所述IgG类抗体包含SEQ ID NO：63的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：65的轻链可变区(VL)。在另一个特定具体实施方案中，所述IgG类抗体包含SEQ ID NO：37的HCDR 1、SEQ ID NO：43的HCDR 2、SEQ ID NO：47的HCDR 3、SEQ ID NO：51的LCDR 1、SEQID NO：55的LCDR 2和SEQ ID NO：59的LCDR 3。在一个甚至更加具体实施方案中，所述IgG类抗体包含SEQ ID NO：67的VH和SEQ ID NO：69的VL。
在一个实施方案中，当于25℃通过SPR测量时，该融合蛋白能够以小于1nM、特别是小于100pM的亲和常数(KD)结合IL-10受体-1(IL-10R1)。在一个具体实施方案中，所述IL-10R1为人IL-10R1。在一个实施方案中，当于25℃通过SPR测量时，所述结合IL-10R1的亲和常数(KD)大致等于或大于所述结合FAP的亲和常数(KD)。在一个具体实施方案中，所述结合IL-10R1的KD大于所述结合FAP的KD的约一半。
在一个特定实施方案中，本发明提供IgG类抗体和IL-10分子的融合蛋白，其中该融合蛋白包含两条相同的重链多肽和两条相同的轻链多肽；且其中
(i)所述IgG类抗体包含SEQ ID NO：37的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO：43的HCDR 2、SEQ ID NO：47的HCDR 3、SEQ ID NO：51的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO：55的LCDR 2和SEQ ID NO：59的LCDR 3，或者包含SEQ IDNO：67的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：69的轻链可变区(VL)；
(ii)所述IgG类抗体在抗体重链中包含氨基酸替代L234A、L235A和P329G(EU编号方式)；
(iii)所述IL-10分子包含SEQ ID NO：1的序列；且
(iv)所述重链多肽每一条包含IgG类抗体重链和IL-10单体，所述IL-10单体在它的N末端经由肽接头融合至所述IgG类抗体重链的C末端。
在另一个实施方案中，本发明提供IgG类抗体和IL-10分子的融合蛋白，其中该融合蛋白包含两条相同的重链多肽和两条相同的轻链多肽；且其中(i)所述IgG类抗体包含SEQ ID NO：37的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO：41的HCDR 2、SEQ ID NO：49的HCDR 3、SEQ ID NO：53的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO：57的LCDR 2和SEQ ID NO：61的LCDR 3，或者包含SEQ IDNO：63的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：65的轻链可变区(VL)；
(ii)所述IgG类抗体在抗体重链中包含氨基酸替代L234A、L235A和P329G(EU编号方式)；
(iii)所述IL-10分子包含SEQ ID NO：1的序列；且
(iv)所述重链多肽每一条包含IgG类抗体重链和IL-10单体，所述IL-10单体在它的N末端经由肽接头融合至所述IgG类抗体重链的C末端。
本发明进一步提供一种多核苷酸，其编码本发明的融合蛋白。进一步提供一种包含本发明的多核苷酸的载体，特别是表达载体。另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸或载体。本发明还提供一种用于生成本发明的融合蛋白的方法，其包括以下步骤：(i)在适合于表达该融合蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞，并(ii)回收该融合蛋白。还提供IgG类抗体和IL-10分子的融合蛋白，该融合蛋白是通过所述方法生成的。
一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明的融合蛋白和药学可接受载剂。还提供本发明的融合蛋白或药物组合物，其用作药物及用于治疗或预防炎性疾病，具体是炎性肠病或类风湿性关节炎，最具体是炎性肠病。进一步提供本发明的融合蛋白在制备用于治疗有此需要的个体中疾病的药物的用途及治疗个体中疾病的方法，其包括对所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药学可接受形式的本发明的融合蛋白。在一个实施方案中，所述疾病为炎性疾病。在一个更加特定实施方案中，所述炎性疾病为炎性肠病或类风湿性关节炎。在一个甚至更加具体实施方案中，所述炎性疾病为炎性肠病。在一个实施方案中，所述个体为哺乳动物，特别是人。
附图简述
图1。多种抗体-IL-10融合型式的示意图。小图(A)至(D)显示基于IgG抗体的型式，小图(E)至(G)显示基于Fab片段的型式。(A)“IgG-IL-10”，有一个IL-10分子(野生型人IL-10细胞因子序列)融合至每条IgG重链C端的人IgG(具有工程化Fc区以避免效应器功能，例如通过氨基酸替代L234A L235A(LALA)P329G)(两条重链上的IL-10分子在同一IgG分子内二聚化)。重链和IL-10之间的连接头：例如(G4S)420聚物。(B)“IgG-单链(sc)IL-10”，有单链IL-10二聚体(scIL-10)融合至IgG重链之一C端的人IgG(具有工程化Fc区以避免效应器功能且组合一条“节”重链和一条“穴”重链以推动二者异二聚化)。重链和单链IL-10之间的连接头：例如(G4S)315聚物。(C)“IgG-IL-10M1”，有工程化单体IL-10分子融合至IgG重链之一C端的人IgG(具有工程化Fc部分以避免效应器功能且组合一条“节”重链和一条“穴”重链以推动二者异二聚化)。重链和单体IL-10之间的连接头：例如(G4S)315聚物。(D)“IgG-(IL-10M1)2”，有一个IL-10单体融合至每条IgG重链C端的人IgG(具有工程化Fc部分以避免效应器功能)(两条重链上的单体IL-10分子不二聚化)。重链和IL-10之间的连接头：例如(G4S)315聚物接头。(E)“Fab-IL-10”，有一个IL-10分子(野生型人IL-10细胞因子序列)融合至Fab重链C端的Fab片段(两个这些融合物经由IL-10部分通过二聚化形成同二聚体活性分子)。重链和IL-10之间的连接头：例如(G4S)315聚物。(F)“Fab-scIL-10-Fab”，由单链IL-10二聚体中断的串联Fab片段(即两个IL-10分子通过例如(G4S)420聚物接头而连接并在第一Fab重链(HC1)的C端和第二Fab重链(HC2)的N端之间插入，产生包含HC1-IL-10-IL-10-HC2的单一肽链)。两条轻链(它们可以与用于其它构建物的轻链相同)与这两条重链配对。(G)“Fab-IL-10M1-Fab”，由工程化单体IL-10分子中断的串联Fab片段。除了单体IL-10部分之外，这种型式与(F)相同。
图2。基于FAP靶向性4B9的IgG-IL-10构建物(见SEQ ID NO 25和27)的纯化。(A)蛋白A纯化步骤的洗脱概况。(B)大小排阻层析步骤的洗脱概况。(C)最终产物的分析性SDS-PAGE(还原的(R)：NuPAGE Novex Bis-Tris迷你凝胶，Invitrogen，MOPS运行缓冲液，非还原的(NR)：NuPAGE Tris-乙酸盐，Invitrogen，Tris-乙酸盐运行缓冲液)。M：大小标志。(D)最终产物在Superdex200柱上的分析性大小排阻层析。单体含量99.8％。
图3。基于FAP靶向性4G8的IgG-scIL-10构建物(见SEQ ID NO 7、11和13)的纯化。(A)蛋白A纯化步骤的洗脱概况。(B)大小排阻层析步骤的洗脱概况(以虚线框标示期望产物)。(C)最终产物的分析性SDS-PAGE(还原的(R)：NuPAGE Novex Bis-Tris迷你凝胶，Invitrogen，MOPS运行缓冲液，非还原的(NR)：NuPAGE Tris-乙酸盐，Invitrogen，Tris-乙酸盐运行缓冲液)；非还原性凝胶上额外的更低MW条带可能代表由一条重链和轻链组成的半分子。(D)最终产物在TSKgel G3000SW XL柱上的分析性大小排阻层析。单体含量80.6％。
图4。基于FAP靶向性4G8的IgG-IL-10M1构建物(见SEQ ID NO 7、13和15)的纯化。(A)蛋白A纯化步骤的洗脱概况。(B)大小排阻层析步骤的洗脱概况。(C)最终产物的分析性SDS-PAGE(还原的(R)：NuPAGE NovexBis-Tris迷你凝胶，Invitrogen，MOPS运行缓冲液，非还原的(NR)：NuPAGETris-乙酸盐，Invitrogen，Tris-乙酸盐运行缓冲液)。(D)最终产物在Superdex200柱上的分析性大小排阻层析。单体含量98.2％。
图5。基于FAP靶向性4B9的IgG-(IL-10M1)2构建物(见SEQ ID NO 25和29)的纯化。(A)蛋白A纯化步骤的洗脱概况。(B)大小排阻层析步骤的洗脱概况。(C)最终产物的LabChip GX(Caliper)分析。(D)最终产物在TKSgelG3000SW XL柱上的分析性大小排阻层析。单体含量100％。
图6。基于FAP靶向性4B9的Fab-IL-10构建物(见SEQ ID NO 25和31)的纯化。(A)蛋白A纯化步骤的洗脱概况。(B)大小排阻层析步骤的洗脱概况。(C)最终产物的分析性SDS-PAGE(还原的(R)：NuPAGE Novex Bis-Tris迷你凝胶，Invitrogen，MOPS运行缓冲液，非还原的(NR)：NuPAGE Tris-乙酸盐，Invitrogen，Tris-乙酸盐运行缓冲液)。(D)最终产物在Superdex 200柱上的分析性大小排阻层析。单体含量92.9％。
图7。基于FAP靶向性4G8的Fab-scIL-10-Fab构建物(见SEQ ID NO 7和21)的纯化。(A)蛋白A纯化步骤的洗脱概况。(B)大小排阻层析步骤的洗脱概况。(C)最终产物的分析性SDS-PAGE(还原的(R)：NuPAGE Novex Bis-Tris迷你凝胶，Invitrogen，MOPS运行缓冲液，非还原的(NR)：NuPAGE Tris-乙酸盐，Invitrogen，Tris-乙酸盐运行缓冲液)。(D)最终产物在Superdex 200柱上的分析性大小排阻层析。单体含量100％。
图8。基于FAP靶向性4G8的Fab-IL-10M1-Fab融合物(见SEQ ID NO 7和23)的纯化。(A)蛋白A纯化步骤的洗脱概况。(B)大小排阻层析步骤的洗脱概况。(C)最终产物的分析性SDS-PAGE(还原的(R)：NuPAGE Novex Bis-Tris迷你凝胶，Invitrogen，MOPS运行缓冲液，非还原的(NR)：NuPAGE Tris-乙酸盐，Invitrogen，Tris-乙酸盐运行缓冲液)。(D)最终产物在Superdex 200柱上的分析性大小排阻层析。单体含量100％。
图9。ProteOn XPR36上的SPR测定法设置。(A)在GLM芯片上通过胺偶联共价固定化抗五His IgG(捕捉剂)，接着捕捉FAP(配体)，随后注射抗FAP抗体-IL-10融合构建物(分析物)。(B)在中性亲合素衍生化传感器芯片(NLC)上固定化生物素化人IL-10R1(配体)，接着注射抗FAP抗体-IL-10融合构建物(分析物)。
图10。不同抗体-IL-10融合蛋白对单核细胞促炎性细胞因子生成的阻抑。(A-C)在用重组人FAP包被的细胞培养板上固定化4G8Fab-IL-10(见SEQ IDNO 7和19)或4G8IgG-IL-10(见SEQ ID NO 7和9)，之后添加单核细胞和作为刺激物的100ng/ml LPS达24小时。随后测量上清液中IL-6(A)、IL-1β(B)和TNFα(C)的浓度(n＝2)。(D-F)将单核细胞与0-200nM 4G8Fab-IL-10或4G8IgG-IL-10(在溶液中)和作为刺激物的100ng/ml LPS一起温育24小时。随后测量上清液中IL-6(D)、IL-1β(E)和TNFα(F)的浓度(n＝2)。
图11。使用两名不同血液供体，图1所示结果的再现。(A)在用重组人FAP包被的细胞培养板上固定化4G8Fab-IL-10或4G8IgG-IL-10，之后添加单核细胞和作为刺激物的100ng/ml LPS达24小时。随后测量上清液中IL-6(左边)、IL-1β(中间)和TNFα(右边)的浓度(每行代表一名血液供体)。(B)单核细胞与0-200nM 4G8Fab-IL-10、4G8IgG-IL-10或野生型人IL-10(在溶液中)和作为刺激物的100ng/ml LPS一起温育24小时。随后测量上清液中IL-6(左边)、IL-1β(中间)和TNFα(右边)的浓度(每行代表一名血液供体)。
图12。不同抗体-IL-10融合蛋白对单核细胞IL-6生成的阻抑。(A-C)在用重组人FAP包被的细胞培养板上固定化4G8Fab-IL-10、4G8IgG-IL-10或相应非靶向性构建物，之后添加单核细胞和作为刺激物的100ng/ml LPS达24小时。随后测量上清液中IL-6的浓度。(D-F)将单核细胞与0-200nM 4G8Fab-IL-10、4G8IgG-IL-10、相应非靶向性构建物或野生型人IL-10(在溶液中)和作为刺激物的100ng/ml LPS一起温育24小时。随后测量上清液中IL-6的浓度。
图13。不同抗体-IL-10融合蛋白对单核细胞L-6生成的阻抑。(A-D)在用不同浓度的重组人FAP包被的细胞培养板上固定化4G8Fab-IL-10(下部行)或4G8IgG-IL-10(上部行)，之后添加单核细胞和作为刺激物的100ng/ml LPS达24小时。随后测量上清液中IL-6的浓度。
图14。不同抗体-IL-10融合蛋白对单核细胞IL-6生成的阻抑。在用不同浓度的重组人FAP包被的细胞培养板上固定化4G8Fab-IL-10(B)或4G8IgG-IL-10(A)，之后添加单核细胞和作为刺激物的100ng/ml LPS达24小时。随后测量上清液中IL-6的浓度。将图13中的相同数据绘图，但是在不同的比较中。
图15。不同抗体-IL-10融合蛋白对单核细胞IL-6生成的阻抑。(A)在用重组人FAP包被的细胞培养板上固定化4B9Fab-IL-10(见SEQ ID NO 25和31)或4B9IgG-IL-10(见SEQ ID NO 25和27)构建物，之后添加单核细胞和作为刺激物的100ng/ml LPS达24小时。随后测量上清液中IL-6的浓度。(B)将单核细胞与0-200nM 4B9Fab-IL-10或4B9IgG-IL-10构建物(在溶液中)和作为刺激物的100ng/ml LPS一起温育24小时。随后测量上清液中IL-6的浓度。
图16。Fab-IL-10和IgG-IL-10型式的大小排阻层析(SEC)概况的比较。箭指示期望的二聚体产物，聚集物以虚线圈标示，而单体以实线圈标示。与Fab-IL-10型式形成对比，由于其重链的二硫化物连接的共价同二聚化，IgG-IL-10型式没有生成单体或“半分子”。
发明详述
定义
除非在下文另外定义，术语在本文中如本领域中一般使用的那样使用。
“成纤维细胞激活蛋白”(缩写为FAP，也称作Seprase(EC 3.4.21))指来自任何脊椎动物来源的任何天然FAP，包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)，除非另有说明。该术语涵盖“全长”、未加工FAP以及源自细胞中加工的任何形式的FAP。该术语还涵盖FAP的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中，本发明的抗体能够特异性结合人、小鼠和/或食蟹猴FAP。人FAP的氨基酸序列显示于UniProt(www.uniprot.org)登录号Q12884(版本128)或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451.2。人FAP的胞外域(ECD)自氨基酸位置26延伸至760。带His标签的人FAP ECD的氨基酸和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO 81和82。小鼠FAP的氨基酸序列显示于UniProt登录号P97321(版本107)或NCBI RefSeq NP_032012.1。小鼠FAP的胞外域(ECD)自氨基酸位置26延伸至761。SEQ ID NO 83和84分别显示带His标签的小鼠FAP ECD的氨基酸和核苷酸序列。SEQ ID NO 85和86分别显示带His标签的食蟹猴FAP ECD的氨基酸和核苷酸序列。
“人IL-10R1”意指UniProt登录号Q13651(版本115)中描述的蛋白质，特别是所述蛋白质自全长序列氨基酸位置22延伸至氨基酸位置235的胞外域。SEQ ID NO 87和88分别显示融合至人Fc区的人IL-10R1ECD的氨基酸和核苷酸序列。
如本文中使用的，术语“融合蛋白”指包含抗体和IL-10分子的融合多肽分子，其中融合蛋白的组件通过肽键彼此连接，或是直接地或是经由肽接头。为清楚起见，融合蛋白的抗体构件的各个肽链可以是非共价连接的，例如通过二硫键。
“融合”意指各组分直接地或经由一种或多种肽接头通过肽键连接。
“特异性结合”意指结合对于抗原是选择性的，并且能与不想要的或非特异性的相互作用区别开来。抗体结合特定抗原的能力能经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术，例如表面等离振子共振技术(在BIAcore仪上分析)(Liljeblad et al.,Glyco J 17,323-329(2000))，以及传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。在一个实施方案中，抗体对无关蛋白的结合程度是该抗体对抗原结合的小于约10％，如例如通过SPR测量的。在某些实施方案中，结合抗原的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M以下，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。
“亲和力”或“结合亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶(例如抗原)之间非共价相互作用总和的强度。除非另外指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以以解离常数(KD)来表述，其为解离与结合速率常数(分别为K解离和K结合)的比率。如此，相等的亲和力可能包含不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中描述的那些方法。用于测量亲和力的一种具体方法是表面等离振子共振(SPR)。
“降低的结合”，例如降低的对Fc受体的结合，指相应相互作用的亲和力降低，如例如通过SPR测量的。为了清楚，该术语还包括亲和力降低至0(或低于分析方法的检测限)，即完全消除相互作用。相反，“升高的结合”指相应相互作用的结合亲和力升高。
如本文中使用的，术语“单链”指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。
术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”指完整抗体外的分子，其包含完整抗体中结合与完整抗体结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)、和单域抗体。关于某些抗体片段的综述参见Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述参见例如Plückthun,in The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；还可参见WO 93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论参见美国专利No.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)；和Hollinger et al.,Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。可以通过多种技术来生成抗体片段，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)生成，如本文中记载的。
术语“全长抗体”、“完整抗体”、和“完全抗体”在本文中可互换使用，指具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在免疫球蛋白分子。例如，天然IgG类抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键连接的两条轻链和两条重链构成。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重域或重链可变域，接着是3个恒定域(CH1、CH2和CH3)，也称为重链恒定区。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻域或轻链可变域，接着是轻链恒定域(CL)(也称为轻链恒定区)。抗体的重链可以归入称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)的5型之一，其中一些可以进一步分成亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定域的氨基酸序列，抗体的轻链可以归入称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)的两类之一。
如本文中使用的，“Fab片段”指包含包含轻链的VL域和恒定域(CL)的轻链片段及重链的VH域和第一恒定域(CH1)的抗体片段。
抗体或免疫球蛋白的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5种主要的类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中数种可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白类的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
“IgG类抗体”指具有天然存在免疫球蛋白G(IgG)分子的结构的抗体。IgG类抗体的抗体重链具有域结构VH-CH1-CH2-CH3。IgG类抗体的抗体轻链具有域结构VL-CL。IgG类抗体基本上由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab片段和一个Fc域组成。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。参见例如Kindt etal.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91(2007)。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。
如本文中所使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区域。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。例示性的高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、和96-101(H3)(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196,901-917(1987))。例示性的CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65、和H3的95-102(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。除了VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”，或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的-CDR，或a-CDR的CDR区域内。例示性的a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58、和H3的95-102(参见Almagro and Fransson,Front.Biosci.13,1619-1633(2008))。除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基(例如，FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号(称作“Kabat编号”)。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。可变域的FR一般由4个FR域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因而，HVR和FR序列一般以下列顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有整个或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
本文中术语“Fc域”或“Fc区”用于定义抗体重链中至少含有恒定区的一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。IgG Fc区包含IgGCH2和IgG CH3域。人IgG Fc区的“CH2域”通常自大约位置231处的氨基酸残基延伸至大约位置340处的氨基酸残基。在一个实施方案中，碳水化合物链附着至CH2域。本文中的CH2域可以是天然序列CH2域或变体CH2域。“CH3域”包含Fc区中CH2域C端的一段残基(即IgG中自大约位置341处的氨基酸残基至大约位置447处的氨基酸残基)。本文中的CH3区可以是天然序列CH3域或变体CH3域(例如具有在其一条链中引入的“隆起”(“节”)和在其另一条链中相应引入的“空腔”(“穴”)的CH3域；参见美国专利No.5,821,333，通过述及明确收入本文)。此类变体CH3域可以用于促进两条不相同抗体重链的异二聚化，如本文中描述的。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端。然而，可以存在或不存在Fc区的C端赖氨酸(Lys447)。除非本文中另外指定，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，也称为EU索引，如记载于Kabat et al.,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991。
术语“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)下调和B细胞活化。
“激活性Fc受体”是一种在抗体的Fc区衔接后，引发刺激携带该受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的Fc受体。激活性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。一种具体的激活性Fc受体为人FcγRIIIa(参见UniProt登录号P08637(版本141))。
“天然IL-10”(也称作“野生型IL-10”)意指天然存在IL-10，与“经修饰IL-10”相反，后者自天然存在IL-10经过修饰，例如为了改变它的一项或多项特性，诸如稳定性。经修饰IL-10分子可以例如包含氨基酸序列中的修饰，例如氨基酸替代、删除或插入。单体形式的稳定性升高的一种特定经修饰IL-10分子已有记载(Josephson et al.,J Biol Chem 275,13552-13557(2000))。
天然IL-10是由两个α-螺旋单体域构成的同二聚体。天然人IL-10单体域的序列显示于SEQ ID NO：1。因而，“IL-10单体”为序列和/或结构与天然IL-10的单体域基本上相似的蛋白质。
“稳定的”或“稳定性”在提到蛋白质使用时意味着该蛋白质的结构完整性(例如其二级结构)得到保留。
“功能性的”在提到蛋白质使用时意味着该蛋白质能够介导生物学功能，特别是自然界中存在的相应蛋白质(例如天然IL-10)会介导的生物学功能。在IL-10的情况中，生物学功能可包括在表达IL-10受体的细胞(例如单核细胞)中激活IL-10受体信号传导、阻抑促炎性细胞因子(诸如TNFα、IL-1、IL-6、IL-12、IL-2和/或INFγ)分泌、抑制MHC II表达及上调共刺激分子(诸如CD80和/或CD86)。
术语“肽接头”为包含一个或多个氨基酸，通常约2-20个氨基酸的肽。肽接头是本领域中已知的或本文中记载的。合适的、非免疫原性的接头肽包括例如(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头。“n”一般是介于1和10之间的数字，通常介于2和4之间。
“节入穴修饰”指CH3域中两条抗体重链之间的界面内的修饰，其中i)在一条重链的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在一条重链的CH3域中的界面内生成隆起(“节”)，其可放置在另一条重链的CH3域中的界面内的空腔(“穴”)中，和ii)在另一条重链的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二CH3域的界面内生成空腔(“穴”)，其中可放置第一CH3域中的界面内的隆起(“节”)。在一个实施方案中，“节入穴修饰”包含抗体重链之一中的氨基酸替代T366W和任选的氨基酸替代S354C，及抗体重链另一中的氨基酸替代T366S、L368A、Y407V和任选的Y349C。节入穴技术记载于例如US5,731,168；US 7,695,936；Ridgway et al.,Prot Eng 9,617-621(1996)及Carter,JImmunol Meth 248,7-15(2001)。一般地，该方法牵涉引入第一多肽的界面处的隆起(“节”)和第二多肽的界面中的相应空腔(“穴”)，使得隆起可位于空腔中，从而促进异二聚体形成和阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽界面的小氨基酸侧链用更大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。通过将大氨基酸侧链用更小侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换在第二多肽的界面中创建与隆起大小相同或相似的互补空腔。分别在位置S354和Y349处引入两个半胱氨酸残基导致在Fc区中的两条抗体重链之间形成二硫桥，进一步使二聚体稳定化(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
氨基酸“替代”指多肽中一个氨基酸用另一种氨基酸替换。在一个实施方案中，氨基酸用具有相似结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。“保守”氨基酸替代可以在所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或两亲性性质的相似性基础上进行。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺；带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、和组氨酸；而带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。非保守替代会需要用这些类别之一的成员交换另一个类别的成员。例如，氨基酸替代还可导致将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换，例如将来自一个组(例如极性)的氨基酸用来自一个不同组(例如碱性)的另一种氨基酸替换。可以使用本领域公知的遗传或化学方法来生成氨基酸替代。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等等。涵盖的是，通过除遗传工程以外的方法(诸如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法也可能是有用的。本文中可能使用了多种命名来指示同一氨基酸替代。例如，抗体重链第329位自脯氨酸变成甘氨酸的替代可以以329G、G329、G329、P329G、或Pro329Gly来指示。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为测定百分比氨基酸序列同一性目的比对可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于比对序列的适宜参数，包括在比较序列的全长里获得最大比对需要的任何算法。然而，就本文中目的而言，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.创作，并且源代码已与用户文档一起提交到美国版权局(U.S.Copyright Office)，Washington D.C.，20559，其在美国版权注册No.TXU510087下注册。ALIGN-2程序可从Genentech，Inc.，South San Francisco，California公开获得，或可从源代码汇编。ALIGN-2程序应当汇编用于UNIX操作系统，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定且不改变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定的氨基酸序列A对/与/相对给定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或其可以用短语表示为对/与/相对给定的氨基酸序列B具有或包含特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y的100倍
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在所述程序对A和B的比对中评为相同匹配的氨基酸残基数，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。会领会的是，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对B的％氨基酸序列同一性将不等于B对A的％氨基酸序列同一性。除非另外明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值如在上一段中描述的那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，而且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物，或能由DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。核苷酸序列可以被非核苷酸构件中断。多核苷酸可包含合成后进行的修饰，诸如缀合至标记物。
术语“修饰”指对肽主链(例如氨基酸序列)的任何操作或对多肽的翻译后修饰(例如糖基化)。
如本文中所使用的，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换使用并指已引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括初始转化的细胞和自其衍生的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内含物上可能与亲本细胞不完全相同，但可以含有突变。本文中包括具有如原始转化细胞中筛选或选择的相同的功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是能用于生成本发明的融合蛋白的任意类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞等，而且还包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。
药剂的“有效量”指引起接受其施用的细胞或组织中的生理学变化必需的量。
药剂例如药物组合物的“治疗有效量”指有效实现期望的治疗或预防结果的量(以必要的剂量且持续必要的时间)。治疗有效量的药剂例如消除、降低、延迟、最小化或预防疾病的不良作用。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如人和非人灵长类如猴)、家兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。特别地，所述个体或受试者是人。
术语“药物组合物”指其形式使得容许其中含有的活性成分的生物学活性有效，且不含对会接受配制剂施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。
“药学可接受载体”指药物组合物中活性成分以外对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文中使用的，“治疗/处理”(及其语法变体)指试图改变治疗个体中疾病的自然进程，并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、降低疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、及消退或改善的预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的形成或延缓病症的进展。
本发明的融合蛋白
本发明提供新颖的抗体-IL-10融合蛋白，其具有特别有利的特性，诸如可生产性、稳定性、结合亲和力和生物学活性。
在第一个方面，本发明提供IgG类抗体和IL-10分子的融合蛋白，其中该融合蛋白包含两条相同的重链多肽和两条相同的轻链多肽。在一个实施方案中，所述重链多肽每一条包含IgG类抗体重链和IL-10单体。在一个更加具体实施方案中，所述IL-10单体在它N端融合至所述IgG类抗体重链的C端，任选经由肽接头。在一个实施方案中，所述重链多肽每一条基本上由IgG类抗体重链、IL-10单体和任选的肽接头组成。在一个实施方案中，所述轻链多肽每一条包含IgG类抗体轻链。在一个实施方案中，所述轻链多肽每一条基本上由IgG类抗体轻链组成。与基于抗体片段的融合蛋白相比，IgG类抗体的存在赋予本发明的融合蛋白以有利的药动学特性，包括延长的血清半衰期(由于经由结合FcRn的再循环及分子大小充分超出肾过滤的阈)。IgG类抗体的存在还能够通过例如蛋白A亲和层析来简单纯化融合蛋白。令人惊讶地，如比较本发明基于IgG的IgG-IL-10融合蛋白与基于Fab片段的相应融合蛋白(Fab-IL-10)的实施例中所示，IgG类抗体的存在还改善融合蛋白在结合其靶抗原时的生物学活性。使用相同的重(和轻)链多肽容许简单生成融合蛋白，避免形成不想要的副产物及规避对促进不相同重链异二聚化的修饰，诸如节入穴修饰的需要。
在一些实施方案中，所述IL-10单体为天然IL-10单体，特别是天然人IL-10单体。在一个具体实施方案中，所述IL-10单体包含SEQ ID NO：1的多肽序列。在一个实施方案中，所述重链多肽中包含的所述IL-10单体形成功能性同二聚体IL-10分子。这种融合蛋白型式是特别有利的，在于两个IL-10单体形成完全功能性的、有生物学活性的IL-10二聚体。此外，与基于抗体片段的融合蛋白形成对比，在本发明融合蛋白中不仅在IL-10单体之间发生二聚化，而且在与单体融合的抗体重链之间也发生二聚化。因此，本发明的融合蛋白包含的IL-10二聚体分解成两个单体的趋势与例如本文所述Fab-IL-10融合蛋白相比降低(见图16)。重要的是，这种融合蛋白型式还在生物学活性方面优于本文所述其它融合蛋白型式。
在其它实施方案中，所述IL-10单体为经修饰IL-10单体，特别是经修饰人IL-10单体。在一个实施方案中，所述经修饰IL-10单体以单体形式在pH 7.0、37℃是稳定的。在一个实施方案中，所述经修饰IL-10单体在pH 7.0、37℃具有与天然IL-10单体相比改善的稳定性。一种合适的经修饰IL-10单体记载于Josephson et al.,J Biol Chem 275,13552-13557(2000)，其还记载了用于测量IL-10单体稳定性的方法。在一个具体实施方案中，所述IL-10单体包含SEQ IDNO：5的多肽序列。在一个实施方案中，所述重链多肽中包含的所述IL-10单体不彼此同二聚化。这种融合蛋白型式包含两个分开的经修饰IL-10单体，而非IL-10二聚体。如实施例所示，这种融合蛋白型式具有与包含IL-10二聚体的融合蛋白相似的对IL-10受体1的结合亲和力(亲合力)。此外，它具有特别好的可生产性，具有高表达产量和较小的聚集倾向。
在一个实施方案中，所述IgG类抗体为IgG1亚类抗体。在一个实施方案中，所述IgG类抗体为人抗体，即它包含人可变和恒定区。例示性人IgG1重和轻链恒定区的序列分别显示于SEQ ID NO 79和80。在一个实施方案中，IgG类抗体包含人Fc区，特别是人IgG Fc区，更特别是人IgG1Fc区。在一个实施方案中，所述IgG类抗体为全长抗体。在一个实施方案中，所述IgG类抗体为单克隆抗体。
虽然IgG类抗体的Fc域赋予融合蛋白以有利的药动学特性，包括长血清半衰期(归于靶组织中较好的积累和有利的组织-血液分布比)，但是它可同时引起不想要的将融合蛋白靶向表达Fc受体的细胞，而非优选的携带抗原的细胞。此外，Fc受体信号传导途径的激活可引起导致(促炎症)细胞因子受体激活的细胞因子释放和系统性施用时的严重副作用。因此，在一个实施方案中，所述IgG类抗体包含修饰，与没有所述修饰的相应IgG类抗体相比，该修饰降低抗体对Fc受体的结合亲和力。在一个具体实施方案中，所述Fc受体为Fcγ受体，特别是人Fcγ受体。对Fc受体的结合亲和力可容易地测定，例如通过ELISA或通过表面等离振子共振(SPR)，使用标准仪器设备，诸如BIAcore设备(GE Healthcare)和Fc受体，诸如可通过重组表达获得。下面描述了一种用于测量结合亲和力的具体的示例性和例示性实施方案。依照一个实施方案，于25℃用在CM5芯片上固定化的配体(Fc受体)使用T100仪器(GE Healthcare)通过表面等离振子共振测量对Fc受体的结合亲和力。简言之，用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)依照供应商的用法说明书活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，GE Healthcare)。用10mM乙酸钠pH 5.5将重组配体稀释至0.5-30μg/ml，之后以10μl/min流速注射以实现大约100-5000个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注射配体后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了动力学测量，于25℃以大约30-50μl/min的流速注射抗体在HBS-EP+(GEHealthcare，10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20，pH 7.4)中的3至5倍连续稀释液(范围介于约0.01nM至300nM之间)。通过同时拟合结合和解离传感图使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(T100Evaluation Software version 1.1.1)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。以比率koff/kon计算平衡解离常数(KD)。参见例如Chen etal.,J Mol Biol 293,865-881(1999)。或者，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系，诸如表达FcγIIIa受体的NK细胞来评估抗体对Fc受体的结合亲和力。
在一个实施方案中，修饰包含一处或多处降低抗体对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变。在一个实施方案中，氨基酸突变为氨基酸替代。典型的，两条抗体重链每一条中存在相同的一处或多处氨基酸突变。在一个实施方案中，所述氨基酸突变将抗体对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍、或至少10倍。在存在多于一处降低抗体对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中，这些氨基酸突变的组合可将抗体对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍、或甚至至少50倍。在一个实施方案中，与没有所述修饰的相应IgG类抗体相比，所述IgG类抗体展现少于20％、特别是少于10％、更特别是少于5％的对Fc受体的结合亲和力。
在一个实施方案中，所述Fc受体为激活性Fc受体。在一个具体实施方案中，所述Fc受体选自下组：FcγRIIIa(CD16a)，FcγRI(CD64)，FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。在一个具体实施方案中，Fc受体为Fcγ受体，更具体是FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa受体。优选地，对这些受体每一种的结合亲和力是降低的。在一个甚至更加具体实施方案中，所述Fc受体为FcγIIIa，特别是人FcγIIIa。在一些实施方案中，对补体构件的结合亲和力，具体是对C1q的结合亲和力也是降低的。在一个实施方案中，对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当抗体展现未修饰形式的抗体对FcRn的结合亲和力的大于约70％时，实现实质性相似的对FcRn的结合，即保留抗体对所述受体的结合亲和力。本发明的融合蛋白中包含的IgG类抗体可展现大于约80％和甚至大于约90％的此类亲和力。
在一个实施方案中，所述降低抗体对Fc受体的结合亲和力的修饰在IgG类抗体的Fc区中，特别是CH2区。在一个实施方案中，所述IgG类抗体在抗体重链第329位(EU编号方式)包含氨基酸替代。在一个更加特定实施方案中，所述氨基酸替代为P329A或P329G，特别是P329G。在一个实施方案中，所述IgG类抗体在抗体重链第234位和第235位(EU编号方式)包含氨基酸替代。在一个具体实施方案中，所述氨基酸替代为L234A和L235A(LALA)。在一个实施方案中，所述IgG类抗体包含抗体重链第329位(EU编号方式)处的氨基酸替代和选自抗体重链位置228，233，234，235，297和331的位置处的别的氨基酸替代。在一个更加特定实施方案中，别的氨基酸替代为S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在一个特定实施方案中，所述IgG类抗体包含抗体重链第P329位、第L234位和第L235位(EU编号方式)处的氨基酸替代。在一个更加特定实施方案中，所述IgG类抗体包含抗体重链中的氨基酸替代L234A、L235A和P329G(LALAP329G)。这种氨基酸替代组合几乎特别有效地消除人IgG类抗体的Fcγ受体结合，如记载于PCT公开文本No.WO 2012/130831，通过述及完整收入本文。PCT公开文本No.WO 2012/130831还记载了制备此类经修饰抗体的方法和用于测定其特性(诸如Fc受体结合或效应器功能)的方法。
在抗体重链中包含修饰的抗体可以使用本领域公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除、替代、插入或修饰来制备。遗传方法可包括编码DNA序列的定点诱变、PCR、基因合成、等等。可通过例如测序来验证正确核苷酸变化。
包含降低Fc受体结合的修饰的抗体一般具有与相应未修饰抗体相比降低的效应器功能，特别是降低的ADCC。因而，在一个实施方案中，所述降低IgG类抗体对Fc受体的结合亲和力的修饰降低IgG类抗体的效应器功能。在一个具体实施方案中，所述效应器功能为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一个实施方案中，ADCC降低至由没有所述修饰的相应IgG类抗体诱导的ADCC的少于20％。抗体的效应器功能可通过本领域已知方法来测量。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的例子记载于美国专利No.5,500,362；Hellstrom et al.Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom et al.,Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；Bruggemann et al.,J Exp Med 166,1351-1361(1987)。或者，可采用非放射性测定法方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.，Mountain View，CA)；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega，Madison，WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes et al.,Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)。在一些实施方案中，IgG类抗体对补体构件(具体是C1q)的结合也是降低的。因而，补体依赖性细胞毒性(CDC)也可以是降低的。可进行C1q结合测定法以测定抗体是否能够结合C1q并因而具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro et al.,J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg et al.,Blood 101,1045-1052(2003)；和Cragg and Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。
在本文上文和PCT公开文本No.WO 2012/130831所述IgG类抗体之外，Fc受体结合和/或效应器功能降低的抗体还包括那些替代Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸第265位、第269位、第270位、第297位和第327位中两个或更多个处具有替代的Fc突变体，包括具有残基265和297变成丙氨酸的替代的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
IgG4亚类抗体展现与IgG1抗体相比降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。因而，在一些实施方案中，本发明的融合蛋白中包含的所述IgG类抗体为IgG4亚类抗体，特别是人IgG4亚类抗体。在一个实施方案中，所述IgG4亚类抗体在Fc区中在位置S228处包含氨基酸替代，具体是氨基酸替代S228P。为了进一步降低它对Fc受体的结合亲和力和/或它的效应器功能，在一个实施方案中，所述IgG4亚类抗体在位置L235处包含氨基酸替代，具体是氨基酸替代L235E。在另一个实施方案中，所述IgG4亚类抗体在位置P329处包含氨基酸替代，具体是氨基酸替代P329G。在一个特定实施方案中，所述IgG4亚类抗体在第S228位、第L235位和第P329位处包含氨基酸替代，具体是氨基酸替代S228P、L235E和P329G。此类经修饰IgG4亚类抗体及其Fcγ受体结合特性记载于PCT公开文本No.WO 2012/130831，通过述及完整收入本文。
本发明的抗体组合多项特别有利的特性，例如对于治疗性应用而言。
在一个实施方案中，所述IgG类抗体能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)。
在一个实施方案中，所述IgG类抗体能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)。FAP已经鉴定为使用本发明的融合蛋白治疗炎性疾病的合适靶。在一个具体实施方案中，当于25℃通过表面等离振子共振(SPR)测量时，该融合蛋白能够以小于1nM、特别是小于100pM的亲和常数(KD)结合FAP。本文中描述了一种通过SPR测量对FAP的结合亲和力的方法。在一个实施方案中，于25℃用通过共价偶联至GLM芯片的抗His抗体固定化的带His标签的抗原使用ProteOn XPR36仪器(Biorad)通过SPR测量融合蛋白的亲和力(KD)。在一种例示性方法中，通过以高水平(高至约5.000RU)以30μl/min固定化到GLM芯片的分开的垂直通道上的共价固定化的抗五His IgG(Qiagen#34660，小鼠单克隆抗体)经由它的H6标签捕捉靶蛋白质(FAP)，所述固定化通过将所有通道用新鲜制备的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(sNHS)混合物同时活化5min，并随后注射10mM乙酸钠缓冲液pH 4.5中的15μg/ml抗五His IgG达180sec。通过注射乙醇胺5分钟来封闭通道。以30μl/min沿着垂直通道自运行缓冲液中的5μg/ml稀释液捕捉带His6标签的FAP达60s以实现约250和600RU之间的配体密度。在单击动力学测定法设置(OSK)中，以100μl/min以范围为50至0.08nM的5倍连续稀释液沿着水平通道注射融合蛋白作为分析物。结合阶段记录180s，解离阶段记录600s。在展示很慢解离速率的相互作用的情况中，解离速率记录延长至1800s以观察复合物的解离。沿着第六通道注射运行缓冲液(PBST)以提供“线上”空白作为参照。通过同时拟合结合和解离传感图使用简单1:1朗格缪尔(Langmuir)结合模型(ProteOn Manager software version 2.1)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。以比率koff/kon计算平衡解离常数(KD)。
在一个实施方案中，所述FAP为人、小鼠和/或食蟹猴FAP。优选地，本发明的融合蛋白中包含的IgG类抗体对人和食蟹猴和/或小鼠FAP是交叉反应性的，这能够例如在人使用之前在食蟹猴和/或小鼠中进行体内研究。
在一个具体实施方案中，所述IgG类抗体包含SEQ ID NO：37的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO：41的HCDR 2、SEQ ID NO：49的HCDR 3、SEQID NO：53的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO：57的LCDR 2和SEQ ID NO：61的LCDR 3。在一个甚至更加具体实施方案中，所述IgG类抗体包含SEQ IDNO：63的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：65的轻链可变区(VL)。在另一个特定具体实施方案中，所述IgG类抗体包含SEQ ID NO：37的HCDR 1、SEQ ID NO：43的HCDR 2、SEQ ID NO：47的HCDR 3、SEQ ID NO：51的LCDR 1、SEQ ID NO：55的LCDR 2和SEQ ID NO：59的LCDR 3。在一个甚至更加具体实施方案中，所述IgG类抗体包含SEQ ID NO：67的VH和SEQ IDNO：69的VL。如实施例所示，这些抗体显示特别强的对人、小鼠以及食蟹猴FAP的结合亲和力/亲合力
在又一些特定实施方案中，所述IgG类抗体包含SEQ ID NO：39的HCDR1、SEQ ID NO：45的HCDR 2、SEQ ID NO：49的HCDR 3、SEQ ID NO：53的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO：57的LCDR 2和SEQ ID NO：61的LCDR3.在一个甚至更加具体实施方案中，所述IgG类抗体包含SEQ ID NO：71的VH和SEQ ID NO：73的VL。在另一个具体实施方案中，所述IgG类抗体包含SEQ ID NO：37的HCDR 1、SEQ ID NO：41的HCDR 2、SEQ ID NO：47的HCDR 3、SEQ ID NO：51的LCDR 1、SEQ ID NO：55的LCDR 2和SEQ ID NO：59的LCDR 3。在一个甚至更加具体实施方案中，所述IgG类抗体包含SEQ IDNO：75的VH和SEQ ID NO：77的VL。
在一个实施方案中，当于25℃通过SPR测量时，该融合蛋白能够以小于1nM、特别是小于100pM的亲和常数(KD)结合IL-10受体-1(IL-10R1)。本文中描述了一种通过SPR测量对IL-10R1的结合亲和力的方法。在一个实施方案中，于25℃使用ProteOn XPR36仪器(Biorad)用通过中性亲合素捕捉在NLC芯片上固定化的生物素化IL-10R1通过SPR测量融合蛋白的亲和力(KD)。在一种例示性方法中，对于不同接触时间，沿着垂直通道以浓度10μg/ml和流速30μl/sec在中性亲合素衍生化芯片基质上捕捉400至1600RU的IL-10R1。通过以100μl/min以水平取向注射以六个不同分析物浓度(50、10、2、0.4、0.08，0nM)测量对生物素化IL10R1的结合，结合速率记录180s，解离速率记录600s。沿着第六通道注射运行缓冲液(PBST)以提供“线上”空白作为参照。通过同时拟合结合和解离传感图使用简单1:1朗格缪尔(Langmuir)结合模型(ProteOn Manager software version 2.1)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。以比率koff/kon计算平衡解离常数(KD)。
在一个具体实施方案中，所述IL-10R1为人IL-10R1。在一个实施方案中，当于25℃通过SPR测量时，所述结合IL-10R1的亲和常数(KD)大致等于或大于所述结合FAP的亲和常数(KD)。在一个具体实施方案中，所述结合IL-10R1的KD大于所述结合FAP的KD的约一半。本发明的融合蛋白结合FAP和IL-10R1的KD值的特定比使得它们特别适合于将IL-10有效靶向表达FAP的组织。不希望受限于理论，由于它们对FAP的结合亲和力至少像它们对IL-10R1的结合亲和力同样高，本发明的融合蛋白不太可能在到达表达FAP的靶组织之前结合靶组织以外(例如在循环中)表达IL-10R1的细胞。
在一个特定方面，本发明提供能够特异性结合FAP且包含修饰的人IgG1亚类抗体和IL-10分子的融合蛋白，与没有所述修饰的相应人IgG1亚类抗体相比，该修饰降低抗体对Fc受体的结合亲和力，
其中该融合蛋白包含两条相同的重链多肽(每一条包含在它的N端融合至人IgG1亚类抗体重链的C端的天然IL-10单体)和两条相同的轻链。
在一个具体实施方案中，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO：9的多肽至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链多肽和与SEQ ID NO：7的多肽至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链多肽。在另一个具体实施方案中，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO：27的多肽至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链多肽和与SEQ ID NO：25的多肽至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链多肽。
又一方面，本发明提供能够特异性结合FAP且包含修饰的人IgG1亚类抗体和IL-10分子的融合蛋白，与没有所述修饰的相应人IgG1亚类抗体相比，该修饰降低抗体对Fc受体的结合亲和力，
其中该融合蛋白包含两条相同的重链多肽(每一条包含在它的N端融合至人IgG1亚类抗体重链的C端的经修饰IL-10单体)和两条相同的轻链。
在一个具体实施方案中，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO：17的多肽至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链多肽和与SEQ ID NO：7的多肽至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链多肽。在另一个具体实施方案中，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO：29的多肽至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链多肽和与SEQ ID NO：25的多肽至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链多肽。
多核苷酸
本发明还提供多核苷酸，其编码如本文中描述的融合物或其抗原结合片段。
本发明的多核苷酸包括那些与以下所列序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸：SEQ ID NO 2,6,8,10,18,26,28,30,38,40,42,44,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,78和89，包括其功能性片段或变体。
可以将编码本发明的融合蛋白的多核苷酸以编码完整融合蛋白的单一多核苷酸表达，或以共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性融合蛋白。例如，抗体的轻链部分可与抗体的重链部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽联合以形成抗体。
在一个实施方案中，本发明涉及编码IgG类抗体和IL-10分子的融合蛋白或其抗原结合片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码如SEQ ID NO63、65、67、69、71、73、75或77所示的可变区序列的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码IgG类抗体和IL-10分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码如SEQ ID NO 7、9、17、25、27或29所示的多肽序列的序列。在另一个实施方案中，本发明进一步涉及编码IgG类抗体和IL-10分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO 2、6、8、10、18、26、28、30、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78或89所示的核酸序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码IgG类抗体和IL-10分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO 2、6、8、10、18、26、28、30、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78或89所示的核酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码IgG类抗体和IL-10分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与SEQ ID NO 63、65、67、69、71、73、75或77的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的可变区序列的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码IgG类抗体和IL-10分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与SEQ ID NO 7、9、17、25、27或29的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽序列的序列。本发明涵盖编码IgG类抗体和IL-10分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码SEQ ID NO 63、65、67、69、71、73、75或77的可变区序列及保守氨基酸替代的序列。本发明还涵盖编码IgG类抗体和IL-10分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码SEQ ID NO 7、9、17、25、27或29的多肽序列及保守氨基酸替代的序列。
在某些实施方案中，所述多核苷酸或核酸是DNA。在其它实施方案中，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
可以例如通过固相肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生成来获得本发明的融合蛋白。对于重组生成，分离一种或多种编码所述融合蛋白(片段)的多核苷酸(例如如上文描述的)，并将其插入一种或多种载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程容易分离并测序这类多核苷酸。在一个实施方案中，提供包含一种或多种本发明的多核苷酸的载体(优选为表达载体)。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建含有融合蛋白(片段)的编码序列以及适宜的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如记载于Maniatis et al.,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold SpringHarbor Laboratory,N.Y.(1989)；及Ausubel et al.,CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)的技术。表达载体可以是质粒、病毒的一部分或可以是核酸片段。表达载体包含表达盒，其中在与启动子和/或其它转录或翻译控制元件的可操作联合中克隆编码融合蛋白(片段)的多核苷酸(即编码区)。如本文中使用的，“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的一部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但可将其视为编码区的一部分(若存在的话)，但任何侧翼序列例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5’和3’非翻译区等，不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中(例如单一载体上)，或存在于分开的多核苷酸构建体中，例如在分开的(不同的)载体上。此外，任何载体可含有单个编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，其经由蛋白水解切割在翻译后或共翻译分开成最终蛋白质。另外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，其与编码本发明的融合蛋白(片段)或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于特殊化的元件或基序，如分泌信号肽或异源功能域。当基因产物例如多肽的编码区与一种或多种调节序列以某种方式联合从而使得该基因产物的表达置于该调节序列的影响或控制下时，即为可操作联合。若诱导启动子功能导致编码期望的基因产物的mRNA的转录并且如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导该基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(如多肽编码区和与其联合的启动子)为“可操作联合的”。如此，如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录，那么该启动子区将是与该核酸可操作联合。所述启动子可以是细胞特异性启动子，其仅在预先确定的细胞中指导DNA的实质性转录。除启动子以外，其它转录控制元件例如增强子、操纵基因、阻遏物和转录终止信号能与多核苷酸可操作联合以指导细胞特异性转录。在本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区，如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子，与内含子-A联合)、猿病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如例如劳斯(Rous)肉瘤病毒)。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和家兔β球蛋白衍生的，以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及自病毒系统衍生的元件(具体地，内部核糖体进入位点或IRES，亦称为CITE序列)。表达盒还可以包含其它特征，如复制起点和/或染色体整合元件，如逆转录病毒长末端重复(LTR)或腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的另外的编码区联合，所述分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果期望分泌所述融合物，那么可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明融合蛋白或其片段的核酸上游。依照信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦启动将生长的蛋白质链跨越粗面内质网输出，就将该信号肽或分泌前导序列从成熟的蛋白质切去。本领域中普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合至多肽N端的信号肽，其从所翻译的多肽切去以生成分泌性或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然的信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或该序列的保留指导与其可操作联合的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，可以将野生型前导序列用人组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列取代。例示性分泌性信号肽的氨基酸和核苷酸序列分别在SEQ IDNO 35和36显示。
可以将编码能用于促进后期纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记融合蛋白的短蛋白序列的DNA纳入融合蛋白(片段)编码多核苷酸内或其末端。
在一个别的实施方案中，提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独地或组合地掺入本文中分别关于多核苷酸和载体所描述的任何特征。在一个这类实施方案中，宿主细胞包含载体(例如已用该载体转化或转染)，所述载体包含编码本发明融合蛋白(的部分)的多核苷酸。如本文中使用的，术语“宿主细胞”指任何能工程化以生成本发明的融合蛋白或其片段的细胞系统种类。适用于复制并支持融合蛋白表达的宿主细胞是本领域中公知的。在适当时，可用特定的表达载体转染或转导这类细胞，并且可以培养大量的含载体细胞以用于接种大规模发酵罐，从而获得充足量的融合蛋白用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物如大肠杆菌，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，可以在细菌中生成多肽，尤其在不需要糖基化时。在表达后，可以将多肽在可溶性级分中从细菌细胞糊分离并可以进一步纯化。除了原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适合编码多肽的载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化模式的多肽的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)，和Li et al.,Nat Biotech 24,210-215(2006)。适用于表达(糖基化)多肽的宿主细胞还自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定出可与昆虫细胞一起使用的大量杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。也可以将植物细胞培养物用作宿主。参见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适应于在悬液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。可用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如记载于Graham et al.,J Gen Virol 36,59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如记载于Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)的)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、猕猴肾细胞(MDCK)，牛鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳房肿瘤细胞(MMT 060562)、TRI细胞(如例如记载于Mather et al.,Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)的)、MRC 5细胞和FS4细胞。其它可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub et al.,Proc Natl Acad Sci USA77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。对于某些适用于蛋白质生产的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞等，但还包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选为哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。
本领域中已知在这些系统中表达外来基因的标准技术。可以将表达包含抗体的重链或轻链的多肽的细胞工程化改造为使得还表达另一抗体链，从而使得表达的产物是具有重链和轻链两者的抗体。
在一个实施方案中，提供了生成依照本发明的融合蛋白的方法，其中所述方法包括在适合于所述融合蛋白表达的条件下培养包含编码融合蛋白的多核苷酸的宿主细胞(如本文中提供的)，并从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述融合蛋白。
在本发明的融合蛋白中，各组分(IgG类抗体和IL-10分子)彼此遗传融合。融合蛋白可设计为使其组分直接彼此融合或经由接头序列间接融合。可依照本领域中公知的方法测定接头的组成和长度，并可以测试功效。还包含另外的序列以纳入切割位点来分开融合蛋白的各个组分(若期望的话)，例如内肽酶识别序列。
在某些实施方案中，本发明的融合蛋白至少包含能结合抗原诸如FAP的抗体可变区。可变区可形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分和自其衍生。生成多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域中公知的(参见例如Harlow and Lane,"Antibodies,a laboratory manual",Cold Spring HarborLaboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成构建生成，可以重组生成(例如如记载于美国专利No.4,186,567的)或可通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合库获得(参见例如McCafferty的美国专利No.5,969,108)。
可以将任何动物物种的抗体用于本发明。可用于本发明的非限制性抗体可以是鼠、灵长类或人起源的。如果抗体意图供人使用，那么可以使用嵌合形式的抗体，其中抗体的恒定区来自人。也可以依照本领域中公知的方法制备人源化或全人形式的抗体(参见例如Winter的美国专利No.5,565,332)。人源化可以通过各种方法实现，包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR嫁接到人(例如受体抗体)框架和恒定区上，保留或不保留关键的框架残基(例如那些对于保留较好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基)，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)嫁接到人框架和恒定区上，或(c)移植完整的非人可变域，但通过替换表面残基用人样部分来“掩饰(cloak)”它们。人源化的抗体及其制备方法综述于例如Almagro and Fransson,Front Biosci 13,1619-1633(2008)，并且还记载于例如Riechmann et al.,Nature 332,323-329(1988)；Queen et al.,Proc NatlAcad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Jones et al.,Nature 321,522-525(1986)；Morrison et al.,Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984)；Morrison and Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen et al.,Science 239,1534-1536(1988)；Padlan,MolecImmun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri et al.,Methods 36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,Mol Immunol 28,489-498(1991)(描述“表面重建”)；Dall’Acqua et al.,Methods 36,43-60(2005)(描述“FR改组”)；及Osbourn et al.,Methods 36,61-68(2005)及Klimka et al.,Br J Cancer 83,252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”办法)。依照本发明的特定抗体为人抗体。可以使用本领域中已知的各种技术来生成人抗体和人可变区。人抗体一般记载于van Dijk and van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)及Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)。人可变区能形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分和自其衍生(参见例如Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。还可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体和人可变区，所述转基因动物已经过修饰以应答抗原激发而生成完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体(参见例如Lonberg,Nat Biotech23,1117-1125(2005)。还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示库的Fv克隆可变区序列来生成人抗体和人可变区(参见例如Hoogenboom et al.inMethods in Molecular Biology 178,1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)；及McCafferty et al.,Nature 348,552-554；Clackson et al.,Nature 352,624-628(1991))。噬菌体通常展示抗体片段，作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段。通过噬菌体展示制备抗体的详细描述可见于WO2012/020006所附实施例，通过述及将其完整收入本文
在某些实施方案中，将本发明的融合蛋白中包含的抗体改造为具有增强的结合亲和力，其依照例如公开于PCT公开文本WO 2012/020006(参见涉及亲和力成熟的实施例)或美国专利申请公开文本No.2004/0132066的方法进行，其完整内容通过提述据此并入。可以经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术来测量本发明的抗体结合特定抗原性决定簇的能力，所述其它技术例如表面等离振子共振技术(Liljeblad,et al.,Glyco J 17,323-329(2000))和传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。可以使用竞争测定法来鉴定与参照抗体竞争对特定抗原的结合的抗体，例如与4G8抗体竞争对FAP的结合的抗体。在某些实施方案中，这类竞争性抗体结合由参照抗体结合的相同表位(例如线性或构象性表位)。用于定位抗体结合的表位的详细的例示性方法在Morris(1996)“EpitopeMapping Protocols”,in Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中提供。在一种例示性竞争测定法中，将固定化的抗原(例如FAP)在溶液中温育，所述溶液包含结合该抗原的第一经标记抗体(例如4G8抗体)和测试其与第一抗体竞争对抗原的结合的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化的抗原在溶液中温育，所述溶液包含第一经标记抗体但没有第二未标记抗体。在允许第一抗体结合抗原的条件下温育后，除去过量的未结合的抗体，并测量与固定化抗原联合的标记物的量。如果与固定化抗原联合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质性降低，那么这指示第二抗体在与第一抗体竞争对抗原的结合。参见Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
可以通过本领域已知的技术来纯化如本文中描述的那样制备的融合蛋白，所述技术如高效液相层析、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等。用于纯化具体蛋白质的实际条件将部分取决于因素，如净电荷、疏水性、亲水性等，而且对于本领域中的技术人员将是明显的。对于亲和层析纯化，能使用融合蛋白结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于本发明的融合蛋白的亲和层析纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。可以使用连续的蛋白A或G亲和层析和大小排阻层析来分离融合蛋白，基本如实施例中描述的。可以通过多种公知的分析方法中的任一种来测定融合蛋白的纯度，包括凝胶电泳、高压液相层析等。例如，如实施例中所描述的那样表达的融合蛋白显示为完整且正确装配的，如通过还原性和非还原性SDS-PAGE证明的(见例如图2、5)。
组合物、配制剂和施用路径
在一个别的方面，本发明提供包含本文中提供的任何融合蛋白的药物组合物，例如用于下述任何治疗方法。在一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任何融合蛋白以及药学可接受载体。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任何融合蛋白及至少一种另外的治疗剂，例如如下文描述的。
还提供以适于体内施用的形式生成本发明的融合蛋白的方法，所述方法包括：(a)获得依照本发明的融合蛋白，并(b)将所述融合蛋白与至少一种药学可接受载体配制在一起，由此配制成用于体内施用的融合蛋白制剂。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的在药学可接受载体中溶解或分散的一种或多种融合蛋白。短语“药学或药理学可接受的”指在所采用的剂量和浓度一般对接受者无毒性，即在适当时对动物如例如人施用时不产生不利、变应性或其它不当反应的分子实体和组合物。根据本公开，制备含有至少一种融合蛋白以及任选地另外的活性成分的药物组合物将是本领域技术人员已知的，如由Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack PrintingCompany,1990例示的，其通过提述并入本文。此外，对于动物(例如人)施用，会理解制剂应当满足FDA生物标准部门(FDA Office of BiologicalStandards)或其它国家的相应机构要求的无菌性、热原性(pyrogenicity)、一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干配制剂或水性溶液。如本文中使用的，“药学可接受载体”包括任何和所有的溶剂、缓冲剂、分散介质、涂料材料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延缓剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂(disintegration agent)、润滑剂、甜味剂、芳香剂、染料、这类类似的材料及其组合，如本领域普通技术人员将已知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.MackPrinting Company,1990,pp.1289-1329，通过提述并入本文)。除非任何常规载体与活性成分不相容，涵盖其在治疗或药物组合物中的使用。
所述组合物可以包含不同类型的载体，这取决于其要以固体、液体还是气雾剂形式施用，以及其对于这类施用路径如注射是否需要是无菌的。可以静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、损伤内、颅内、关节内、前列腺内、脾内、肾内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肿瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、囊泡内、粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、表面(topically)、局部(locally)、通过吸入(例如气雾剂吸入)、注射、输注、连续输注、直接浸洗靶细胞的局部灌注、经由导管、经由灌洗、以乳剂、以液体组合物(例如脂质体)、或通过其它方法或前述项的任意组合施用本发明的融合蛋白(以及任何另外的治疗剂)，如本领域中普通技术人员会知晓的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack PrintingCompany,1990，通过提述并入本文)。胃肠外施用，特别是静脉内注射，最常用于施用多肽分子如本发明的融合蛋白。
胃肠外组合物包括那些设计用于通过注射施用，例如皮下、皮内、损伤内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射施用的组合物。对于注射，可以将本发明的融合蛋白在水性溶液，优选地在生理学相容的缓冲液中配制，所述生理学相容的缓冲液如汉克(Hanks)氏溶液、林格(Ringer)氏溶液或生理学盐水缓冲液。溶液可以含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，融合蛋白可以为粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原水构成。根据需要，通过将本发明的融合蛋白以需要的量掺入到具有下文列举的各种其它成分的合适溶剂中来制备无菌可注射溶液。可以容易地实现无菌，例如通过过滤流过无菌过滤膜进行。一般地，通过将各种无菌活性成分掺入到无菌媒介物中来制备分散剂，所述无菌媒介物含有基础分散介质和/或其它成分。在制备无菌可注射溶液、悬液或乳剂的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥或冻冻干燥技术，其将活性成分以及任何另外的期望成分的粉末从其先前无菌过滤的液体介质产生。液体介质在必要时应当是适当缓冲的，并且在用充足的盐水或葡萄糖注射前首先使液体稀释液等张。组合物在制备和贮存条件下必须是稳定的，并且针对微生物如细菌和真菌的污染作用提供保护。会领会的是，应当将内毒素污染最少保持于安全水平，例如低于0.5ng/mg蛋白质。合适的药学可接受载体包括但不限于：缓冲剂如磷酸、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(低于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清清蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反荷离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬液可以含有提高悬液粘度的化合物，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的试剂。另外，可以将活性化合物的悬液制备为合适的油性注射悬液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油或合成的脂肪酸酯，如乙基cleats或甘油三酯或脂质体。
可以将活性成分在例如分别通过凝聚技术或通过界面聚合作用制备的微囊剂，例如羟甲基纤维素或明胶微囊剂和聚-(甲基丙烯酸酯)微囊剂中，在胶体药物投递系统(例如脂质体、清蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液(macroemulsion)中包载。这类技术披露于Remington'sPharmaceutical Sciences(18th Ed.Mack Printing Company,1990)。可以制备持续释放的制剂。合适的持续释放制剂的例子包括含多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形制品例如膜或微囊剂的形式。在具体的实施方案中，可以通过在组合物中使用吸收延迟剂如例如单硬脂酸铝、明胶或其组合，来产生可注射组合物的延长吸收。
在先前描述的组合物外，融合蛋白还可以配制为贮存(depot)制剂。可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用这类长效配制剂。如此，例如所述融合蛋白可以用合适的聚合或疏水性材料(例如作为可接受油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制为微溶性衍生物，例如微溶性盐。
可以通过常规的混合、溶解、乳化、包囊、包载或冻干过程来制备包含本发明的融合蛋白的药物组合物。可以以常规方式配制药物组合物，其使用一种或多种有助于将蛋白质加工成可药学使用的制剂的生理学可接受载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂。合适的配制剂依赖于选择的施用路径。
可以将融合蛋白以游离酸或碱、中性或盐形式配制成组合物。药学可接受盐是基本保留游离酸或碱的生物学活性的盐。这些包括酸加成盐(acidaddition salt)，例如与蛋白质性组合物的游离氨基基团形成的那些，或与无机酸(如例如氢氯酸或磷酸)或与有机酸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的。与游离羧基基团形成的盐还可以自无机碱如例如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁；或有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因(procaine)衍生。药用盐倾向于比相应的游离碱形式更可溶于水性溶剂和其它质子溶剂中。
治疗方法和组合物
可以将本文中提供的任一种融合蛋白用在治疗方法中。
对于在治疗方法中的使用，将以与优良医学实践一致的方式配制、给药和施用本发明的融合蛋白。在此背景中考虑的因素包括治疗的特定病症、治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的起因、药剂的投递部位、施用方法、施用时间安排以及医学从业人员已知的其它因素。
在一个方面，提供用作药物的本发明的融合蛋白。在别的方面，提供用于治疗疾病的本发明的融合蛋白。在某些实施方案中，提供用于治疗方法的本发明的融合蛋白。在一个实施方案中，本发明提供如本文中描述的融合蛋白，用于治疗有此需要的个体中的疾病。在某些实施方案中，本发明提供融合蛋白，用于治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括对所述个体施用治疗有效量的融合蛋白。在某些实施方案中，待治疗的疾病是炎性疾病。例示性炎性疾病包括炎性肠病(例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)和类风湿性关节炎。在一个特定实施方案中，该疾病为炎性肠病或类风湿性关节炎，特别是炎性肠病，更特别是克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗炎剂(如果待治疗的疾病是炎性疾病的话)。依照上文任意实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。
在一个别的方面，本发明提供本发明的融合蛋白在制造或制备药物中的用途，所述药物用于治疗有此需要的个体中的疾病。在一个实施方案中，所述药物用于治疗疾病的方法，该方法包括对患疾病的个体施用治疗有效量的药物。在某些实施方案中，待治疗的疾病是炎性疾病。在一个特定实施方案中，该疾病为炎性肠病或类风湿性关节炎，特别是炎性肠病，更特别是克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。在一个实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗炎剂(如果待治疗的疾病是炎性疾病的话)。依照上文任意实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。
在一个别的方面，本发明提供用于在个体中治疗疾病的方法，包括对所述个体施用治疗有效量的本发明的融合蛋白。在一个实施方案中，对所述个体施用组合物，其包含药学可接受的形式的本发明的融合蛋白。在某些实施方案中，待治疗的疾病是炎性疾病。在一个特定实施方案中，该疾病为炎性肠病或类风湿性关节炎，特别是炎性肠病，更特别是克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗炎剂(如果待治疗的疾病是炎性疾病的话)。依照上文任意实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。
本发明的融合蛋白作为诊断试剂也是有用的。能容易地检测融合蛋白对抗原决定簇的结合，例如通过附着于融合蛋白的标记物或通过使用经过标记的、对本发明的融合蛋白特异性的二抗。
在一些实施方案中，对细胞施用有效量的本发明的融合蛋白。在其它实施方案中，对个体施用治疗有效量的本发明的融合蛋白以治疗疾病。
为了预防或治疗疾病，本发明的融合蛋白的合适剂量(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、施用路径、患者的体重、融合蛋白的类型、疾病的严重程度和进程、施用融合蛋白是为了预防还是治疗目的、先前或同时的治疗干预、患者的临床史和对融合蛋白的响应、以及主治医师的判断。负责施用的从业人员将在任何事件中确定组合物中活性成分的浓度和用于个体受试者的合适剂量。本文中涵盖各种给药方案，包括但不限于在各个时间点的单次或多次施用、推注施用、和脉冲输注。
所述融合蛋白适宜地在一次或一系列治疗里对患者施用。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的融合蛋白可以是用于对患者施用的起始候选剂量，不管是例如通过一次或多次分开的施用，还是通过连续输注进行。根据上文提及的因素，一种典型的每日剂量的范围可以从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在数天或更长里的重复施用，根据状况，治疗一般将持续直至发生对疾病症状的期望的抑制。融合蛋白的一种例示性剂量将在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其它非限制性例子中，剂量还可包括每次施用从约1μg/kg体重、约5μg/kg体重、约10μg/kg体重、约50μg/kg体重、约100μg/kg体重、约200μg/kg体重、约350μg/kg体重、约500μg/kg体重、约1mg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约50mg/kg体重、约100mg/kg体重、约200mg/kg体重、约350mg/kg体重、约500mg/kg体重，至约1000mg/kg体重或更多，以及其中可导出的任何范围。在从本文列出的数量可导出的范围的非限制性例子中，基于上文描述的数目，可以施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重的范围，约5微克/kg体重至约500毫克/kg体重的范围等。如此，可以对患者施用一剂或多剂的约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。可以间歇地施用这类剂量，例如每周或每3周(例如使得患者接受约2至约20、或例如约6剂的融合蛋白)。可以施用起始较高的加载剂量，继之以一剂或多剂较低剂量。然而，可以使用其它剂量方案。通过常规技术和测定法容易监测该疗法的进行。
本发明的融合蛋白一般将以对于实现意图的目的有效的量使用。对于治疗或预防疾病状况的用途，以治疗有效量施用或应用本发明的融合蛋白、或其药物组合物。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力以内，尤其根据本文中提供的详细公开内容。
对于系统性施用，能从体外测定法如细胞培养测定法初步估算出治疗有效剂量。然后可以在动物模型中配制剂量以达到包含如在细胞培养中测定的IC50的循环浓度范围。可以将此类信息用于更准确地确定人中的可用剂量。
使用本领域中公知的技术，还能从体外数据例如动物模型估算出初始剂量。本领域中的普通技术人员能容易地基于动物数据优化对人的施用。
可以分别调整剂量量和时间间隔以提供足以维持治疗效果的融合蛋白的血浆水平。通过注射施用的通常患者剂量的范围为从约0.1至50mg/kg/天，通常约0.5至1mg/kg/天。可以通过每日施用多剂实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC测量血浆中的水平。
在局部施用或选择性摄取的情况中，融合蛋白的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员会能够在无需过度实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文中描述的融合蛋白的治疗有效剂量一般将提供治疗益处，而不导致实质性毒性。可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学规程来测定融合蛋白的毒性和治疗功效。可以使用细胞培养测定法和动物研究来测定LD50(对50％的群体致命的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率为治疗指数，其可以表达为LD50/ED50比。优选展现出较大治疗指数的融合蛋白。在一个实施方案中，依照本发明的融合蛋白展现出高治疗指数。可以将从细胞培养测定法和动物研究获得的数据用来制定适用于人的剂量范围。优选地，剂量处于具有很小或无毒性的循环浓度(包含ED50)的范围内。剂量在此范围内可以随多种因素，例如采用的剂量形式、利用的施用路径、受试者的状况等而变化。鉴于患者的状况，各个内科医生可以选择确切的配制剂、施用路径和剂量(参见例如Fingl et al.,1975,in:The Pharmacological Basis of Therapeutics,Ch.1,p.1，通过提述完整并入本文)。
用本发明的融合蛋白治疗的患者的主治内科医生将知晓如何及何时终止、中断或调整施用(由于毒性、器官功能障碍等)。相反，如果临床应答不适当(排除毒性)，主治内科医生还将知晓如何将治疗调整至更高水平。在感兴趣的病症的管理中的施用剂量的量级将随待治疗状况的严重程度、施用路径等而变化。可以例如部分地通过标准的预后评估方法来评估状况的严重程度。另外，剂量以及可能的给药频率也将随个体患者的年龄、体重和应答而变化。
其它药剂和治疗
本发明的融合蛋白可以与一种或多种其它药剂在疗法中组合施用。例如，本发明的融合蛋白可以与至少一种另外的治疗剂共施用。术语“治疗剂”涵盖施用以治疗需要此类治疗的个体中的症状或疾病的任何药剂。这类另外的治疗剂可以包含任何适用于所治疗的特定适应征的任何活性成分，优选地具有不会彼此不利影响的互补活性的那些活性成分。在某些实施方案中，另外的治疗剂是抗炎剂。
这类其它药剂以对意图目的有效的量适宜地组合存在。这类其它药剂的有效量取决于使用的融合蛋白的量、病症或治疗的类型以及上文所述其它因素。所述融合蛋白一般以与本文中描述的相同的剂量和施用路径、或以本文中描述的剂量的约1至99％、或通过凭经验/临床上确定为合适的任何剂量和任何路径使用。
上文记载的这类组合疗法涵盖组合施用(其中在同一组合物或分别的组合物中包含两种或更多种治疗剂)和分开施用，在该情况中，本发明的融合蛋白的施用可以在施用另外的治疗剂和/或辅助剂之前、同时和/或之后发生。
制品
在本发明的另一个方面，提供含有可用于治疗、预防和/或诊断上文描述的病症的材料的制品。所述制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可从多种材料如玻璃或塑料形成。所述容器容纳组合物，其自身或与其它组合物组合对于治疗、预防和/或诊断状况是有效的，并且可以具有无菌的存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。组合物中至少一种活性成分是本发明的融合蛋白。标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的状况。此外，所述制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的融合蛋白；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的治疗剂。本发明的这一实施方案中的制品还可以包含包装插页，其指示该组合物可用于治疗特定状况。或者/另外，所述制品还可以包含第二(或第三)容器，其包含药学可接受缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格(Ringer)氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针、和注射器。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应理解鉴于上文提供的一般性描述，可以实践各种其他实施方案。
重组DNA技术
使用标准方法操作DNA，如Sambrook et al.,Molecular cloning:Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中描述的。依照制造商的用法说明书使用分子生物学试剂。通过双链测序来测定DNA序列。关于人免疫球蛋白的轻链和重链核苷酸序列的一般信息参见：Kabat,E.A.et al.,(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Ed.,NIH Publication No 91-3242。
基因合成
期望的基因片段通过使用合适的模板进行PCR来生成或在Geneart AG(Regensburg，Germany)通过自动化基因合成从合成的寡核苷酸和PCR产物合成。将侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆到标准的克隆/测序载体中。从经转化的细菌纯化质粒DNA，并通过UV分光术测定浓度。通过DNA测序确认亚克隆的基因片段的DNA序列。基因片段设计为具有合适的限制性位点以允许亚克隆到相应的表达载体中。所有构建体均设计为具有编码前导肽的5’端DNA序列，该前导肽(MGWSCIILFLVATATGVHS)在真核细胞中将蛋白质靶向分泌。
抗体-IL-10融合构建物的克隆
以符合读码框的方式将重和轻链V域的扩增DNA片段插入包含人IgG1或Fab恒定重链或人恒定轻链的相应受体哺乳动物表达载体任一。始终在分开的质粒上编码重链和轻链。尽管编码轻链的质粒对于基于IgG的和基于Fab的IL-10融合构建物是相同的，但是对于基于Fab的构建物，编码重链的质粒根据型式含有一个或两个VH-CH1域连同相应IL-10部分。在Fab重链质粒包含两个VH-CH1域(由单链IL-10二聚体或工程化单体IL-10(Josephson et al.,JBiol Chem 275,13552-7(2000))中断的串联Fab)的情况中，两个V域必须以两步克隆规程使用对它们每一个而言不同的限制性位点组合进行插入。始终以符合这些抗体的重链的读码框的方式克隆这些构建物的IL-10部分，分别在Fab或IgG重链的C端和细胞因子的N端之间使用(G4S)315聚物接头。只有IgG-IL-10型式(图1A)在IgG重链的C端和细胞因子的N端之间包含(G4S)420聚物接头。IgG重链的C末端赖氨酸残基在添加连接头时去除。对于单链IL-10，在两条IL-10链之间插入(G4S)420聚物接头。在两条不同IgG重链中只有一条融合至IL-10的情况中，需要构建和转染两种重链质粒以通过IgGCH3域中的节入穴修饰推动异二聚化。连接至IL-10部分的“穴”重链在CH3域中携带Y349C、T366S、L368A和Y407V突变，而不融合的“节”重链在CH3域中携带S354C和T366W突变(EU编号方式)。为了消除FcγR结合/效应器功能及防止FcR共活化，将下述突变引入每一条IgG重链的CH2域：L234A，L235A和P329G(EU编号方式)。通过MPSV启动子驱动抗体-IL-10融合构建物的表达，并通过位于CDS下游的合成polyA信号序列终止转录。在表达盒以外，每一种载体包含EBV oriP序列以在表达EBV-EBNA的细胞系中进行自主复制。
抗体-IL-10融合蛋白的制备
针对FAP的抗原结合模块的生成、亲和力成熟和表征的详情可见PCT公开文本No.WO 2012/020006的实施例，特别是实施例2-6(制备)和7-13(表征)，通过述及将其完整收入本文。如本文中描述的，通过噬菌体展示生成了多种针对FAP的抗原结合域，包括下述实施例中使用的称作4G8和4B9的。
使用磷酸钙转染用哺乳动物表达载体共转染指数式生长中的HEK293-EBNA细胞来生成实施例中使用的抗体-IL-10融合构建物。或者，通过聚乙烯亚胺(PEI)用表达载体转染悬浮生长中的HEK293EBNA细胞。可以使用蛋白A基质通过亲和层析来纯化所有基于克隆4G8和4B9的FAP靶向性抗体-IL-10融合构建物。
简言之，通过由一个亲和层析步骤(蛋白A)继以大小排阻层析(Superdex200，GE Healthcare)构成的方法纯化与IL-10(单链(sc)IL-10或IL-10M1)融合的FAP靶向性构建物。在20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH 7.5中平衡蛋白A柱，加载上清液，并用20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠(任选有或无500mM氯化钠)pH 7.5清洗柱，接着用13.3mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、500mM氯化钠pH 5.45清洗(在上清液中存在FBS的情况中)。任选用10mM MES、50mM氯化钠pH 5实施第三清洗。用20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸pH 3洗脱融合构建物。合并洗脱的级分，并在最终配制缓冲液(其为25mM磷酸钾、125mM氯化钠、100mM甘氨酸pH6.7或20mM组氨酸、140mM NaCl pH 6.0)中通过大小排阻层析精炼。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来测定经过纯化的抗体-IL-10融合构建物的蛋白质浓度。通过在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)存在和缺失下的SDS-PAGE并用考马斯蓝(SimpleBlueTM SafeStain，Invitrogen)染色，分析融合构建物的纯度、完整性和单体状态。依照制造商的用法说明书(4-20％Tris-甘氨酸凝胶或3-12％Bis-Tris)使用预制凝胶系统(Invitrogen)。或者，依照制造商的说明书使用LabChip GX(Caliper)分析还原的和非还原的抗体-IL-10融合构建物。于25℃使用Superdex 20010/300GL分析性大小排阻柱(GE Healthcare)(用2mM MOPS、150mM NaCl、0.02％NaN3pH 7.3运行缓冲液)或者TSKgelG3000SW XL柱(在25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM精氨酸、0.02％(w/v)NaN3pH 6.7运行缓冲液中)分析免疫缀合物样品的聚集体含量。
不同构建物的纯化和随后分析的结果显示于图2-8。IgG-IL-10构建物展现数项生产优势胜过其它IL-10融合型式。第一，在与Fab-IL-10型式的比较中，将IL-10同二聚体锚定在相同抗体分子内。因而，在生产时，不会发生对Fab-IL-10型式看到的单体IL-10分子，其中在Fab-IL-10型式的亲和层析后，观察到单体和二聚体蛋白质种类，其中只有二聚体是想要的活性产物(比较图2B和图6B)。第二，与包含节入穴修饰的基于异二聚体IgG的型式(例如IgG-scIL-10和IgG-IL-10M1)形成对比，IgG-IL-10构建物包含两条相同的重链。这避免不想要的副产品，像穴-穴或节-节同二聚体。
通过SPR测定亲和力
于25℃用PBST运行缓冲液(10mM磷酸盐、150mM氯化钠pH 7.4、0.005％Tween 20)使用ProteOn XPR36(BioRad)仪器通过表面等离振子共振(SPR)测量抗体-IL-10融合构建物对来自三种不同物种(人、鼠和食蟹猴)的FAP及对人IL-10R1的动力学速率常数(kon和koff)以及亲和力(KD)。为了测定对FAP的亲和力，通过共价固定化的抗H6抗体经由它的H6标签捕捉靶蛋白质(图9A)。简言之，以高水平(直到约5.000RU)以30μl/min将抗五His IgG(Qiagen#34660，小鼠单克隆抗体)固定化到GLM芯片的分开的垂直通道上，所述固定化通过将所有通道用新鲜制备的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(sNHS)混合物同时活化5min，随后注射10mM乙酸钠缓冲液pH 4.5中的15μg/ml抗五His IgG达180sec。通过注射乙醇胺5分钟来封闭通道。以30μl/min沿着垂直通道自运行缓冲液中的5μg/ml稀释液捕捉带H6标签、来自不同物种(见SEQ ID NO 81、83和85)的FAP达60s以实现约250和600RU之间的配体密度。在单击动力学测定法设置(OSK)中，以100μl/min以范围为50至0.08nM的5倍连续稀释液沿着水平通道注射抗体-IL-10融合构建物作为分析物。结合阶段记录180s，解离阶段记录600s。在展示很慢解离速率的相互作用的情况中，解离速率记录延长至1800s以观察复合物的解离。然而，在一些情况中，仍然不可能拟合这些解离速率，因此使用估值1x 10-51/s来计算KD。沿着第六通道注射运行缓冲液(PBST)以提供“线上”空白作为参照。通过同时拟合结合和解离传感图使用简单1:1朗格缪尔(Langmuir)结合模型(ProteOn Managersoftware version 2.1)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。以比率koff/kon计算平衡解离常数(KD)。以水平取向以100μl/min通过两次10mM甘氨酸pH 1.5和50mM NaOH脉冲30s实施再生，自捕捉的FAP和结合的抗体-IL-10融合构建物解离抗五His IgG。
为了测量抗体-IL-10融合构建物和人IL-10R1之间的相互作用，使用NLC芯片来固定化生物素化受体(图9B)。对于不同接触时间，以浓度10μg/ml和流速30μl/sec沿着垂直通道在中性亲合素衍生化的芯片基质上捕捉400至1600RU的人IL-10R1(见SEQ ID NO：87)。通过以100μl/min以水平取向注射以六个不同分析物浓度(50、10、2、0.4、0.08、0nM)测量对生物素化人IL10R1的结合，结合速率记录180s，解离速率记录600s。沿着第六通道注射运行缓冲液(PBST)以提供“线上”空白作为参照。通过同时拟合结合和解离传感图使用简单1:1朗格缪尔(Langmuir)结合模型(ProteOnManager software version 2.1)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。以比率koff/kon计算平衡解离常数(KD)。因为无法在没有活性损失的情况下再生人IL-10R1，所以对于每一种相互作用使用新鲜固定化的传感器芯片表面挨个通道实施两个后续步骤(配体捕捉和分析物注射)。
表1和2显示分别基于抗FAP克隆4G8或4B9的抗体-IL-10融合构建物结合来自不同物种的FAP和人IL-10R1的动力学速率和平衡常数的汇总。
表1：基于抗FAP克隆4G8的抗体融合物的动力学速率和平衡常数的汇总。对来自不同物种的FAP及对人IL-10R1的结合。
表2：基于抗FAP克隆4B9的抗体融合物的动力学速率和平衡常数的汇总。对来自不同物种的FAP及对人IL-10R1的结合。
我们手头未与抗体融合但C端带H6标签的野生型(wt)IL-10细胞因子显示52pM对人IL-10R1的KD(kon 2.5x 1061/Ms，koff 1.3x10-41/s)。对于基于二聚体细胞因子的抗体-IL-10融合构建物，对IL-10R1的亲合力与未融合的细胞因子相当，也是两位数的pM(范围为18至73pM)。这显示了这种细胞因子耐受在N端与抗体或其片段融合，对人IL-10R1的亲合力没有显著损失。相反，基于单体细胞因子的抗体-IL-10融合构建物没有显示二聚体IL-10融合物的亲合效应，因此它们对受体的亲和力在三位数的pM或一位数的nM范围中(分别为815pM和1.1nM)。对FAP的结合依赖于相应抗体，其中克隆4B9显示更高的对人和食蟹猴FAP的亲和力/亲合力，而克隆4G8展现更高的对鼠FAP的亲和力/亲合力。事实上，4G8抗体对鼠FAP的亲和力是如此之强，以至于有可能在所应用的条件下测定复合物的解离速率。
IL-10和IL-10R1之间的相互作用为范围约35-200pM的高亲和力(亲合力)(Moore,K.W.et al.,Annu.Rev.Immunol.19,683-765(2001))。对于包含二聚体IL-10部分或两个独立单体的构建物，与抗体融合看来对亲和力没有显著改变(约19-73pM)。然而，对于单体IL-10融合构建物，这种结合强度显著降低，最有可能是因为没有在二聚体细胞因子或与相同IgG融合的两个单体的情况中发生的亲合效应。理想的是，抗体-IL-10融合构建物对靶FAP的亲和力应当高于对高亲和力细胞因子受体IL-10R1的亲和力，从而实现对表达FAP的组织的有效靶向。尽管IL-10和IL-10R1之间存在高亲和力，基于IgG-IL-10型式的分子展现的对靶FAP的亲和力仍然更高：分别是克隆4B9IgG-IL-10(对IL-10R1的48pM比对人FAP的11pM)和克隆4G8(对IL-10R1的25pM比对鼠FAP的6pM)。这些对IL-10R1以及对FAP的亲和力看来对于实现有效靶向过表达FAP的组织是合适的，而且IL-10R1看来不代表这些分子的接收器(sink)。
阻抑LPS诱导的原代单核细胞促炎性细胞因子生成
对于基于IgG或Fab的FAP靶向性IL-10构建物之间的功能表征和区分，在不同体外测定法中评估这些分子的效力。例如，测量阻抑LPS诱导的原代单核细胞促炎性细胞因子生成的功效。对于这项实验，通过Ficoll Hypaque密度梯度，继以单核细胞负分离(Miltenyi Biotec GmbH，Bergisch Gladbach，Germany，#130-091-153)分开200ml肝素化外周血(得自健康志愿者，MedicalServices department，Roche Diagnostics GmbH，Penzberg，Germany)。在培养基(补偿有10％人血清、2mM L-谷氨酰胺[Gibco，#25030]、和Pen/Strep的RPMI 1640[Gibco/Invitrogen，Darmstadt，Germany，cat.no.#10509-24])中以5x 104个细胞/孔在96孔F细胞培养板(Costar/Corning Life Sciences，Amsterdam，The Netherlands；#3596)中接种经过纯化的单核细胞。
在(a)溶液和(b)实验设置中测试所有抗体-IL-10融合蛋白，其中于4℃过夜将重组人FAP(cfin＝1μg/ml)包被到板上(或者于室温60-90min)，并通过结合包被的FAP来固定化抗体-IL-10融合蛋白。
对于设置(a)，在接种后在滴定量(正常情况为0-500nM)的所示抗体-融合构建物或作为阳性对照的重组野生型人IL-10存在或缺失下直接用100ng/ml LPS(Sigma-Aldrich/Nunc，Taufkirchen，Germany，#L3129)刺激细胞。对于设置(b)，在包被后去除未结合的FAP，并于室温将板用培养基(见上文)封闭1小时，之后与IL-10构建物一起再温育1小时。此后，用培养基清洗板，之后与适宜的刺激物(100ng/ml LPS)一起将单核细胞添加入培养物。
对于所有实验，将细胞于37℃和5％CO2温育24小时。收集上清液(任选保存于-20/-80℃)，并使用针对IL-1β、IL-6、G-CSF、和/或TNFα的CBA Flex套组(BD Biosciences，Heidelberg，Germany，#558279、#558276、#558326和#558299)测试细胞因子生成。用FACS阵列(购自BD)测量板，并使用FCAP软件(购自BD)进行分析。
如图10所示，4G8Fab-IL-10和IgG-IL-10在阻抑促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、和TNFα方面的体外效力在设置(a)中是相当的(图10D、E、F)。相反，在设置(b)中，基于IgG的型式展现与Fab-IL-10相比卓越的效力(图10A、B、C)。相应EC50值[nM]显示于表3。IgG-IL-10构建物在设置(b)中的EC50值与重组wt人IL-10(只能在设置(a)中测试)的EC50值相似。
表3：4G8-IgG-IL-10和4G8-Fab-IL-10阻抑单核细胞细胞因子生成的EC50值(供体1)。
这个结果在使用两名不同血液供体进行的一项独立实验中再现(图11，A和B，表4和5)。在这项实验中，基于IgG的靶向性IL-10构建物在阻抑测试的所有三种细胞因子方面再次显著优于基于Fab的分子，如通过在设置(b)中获得的EC50值指示的。在设置(a)中，所有分子是相当的。
表4：4G8-IgG-IL-10和4G8-Fab-IL-10阻抑单核细胞细胞因子生成的EC50值(供体2)。
表5：4G8-IgG-IL-10和4G8-Fab-IL-10阻抑单核细胞细胞因子生成的EC50值(供体3)。
在又一项实验中，再次评估基于Fab和IgG的IL-10构建物在阻抑单核细胞IL-6生成方面的效力，并与wt IL-10以及不结合FAP的非靶向性Fab-IL-10和IgG-IL-10构建物比较(图12和表6)。再次，发现4G8-IgG-IL-10在实验性设置(b)中在阻抑IL-6生成方面与4G8-Fab-IL-10相比更加有效，而非靶向性构建物只在最高浓度引起阻抑。相反，在设置(a)中，所有构建物的效力是相当的。
表6：4G8-IgG-IL-10和4G8-Fab-IL-10阻抑单核细胞IL-6生成的EC50值(供体4)。
因为在先前测定法中用于包被的重组人FAP浓度可能反映人工或非生理条件，所以滴定FAP包被量(cfin介于0.25和5μg/ml之间)，并在实验性设置(b)中评估它对EC50值的影响。
如图13所示，总之，基于IgG和Fab的构建物的EC50值比率没有显著差异。在所有浓度，IgG-IL-10构建物在抑制IL-6诱导方面更加有力(图13和表7和8)。然而，FAP包被浓度确实影响实验结果，随着浓度降低，EC50值一般升高，这可能反映滴定板上固定化的构建物量(表8；对于基于Fab的构建物，在最低的FAP浓度观察到细胞因子降低，但是无法计算EC50)。有趣的是，在高FAP浓度(5μg/ml)，检测到IL-6分泌总量的升高(图14)。
表7：4G8-IgG-IL-10和人野生型IL-10(在溶液中)阻抑单核细胞IL-6生成的EC50值(供体5)。
样品 hIL-6EC50[nM]
4G8-IgG-IL-10 0.066
hu wt IL-10 0.010
表8：在不同浓度的包被FAP上固定化的4G8-IgG-IL-10和4G8-Fab-IL-10阻抑单核细胞IL-6生成的EC50值(供体5)。
在又一项实验中，测试了包含不同FAP靶向域即亲和力成熟的抗FAP抗体变体4B9的IL-10融合构建物。再次，在实验性设置(a)和(b)中评估该构建物在阻抑LPS诱导的单核细胞IL-6生成方面的体外效力。
图15显示，对于基于4B9的构建物，IgG-IL-10分子在实验性设置(a)中在阻抑IL-6生成方面优于Fab-IL-10构建物(且在设置(b)中相当)。相应EC50值显示于表9。一般而言，4B9和4G8构建物展现相似效力。
表9：基于4G8和4B9的IgG-IL-10和Fab-IL-10阻抑单核细胞IL-6生成的EC50值(供体7)。
在又一系列实验中，比较了基于4G8的IgG-IL-10、Fab-IL-10、Fab-IL-10M1-Fab和IgG-IL-10M1构建物。在实验性设置(a)和(b)中评估了对LPS诱导的单核细胞促炎性细胞因子IL-6、IL-1β和TNFα生成的阻抑。这些实验的结果显示于表10-12(三名不同供体)。正如在先前的实验中，IgG-IL-10是最有力的构建物，特别是在实验性设置(b)中。
表10：4G8IgG-IL-10、4G8Fab-IL-10、4G8Fab-IL-10M1-Fab和4G8IgG-IL-10M1融合蛋白阻抑单核细胞细胞因子生成的EC50值(供体1)。
表11：4G8IgG-IL-10、4G8Fab-IL-10、4G8Fab-IL-10M1-Fab和4G8IgG-IL-10M1融合蛋白阻抑单核细胞细胞因子生成的EC50值(供体2)。
表12：4G8IgG-IL-10、4G8Fab-IL-10、4G8Fab-IL-10M1-Fab和4G8IgG-IL-10M1融合蛋白阻抑单核细胞细胞因子生成的EC50值(供体3)。
在还有又一系列实验中，比较了基于4G8的Fab-IL-10、Fab-scIL-10-Fab和Fab-IL-10M1-Fab构建物。在实验性设置(a)和(b)中评估了对LPS诱导的单核细胞IL-6、IL-1β、TNFα和G-CSF生成的阻抑。这些实验的结果显示于表13-17(六名不同供体)。结果显示包含二聚体IL-10分子的构建物比具有scIL-10或单体IL-10M1分子的构建物更加有力。
表13：4G8Fab-IL-10、4G8Fab-scIL-10-Fab和4G8Fab-IL-10M1-Fab融合蛋白阻抑单核细胞细胞因子生成的EC50值。
表14：4G8Fab-IL-10、4G8Fab-scIL-10-Fab和4G8Fab-IL-10M1-Fab融合蛋白阻抑单核细胞IL-6生成的EC50值。
表15：4G8Fab-IL-10、4G8Fab-scIL-10-Fab和4G8Fab-IL-10M1-Fab融合蛋白阻抑单核细胞IL-1β生成的EC50值。
表16：4G8Fab-IL-10、4G8Fab-scIL-10-Fab和4G8Fab-IL-10M1-Fab融合蛋白阻抑单核细胞G-CSF生成的EC50值。
表17：4G8Fab-IL-10、4G8Fab-scIL-10-Fab和4G8Fab-IL-10M1-Fab融合蛋白阻抑单核细胞TNFα生成的EC50值。
最后，比较了基于4B9和4G8的Fab-IL-10和IgG-(IL-10M1)2构建物。在实验性设置(a)和(b)中评估了对LPS诱导的单核细胞IL-6生成的阻抑。这项实验的结果显示于表19。结果显示包括IgG-(IL-10M1)2在内的所有构建物在设置(b)中比在设置(a)中性能更好。
表18：4B9IgG-IL-10、4G8IgG-IL-10和4G8IgG-(IL-10M1)2融合蛋白对于阻抑单核细胞IL-6生成的EC50值。
阻抑IFNγ诱导的原代单核细胞上MHC-II分子上调
对于基于IgG和Fab的FAP靶向性IL-10构建物之间的功能表征和区分，评估了它们阻抑IFNγ诱导的单核细胞中MHC-II表达的能力。与细胞因子阻抑测定法类似，在溶液中(实验性设置(a)；见上文)或通过结合至细胞培养板上包被的FAP而固定化(实验性设置(b)；见上文)，用构建物实施这项实验。原则上，如上所述分离并培养单核细胞，但是用250U/ml IFNγ(BD，#554616)刺激24小时。在刺激之前，任选用重组野生型(wt)IL-10或不同抗体-IL-10融合构建物处理细胞。温育之后，通过Accutase处理(PAA，#L11-007)来解离细胞，并用含有3％人血清(Sigma，#4522)的PBS中的抗HLA-DR抗体(BD，#559866)染色以避免任何非特异性FcγR结合，之后进行最终的FACS分析。
这项实验的结果显示于表19，证明基于4B9的构建物IgG-IL-10分子在下调IFNγ诱导的原代单核细胞上MHC-II表达方面在实验性设置(b)中优于Fab-IL-10构建物(在设置(a)中相当)。
表19：4B9IgG-IL-10和4B9Fab-IL-10对于下调原代单核细胞上IFNγ诱导的MHC-II表达的EC50值。
样品 EC50[nM]设置(a)(溶液) EC50[nM]设置(b)(固定化)
Fab-IL-10 0.072 不可计算
IgG-IL-10 0.064 0.018
hu wt IL-10 0.004 未测试
分离的原代单核细胞中IL-10诱导的STAT3磷酸化
因为IL-10R信号传导引起STAT3磷酸化，使用新鲜分离的血液单核细胞在pSTAT3测定法中评估数种靶向性IL-10构建物和型式的功能(Finbloom&Winestock,J.Immunol.1995；Moore et al.,Annu.Rev.Immunol.2001；Mosser&Zhang,Immunological Reviews 2008)。简言之，如上所述自健康供体的Ficoll分离PBMC不触及地分离CD14+单核细胞。典型地，在300μl培养基(RPMI1640/10％FCS/L-谷氨酰胺/pen/strep)中将3-10x 105个细胞转移入FACS管，并通常于37℃，5％CO2与0-200/500nM wt人IL-10或所示抗体-IL-10融合蛋白一起温育30分钟。然后，每管添加300μl预温热的固定缓冲液I(BD Biosciences，#557870)，漩涡振荡，并于37℃温育10分钟，之后将细胞用2ml PBS/2％FCS清洗一次并以250x g离心10分钟。随后，每管添加300μl冰冷却的透化缓冲液III(BD Biosciences，#558050)进行细胞透化，并在冰上温育30分钟，之后再次如上所述清洗细胞。最后，在100μl抗体稀释液(抗Stat-3.A647；BD Biosciences，#557815)中重悬浮细胞，并于4℃温育30分钟，之后为FACS分析而清洗和加工细胞。
在这项实验中为不同构建物获得的EC50值显示于表20和21。结果显示包含二聚体IL-10分子的构建物(基于Fab或IgG)比包含scIL-10分子或单体IL-10M1分子的构建物更有活性。
表20：在分离的原代单核细胞中基于4G8的抗体-IL-10融合蛋白对于IL-10诱导的STAT3磷酸化的EC50值。
表21：在分离的原代单核细胞中基于4B9的抗体-IL-10融合蛋白对于IL-10诱导的STAT3磷酸化的EC50值。
样品 EC50[nM]pSTAT3诱导
人wt IL-10 0.017
IgG-IL-10 0.130
IgG-(IL-10M1)2 0.435
FAP靶向性和非靶向性抗体-IL-10融合蛋白的生物分布
在具有胶原诱发的关节炎、达到预定关节炎得分>3(第一次免疫接种后28天)的DBA/1J小鼠中以50μg每只小鼠测定了FAP靶向性、In-111标记的4B9IgG-IL-10、4G8IgG-IL-10和非靶向性DP47GS IgG-IL 10的组织生物分布。在每组5只小鼠中在i.v.注射放射性标记的缀合物后72小时实施生物分布。
这项实验的结果显示于表22。非靶向性抗体-IL-10融合蛋白DP47GSIgG-IL-10在发炎关节中的摄取显著(p<0.0001)低于靶向性IgG-IL-10融合蛋白的摄取，指示4B9IgG-IL-10和4G8IgG-IL-10的摄取是由FAP介导的。脾摄取最有可能是由IL-10介导的，因为所有三种构建物显示相似水平的脾积累。
表22：抗体构建物的摄取(％注射剂量/克组织)。
组织 4B9IgG-IL-10 4G8IgG-IL-10 DP47GS IgG-IL-10
发炎关节 20.7±1.1 19.6±1.0 8.6±1.0
脾 6.3±0.4 7.3±0.3 6.7±0.5
血液 4.2±0.5 1.1±0.1 7.3±1.0
为了研究IL-10对IgG-IL-10生物分布的影响，在第二项实验中，比较In-111标记的4G8IgG-IL-10的生物分布与In-111标记的4G8IgG的生物分布。
这项实验的结果显示于表23。在4G8IgG和4G8IgG-IL-10之间，发炎关节中的积累没有显著差异，指示IL-10对4G8IgG靶向发炎部位没有显著影响。4G8IgGI-IL-10的脾摄取显著高于4G8IgG的脾摄取(p<0.0001)，指示脾中的摄取是部分由IL-10介导的。
表22：抗体构建物的摄取(％注射剂量/克组织)。
组织 4G8IgG 4G8IgG-IL-10
发炎关节 18.1±1.0 19.6±1.0
脾 2.9±0.2 7.3±0.3
血液 3.9±0.8 1.1±0.1
***
尽管为了理解清楚已通过例示和实施例相当详细地描述了前述发明，但该描述和实施例不应解释为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容均通过提述完整明确收录。

Claims (52)

1.IgG类抗体和IL-10分子的融合蛋白，其中该融合蛋白包含两条相同的重链多肽和两条相同的轻链多肽。
2.权利要求1的融合蛋白，其中每一条所述重链多肽包含IgG类抗体重链和IL-10单体。
3.权利要求2的融合蛋白，其中所述IL-10单体在它的N末端融合至所述IgG类抗体重链的C末端，任选经由肽接头。
4.权利要求1至3任一项的融合蛋白，其中所述重链抗体每一条基本上由IgG类抗体重链、IL-10单体和任选的肽接头组成。
5.权利要求2至4任一项的融合蛋白，其中所述IL-10单体为天然IL-10单体，特别是天然人IL-10单体。
6.权利要求2至5任一项的融合蛋白，其中所述IL-10单体包含SEQ ID NO：1的多肽序列。
7.权利要求2至5任一项的融合蛋白，其中所述重链多肽中包含的所述IL-10单体形成功能性同二聚体IL-10分子。
8.权利要求2至4任一项的融合蛋白，其中所述IL-10单体为经修饰IL-10单体，特别是经修饰人IL-10单体。
9.权利要求8的融合蛋白，其中所述经修饰IL-10单体以单体形式在pH 7.0、37℃是稳定的。
10.权利要求2至4、8或9任一项的融合蛋白，其中所述IL-10单体包含SEQ IDNO：5的多肽序列。
11.权利要求2至4或8至10任一项的融合蛋白，其中所述重链多肽中包含的所述IL-10单体不彼此同二聚化。
12.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述IgG类抗体包含如下修饰，与没有所述修饰的相应IgG类抗体相比，所述修饰降低抗体对Fc受体的结合亲和力。
13.权利要求12的融合蛋白，其中所述Fc受体为Fcγ受体，特别是人Fcγ受体。
14.权利要求12或13的融合蛋白，其中所述Fc受体为激活性Fc受体。
15.权利要求12至14任一项的融合蛋白，其中所述Fc受体选自下组：FcγRIIIa(CD16a)，FcγRI(CD64)，FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
16.权利要求12至15任一项的融合蛋白，其中所述Fc受体为FcγIIIa，特别是人FcγIIIa。
17.权利要求12至16任一项的融合蛋白，其中所述IgG类抗体在抗体重链第329位(EU编号方式)处包含氨基酸替代
18.权利要求17的融合蛋白，其中所述氨基酸替代为P329G。
19.权利要求12至18任一项的融合蛋白，其中所述IgG类抗体在抗体重链第234位和第235位(EU编号方式)处包含氨基酸替代。
20.权利要求19的融合蛋白，其中所述氨基酸替代为L234A和L235A(LALA)。
21.权利要求12至20任一项的融合蛋白，其中所述IgG类抗体在抗体重链中包含氨基酸替代L234A、L235A和P329G(EU编号方式)。
22.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述IgG类抗体为IgG1亚类抗体。
23.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述IgG类抗体为全长抗体。
24.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述IgG类抗体为人抗体。
25.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述IgG类抗体能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)。
26.权利要求25的融合蛋白，其中当于25℃通过表面等离振子共振(SPR)测量时，该融合蛋白能够以小于1nM、特别是小于100pM的亲和常数(KD)结合FAP。
27.权利要求25或26的融合蛋白，其中所述FAP为人、小鼠和/或食蟹猴FAP。
28.权利要求25至27任一项的融合蛋白，其中所述IgG类抗体包含SEQ IDNO：37的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO：41的HCDR 2、SEQ ID NO：49的HCDR 3、SEQ ID NO：53的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO：57的LCDR 2和SEQ ID NO：61的LCDR 3。
29.权利要求28的融合蛋白，其中所述IgG类抗体包含SEQ ID NO：63的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：65的轻链可变区(VL)。
30.权利要求25至27任一项的融合蛋白，其中所述IgG类抗体包含SEQ IDNO：37的HCDR 1、SEQ ID NO：43的HCDR 2、SEQ ID NO：47的HCDR3、SEQ ID NO：51的LCDR 1、SEQ ID NO：55的LCDR 2和SEQ ID NO：59的LCDR 3。
31.权利要求30的融合蛋白，其中所述IgG类抗体包含SEQ ID NO：67的VH和SEQ ID NO：69的VL。
32.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中当于25℃通过SPR测量时，该融合蛋白能够以小于1nM、特别是小于100pM的亲和常数(KD)结合IL-10受体-1(IL-10R1)。
33.权利要求32的融合蛋白，其中所述IL-10R1为人IL-10R1。
34.权利要求32的融合蛋白，当引用权利要求26时，其中当于25℃通过SPR测量时，所述结合IL-10R1的亲和常数(KD)大致等于或大于所述结合FAP的亲和常数(KD)。
35.一种多核苷酸，其编码前述权利要求任一项的融合蛋白。
36.一种包含权利要求35的多核苷酸的载体，特别是表达载体。
37.一种宿主细胞，其包含权利要求31的多核苷酸或权利要求36的载体。
38.一种生成权利要求1至34中任一项的融合蛋白的方法，其包括以下步骤：
(i)在适合于表达所述融合蛋白的条件下培养权利要求37的宿主细胞，并
(ii)回收所述融合蛋白。
39.IgG类抗体和IL-10的融合蛋白，其是通过权利要求38的方法生成的。
40.一种药物组合物，其包含权利要求1至34或39中任一项的融合蛋白和药学可接受载剂。
41.权利要求1至34或39中任一项的融合蛋白或权利要求40的药物组合物，其用作药物。
42.权利要求1至34或39中任一项的融合蛋白或权利要求40的药物组合物，其用于治疗或预防炎性疾病。
43.权利要求42的融合蛋白或药物组合物，其中所述炎性疾病为炎性肠病或类风湿性关节炎。
44.权利要求1-34或39中任一项的融合蛋白在制备用于治疗有此需要的个体中疾病的药物的用途。
45.权利要求44的用途，其中所述疾病为炎性疾病。
46.权利要求45的用途，其中所述炎性疾病为炎性肠病或类风湿性关节炎。
47.权利要求44-46任一项的用途，其中所述个体为哺乳动物，特别是人。
48.一种治疗个体中疾病的方法，其包括对所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药学可接受形式的权利要求1至34或39中任一项的融合蛋白。
49.权利要求48的方法，其中所述疾病为炎性疾病。
50.权利要求49的方法，其中所述炎性疾病为炎性肠病或类风湿性关节炎。
51.权利要求48-50任一项的方法，其中所述个体为哺乳动物，特别是人。
52.如说明书所述的发明。
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