JPH09163986A - サイトカインレセプタ−領域、その製法及びそれに使用する宿主 - Google Patents
サイトカインレセプタ−領域、その製法及びそれに使用する宿主Info
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- JPH09163986A JPH09163986A JP7330106A JP33010695A JPH09163986A JP H09163986 A JPH09163986 A JP H09163986A JP 7330106 A JP7330106 A JP 7330106A JP 33010695 A JP33010695 A JP 33010695A JP H09163986 A JPH09163986 A JP H09163986A
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- Japan
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- cytokine receptor
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- receptor region
- sil
- receptor domain
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】機能は同じであるが、分子量が細胞外領域全体
に比べ小さいという特徴を有する、組換えサイトカイン
レセプタ−領域を提供する。 【解決手段】ＩＬ−６Ｒ中のサイトカインレセプタ−領
域をコ−ドする遺伝子を含有する発現ベクタ−により形
質転換されたピキア酵母、それを培養し培養物からＩＬ
−６Ｒのサイトカインレセプタ−領域を採取することを
特徴とするＩＬ−６Ｒのサイトカインレセプタ−領域の
製造法、及びそのような方法により製造された組換えＩ
Ｌ−６Ｒのサイトカインレセプタ−領域。
に比べ小さいという特徴を有する、組換えサイトカイン
レセプタ−領域を提供する。 【解決手段】ＩＬ−６Ｒ中のサイトカインレセプタ−領
域をコ−ドする遺伝子を含有する発現ベクタ−により形
質転換されたピキア酵母、それを培養し培養物からＩＬ
−６Ｒのサイトカインレセプタ−領域を採取することを
特徴とするＩＬ−６Ｒのサイトカインレセプタ−領域の
製造法、及びそのような方法により製造された組換えＩ
Ｌ−６Ｒのサイトカインレセプタ−領域。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、サイトカインレセ
プタ−領域、その製法及びそれに使用する宿主に関する
ものであり、詳しくは組換えサイトカインレセプタ−領
域、その製法及びそれに使用する宿主に関するものであ
る。
プタ−領域、その製法及びそれに使用する宿主に関する
ものであり、詳しくは組換えサイトカインレセプタ−領
域、その製法及びそれに使用する宿主に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】４つのαヘリックスから構成されること
を特徴とする、サイトカインが結合するレセプタ−は、
ヘマトポイエチックレセプタ−ファミリ−（造血系レセ
プタ−群）と呼ばれるグル−プに属し、７つのβシ−ト
から構成されるバレル（樽）が短いリンカ−で２個つな
がった構造体をとることが特徴である。この構造体はサ
イトカインレセプタ−領域と呼ばれ、その中には、トリ
プトファン−セリン−Ｘ−トリプトファン−セリン（Ｘ
は不特定のアミノ酸残基）という配列が広く保存されて
いる（Ｂａｚａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ．，８７巻、ｐ６９３４，１９９０年参
照）。
を特徴とする、サイトカインが結合するレセプタ−は、
ヘマトポイエチックレセプタ−ファミリ−（造血系レセ
プタ−群）と呼ばれるグル−プに属し、７つのβシ−ト
から構成されるバレル（樽）が短いリンカ−で２個つな
がった構造体をとることが特徴である。この構造体はサ
イトカインレセプタ−領域と呼ばれ、その中には、トリ
プトファン−セリン−Ｘ−トリプトファン−セリン（Ｘ
は不特定のアミノ酸残基）という配列が広く保存されて
いる（Ｂａｚａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ．，８７巻、ｐ６９３４，１９９０年参
照）。
【０００３】ヘマトポイエチックレセプタ−ファミリ−
に属するサイトカインレセプタ−は、膜型及び可溶型の
どちらでも、サイトカインと結合することができる。ヘ
マトポイエチックレセプタ−ファミリ−の１種であるイ
ンターロイキン６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）の可溶型
は、そのリガンドであるインターロイキン６（ＩＬ−
６）と結合すると、標的細胞膜上のｇｐ１３０と結合す
ることにより、刺激を伝えることが知られている（Ｒｏ
ｓｅ−Ｊｏｈｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．，３００
巻、ｐ２８１，１９９４年参照）。一方、インターロイ
キン４レセプター（ＩＬ−４Ｒ）の可溶型は、そのリガ
ンドであるインターロイキン４（ＩＬ−４）と結合する
と、標的細胞膜上のＩＬ−４Ｒと結合することを阻害
し、刺激が伝わらないことが知られている（Ｒｏｓｅ−
Ｊｏｈｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．，３００巻、ｐ２
８１，１９９４年参照）。
に属するサイトカインレセプタ−は、膜型及び可溶型の
どちらでも、サイトカインと結合することができる。ヘ
マトポイエチックレセプタ−ファミリ−の１種であるイ
ンターロイキン６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）の可溶型
は、そのリガンドであるインターロイキン６（ＩＬ−
６）と結合すると、標的細胞膜上のｇｐ１３０と結合す
ることにより、刺激を伝えることが知られている（Ｒｏ
ｓｅ−Ｊｏｈｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．，３００
巻、ｐ２８１，１９９４年参照）。一方、インターロイ
キン４レセプター（ＩＬ−４Ｒ）の可溶型は、そのリガ
ンドであるインターロイキン４（ＩＬ−４）と結合する
と、標的細胞膜上のＩＬ−４Ｒと結合することを阻害
し、刺激が伝わらないことが知られている（Ｒｏｓｅ−
Ｊｏｈｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．，３００巻、ｐ２
８１，１９９４年参照）。
【０００４】遺伝子工学を用いて組換えサイトカインレ
セプタ−を作ることはすでによく知られている方法であ
る。この場合、組換えサイトカインレセプタ−の活性、
すなわちそのリガンドであるサイトカインと結合し、刺
激を伝達あるいは阻害することができるものであれば、
組換えサイトカインレセプタ−の分子量は小さいほど精
製等の取扱いが容易である。また、診断薬あるいは治療
薬として用いる場合も、活性に不要な部分は除去するこ
とが望ましい。例えば、可溶性ＩＬ−６Ｒの産業上の用
途としては、ＩＬ−６の生理活性のひとつである血小板
増多効果（石橋ら、Ｂｌｏｏｄ， ７４， ｐ１２４
１，１９８９年参照）、あるいはＳＣＦ（Ｓｔｅｍ ｃ
ｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ，幹細胞因子）存在下でのＩＬ−
６の骨髄幹細胞の増殖効果（Ｓｕｉら、Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ， Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５年参
照）の増強が挙げられる。この場合も、可溶性ＩＬ−６
Ｒは、ＩＬ−６と結合し、その複合体が細胞膜上ｇｐ１
３０と結合して刺激を伝えることができるものであるな
らば、副反応や副作用を減少させるために、分子量はよ
り小さいことが好ましい。
セプタ−を作ることはすでによく知られている方法であ
る。この場合、組換えサイトカインレセプタ−の活性、
すなわちそのリガンドであるサイトカインと結合し、刺
激を伝達あるいは阻害することができるものであれば、
組換えサイトカインレセプタ−の分子量は小さいほど精
製等の取扱いが容易である。また、診断薬あるいは治療
薬として用いる場合も、活性に不要な部分は除去するこ
とが望ましい。例えば、可溶性ＩＬ−６Ｒの産業上の用
途としては、ＩＬ−６の生理活性のひとつである血小板
増多効果（石橋ら、Ｂｌｏｏｄ， ７４， ｐ１２４
１，１９８９年参照）、あるいはＳＣＦ（Ｓｔｅｍ ｃ
ｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ，幹細胞因子）存在下でのＩＬ−
６の骨髄幹細胞の増殖効果（Ｓｕｉら、Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ， Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５年参
照）の増強が挙げられる。この場合も、可溶性ＩＬ−６
Ｒは、ＩＬ−６と結合し、その複合体が細胞膜上ｇｐ１
３０と結合して刺激を伝えることができるものであるな
らば、副反応や副作用を減少させるために、分子量はよ
り小さいことが好ましい。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、機能は同じ
であるが、分子量が細胞外領域全体に比べ小さいという
特徴を有する、組換えサイトカインレセプタ−を提供す
ることを目的とするものである。
であるが、分子量が細胞外領域全体に比べ小さいという
特徴を有する、組換えサイトカインレセプタ−を提供す
ることを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
め、本発明者らは、サイトカインレセプタ−の製造方法
について鋭意研究を行った結果、サイトカインレセプタ
−領域のみを宿主−ベクタ−系で発現させ、発現した該
蛋白質を同定し、遺伝子工学的に大量に該蛋白質を生産
し、さらにリガンドに結合できるという性質を保持した
状態で効率良く該蛋白質を分離回収する方法を確立し
た。
め、本発明者らは、サイトカインレセプタ−の製造方法
について鋭意研究を行った結果、サイトカインレセプタ
−領域のみを宿主−ベクタ−系で発現させ、発現した該
蛋白質を同定し、遺伝子工学的に大量に該蛋白質を生産
し、さらにリガンドに結合できるという性質を保持した
状態で効率良く該蛋白質を分離回収する方法を確立し
た。
【０００７】すなわち本発明は、サイトカインレセプタ
−領域をコ−ドする遺伝子を含有する発現ベクタ−によ
り形質転換された宿種、その宿種を培養し、そして当該
培養物からサイトカインレセプタ−領域を採取すること
を特徴とするサイトカインレセプタ−領域の製造方法、
及びそのようにして製造された組換えサイトカインレセ
プタ−領域にある。
−領域をコ−ドする遺伝子を含有する発現ベクタ−によ
り形質転換された宿種、その宿種を培養し、そして当該
培養物からサイトカインレセプタ−領域を採取すること
を特徴とするサイトカインレセプタ−領域の製造方法、
及びそのようにして製造された組換えサイトカインレセ
プタ−領域にある。
【０００８】また本発明は、サイトカインレセプタ−領
域をコ−ドする遺伝子を含有する発現ベクタ−により形
質転換されたピキア酵母、そのピキア酵母を培養し、そ
して当該培養物からサイトカインレセプタ−領域を採取
することを特徴とするサイトカインレセプタ−領域の製
造方法、及びそのようにして製造された組換えサイトカ
インレセプタ−領域にある。
域をコ−ドする遺伝子を含有する発現ベクタ−により形
質転換されたピキア酵母、そのピキア酵母を培養し、そ
して当該培養物からサイトカインレセプタ−領域を採取
することを特徴とするサイトカインレセプタ−領域の製
造方法、及びそのようにして製造された組換えサイトカ
インレセプタ−領域にある。
【０００９】以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１０】本発明で提供される組換えサイトカインレ
セプタ−領域とは、ヘマトポイエチックレセプタ−ファ
ミリ−（造血系レセプタ−群）と呼ばれるサイトカイン
レセプタ−中に存在する、７つのβシ−トから構成され
るバレル（樽）用の構造体が短いリンカ−で２個つなが
った構造体、すなわちサイトカインレセプタ−領域を、
適当な宿種を用いて発現させたものである。
セプタ−領域とは、ヘマトポイエチックレセプタ−ファ
ミリ−（造血系レセプタ−群）と呼ばれるサイトカイン
レセプタ−中に存在する、７つのβシ−トから構成され
るバレル（樽）用の構造体が短いリンカ−で２個つなが
った構造体、すなわちサイトカインレセプタ−領域を、
適当な宿種を用いて発現させたものである。
【００１１】宿主としては、大腸菌、動物細胞、ピキア
酵母などが使用できるが、特にピキア酵母が好ましい。
本明細書中には、一例としてＩＬ−６Ｒのサイトカイン
レセプター領域の製造を記述しているが、サイトカイン
レセプター領域としては特に限定はなく、種々のサイト
カインレセプター領域を用いることができる。
酵母などが使用できるが、特にピキア酵母が好ましい。
本明細書中には、一例としてＩＬ−６Ｒのサイトカイン
レセプター領域の製造を記述しているが、サイトカイン
レセプター領域としては特に限定はなく、種々のサイト
カインレセプター領域を用いることができる。
【００１２】サイトカインレセプタ−領域を生産するた
めに用いるサイトカインレセプタ−領域をコ−ドするＤ
ＮＡ配列とは、ヘマトポイエチックレセプタ−ファミリ
−に属するサイトカインレセプタ−をコ−ドするＤＮＡ
配列のうち、例えばサイトカインレセプタ−領域をコ−
ドするＤＮＡ配列に適当な修飾を加えたものが挙げられ
る。目的のレセプタ−の１次構造からサイトカインレセ
プタ−領域を同定することは、それ自体よく知られた方
法である（Bazan ら、Proc. Natl. Acad. Sci.87, p693
4, 1990年参照）。また上記適当な修飾法として、終止
コドンを細胞外領域あるいは膜貫通領域に挿入する方
法、細胞外領域中の免疫グロブリン様領域、膜貫通領
域、細胞内領域を除去する方法等があげられる。また、
該配列中の１個もしくは複数個のヌクレオチドが他のヌ
クレオチド配列により置換されており、及び／または１
個もしくは複数個のヌクレオチドが欠失しており、及び
／または１個もしくは複数個のヌクレオチドが付加され
たものも上記ＤＮＡ配列に含められる。この場合の複数
個というのは、約２〜２０個が好ましい。
めに用いるサイトカインレセプタ−領域をコ−ドするＤ
ＮＡ配列とは、ヘマトポイエチックレセプタ−ファミリ
−に属するサイトカインレセプタ−をコ−ドするＤＮＡ
配列のうち、例えばサイトカインレセプタ−領域をコ−
ドするＤＮＡ配列に適当な修飾を加えたものが挙げられ
る。目的のレセプタ−の１次構造からサイトカインレセ
プタ−領域を同定することは、それ自体よく知られた方
法である（Bazan ら、Proc. Natl. Acad. Sci.87, p693
4, 1990年参照）。また上記適当な修飾法として、終止
コドンを細胞外領域あるいは膜貫通領域に挿入する方
法、細胞外領域中の免疫グロブリン様領域、膜貫通領
域、細胞内領域を除去する方法等があげられる。また、
該配列中の１個もしくは複数個のヌクレオチドが他のヌ
クレオチド配列により置換されており、及び／または１
個もしくは複数個のヌクレオチドが欠失しており、及び
／または１個もしくは複数個のヌクレオチドが付加され
たものも上記ＤＮＡ配列に含められる。この場合の複数
個というのは、約２〜２０個が好ましい。
【００１３】サイトカインレセプタ−領域を暗号化する
ｃＤＮＡは、例えば対象となるサイトカインレセプタ−
の一次構造を参照してＤＮＡを合成し、例えば適当な培
養細胞で発現したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これ
を鋳型としてＰＣＲ反応により調製することが可能であ
る。このような例として、ヒトＩＬ−６レセプタ−の一
次構造（Ｙａｍａｓａｋｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２
４１， ｐ８２５，１９８８年参照）を参照してＤＮＡ
を合成したり、ヒト肝臓細胞で発現したｍＲＮＡからｃ
ＤＮＡを合成し、これを鋳型としてＰＣＲ反応によりヒ
トＩＬ−６レセプタ−のサイトカインレセプタ−領域を
調製したりすることが可能である。
ｃＤＮＡは、例えば対象となるサイトカインレセプタ−
の一次構造を参照してＤＮＡを合成し、例えば適当な培
養細胞で発現したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これ
を鋳型としてＰＣＲ反応により調製することが可能であ
る。このような例として、ヒトＩＬ−６レセプタ−の一
次構造（Ｙａｍａｓａｋｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２
４１， ｐ８２５，１９８８年参照）を参照してＤＮＡ
を合成したり、ヒト肝臓細胞で発現したｍＲＮＡからｃ
ＤＮＡを合成し、これを鋳型としてＰＣＲ反応によりヒ
トＩＬ−６レセプタ−のサイトカインレセプタ−領域を
調製したりすることが可能である。
【００１４】本発明のベクタ−は、サイトカインレセプ
タ−領域を暗号化するｃＤＮＡの他に、自己増殖のため
の複製開始点、形質転換細胞の選択を簡単にするための
薬剤耐性遺伝子、宿主細胞のＨｉｓ合成遺伝子の変換を
相補するＨｉｓ４遺伝子、サイトカインレセプタ−領域
のｍＲＮＡへのポリアデニレ−ション配列、サイトカイ
ンレセプタ−領域のｃＤＮＡの転写を終了させるための
タ−ミネ−タ−などの塩基配列を有していることが好ま
しい。また、プロモ−タ−としては宿種が大腸菌の場合
は、ｔａｃやｐｈｏＡ，宿種が酵母の場合は、アルコ−
ルオキシダ−ゼプロモ−タ−、宿種が動物細胞の場合は
ＳＶ４０やサイトメガロウイルスプロモ−タ−などを用
いることができる。
タ−領域を暗号化するｃＤＮＡの他に、自己増殖のため
の複製開始点、形質転換細胞の選択を簡単にするための
薬剤耐性遺伝子、宿主細胞のＨｉｓ合成遺伝子の変換を
相補するＨｉｓ４遺伝子、サイトカインレセプタ−領域
のｍＲＮＡへのポリアデニレ−ション配列、サイトカイ
ンレセプタ−領域のｃＤＮＡの転写を終了させるための
タ−ミネ−タ−などの塩基配列を有していることが好ま
しい。また、プロモ−タ−としては宿種が大腸菌の場合
は、ｔａｃやｐｈｏＡ，宿種が酵母の場合は、アルコ−
ルオキシダ−ゼプロモ−タ−、宿種が動物細胞の場合は
ＳＶ４０やサイトメガロウイルスプロモ−タ−などを用
いることができる。
【００１５】培養液などからサイトカインレセプタ−領
域を回収する操作は、通常の例えば液体クロマトグラフ
ィ−などの手法を用いて培養上清から回収、精製すれば
良い。
域を回収する操作は、通常の例えば液体クロマトグラフ
ィ−などの手法を用いて培養上清から回収、精製すれば
良い。
【００１６】
【発明の実施の形態】以下本発明をさらに詳細に説明す
るために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定
されるものではない。
るために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定
されるものではない。
【００１７】実施例１ ピキア酵母でのサイトカインレ
セプタ−領域を含むＩＬ−６Ｒ発現用プラスミドの調
製。
セプタ−領域を含むＩＬ−６Ｒ発現用プラスミドの調
製。
【００１８】ＩＬ−６Ｒ領域を含む配列として、ＩＬ−
６Ｒの１１３番目のグリシンから３３６番目のトレオニ
ンまでの計２２４アミノ酸をコ−ドする発現プラスミド
ｐＰＩＣ９−ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｈ、及びＩＬ−６Ｒ領域
を含む配列として、ＩＬ−６Ｒの１１３番目のグリシン
から３５５番目のプロリンまでとＧＳＲＲＲＧＳＣＧＬ
との計２５３アミノ酸をコ−ドする発現プラスミドｐＰ
ＩＣ９−ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌをそれぞれ以下の方法で
構築した。
６Ｒの１１３番目のグリシンから３３６番目のトレオニ
ンまでの計２２４アミノ酸をコ−ドする発現プラスミド
ｐＰＩＣ９−ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｈ、及びＩＬ−６Ｒ領域
を含む配列として、ＩＬ−６Ｒの１１３番目のグリシン
から３５５番目のプロリンまでとＧＳＲＲＲＧＳＣＧＬ
との計２５３アミノ酸をコ−ドする発現プラスミドｐＰ
ＩＣ９−ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌをそれぞれ以下の方法で
構築した。
【００１９】プライマ−５´−ＣＣＣＧＡＧＧＡＧＣＣ
ＣＣＡＧＣＴＣ−３´と５´−ＧＧＣＧＡＡＴＴＣＣＴ
ＡＡＧＴＡＧＴＡＡＴＴＧＣＣＴＣ−３´により、ＩＬ
−６ＲのｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。増幅された
ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断した後、ＳｎａＢＩとＥｃｏ
ＲＩで切断したピキア用発現プラスミドｐＰＩＣ９（イ
ンビトロジェン社）に挿入することにより、ＩＬ−６Ｒ
発現プラスミドｐＰＩＣ９−ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｈを得
た。
ＣＣＡＧＣＴＣ−３´と５´−ＧＧＣＧＡＡＴＴＣＣＴ
ＡＡＧＴＡＧＴＡＡＴＴＧＣＣＴＣ−３´により、ＩＬ
−６ＲのｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。増幅された
ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断した後、ＳｎａＢＩとＥｃｏ
ＲＩで切断したピキア用発現プラスミドｐＰＩＣ９（イ
ンビトロジェン社）に挿入することにより、ＩＬ−６Ｒ
発現プラスミドｐＰＩＣ９−ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｈを得
た。
【００２０】プライマ−５´−ＣＣＣＧＡＧＧＡＧＣＣ
ＣＣＡＧＣＴＣ−３´と５´−ＧＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣ
ＡＧＡＧＣＣＣＧＣＡＴＣＣＡＣＧＴＣＴＴＣＴＴＧＡ
ＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＴＣＧＣＡＴＴＴＧＣ−
３´により、ＩＬ−６ＲのｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅
した。増幅されたＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断した後、Ｓ
ｎａＢＩとＥｃｏＲＩで切断したピキア用発現プラスミ
ドｐＰＩＣ９（インビトロジェン社）に挿入することに
より、ＩＬ−６Ｒ発現プラスミドｐＰＩＣ９−ｓＩＬ−
６Ｒ−ｓｐｌを得た。
ＣＣＡＧＣＴＣ−３´と５´−ＧＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣ
ＡＧＡＧＣＣＣＧＣＡＴＣＣＡＣＧＴＣＴＴＣＴＴＧＡ
ＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＴＣＧＣＡＴＴＴＧＣ−
３´により、ＩＬ−６ＲのｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅
した。増幅されたＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断した後、Ｓ
ｎａＢＩとＥｃｏＲＩで切断したピキア用発現プラスミ
ドｐＰＩＣ９（インビトロジェン社）に挿入することに
より、ＩＬ−６Ｒ発現プラスミドｐＰＩＣ９−ｓＩＬ−
６Ｒ−ｓｐｌを得た。
【００２１】得られたＩＬ−６Ｒ発現プラスミドｐＰＩ
Ｃ９−ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｈ及びｐＰＩＣ９−ｓＩＬ−６
Ｒ−ｓｐｌを図１に示す。
Ｃ９−ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｈ及びｐＰＩＣ９−ｓＩＬ−６
Ｒ−ｓｐｌを図１に示す。
【００２２】実施例２ 形質転換体の作製。
【００２３】Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１
１５株（インビトロジェン社）からＣｒｅｇｇ Ｊ．
Ｍ．の方法（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．，
５，ｐ３３７６，１９８５年参照）及び特開平２−１０
４９２０号に記載の方法に従ってスフェロプラストを調
製し、ＢｇｌＩＩによって線状化したｐＰＩＣ９−ｓＩ
Ｌ−６Ｒ−ｓｈあるいはｐＰＩＣ９−ｓＩＬ−６Ｒ−ｓ
ｐｌにより、以下の方法で形質転換を行った。
１５株（インビトロジェン社）からＣｒｅｇｇ Ｊ．
Ｍ．の方法（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．，
５，ｐ３３７６，１９８５年参照）及び特開平２−１０
４９２０号に記載の方法に従ってスフェロプラストを調
製し、ＢｇｌＩＩによって線状化したｐＰＩＣ９−ｓＩ
Ｌ−６Ｒ−ｓｈあるいはｐＰＩＣ９−ｓＩＬ−６Ｒ−ｓ
ｐｌにより、以下の方法で形質転換を行った。
【００２４】すなわち、ＧＳ１１５をＹＰＤ培地５０ｍ
ｌで３０℃でＯＤ６００が１になるまで振とう培養した
後、菌を集め、リチウムクロライド法により発現プラス
ミドを導入した。形質転換菌は最小栄養培地で培養し、
ヒスチジン要求性を失った形質転換菌を選別した。３０
から１００クロ−ンを保存用プレ−トで培養した後、９
６穴に移し、ＢＭＧＹ培地０．１５ｍｌの中で３０℃で
２４時間培養した。その後、菌を集め、ＢＭＭＹ培地に
サスペンドし、メタノ−ルを加えてＰａｏｘプロモ−タ
−を誘導し、３０℃で２４時間培養した。途中、４時間
後と１６時間後に、メタノ−ルを０．５％加えた。最後
に上清を集め１２．５％ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行
い、最も発現量の多いクロ−ンｓＩＬ−６Ｒ−ｓｈとｓ
ＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌを選んだ。
ｌで３０℃でＯＤ６００が１になるまで振とう培養した
後、菌を集め、リチウムクロライド法により発現プラス
ミドを導入した。形質転換菌は最小栄養培地で培養し、
ヒスチジン要求性を失った形質転換菌を選別した。３０
から１００クロ−ンを保存用プレ−トで培養した後、９
６穴に移し、ＢＭＧＹ培地０．１５ｍｌの中で３０℃で
２４時間培養した。その後、菌を集め、ＢＭＭＹ培地に
サスペンドし、メタノ−ルを加えてＰａｏｘプロモ−タ
−を誘導し、３０℃で２４時間培養した。途中、４時間
後と１６時間後に、メタノ−ルを０．５％加えた。最後
に上清を集め１２．５％ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行
い、最も発現量の多いクロ−ンｓＩＬ−６Ｒ−ｓｈとｓ
ＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌを選んだ。
【００２５】実施例３ ＩＬ−６Ｒの発現。
【００２６】実施例２で得られたクロ−ンｓＩＬ−６Ｒ
−ｓｈとクロ−ンｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌとをそれぞれ１
リットルの１％グリセロ−ル含有培地でＯＤ６００＝１
４となるまで３０℃で振とう培養した後、菌体を０．８
％メタノ−ル含有倍地に移し、メタノ−ルの濃度を０．
２〜０．８％に保ちながら、２日間培養した。その後、
培養物を遠心操作により培養上清と菌体に分画した。
−ｓｈとクロ−ンｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌとをそれぞれ１
リットルの１％グリセロ−ル含有培地でＯＤ６００＝１
４となるまで３０℃で振とう培養した後、菌体を０．８
％メタノ−ル含有倍地に移し、メタノ−ルの濃度を０．
２〜０．８％に保ちながら、２日間培養した。その後、
培養物を遠心操作により培養上清と菌体に分画した。
【００２７】培養上清中のＩＬ−６Ｒは、以下の方法で
解析した。
解析した。
【００２８】まず、形質転換株ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｈ及び
ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌの培養上清中にＩＬ−６Ｒが含ま
れていることをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌの培養上清中にＩＬ−６Ｒが含ま
れていることをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
【００２９】具体的には、未形質転換株ＧＳ１１５，ｐ
ＰＩＣ９−ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｈで形質転換した株ｓＩＬ
−６Ｒ−ｓｈ及びｐＰＩＣ９−ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌで
形質転換した株ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌをそれぞれ培養
し、メタノ−ルによる誘導の４８時間後に培養液を集め
た。遠心により細胞を除去し、上清を１０倍に濃縮した
ものをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。結果を図２に示す。
図中（１）は、銀染色したときのパタ−ン、（２）はマ
ウス由来でヒトＩＬ−６Ｒのサイトカインレセプタ−領
域を認識するモノクロ−ナル抗体であるＰＭ１（Ｈｉｒ
ａｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３，ｐ２９０
０，１９８９年参照）でウエスタンブロットをしたとき
のパタ−ンである。
ＰＩＣ９−ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｈで形質転換した株ｓＩＬ
−６Ｒ−ｓｈ及びｐＰＩＣ９−ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌで
形質転換した株ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌをそれぞれ培養
し、メタノ−ルによる誘導の４８時間後に培養液を集め
た。遠心により細胞を除去し、上清を１０倍に濃縮した
ものをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。結果を図２に示す。
図中（１）は、銀染色したときのパタ−ン、（２）はマ
ウス由来でヒトＩＬ−６Ｒのサイトカインレセプタ−領
域を認識するモノクロ−ナル抗体であるＰＭ１（Ｈｉｒ
ａｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３，ｐ２９０
０，１９８９年参照）でウエスタンブロットをしたとき
のパタ−ンである。
【００３０】次に３種類のＥＬＩＳＡで以下の解析を行
った。
った。
【００３１】まず、大腸菌由来ヒトＩＬ−６（Ｙａｓｕ
ｋａｗａら、Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｌｅｔｔ．， １２，
ｐ４１９，１９９０年参照）とウサギ由来抗ヒトＩＬ
−６Ｒポリクロ−ナル抗体とのサンドイッチＥＬＩＳＡ
において、未形質転換株ＧＳ１１５の培養上清を２０倍
に薄めたもの（白四角）、ｐＰＩＣ９−ｓＩＬ−６Ｒ−
ｓｐｌで形質転換した株ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌの培養上
清を２０倍に薄めたもの（黒四角）、０．２５μｇ／ｍ
ｌの精製ＩＬ−６Ｒ（白丸）を、種々の濃度のＩＬ−６
で固相をコートして測定したときのプレ−トの発色を図
３に示す。図中、縦軸は４０５ｎｍにおける吸光度、横
軸は固相にコートしたＩＬ−６濃度を示す。
ｋａｗａら、Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｌｅｔｔ．， １２，
ｐ４１９，１９９０年参照）とウサギ由来抗ヒトＩＬ
−６Ｒポリクロ−ナル抗体とのサンドイッチＥＬＩＳＡ
において、未形質転換株ＧＳ１１５の培養上清を２０倍
に薄めたもの（白四角）、ｐＰＩＣ９−ｓＩＬ−６Ｒ−
ｓｐｌで形質転換した株ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌの培養上
清を２０倍に薄めたもの（黒四角）、０．２５μｇ／ｍ
ｌの精製ＩＬ−６Ｒ（白丸）を、種々の濃度のＩＬ−６
で固相をコートして測定したときのプレ−トの発色を図
３に示す。図中、縦軸は４０５ｎｍにおける吸光度、横
軸は固相にコートしたＩＬ−６濃度を示す。
【００３２】図３より明らかなように、形質転換株ｓＩ
Ｌ−６Ｒ−ｓｐｌの培養上清中にはＩＬ−６と結合する
ＩＬ−６Ｒが確認されたが、ネガティブコントロ−ルで
ある非形質転換菌の培養上清中にはＩＬ−６と結合する
ＩＬ−６Ｒが確認されなかった。
Ｌ−６Ｒ−ｓｐｌの培養上清中にはＩＬ−６と結合する
ＩＬ−６Ｒが確認されたが、ネガティブコントロ−ルで
ある非形質転換菌の培養上清中にはＩＬ−６と結合する
ＩＬ−６Ｒが確認されなかった。
【００３３】次に、マウス由来でヒトＩＬ−６Ｒの免疫
グロブリン様領域を認識するモノクロ−ナル抗体である
ＭＴ１８（Ｈｉｒａｔａら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
１４３，ｐ２９００，１９８９年参照）とウサギ由来抗
ヒトＩＬ−６Ｒポリクロ−ナル抗体とのサンドイッチＥ
ＬＩＳＡにおいて、未形質転換株ＧＳ１１５の培養上清
（１）、形質転換株ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌの培養上清
（２）、１５μｇ／ｍｌの精製ＩＬ−６Ｒ（３）を、１
００倍（黒四角）、１０００倍（まだらの四角）、ある
いは１００００倍（白四角）薄めたものを測定したとき
のプレ−トの発色（３回の平均値）を図４に示す。図
中、縦軸は４０５ｎｍにおける吸光度を示す。
グロブリン様領域を認識するモノクロ−ナル抗体である
ＭＴ１８（Ｈｉｒａｔａら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
１４３，ｐ２９００，１９８９年参照）とウサギ由来抗
ヒトＩＬ−６Ｒポリクロ−ナル抗体とのサンドイッチＥ
ＬＩＳＡにおいて、未形質転換株ＧＳ１１５の培養上清
（１）、形質転換株ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌの培養上清
（２）、１５μｇ／ｍｌの精製ＩＬ−６Ｒ（３）を、１
００倍（黒四角）、１０００倍（まだらの四角）、ある
いは１００００倍（白四角）薄めたものを測定したとき
のプレ−トの発色（３回の平均値）を図４に示す。図
中、縦軸は４０５ｎｍにおける吸光度を示す。
【００３４】図４から明らかなように、形質転換株ｓＩ
Ｌ−６Ｒ−ｓｐｌと非形質転換株の培養上清のいずれに
も発色は見られなかった。これは、形質転換株ｓＩＬ−
６Ｒ−ｓｐｌが発現するＩＬ−６Ｒが免疫グロブリン様
領域を欠失していることを示す。
Ｌ−６Ｒ−ｓｐｌと非形質転換株の培養上清のいずれに
も発色は見られなかった。これは、形質転換株ｓＩＬ−
６Ｒ−ｓｐｌが発現するＩＬ−６Ｒが免疫グロブリン様
領域を欠失していることを示す。
【００３５】最後に、抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体ＰＭ１とウ
サギ由来抗ヒトＩＬ−６Ｒポリクロ−ナル抗体とのサン
ドイッチＥＬＩＳＡにおいて、未形質転換株ＧＳ１１５
の培養上清（１）、形質転換株ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌの
培養上清（２）、１５μｇ／ｍｌの精製ＩＬ−６Ｒ
（３）を、１００倍（黒四角）、１０００倍（まだらの
四角）、あるいは１００００倍（白四角）薄めたものを
測定したときのプレ−トの発色（３回の平均値）を図５
に示す。図中、縦軸は４０５ｎｍにおける吸光度を示
す。
サギ由来抗ヒトＩＬ−６Ｒポリクロ−ナル抗体とのサン
ドイッチＥＬＩＳＡにおいて、未形質転換株ＧＳ１１５
の培養上清（１）、形質転換株ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌの
培養上清（２）、１５μｇ／ｍｌの精製ＩＬ−６Ｒ
（３）を、１００倍（黒四角）、１０００倍（まだらの
四角）、あるいは１００００倍（白四角）薄めたものを
測定したときのプレ−トの発色（３回の平均値）を図５
に示す。図中、縦軸は４０５ｎｍにおける吸光度を示
す。
【００３６】図５から明らかなように、形質転換株ｓＩ
Ｌ−６Ｒ−ｓｐｌの培養上清中にはＩＬ−６Ｒが確認さ
れたが、非形質転換菌の培養上清中には、ＩＬ−６Ｒが
確認されなかった。これは、形質転換株ｓＩＬ−６Ｒ−
ｓｐｌが発現するＩＬ−６Ｒがサイトカインレセプタ−
領域を有することを示す。
Ｌ−６Ｒ−ｓｐｌの培養上清中にはＩＬ−６Ｒが確認さ
れたが、非形質転換菌の培養上清中には、ＩＬ−６Ｒが
確認されなかった。これは、形質転換株ｓＩＬ−６Ｒ−
ｓｐｌが発現するＩＬ−６Ｒがサイトカインレセプタ−
領域を有することを示す。
【００３７】実施例４ ＩＬ−６Ｒの精製。
【００３８】実施例３で得られた形質転換株ｓＩＬ−６
Ｒ−ｓｐｌの培養上清を、膜濃縮器ＨＦ−Ｌａｂ１（東
ソ−製）で濃縮し、ＰＭ１結合トレシルトヨパ−ル（東
ソ−製）でアフィニティ−精製した。カラムからの溶出
には、３Ｍ ＫＳＣＮ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）を用いた。素通り分画（１）及び溶出分
画（２）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、銀染色したときの
パタ−ンを図６に示す。
Ｒ−ｓｐｌの培養上清を、膜濃縮器ＨＦ−Ｌａｂ１（東
ソ−製）で濃縮し、ＰＭ１結合トレシルトヨパ−ル（東
ソ−製）でアフィニティ−精製した。カラムからの溶出
には、３Ｍ ＫＳＣＮ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）を用いた。素通り分画（１）及び溶出分
画（２）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、銀染色したときの
パタ−ンを図６に示す。
【００３９】図６に示される通り、本操作により精製Ｉ
Ｌ−６Ｒを得ることができた。
Ｌ−６Ｒを得ることができた。
【００４０】実施例５ ＩＬ−６Ｒの生物活性。
【００４１】ヒト肝臓細胞株ＨｅｐＧ２−ＩＬ−６は、
ＩＬ−６を発現するが、細胞膜上にＩＬ−６Ｒを発現し
ていないため、ＩＬ−６Ｒの活性測定に用いられる（Ｍ
ａｃｋｉｅｗｉｃｚら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４
９巻、ｐ２０２１，１９９２年参照）。
ＩＬ−６を発現するが、細胞膜上にＩＬ−６Ｒを発現し
ていないため、ＩＬ−６Ｒの活性測定に用いられる（Ｍ
ａｃｋｉｅｗｉｃｚら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４
９巻、ｐ２０２１，１９９２年参照）。
【００４２】非刺激のＨｅｐＧ２−ＩＬ−６細胞（対
照）、形質転換株ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｈの培養上清１５μ
ｌで刺激したＨｅｐＧ２−ＩＬ−６細胞、あるいは形質
転換株ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌの培養上清１５μｌで刺激
したＨｅｐＧ２−ＩＬ−６細胞由来のｍＲＮＡを、ハプ
トグロビンのｃＤＮＡをプロ−ブとし、ノ−ザンブロッ
ドを行った結果を図７左に示す。また、形質転換株ｓＩ
Ｌ−６Ｒ−ｓｐｌの培養上清を各種濃度のＩＬ−６Ｒ分
だけ加えて刺激したＨｅｐＧ２−ＩＬ−６細胞由来のｍ
ＲＮＡをハプトグロビンのｃＤＮＡをプローブとし、ノ
ーザンブロッドをおこなった結果を図７右に示す。
照）、形質転換株ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｈの培養上清１５μ
ｌで刺激したＨｅｐＧ２−ＩＬ−６細胞、あるいは形質
転換株ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌの培養上清１５μｌで刺激
したＨｅｐＧ２−ＩＬ−６細胞由来のｍＲＮＡを、ハプ
トグロビンのｃＤＮＡをプロ−ブとし、ノ−ザンブロッ
ドを行った結果を図７左に示す。また、形質転換株ｓＩ
Ｌ−６Ｒ−ｓｐｌの培養上清を各種濃度のＩＬ−６Ｒ分
だけ加えて刺激したＨｅｐＧ２−ＩＬ−６細胞由来のｍ
ＲＮＡをハプトグロビンのｃＤＮＡをプローブとし、ノ
ーザンブロッドをおこなった結果を図７右に示す。
【００４３】図７に示すように、形質転換株ｓＩＬ−６
Ｒ−ｓｈ及びｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌの培養上清中に含ま
れるＩＬ−６Ｒは、ＨｅｐＧ２−ＩＬ−６にハプトグロ
ビンの発現を誘導した。これは、これらのＩＬ−６Ｒ
は、ＩＬ−６と結合するとｇｐ１３０と会合することを
示す。また形質転換株ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌの培養上清
中のＩＬ−６Ｒは、濃度依存的にＨｅｐＧ２−ＩＬ−６
にハプトグロビンの発現を誘導した。
Ｒ−ｓｈ及びｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌの培養上清中に含ま
れるＩＬ−６Ｒは、ＨｅｐＧ２−ＩＬ−６にハプトグロ
ビンの発現を誘導した。これは、これらのＩＬ−６Ｒ
は、ＩＬ−６と結合するとｇｐ１３０と会合することを
示す。また形質転換株ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌの培養上清
中のＩＬ−６Ｒは、濃度依存的にＨｅｐＧ２−ＩＬ−６
にハプトグロビンの発現を誘導した。
【００４４】
【発明の効果】本発明で提供されるサイトカインレセプ
タ−領域の遺伝子工学的生産法、及び該蛋白質の分離回
収法により、自然状態では極めて微量にしか生産されな
いサイトカインレセプタ−と同等のサイトカインレセプ
タ−領域を大量に生産することが可能である。このこと
は、個体発生及び免疫機構の研究、さらにはそれらの成
果に基づく治療薬診断薬等の開発等に大きな意義を持
つ。また抗サイトカインレセプタ−領域抗体を作製する
ための免疫原、さらにはサイトカインレセプタ−領域の
免疫化学的測定法の標準物質として用いることもでき
る。
タ−領域の遺伝子工学的生産法、及び該蛋白質の分離回
収法により、自然状態では極めて微量にしか生産されな
いサイトカインレセプタ−と同等のサイトカインレセプ
タ−領域を大量に生産することが可能である。このこと
は、個体発生及び免疫機構の研究、さらにはそれらの成
果に基づく治療薬診断薬等の開発等に大きな意義を持
つ。また抗サイトカインレセプタ−領域抗体を作製する
ための免疫原、さらにはサイトカインレセプタ−領域の
免疫化学的測定法の標準物質として用いることもでき
る。
【図１】実施例１で作製したベクタ−ｐＰＩＣ９−ｓＩ
Ｌ−６Ｒ−ｓｈ及びｐＰＩＣ９−ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌ
の構造を示す図である。
Ｌ−６Ｒ−ｓｈ及びｐＰＩＣ９−ｓＩＬ−６Ｒ−ｓｐｌ
の構造を示す図である。
【図２】実施例３で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示
す図である。
す図である。
【図３】実施例３で固相化ＩＬ−６を用いて行ったＥＬ
ＩＳＡの結果を示す図である。
ＩＳＡの結果を示す図である。
【図４】実施例３でモノクローナル抗体ＭＴ１８を用い
て行ったＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
て行ったＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図５】実施例３でモノクローナル抗体ＰＭ１を用いて
行ったＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
行ったＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図６】実施例４において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を
銀染色したときの結果を示す図である。
銀染色したときの結果を示す図である。
【図７】実施例５のノーザンブロッドの結果を示す図で
ある。
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 ステファン ローゼ−ジョン ドイツ国マインツ，オーベレ ツアールバ ッヒャーシュトラッセ63，Ｄ−55101，ヨ ハネスグーテンベルグ−ウニバージテート マインツ エルステ メディチニッシェ クリニック内 (72)発明者 マルテ ペーターズ ドイツ国マインツ，オーベレ ツアールバ ッヒャーシュトラッセ63，Ｄ−55101，ヨ ハネスグーテンベルグ−ウニバージテート マインツ エルステ メディチニッシェ クリニック内 (72)発明者 ペトラ フォルマー ドイツ国マインツ，オーベレ ツアールバ ッヒャーシュトラッセ63，Ｄ−55101，ヨ ハネスグーテンベルグ−ウニバージテート マインツ エルステ メディチニッシェ クリニック内
Claims (9)
- 【請求項１】サイトカインレセプタ−領域をコ−ドする
遺伝子を含有する発現ベクタ−により形質転換された宿
種。 - 【請求項２】請求項１に記載の宿種を培養し、そして当
該培養物からサイトカインレセプタ−領域を採取するこ
とを特徴とするサイトカインレセプタ−領域の製造方
法。 - 【請求項３】請求項２に記載の方法により製造された組
換えサイトカインレセプタ−領域。 - 【請求項４】サイトカインレセプタ−領域をコ−ドする
遺伝子を含有する発現ベクタ−により形質転換されたピ
キア酵母。 - 【請求項５】請求項４に記載のピキア酵母を培養し、そ
して当該培養物からサイトカインレセプタ−領域を採取
することを特徴とするサイトカインレセプタ−領域の製
造方法。 - 【請求項６】請求項５に記載の方法により製造された組
換えサイトカインレセプタ−領域。 - 【請求項７】サイトカインレセプタ−領域がＩＬ−６レ
セプタ−のサイトカインレセプタ−領域である請求項４
に記載のピキア酵母。 - 【請求項８】サイトカインレセプタ−領域がＩＬ−６レ
セプタ−のサイトカインレセプタ−領域である請求項５
に記載の製造方法。 - 【請求項９】サイトカインレセプタ−領域がＩＬ−６レ
セプタ−のサイトカインレセプタ−領域である請求項６
に記載の組換えサイトカインレセプタ−領域。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7330106A JPH09163986A (ja) | 1995-12-19 | 1995-12-19 | サイトカインレセプタ−領域、その製法及びそれに使用する宿主 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7330106A JPH09163986A (ja) | 1995-12-19 | 1995-12-19 | サイトカインレセプタ−領域、その製法及びそれに使用する宿主 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09163986A true JPH09163986A (ja) | 1997-06-24 |
Family
ID=18228867
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7330106A Pending JPH09163986A (ja) | 1995-12-19 | 1995-12-19 | サイトカインレセプタ−領域、その製法及びそれに使用する宿主 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09163986A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001083536A1 (fr) * | 2000-04-27 | 2001-11-08 | Biowindow Gene Development Inc. Shanghai | Nouveau polypeptide, recepteur 15 du facteur cellulaire, et polynucleotide codant pour ce polypeptide |
-
1995
- 1995-12-19 JP JP7330106A patent/JPH09163986A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001083536A1 (fr) * | 2000-04-27 | 2001-11-08 | Biowindow Gene Development Inc. Shanghai | Nouveau polypeptide, recepteur 15 du facteur cellulaire, et polynucleotide codant pour ce polypeptide |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050426 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050627 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050802 |