KR20220099656A - 신규 il-10 변이체 융합단백질 생산용 세포주 및 그의 용도 - Google Patents

신규 il-10 변이체 융합단백질 생산용 세포주 및 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20220099656A
KR20220099656A KR1020210001819A KR20210001819A KR20220099656A KR 20220099656 A KR20220099656 A KR 20220099656A KR 1020210001819 A KR1020210001819 A KR 1020210001819A KR 20210001819 A KR20210001819 A KR 20210001819A KR 20220099656 A KR20220099656 A KR 20220099656A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cell
protein
ser
fusion protein
glu
Prior art date
Application number
KR1020210001819A
Other languages
English (en)
Inventor
진현탁
Original Assignee
주식회사 프로젠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 프로젠 filed Critical 주식회사 프로젠
Priority to KR1020210001819A priority Critical patent/KR20220099656A/ko
Priority to PCT/KR2022/000243 priority patent/WO2022149881A1/ko
Publication of KR20220099656A publication Critical patent/KR20220099656A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5428—IL-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Abstract

본 발명은 신규 세포주에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 단량체성 인간 Interleukin-10(이하, IL-10) 변이체 단백질이 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 변형 Fc 영역 펩타이드와 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 숙주세포에 안정적 형질감염시켜 제조되는 상기 융합단백질을 발현하는 신규 세포주 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

신규 IL-10 변이체 융합단백질 생산용 세포주 및 그의 용도{A novel cell line for producing IL-10 variant fusion protein and use thereof}
본 발명은 신규 IL-10 변이체 단백질 생산용 세포주 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 생산성과 면역억제능력이 향상된 IL-10 변이체 단백질의 생산용 신규 세포주 및 그의 용도에 관한 것이다.
인터류킨 10(이하, "IL-10"이라 지칭함)은 사이토카인 합성 저해 인자(cytokine synthesis inhibitory factor, CSIF)라고 불리우는 약 37 kDa의 비공유 결합된 동종이량체로 발현되는 항-염증성 사이토카인이다. IL-10은 면역관용의 유도와 유지에 중요한 역할을 하며, 이러한 우세한 항-염증 특성은 오랜 기간 동안 알려져 왔다. IL-10은 TNFα, IL-1, IL-6, 및 IL-12 뿐만 아니라 IL-2 및 INFγ와 같은 Th1 사이토카인과 같은 염증-촉진성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 분비를 억제하고 대식세포, B 세포 및 T 세포의 분화 및 증식을 조절한다(Glocker et al., Ann. NY Acad. Sci. 1246: 102-107, 2011; Moore et al., Annu. Rev. Immunol.19, 683-765 (2001); Waal Malefyt et al., J. Exp. Med. 174: 915-924, 1991; Williams et al., Immunol. 113: 281-292, 2004). 또한, 이는 항원 제시의 강력한 억제제로서, MHC II 발현뿐만 아니라 공동자극 인자 CD80 및 CD86의 상향조절을 억제한다(Mosser & Yhang, Immunol. Rev. 226: 205-218, 2008). 이러한 특성 때문에 IL-10은 염증성 장질환이나 건선과 같은 면역 질환 등의 치료제로 사용하려는 연구가 진행되어 왔다.
그러나, IL-10은 면역자극 활성이라는 정 반대의 작용도 갖는 이중특성을 갖는 것으로 알려지고 있다. 이와 관련하여 구체적으로 IL-10은 B 세포 활성화를 자극하고, B 세포의 생존을 연장하며, B 세포의 클래스 전환(class switching)에 기여할 수 있다. 또한 NK 세포 증식과 사이토카인 생성을 자극할 수 있으며 CD8+ T 세포의 특정 부분 집단의 증식을 촉진하는 성장인자 역할을 할 수 있다(Mosser & Yhang, Immunol. Rev. 226: 205-218, 2009; Cai et al., Eur. J. Immunol. 29: 2658-2665, 1999; Santin et al., J. Virol. 74: 4729-4737, 2000; Rowbottom et al., Immunol. 160: 3188-3193, 1998). 중요하게도, 인간에서 고용량의(각각 20 및 25 ㎍/kg) IL-10은 INFγ의 생산을 증가시킬 수 있는 것으로 보고된 바 있다(Lauw et al., J. Immunol., 165: 2783-2789, 2000; Tilg et al., Gut 50: 191-195, 2002).
이에, IL-10 단백질의 87번째 아미노산인 이소류신이 면역 활성화에 관련이 되어 있으며, 이를 알라닌으로 치환시킬 경우 면역 활성 작용이 억제될 수 있음이 보고된 바 있다(Ding et al., J. Exp. Med. 191(2): 213-223, 2000). 그러나, 상기 변이체 IL-10의 경우 야생형에 비해 IL-10R1과의 친화성이 매우 약한 것으로 확인되어, 동등한 면역 억제 활성을 위해서는 고용량의 투여가 필요한 단점이 있다.
한편, IL-10 단백질은 구조적 특성 때문에 재조합 단백질로 생산 시 다량의 불용성 응집체가 생성이 되며, 이는 생산성에 있어서 큰 문제점을 야기한다. 이에, IL-10의 2차 구조상 네 번째 및 다섯 번째 알파나선 사이에 6 a.a.의 링커 펩타이드를 도입함으로써 이량체를 형성하지 않는 단량체성 IL-10이 개발된 바 있으나(Josephson et al., J. Biol. Chem. 275(18): 13552-13557, 2000), 체내 반감기가 짧고 활성이 매우 낮기 때문에 이를 치료제로 사용하는데 걸림돌이 되고 있다. 이러한, 낮은 체내 안정성을 극복하기 위해 IgA의 Fc 도메인에 융합단백질의 형태로 발현시키는 시도가 이루어졌으나(Westerhof et al., PLOS ONE, 7(10): e46460, 2012), IL-10 활성의 회복은 제한적으로 이루어졌다.
이에, 본 발명자들은 안정성이 향상되면서도 그 생물학적 활성이 떨어지지 않는 새로운 형태의 IL-10 변이체 단백질을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 단량체성 IL-10 변이체 단백질에 변형 면역글로불린 Fc 영역을 연결하여 제조된 새로운 형태의 융합단백질의 개발에 성공하였고 이에 대한 특허출원을 완료하였다(대한민국 특허출원 제10-2020-0083781호). 그러나, 상기 특허출원은 신규 융합단백질 그 자체에 관한 것으로서 이를 실제 임상에 적용하기 위해서는 산업적 규모로 대량생산할 수 있는 세포주의 개발이 절실히 요구되고 있다.
본 발명은 상술한 문제점을 포함하여 여러 가지 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 보다 효율적으로 IL-10 변이체 융합단백질을 대량생산할 수 있는 신규 세포주 및 상기 세포주를 이용한 상기 IL-10 변이체 융합단백질의 생산방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나, 본 발명의 보호범위가 상기 목적으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 단량체성 인간 Interleukin-10(이하, IL-10) 변이체 단백질이 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 변형 Fc 영역 펩타이드와 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 숙주세포에 안정적으로 형질감염시켜 제조되는 상기 융합단백질을 발현하는 신규 세포주가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 단량체성 인간 IL-10 변이체 단백질이 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 변형 Fc 영역 펩타이드와 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 준비하는 단계; 상기 유전자 컨스트럭트로 숙주세포를 형질감염시키는 단계; 상기 유전자 컨스트럭트가 형질감염된 세포를 선별하는 단계; 및 상기 형질감염 세포 집단 중 단일 세포를 분리하여 형질감염 단일 세포주를 제조하는 단계를 포함하는 단량체성 인간 IL-10 변이체 단백질이 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 변형 Fc 영역 펩타이드와 연결된 융합단백질을 발현하는 단클론성 형질감염 세포의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 상기 중 어느 하나의 신규 세포주를 배양배지에 접종한 후 배양하는 단계; 및 상기 배양배지 또는 상기 신규 세포주의 세포체로부터 상기 융합단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 단량체성 인간 IL-10 변이체 단백질이 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 변형 Fc 영역 펩타이드와 연결된 융합단백질의 생산방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 상기 생산방법에 의해 생산된 단량체성 인간 IL-10 변이체 단백질이 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 변형 Fc 영역 펩타이드와 연결된 융합단백질이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역질환 치료용 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 신규 세포주는 단량체성 IL-10 변이체 융합단백질을 효율적으로 대량생산할 수 있어, 과도한 염증반응으로 인해 유발된 질환 또는 면역억제가 필요한 질환의 치료를 위한 치료제의 대량생산에 효율적으로 사용될 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 IL-10 융합단백질 발현용 CHO 세포주의 1차 하이폭잔틴(HT) 선별시 세포생존도(Viability) 및 증배시간(Td)을 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 IL-10 융합단백질 발현용 CHO 세포주의 2차 HT 선별시 세포생존도(Viability) 및 증배시간(Td)을 측정한 결과를 나타내는 그래프다.
도 2a는 1차 메토트렉세이트(MTX) 증폭 후 각 풀의 세포당 생산성(μg/cells) 및 배양 상등액 부피당 생산성(μg/mL)을 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 2b는 2차 메토트렉세이트(MTX) 증폭 후 각 풀의 세포당 생산성(μg/cells) 및 배양 상등액 부피당 생산성(μg/mL)을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 상기 1차 및 2차 MTX 증폭에 의해 선별된 풀의 배양규모를 125 mL로 확대한 후 각 풀의 세포당 생산성(μg/cells) 및 배양 상등액 부피당 생산성(μg/mL)을 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 3b는 상기 배양규모 확대 후 생산성 분석에서 선정된 풀을 대상으로 최종 생산성을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 1차 단일 세포 정렬 분석에서 선정된 클론의 증식성을 분석한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 4b는 2차 단일 세포 정렬 분석에서 선정된 클론의 증식성을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 상기 단일 세포 정렬 분석에서 선정된 클론을 대상으로 생산성을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 상기 선정된 클론으로부터 생산된 융합단백질을 확인하기 위해 세포 배양액으로 SDS-PAGE를 수행한 결과이다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 단량체성 인간 IL-10 변이체 단백질이 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 변형 Fc 영역 펩타이드와 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 숙주세포에 안정적 형질감염시켜 제조되는 상기 융합단백질을 발현하는 신규 세포주가 제공된다.
상기 세포주에 있어서, 상기 단량체성 IL-10 변이체(IL-10Vm) 단백질은 인간 IL-10 단백질의 성숙형 형태(mature form) 기준으로 116번째 아미노산인 아스파라긴 및 117번째 아미노산인 라이신 사이에 6 내지 12 a.a.의 길이를 갖는 스페이서 펩타이드가 삽입된 것일 수 있고, 이 경우 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 추가적으로 인간 IL-10 단백질의 성숙형 형태를 기준으로 87번째 아미노산인 이소류신이 알라닌으로 치환된 단량체성 IL-10 변이체 단백질일 수 있으며, 위 두 가지 변형이 모두 포함된 것일 수 있고, 이 경우 구체적으로는 서열번호 35의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 인간 IL-10 단백질의 성숙형 형태는 UniProtKB P22301에 기재된 아미노산 서열 기준으로 19-178번째 아미노산 서열(서열번호 42)로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 단량체성 IL-10 변이체 단백질에 있어서, 상기 스페이서 펩타이드는 7 내지 11 a.a., 8 내지 10 a.a. 또는 9 a.a.의 길이를 가질 수 있으며, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 a.a.의 길이를 가질 수 있다. 본 발명의 구체적인 태양에서, 상기 스페이서 펩타이드는 GGSGGSGGS(서열번호 4), (GGGSGG)n(단위체: 서열번호 7, n은 1 또는 2의 정수), GGGGSGGGGS(서열번호 8), (GGS)n(단위체: n은 2 내지 4의 정수), (GS)n(단위체: n은 3 내지 6의 정수), 또는 (GSSGGS)n(단위체: 서열번호 10, n은 1 내지 2의 정수)의 아미노산 서열을 갖는 스페이서 펩타이드일 수 있으며, 상기 스페이서 펩타이드를 구성하는 아미노산은 면역원성을 유발하지 않는다면 다른 종류의 아미노산으로 치환될 수 있고 바람직하게는 9 a.a의 길이를 가질 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "스페이서 펩타이드(spacer peptide)"는 특정 단백질 내부에 삽입되어 해당 단백질의 구조 및/또는 기능을 변화시키는 역할을 수행하는 펩타이드를 의미한다. 이런 의미에서 다른 융합 파트너를 연결하는 링커 펩타이드와 구분이 되나, 통상적인 링커 펩타이드가 스페이서 펩타이드로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 단량체성 IL-10 변이체 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 단량체성 IL-10 변이체 단백질은 인간 IL-10 단백질의 성숙형 형태를 기준으로 87번째 아미노산인 이소류신이 알라닌으로 치환된 단량체성 IL-10 변이체 단백질 일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 35의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 단량체성 IL-10 단백질은 단량체성 IL-10을 형성하는 구조를 나타낸다면 서열번호 1 또는 서열번호 35의 아미노산 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 것일 수 있으며 포유동물 유래 단백질은 모두 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "융합단백질"은 둘 이상의 단백질 또는 단백질 내 특정 기능을 담당하는 도메인이 각각의 단백질 또는 도메인이 본연의 기능을 담당하도록 연결된 재조합 단백질(recombinant protein)을 의미한다. 상기 둘 이상의 단백질 또는 도메인 사이에는 통상적으로 유연한 구조를 갖는 링커 펩타이드(linker peptide)가 삽입될 수 있다. 상기 링커 펩타이드는 AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 2), GGSGG(서열번호 3), GGSGGSGGS(서열번호 4), GGGSGG(서열번호 7), GGGGSGGGGS(서열번호 8), (GGGGS)n(단위체: 서열번호 9, n은 1 내지 10의 정수), (GGS)n(단위체: n은 1 내지 10의 정수), (GS)n(단위체: n은 1 내지 10의 정수), (GSSGGS)n(단위체: 서열번호 10, n은 1 내지 10의 정수), KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 11), EGKSSGSGSESKST(서열번호 12), GSAGSAAGSGEF(서열번호 13), (EAAAK)n(단위체: 서열번호 14, n은 1 내지 10의 정수), CRRRRRREAEAC(서열번호 15), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 16), GGGGGGGG(서열번호 17), GGGGGG(서열번호 18), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 19), PAPAP(서열번호 20), (Ala-Pro)n(단위체: n은 1 내지 10의 정수), VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 21), PLGLWA(서열번호 22), TRHRQPRGWE(서열번호 23), AGNRVRRSVG(서열번호 24), RRRRRRRR(서열번호 25), GFLG(서열번호 26), GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 27), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 28), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 30), GGGGSGGGGSGGGGSEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 31), RNTGRGGEEKKGSKEKEEQEERETKTPECP(서열번호 32), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 33), GSGGGSGTLVTVSSESKYGPPCPPCP(서열번호 34), EPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 36), EPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 37), THTCPPCP(서열번호 38), GGGGSGGGGSGGGGSAKNTTAPATTRNTTRGGEEKKKEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 39), AGSGGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 40), 및 GGGSGGSTHTCPPCP(서열번호 41) 등이 포함될 수 있다.
상기 신규 세포주에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 조절서열에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트 형태로 포함될 수 있으며, 상기 유전자 컨스트럭트는 재조합 벡터, 바람직하게는 발현벡터의 형태로 제공될 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked to)"이란 목적으로 하는 핵산서열(예컨대, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 숙주세포에서)이 그의 발현이 이루어질 수 있도록 하는 방식으로 상기 조절서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다.
상기 "조절서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 조절 요소(예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 의미이다. 조절서열에는 많은 숙주세포에서 목적으로 하는 핵산이 항상적으로 발현될 수 있도록 지시하는 것, 특정한 조직세포에서만 목적으로 하는 핵산이 발현될 수 있도록 지시하는 것(예, 조직특이적 조절서열), 그리고 특정 신호에 의해 발현이 유도되도록 지시하는 것(예, 유도성 조절서열)이 포함된다. 발현벡터의 설계는 형질전환될 숙주세포의 선택 및 원하는 단백질 발현의 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것은 당업자라면 이해할 수 있다. 본 발명의 발현벡터는 숙주 세포에 도입되어 상기 융합단백질을 발현할 수 있다. 상기 진핵세포 및 원핵세포에서 발현을 가능하게 하는 조절서열들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상술한 바와 같이, 이들은 보통 전사개시를 담당하는 조절서열들 및, 선택적으로 전사물의 전사종결 및 안정화를 담당하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가적인 조절서열들은 전사조절인자 외에도 번역 증진인자 및/또는 천연-조합 또는 이종성 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 포유류 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 가능한 조절서열들은 CMV-HSV 티미딘 키나아제 프로모터, SV40, RSV-프로모터(로우스 육종 바이러스), 인간 신장 요소 1α-프로모터, 글루코코르티코이드-유도성 MMTV-프로모터(몰로니 마우스 종양 바이러스), 메탈로티오네인-유도성 또는 테트라사이클린-유도성 프로모터 또는, CMV 증폭제 또는 SV40-증폭제와 같은 증폭제를 포함한다. 신경 세포 내 발현을 위해, 신경미세섬유-프로모터(neurofilament-promoter), PGDF-프로모터, NSE-프로모터, PrP-프로모터 또는 thy-1-프로모터들이 사용될 수 있다는 것이 고려되고 있다. 상기 프로모터들은 당 분야에 알려져 있으며, 문헌(Charron, J. Biol. Chem. 270: 25739-25745, 1995)에 기술되어 있다. 원핵세포내 발현을 위해, lac-프로모터, tac-프로모터 또는 trp 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터들이 개시되어 있다. 전사를 개시할 수 있는 인자들 외에, 상기 조절서열들은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 하류(downstream)에 SV40-폴리-A 부위 또는 TK-폴리-A 부위와 같은 전사 종결 신호를 포함할 수도 있다. 본 문서에서, 적당한 발현 벡터들은 당 분야에 알려져 있으며, 그 예로는 오카야마-베르그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1(Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3(Invitrogene), pSPORT1(GIBCO BRL), pGX-27(특허 제1442254호), pX(Pagano et al., Science 255: 1144-1147, 1992), 효모 2-혼성(two-hybrid) 벡터, 가령 pEG202 및 dpJG4-5(Gyuris et al., Cell 75: 791-803, 1995) 또는 원핵 발현 벡터, 가령 람다 gt11 또는 pGEX(Amersham Pharmacia)가 있다. 본 발명의 핵산 분자들 외에, 벡터는 분비 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분비신호들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그리고, 사용된 발현 시스템에 따라, 융합단백질을 세포 구획으로 이끌 수 있는 리더서열(leader sequence)이 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 코딩 서열에 조합되며, 바람직하게는 해독된 단백질 또는 이의 단백질을 세포질 주변 또는 세포외 매질로 직접 분비할 수 있는 리더 서열이다.
또한, 본 발명에서 사용되는 벡터는 예를 들면, 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 제조될 수 있으며, 표준 재조합 DNA 기술에는 예를 들면, 평활말단 및 접착말단 라이게이션, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 처리, 부적합한 결합을 방지하기 위하여 알칼리 포스테이즈 처리에 의한 인산기 제거 및 T4 DNA 라이게이즈에 의한 효소적 연결 등이 포함된다. 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 신호 펩타이드를 코딩하는 DNA, 본 발명의 단량체성 변이체 IL-10 단백질을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 DNA를 적절한 조절서열이 포함되어 있는 벡터에 재조합함으로써 본 발명의 벡터가 제조될 수 있다. 상기 조절 서열이 포함되어 있는 벡터는 상업적으로 구입 또는 제조할 수 있다.
상기 발현벡터는 분비 신호서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 분비 신호서열은 세포 내에서 발현되는 재조합 단백질의 세포 밖으로의 분비를 유도하며, tPA(tissue plasminogen activator) 신호서열(서열번호 29), HSV gDs(단순포진 바이러스 당단백질 Ds) 신호서열 또는 성장호르몬 신호서열일 수 있다.
상기 숙주세포는 바람직하게는 포유동물 세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 CHO 세포, HEK293 세포, COS7 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, W138 세포, BHK 세포, MDCK 세포, 또는 HuT 78 세포일 수 있으며, 상기 CHO 세포는 CHO DHFR- 또는 CHO DG44 세포일 수 있다.
상기 안정적 형질감염은 숙주세포로 CHO DHFR- 세포주 또는 CHO DG44 세포 사용 시 메토트렉세이트(methotrexate, MTX) 농도의 점진 증가에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 단량체성 인간 IL-10 변이체 단백질이 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 변형 Fc 영역 펩타이드와 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 준비하는 단계; 상기 유전자 컨스트럭트로 숙주세포를 형질감염시키는 단계; 상기 유전자 컨스트럭트가 형질감염된 세포를 선별하는 단계; 및 상기 형질감염 세포 집단 중 단일 세포를 분리하여 형질감염 단일 세포주를 제조하는 단계를 포함하는 단량체성 인간 IL-10 변이체 단백질이 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 변형 Fc 영역 펩타이드와 연결된 융합단백질을 발현하는 단클론성 형질감염 세포의 제조방법이 제공된다.
상기 형질감염된 세포는 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 게놈 내에서 증폭되도록 유전자 증폭 공정을 통해 유전자 증폭된 세포일 수 있고, 상기 유전자 증폭 공정은 숙주세포가 CHO DHFR- 또는 CHO DG44 세포일 경우 메토트렉세이트를 이용하여 수행될 수 있고, 상기 유전자 컨스트럭트 내에 포함된 항생제 내성 유전자가 네오마이신 저항 유전자(neo r)일 경우, 항생제 G418(Geneticin)을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 상기 중 어느 하나의 신규 세포주를 배양배지에 접종한 후 배양하는 단계; 및 상기 배양배지 또는 상기 신규 세포주의 세포체로부터 상기 융합단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 단량체성 인간 IL-10 변이체 단백질이 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 변형 Fc 영역 펩타이드와 연결된 융합단백질의 생산방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 생산방법에 의해 생산된 단량체성 인간 IL-10 변이체 단백질이 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 변형 Fc 영역 펩타이드와 연결된 융합단백질이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역질환 치료용 조성물이 제공된다.
상기 조성물에 있어서, 상기 염증성 질환은 비염, 알러지성 결막염, 유행성 결막염, 간염, 기관지염, 후두염, 편도선염, 갑상선염, 후두염, 뇌염, 척수염, 폐렴, 위염, 대장염, 방광염, 췌장염, 방광염, 활막염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 강직 척추염, 건선, 소양증, 양진, 지루성 피부염, 여드름, 자극성 피부염 또는 아토피성 피부염일 수 있고, 상기 면역질환은 염증성 장질환, 류마티스성 관절염, 베체트병, 전신 루푸스, 쇼그렌증후군, 중증근무력증, 경피증, 결절성 다발동맥염, 기쿠치병, 교원병, 하시모토 갑상선염, 백반증, 스틸병, 원형탈모, 다발성 경화증, 기립성 빈맥증후군, 자가면역성 간염, 자가면역성 췌장염, 자가면역성 뇌염, 자가면역성 용혈성 빈형, 스티븐스-존스 증후군, 갈랑 바레 증후군, 사이토카인 폭풍 또는 천포창일 수 있으며, 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염 또는 크론병일 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 단량체성 인간 IL-10 변이체의 제조
본 발명자들은 하기 표 1과 같은 구성을 갖는 인간 IL-10 변이체 단백질 서열을 결정하고 각각의 융합단백질의 구성요소들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드들을 PCR 증폭 및 올리고뉴클레오타이드 합성(코스모진텍, 한국)을 통해 제조한 후, T4 ligase를 사용하여 유전자 컨스트럭트를 제조하고 이를 pAD15 발현벡터(WO2015/009052A)에 클로닝한 후 pAD15-PG-010 벡터를 제조하였다.
본 발명의 일실시예에 따라 제조된 융합단백질의 구조
Fc-IL-10Vm Fc 링커 IL-10Vm
아미노산 서열 SHTQPLGVFL FPPKPKDQLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR
EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP
PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV
DKSRWQEGNV FSCSVLHEAL HNHYTQKSLS LSLG		 AAGSGGGGGS GGGGSGGGGS SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFFQMK DQLDNLLLKE SLLEDFKGYL
GCQALSEMIQ FYLEEVMPQA ENQDPDAKAH VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENGGSG
GSGGSKSKAV EQVKNAFNKL QEKGIYKAMS EFDIFINYIE AYMTMKIRN
서열번호 5 2 35
실시예 2: Fc-IL-10Vm 융합단백질 생산 안정적 세포주의 구축
상기 실시예 1의 결과로부터 본 발명자들은 RCB(research cell bank)를 구축하기 위해 실시예 1에서 제조된 pAD15-PG-010 발현벡터를 CHO DG44 세포에 형질감염 시킨 후 안정적 세포주를 제조하였다.
2-1: 형질감염
구체적으로, 본 발명자들은 우선 냉동보관 중인 CHO DG44(from Dr. Chasin, Columbia University, USA) 세포를 해동한 후, 5x105 cells/mL로 파종하여 2일 후 생존세포 농도가 1x106 cells/mL 이상, 생존율 95% 이상으로 회복시킨 후 계대배양하였다. 3 내지 10 계대 이내로 계대배양된 안정화된 CHO GD44 세포(6.5x106 cells)를 세척한 후 형질감염 키트에 포함된 재현탁 완충액 130 μl로 재현탁하고 pAD15-PG-010 발현벡터 DNA 26 μg을 잘 혼합한 후 전기천공용 큐벳에 10 μl 씩 13개의 큐벳에 나눠 분주한 후, 전기천공기로 형질감염을 수행하였다. 전기천공에 의한 형질감염은 총 2차례 수행하였다. 전기자극 받은 세포를 배양배지(EX-CELL CHO 포함)가 담긴 6-웰 플레이트로 이동시킨 후 재현탁하였다. 그런 다음 플레이트를 상하 좌우로 잘 흔들어 준 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
2-2: HT 선별
1차 및 2차 형질감염으로부터 48시간이 경과한 6-웰 플레이트의 세포들을 각각 수집하여(pooling) 세포수를 Vi-cell 계수 키트로 측정하였다. 접종할 세포 수를 계산하여 50 ml 튜브로 배양액을 옮긴 후, 1,100 rpm에서 4분간 원심분리를 하였다. 원심분리 후 상등액 1 mL은 발현 확인을 위해 시료로 채취하고 나머지 상등액은 제거한 후, 남은 펠렛에 5 mL 배지(EX-CELL CHO 포함)를 넣고 현탁하였다. 그런 다음, T-25 비코팅 플라스크에 접종한 후, 약 2주간 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양하는 2주 동안 일정한 간격으로 생존 세포 농도와 생존도를 관찰하였다. 생존 세포농도가 최소 0.6x106 cells/mL, 생존도 90% 이상 정도의 세포 상태가 회복되었을 때 HT 선별이 되었다고 판단하여, 배양규모를 T-플라스크로 확장하였다. 1차 HT 선별 및 2차 HT 선별 결과는 표 2, 표 3, 도 1a 및 도 1b에서 확인되는 바와 같다.
1차 HT 선별 결과
Fc-IL10Vm Viability (%) Viable cells (cells/mL, x106) Td (hr)
P8 HT D0 66.76 0.26
P09 HT D7 20.58 0.12
P10 HT D10 21.88 0.19 89.15
P11 HT D13 22.8 0.21 458.8
P12 HT D16 47.26 0.47 68.71
P13 HT D19 80.81 1.58 39.94
P14 HT D22 93.8 2.28 31.3
P15 HT D26 94.9 2.77 30.2
2차 HT 선별 결과
Fc-IL10Vm Viability (%) Viable cells (cells/mL, x106) Td (hr)
P12 HT D0 88.49 0.62
P13 HT D7 34.90 0.18
P14 HT D10 51.05 0.53 135.69
P15 HT D13 85.3 2.27 34.1
P16 HT D16 95.13 2.91 28.25
아울러, 상기 1차 및 2차 HT 선별이 완료된 시료에 대하여 마이코플라즈마 감염 여부를 조사하였다. 구체적으로. 마이코플라스마 검출 분석은 마이코플라즈마 검출 키트(Lonza, Cat# LT07318)와 대조군으로 Mycoalert control set(Lonza, Cat# LT07-518, Lot# 0000867081)를 이용하여 제조사의 지침대로 수행하였다. 그 결과 표 4에서 확인되는 바와 같이, 두 차례 선별 모두 마이코플라즈마는 검출되지 않았다.
마이코플라즈마 검출 결과
대조군 판독 A 판독 B B/A 결과
양성대조군 2022 291220 144.03 양성
음성대조군 4709 1028 0.22 음성
시료 판독 A 판독 B B/A 결과
Fc-IL10Vm 1차 HT 선별 16557 6780 0.41 음성
Fc-IL10Vm 2차 HT 선별 11610 5314 0.46 음성
2-3: 메토트렉세이트(MTX) 증폭
상기 실시예 2-2에서 1차 및 2차 HT 선별된 세포를 풀링하여 메토트렉세이트(MTX) 50 nM, 100 nM 및 200 nM을 첨가한 배지로 6-웰 플레이트에 파종하고 세포 회복 후 1차 및 2차 형질감염의 생산성을 배양 3일차의 배양 상등액을 대상으로 인간 Fc ELISA 키트로 평가하였다.
그 결과 도 2a 및 2b에서 확인되는 바와 같이, 1차 형질감염 MTX 풀에서 총 8개의 풀(1stTX-50 nM-5, 1stTX-50 nM-9, 1stTX-100 nM-4, 1stTX-100 nM-9, 1stTX-100 nM-11, 1stTX-100 nM-12, 1stTX-200 nM-1, 1st TX-200 nM-8)이 선정 되었고, 2차 형질감염 MTX 풀에서 총 5개의 풀(2ndTX-50 nM-5, 2ndTX-200 nM-4, 2ndTX-200 nM-5, 2ndTX-200 nM-6, 2ndTX-200 nM-7)이 선정되었다.
상기에서 선정된 13개의 풀을 125 mL로 배양규모를 확대한 후, 생존도 85% 이상 회복하였을 때 상기와 동일하게 생산성 평가를 진행하여 총 8개의 풀(1stTX-50 nM-9, 1stTX-100 nM-9, 1stTX-100 nM-12, 1stTX-200 nM-1, 1stTX-200 nM-2, 1stTX-200 nM-9, 2ndTX-200 nM-4, 2ndTX-200 nM-5)을 선정하였다(도 3a).
상기 선정된 8개의 풀에서 생존도 90% 이상 회복하였을 때 다시 생산성 평가를 진행하여 생산성이 가장 높은 풀 3개(1stTX 200 nM-1, 1stTX-200 nM-2, 1stTX-200 nM-9)를 선정하였다(도 3b). 최종 선정된 3개 풀 모두 각 5 바이알 씩 스탁(stock)을 제조하여 마이코플라즈마 검출 분석 후(표 5) 액체질소 탱크에 저장 하였다.
메토트렉세이트 증폭 완료 후 마이코플라즈마 검출 결과
대조군 판독 A 판독 B B/A 결과
양성대조군 4600 1094438 237.92 양성
음성대조군 6180 574 0.09 음성
시료 판독 A 판독 B B/B 결과
Fc-IL10Vm 200M-1p 459904 15935 0.035 음성
Fc-IL10Vm 200M-2p 280241 11159 0.040 음성
Fc-IL10Vm 200M-9p 254429 10878 0.043 음성
2-4: 단일 클론 확보
상기 HT 선별 및 메토트렉세이트 증폭 실험은 여러 이질적인 형질감염체를 풀링하여 수행한 것이기 때문에, 이질적인 세포집단으로 혼재되어 있다. 따라서, 본 발명자들은 상기 풀로부터 단일 세포 기원의 클론을 분리하기 위해 한계 희석 클로닝(limited dilution cloning, LDC)를 수행하였다.
구체적으로, 메토트렉세이트 증폭 후 3 일차 배양 상등액에서의 생산성이 가장 우수했던 1stTX-200 nM-1p와 1stTX-200 nM-9p를 이용하여 LDC를 진행하였다. 냉포획 분석(cold capture assay)을 적용하여 비염색 대조군(음성) 대비 생산성이 높게 측정 되는 상위 4~9%를 게이팅하여 96-웰에 직접 단일 세포 정렬을 진행하였다. 2회차 세포 정렬 모두 메토트렉세이트 풀 당 5 플레이트씩 파종하였다.
CSI 이미지 분석일 0, 1, 2, 8, 및 14일차에 현미경 기록을 남겼고, CSI loci 분석을 통해 단일 세포로부터 유래한 클론들을 선별하였다. 1차 정렬에서는 14 클론이 2차 정렬에서는 26 클론이 확인되어, 인간 IgG ELISA 분석을 통해 스크리닝을 수행하였다. 그 결과, ELISA에서 발색되는 모든 클론은 총 26개로 확인되었다(1차 정렬 8클론, 2차 정렬 18클론, 도 4a 및 4b).
2-5: 우수 클론 선별
상기 실시예 2-4에서 선별된 클론들을 대상으로 배양 규모 확대에 성공한 8 클론(#11, #17, #21, #24, #28, #29, #35 및 #40)을 대상으로 125 mL T-플라스크 규모에서의 생산성을 평가하였다. 그 결과 배양 3일차에서 생산성이 높은 5개의 클론이 선정되었다(도 5). #21 및 #24는 세포당 생산성은 매우 높았으나 생존도가 극히 낮아서 전체적인 생산성이 떨어지는 관계로 폐기하였다.
2-6: 선별 클론 단백질 발현 확인
상기 실시예 2-5에서 선별된 4 클론(#11, #28, #29, #35)을 HycellCHO 배지로 적응을 거친 후 배치배양을 수행하였다. 그 결과 배치배양일은 8~12일, 최대 세포밀도는 5.66 ~ 18.2X106 cells/ml로 다양하게 확인되었다. 클론별 단백질 발현을 확인하기 위해 배양액을 이용하여 SDS-PAGE를 수행하였으며, 그 결과 표적 크기인 97.6 kDa 근처에서 밴드가 명확하게 확인되었다(도 6). 이 중 3 클론(#11, #35, #28)에 대해 각 25 바이알 씩 스탁(stock)을 제조하여 마이코플라즈마 검출 분석 후(표 6) 액체질소 탱크에 저장하였다.
우수 클론 선별 후 마이코플라즈마 검출 결과
대조군 판독 A 판독 B B/A 결과
양성대조군 4019 990978 246.57 양성
음성대조군 5389 684 0.13 음성
시료 판독 A 판독 B B/B 결과
#11 클론 546158 59904 0.11 음성
#35 클론 912217 102890 0.11 음성
#28 클론 811201 89137 0.11 음성
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> PROGEN CO., LTD. <120> A novel cell line for producing IL-10 variant fusion protein and use thereof <130> PD20-6031 <160> 42 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 169 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monomeric IL-10 variant <400> 1 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Ser Lys 115 120 125 Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly 130 135 140 Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu 145 150 155 160 Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 165 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 2 Ala Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 3 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer peptide <400> 4 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 5 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified Fc region lysine deleted <400> 5 Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 1 5 10 15 Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 20 25 30 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 35 40 45 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 50 55 60 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 65 70 75 80 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 85 90 95 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 100 105 110 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 115 120 125 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 130 135 140 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 145 150 155 160 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 165 170 175 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 180 185 190 Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 195 200 205 Leu Ser Leu Ser Leu Gly 210 <210> 6 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified Fc region <400> 6 Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 1 5 10 15 Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 20 25 30 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 35 40 45 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 50 55 60 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 65 70 75 80 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 85 90 95 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 100 105 110 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 115 120 125 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 130 135 140 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 145 150 155 160 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 165 170 175 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 180 185 190 Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 195 200 205 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 7 Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 8 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker unit sequence <400> 9 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 10 Gly Ser Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 11 Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 12 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr 1 5 10 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 13 Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe 1 5 10 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 14 Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 15 Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Ala Glu Ala Cys 1 5 10 <210> 16 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 16 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala 20 25 30 Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 35 40 45 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 17 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 18 Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 19 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Ala Lys Ala 1 5 10 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 20 Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 21 Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp 1 5 10 15 Val <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 22 Pro Leu Gly Leu Trp Ala 1 5 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 23 Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 24 Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly 1 5 10 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 25 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 26 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 26 Gly Phe Leu Gly 1 <210> 27 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 27 Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp 1 5 10 15 Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gly Ser Gln Lys Ala Gly Val Asp Glu 20 25 30 <210> 28 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 28 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 10 15 Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 20 25 30 <210> 29 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tPA signal peptide <400> 29 Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala 20 25 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 30 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 31 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 31 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 10 15 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 20 25 30 Pro <210> 32 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 32 Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Ser Lys Glu Lys 1 5 10 15 Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro 20 25 30 <210> 33 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 33 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 10 15 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 20 25 30 <210> 34 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 34 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser 1 5 10 15 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 20 25 <210> 35 <211> 169 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monomeric IL-10 I87A variant <400> 35 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ala Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Ser Lys 115 120 125 Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly 130 135 140 Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu 145 150 155 160 Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 165 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 36 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 37 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 38 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 <210> 39 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 39 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala 1 5 10 15 Lys Asn Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Thr Arg Gly Gly 20 25 30 Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Thr 35 40 45 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 50 55 <210> 40 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 40 Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 41 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 42 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wild type human IL-10 (mature form) <400> 42 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160

Claims (13)

  1. 단량체성 인간 Interleukin-10(이하, IL-10) 변이체 단백질이 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 변형 Fc 영역 펩타이드와 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 숙주세포에 안정적 형질감염시켜 제조되는 상기 융합단백질을 발현하는 신규 세포주.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단량체성 IL-10 변이체(이하, IL-10Vm) 단백질은 인간 IL-10 단백질의 성숙형 형태(mature form) 기준으로 116번째 아미노산인 아스파라긴 및 117번째 아미노산인 라이신 사이에 6 내지 12 a.a.의 길이를 갖는 스페이서 펩타이드가 삽입된 것인, 신규 세포주.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 IL-10Vm 단백질은 상기 인간 IL-10 단백질의 성숙형 형태를 기준으로 87번째 아미노산인 이소류신이 알라닌으로 치환된 단량체성 IL-10 변이체 단백질인, 신규 세포주.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 IL-10Vm 단백질은 서열번호 1 또는 35로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 신규 세포주.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드는 조절서열에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터로 상기 숙주세포에 형질감염되는, 신규 세포주.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 숙주세포는 CHO 세포, HEK293 세포, COS7 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, W138 세포, BHK 세포, MDCK 세포, 또는 HuT 78 세포인, 신규 세포주.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 CHO 세포는 CHO DHFR- 또는 CHO DG44 세포인, 신규 세포주.
  8. 제1항에 있어서,
    메토트렉세이트로 유전자 증폭된, 신규 세포주.
  9. 단량체성 인간 Interleukin-10(이하, IL-10) 변이체 단백질이 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 변형 Fc 영역 펩타이드와 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 준비하는 단계;
    상기 유전자 컨스트럭트로 숙주세포를 형질감염시키는 단계;
    상기 유전자 컨스트럭트가 형질감염된 세포를 선별하는 단계; 및
    상기 형질감염 세포 집단 중 단일 세포를 분리하여 형질감염 단일 세포주를 제조하는 단계를 포함하는 단량체성 인간 IL-10 변이체 단백질이 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 변형 Fc 영역 펩타이드와 연결된 융합단백질을 발현하는 단클론성 형질감염 세포의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 형질감염 세포는 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 게놈 내에서 증폭되도록 유전자 증폭 공정을 통해 유전자 증폭된 세포인, 제조방법.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 신규 세포주를 배양배지에 접종한 후 배양하는 단계; 및 상기 배양배지 또는 상기 신규 세포주의 세포체로부터 상기 융합단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 단량체성 인간 IL-10 변이체 단백질이 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 변형 Fc 영역 펩타이드와 연결된 융합단백질의 생산방법.
  12. 제11항의 세포주로부터 생산된 단량체성 인간 IL-10 변이체 단백질이 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 변형 Fc 영역 펩타이드와 연결된 융합단백질.
  13. 제12항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역질환 치료용 조성물.
KR1020210001819A 2021-01-07 2021-01-07 신규 il-10 변이체 융합단백질 생산용 세포주 및 그의 용도 KR20220099656A (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210001819A KR20220099656A (ko) 2021-01-07 2021-01-07 신규 il-10 변이체 융합단백질 생산용 세포주 및 그의 용도
PCT/KR2022/000243 WO2022149881A1 (ko) 2021-01-07 2022-01-06 신규 il-10 변이체 융합단백질 생산용 세포주 및 그의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210001819A KR20220099656A (ko) 2021-01-07 2021-01-07 신규 il-10 변이체 융합단백질 생산용 세포주 및 그의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220099656A true KR20220099656A (ko) 2022-07-14

Family

ID=82358263

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210001819A KR20220099656A (ko) 2021-01-07 2021-01-07 신규 il-10 변이체 융합단백질 생산용 세포주 및 그의 용도

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20220099656A (ko)
WO (1) WO2022149881A1 (ko)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014023673A1 (en) * 2012-08-08 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-10 fusion proteins and uses thereof
WO2016100788A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-23 Alkermes, Inc. Single chain fc fusion proteins
CN108948207B (zh) * 2017-05-22 2020-11-13 杭州博虎生物科技有限公司 一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白及其编码基因与应用
WO2020097946A1 (zh) * 2018-11-18 2020-05-22 杭州博虎生物科技有限公司 一种重组人白细胞介素10融合蛋白及其应用
AU2020273903B2 (en) * 2019-05-14 2024-05-09 Progen Co Ltd Novel modified immunoglobulin Fc-fusion protein and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022149881A1 (ko) 2022-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2541651C (en) Methods of synthesizing heteromultimeric polypeptides in yeast using a haploid mating strategy
JP4054354B2 (ja) ＮＦ−κＢのレセプター活性化因子−レセプターはＴＮＦレセプタースーパーファミリーの一員である
JP2898064B2 (ja) ヒトｇｐ１３０蛋白質
JP5481478B2 (ja) 新規調節エレメント
CN111494625B (zh) 用于治疗il-4和/或il-13介导的信号转导相关的疾病的药物组合物
RU2630656C2 (ru) АНТИТЕЛА ПРОТИВ αβTCR
US6156514A (en) Methods for making recombinant cells
JPH1095800A (ja) Ｔｎｆ結合タンパク質
WO1994004570A1 (en) Cd40 ligand, anti cd40 antibodies, and soluble cd40
CN106336459B (zh) 抗人白细胞介素-17a单克隆抗体、其制备方法和应用
KR20180119135A (ko) 4-1bbl 변이체 및 이를 포함하는 융합 단백질
KR20110044769A (ko) 발현 벡터 및 그의 방법
US5852176A (en) Antibodies to receptors for human interleukin-12
Sohda et al. Identification of a soluble isoform of human IL-17RA generated by alternative splicing
KR20220099656A (ko) 신규 il-10 변이체 융합단백질 생산용 세포주 및 그의 용도
WO1991014776A1 (en) Dna coding for granulocytic colony stimulating factor receptor
JP3683000B2 (ja) Ｓｐａ−１蛋白質及びそれをコードする遺伝子
KR101993938B1 (ko) IFNα2로부터의 SAR 인자를 갖는 발현 시스템
US20230100000A1 (en) Immune cell expressing adapter chimeric antigen receptor for sensing soluble antigens
JP3365859B2 (ja) プレｂ細胞増殖支持能を有するポリペプチドをコードする遺伝子
JP2002523046A (ja) ヒトｉｌ−１エプシロンｄｎａおよびポリペプチド
KR100189170B1 (ko) C6 베타-케모카인에 속하는 사람의 mrp cdna
JPH07165795A (ja) ヒト・インターロイキン−２受容体
JPWO2007055369A1 (ja) 活性化形質細胞様樹状細胞に特異的に発現する膜分子
JPH09163986A (ja) サイトカインレセプタ−領域、その製法及びそれに使用する宿主