JP2798674B2 - ヒトインターフェロンベータを生産する動物細胞の作成方法 - Google Patents
ヒトインターフェロンベータを生産する動物細胞の作成方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の概要〕 動物宿主細胞にてIFNベータを生産する方法を開示す
る。比較的高収量で細胞分泌物から単離されたIFNベー
タは約3.8×108IE/mg蛋白質の比活性を有する。生物学
的および免疫学的試験により、この単離されたIFNベー
タは天然IFNベータとほぼ完全に同一であることが示さ
れた。開示する方法で生産されたIFNベータは95％まで
配糖化されており、この配糖化は構造および配列の点で
天然IFNベータと実質的に一致し、なおその同一性が失
われることはない。
る。比較的高収量で細胞分泌物から単離されたIFNベー
タは約3.8×108IE/mg蛋白質の比活性を有する。生物学
的および免疫学的試験により、この単離されたIFNベー
タは天然IFNベータとほぼ完全に同一であることが示さ
れた。開示する方法で生産されたIFNベータは95％まで
配糖化されており、この配糖化は構造および配列の点で
天然IFNベータと実質的に一致し、なおその同一性が失
われることはない。
インターフェロンは有効な抗ウイルスポリプペチドの
一群を構成し、これは、外来誘導物質（例えばウイル
ス、核酸、特定の抗原）と接触した後の誘発細胞を培養
することにより生成する。小群の１つがベータインター
フェロン（IFNベータ）を構成するが、これは主として
繊維芽細胞を培養することにより生成する（ハーベル
（Havell）ら（1972）およびステワート（Stewart）II
（1979））。従来、２種のベータインターフェロンが知
られていたが、それぞれの免疫学的特徴は互いに類似
し、生成し得る単離されたモノクロナール、中和抗体は
両方のインターフェロンを共に不活性化する（チルベル
スタイン（Zilberstein）ら（1985））。しかしなが
ら、RANゲルブロットハイブリダイゼーション実験にお
いてIFNベータ1 cDNAプローブに対しIFNベータ2mRNAが
クロスハイブリダイズしたことは皆無であり、その逆も
皆無である（セーガル（Sehgal）ら（1980））。
一群を構成し、これは、外来誘導物質（例えばウイル
ス、核酸、特定の抗原）と接触した後の誘発細胞を培養
することにより生成する。小群の１つがベータインター
フェロン（IFNベータ）を構成するが、これは主として
繊維芽細胞を培養することにより生成する（ハーベル
（Havell）ら（1972）およびステワート（Stewart）II
（1979））。従来、２種のベータインターフェロンが知
られていたが、それぞれの免疫学的特徴は互いに類似
し、生成し得る単離されたモノクロナール、中和抗体は
両方のインターフェロンを共に不活性化する（チルベル
スタイン（Zilberstein）ら（1985））。しかしなが
ら、RANゲルブロットハイブリダイゼーション実験にお
いてIFNベータ1 cDNAプローブに対しIFNベータ2mRNAが
クロスハイブリダイズしたことは皆無であり、その逆も
皆無である（セーガル（Sehgal）ら（1980））。
以後IFNベータというヒト２倍体繊維芽細胞（FS−
４）に由来するIFNベータ１は、かなり長い間臨床的応
用に用いられた。これは1983年に連邦厚生局により重篤
で生命を脅かすウイルス感染の処置に対し調製が許可さ
れた。その有効性の理由および欠点に起因し、広範な他
の有効なウイルス抑制剤が多くの場合選択手段として示
された。
４）に由来するIFNベータ１は、かなり長い間臨床的応
用に用いられた。これは1983年に連邦厚生局により重篤
で生命を脅かすウイルス感染の処置に対し調製が許可さ
れた。その有効性の理由および欠点に起因し、広範な他
の有効なウイルス抑制剤が多くの場合選択手段として示
された。
しかしながら、通常の形質転換されていない２倍体繊
維芽細胞を基礎として生産を行うと、貴重で高価な原料
を使用するばかりでなくコストのかかる細胞基材の使用
が必要となると共に手順遂行の合理化が狭い範囲に止ま
り、臨床的に使用する薬剤の高価格を著しく限定する。
維芽細胞を基礎として生産を行うと、貴重で高価な原料
を使用するばかりでなくコストのかかる細胞基材の使用
が必要となると共に手順遂行の合理化が狭い範囲に止ま
り、臨床的に使用する薬剤の高価格を著しく限定する。
このような状況によりずっと早くから代替調製手段の
探索が行われ、一般に最新の遺伝子工学的手法の開発の
重要な刺激となった。異種宿主細胞系内にヒトIFNベー
タの遺伝子を導入することは、古典的な好適手段に対す
る１つの真の代替手段を示唆し、生理学的バリヤを越え
た狭い境界領域へ至る成功への道程を照らすものであ
る。
探索が行われ、一般に最新の遺伝子工学的手法の開発の
重要な刺激となった。異種宿主細胞系内にヒトIFNベー
タの遺伝子を導入することは、古典的な好適手段に対す
る１つの真の代替手段を示唆し、生理学的バリヤを越え
た狭い境界領域へ至る成功への道程を照らすものであ
る。
宿主細胞系、原核生物、下等および高等真核生物につ
き処理に対し原則的に存在する３群では、技術水準に基
けば、細菌の宿主系である大腸菌（イー・コリ）は一般
に低い生産コストの点で、一義的に利点を与え得る。
き処理に対し原則的に存在する３群では、技術水準に基
けば、細菌の宿主系である大腸菌（イー・コリ）は一般
に低い生産コストの点で、一義的に利点を与え得る。
期待は高いにも拘らず、技術的観点から見ればこれら
の生産系においてはこの方法論による多量の原体IFNベ
ータ生産には成功していないに止まる（タニグチ（Tani
guchi）ら（1980）およビゴーデル（Goeddel）（198
0））。この困難性の主要な原因は、宿主細胞内で変性
型の原体材料が合胞体として存在する点にある。実際、
増殖する宿主細胞の一部から有効に分離することは可能
であるが、種々の点（低い溶解性、処置による誤ったイ
オウ部分結合形成）に問題があり、臨床的に利用可能な
材料の収率は極めて低い。
の生産系においてはこの方法論による多量の原体IFNベ
ータ生産には成功していないに止まる（タニグチ（Tani
guchi）ら（1980）およビゴーデル（Goeddel）（198
0））。この困難性の主要な原因は、宿主細胞内で変性
型の原体材料が合胞体として存在する点にある。実際、
増殖する宿主細胞の一部から有効に分離することは可能
であるが、種々の点（低い溶解性、処置による誤ったイ
オウ部分結合形成）に問題があり、臨床的に利用可能な
材料の収率は極めて低い。
有効性に部分的欠点があるのは、変性または正しく構
成されない内部イオウ結合部分によると推定され（ロー
ン（Lawn）ら（1981））、天然に認められる形態と対比
する生産物が配糖化されていないことに起因する。
成されない内部イオウ結合部分によると推定され（ロー
ン（Lawn）ら（1981））、天然に認められる形態と対比
する生産物が配糖化されていないことに起因する。
このような背景の結果、真核生物の発現系の開発を現
実のものとし、これにより異種遺伝子産物の複合構造が
正確な「プロセシング」を経て標準的に広く認められた
形態として生産されることを可能にする必要性が増大す
る。現在、この技術の系は一連の著者により白熱して著
述されているところである（レエス（Reyes）ら（198
2）、ミトラニ−ロゼンバウム（Mitrani−Rosenbaum）
ら（1983）、スミス（Smith）ら（1983）、マコーミッ
ク（McCormick）ら（1984）、チェルナヨフスキイ（Che
rnajovsky）ら（1984）、フクナガ（Fukunaga）ら（198
4）、パージ（Page）ら（1985））。
実のものとし、これにより異種遺伝子産物の複合構造が
正確な「プロセシング」を経て標準的に広く認められた
形態として生産されることを可能にする必要性が増大す
る。現在、この技術の系は一連の著者により白熱して著
述されているところである（レエス（Reyes）ら（198
2）、ミトラニ−ロゼンバウム（Mitrani−Rosenbaum）
ら（1983）、スミス（Smith）ら（1983）、マコーミッ
ク（McCormick）ら（1984）、チェルナヨフスキイ（Che
rnajovsky）ら（1984）、フクナガ（Fukunaga）ら（198
4）、パージ（Page）ら（1985））。
構成原理 以下に遺伝子工学的技術を応用した新規な細胞ライン
BICの構成を記載する。従来技術と比較すると、実質的
に天然物質と同定された未変性産物を大量かつ実質的に
低コストで生産することができる。
BICの構成を記載する。従来技術と比較すると、実質的
に天然物質と同定された未変性産物を大量かつ実質的に
低コストで生産することができる。
宿主細胞ライン 宿主細胞として、ウルラウブ（Urlaub）ら（1980）に
記載された完全CHOライン（チャイニーズハムスタ卵）
のDHFR-変異株を選ぶ。
記載された完全CHOライン（チャイニーズハムスタ卵）
のDHFR-変異株を選ぶ。
ベクタ インターフェロン遺伝子 出発材料としてプラスミドベクタpBR13を用い、これ
にゲノミックIFNベータ遺伝子を含有せしめる。このゲ
ノミックDNAの特定の断片をマニアティス（Maniatis）
ら（1982）に記載された方法により切断調製し、既に公
知のベクタ（pSVd2−３）と組換える。
にゲノミックIFNベータ遺伝子を含有せしめる。このゲ
ノミックDNAの特定の断片をマニアティス（Maniatis）
ら（1982）に記載された方法により切断調製し、既に公
知のベクタ（pSVd2−３）と組換える。
プロモータ 一般に重要な点は、発現を制御する適切なプロモータ
を選択することである。誘導的プロモータを配置する際
の可能性（ハウザ（Hauser）ら（1982）および）ブリン
スタ（Brinster）ら（1982）に対し、モスタフ（Mostha
f）ら（1985）に記載されたSV40の強力な構成的プロモ
ータには利点があり、これはさらにエンハンサ領域を含
む。可能性と並んで誘導依存性の生産方法を用いる特に
不利な経験（ネガティブフィードバック、細胞毒性）が
一方であり、他方では完全な発酵方法でも細胞培養の付
着は避けられず、このような結論となる。詳細に記載し
た構成の下で、これを一般にpSVIFNAsnと命名する。
を選択することである。誘導的プロモータを配置する際
の可能性（ハウザ（Hauser）ら（1982）および）ブリン
スタ（Brinster）ら（1982）に対し、モスタフ（Mostha
f）ら（1985）に記載されたSV40の強力な構成的プロモ
ータには利点があり、これはさらにエンハンサ領域を含
む。可能性と並んで誘導依存性の生産方法を用いる特に
不利な経験（ネガティブフィードバック、細胞毒性）が
一方であり、他方では完全な発酵方法でも細胞培養の付
着は避けられず、このような結論となる。詳細に記載し
た構成の下で、これを一般にpSVIFNAsnと命名する。
選択 選択および増幅を遂行するに際し、高発現細胞を用い
DHFR遺伝子を別に第２のプラスミドpAdD26SV（Ａ）−３
に導入する。独特なアデノプロモータとSV40プロモータ
のエンハンサ領域（S.O.）との相互作用を介してIFNベ
ータ発現の選択が最終的に可能となる。予期した通り前
記した構成で、共感染DNAが近接して組込まれる。
DHFR遺伝子を別に第２のプラスミドpAdD26SV（Ａ）−３
に導入する。独特なアデノプロモータとSV40プロモータ
のエンハンサ領域（S.O.）との相互作用を介してIFNベ
ータ発現の選択が最終的に可能となる。予期した通り前
記した構成で、共感染DNAが近接して組込まれる。
感染 前記発現ベクタ、制御配列並びに構造遺伝子を含み細
胞ラインの欠損を回復する選択プラスミドをリン酸カル
シウム沈殿法により実験的に決定した所定の至適混合比
で相互感染させる。
胞ラインの欠損を回復する選択プラスミドをリン酸カル
シウム沈殿法により実験的に決定した所定の至適混合比
で相互感染させる。
増幅、クローン化並びにセルバンク 感染付着したものからインターフェロンを発現するク
ローンを、カウフマン（Kaufman）ら（1985）により最
初に記載された方法をメソトレザット（Methotrexat）
濃度を越える程度で高生産コロニの二段選別を行わずに
用いて増幅させ、連結クローン化すると共に一連の過程
において十分な細胞数を確保し、上記の方法により液体
窒素中のスタムセルバンクとして保存する。
ローンを、カウフマン（Kaufman）ら（1985）により最
初に記載された方法をメソトレザット（Methotrexat）
濃度を越える程度で高生産コロニの二段選別を行わずに
用いて増幅させ、連結クローン化すると共に一連の過程
において十分な細胞数を確保し、上記の方法により液体
窒素中のスタムセルバンクとして保存する。
結果 原体生産 記載する方法により得られる実験記号BIC8622（BIC,P
HLS受領No.87040301）の細胞ラインを操作の後に分離
し、この際、マルチトレイ（NUNC）中の定常培養で１〜
５％NCS bzw.FCSを補償した通常の細胞培養培地（イー
レの塩を用いて改変したイーグルのMEM）を用いる。マ
イクロ支持台上のフェルメンタ（シドデックスIII,ファ
ルマシア）で、１リットルの培養物当り１日につき0.4
〜1.6×109の国際単位のIFNベータが構成的に生産され
る。
HLS受領No.87040301）の細胞ラインを操作の後に分離
し、この際、マルチトレイ（NUNC）中の定常培養で１〜
５％NCS bzw.FCSを補償した通常の細胞培養培地（イー
レの塩を用いて改変したイーグルのMEM）を用いる。マ
イクロ支持台上のフェルメンタ（シドデックスIII,ファ
ルマシア）で、１リットルの培養物当り１日につき0.4
〜1.6×109の国際単位のIFNベータが構成的に生産され
る。
濃縮 スルホプロピル陽イオン交換体への吸着およびそれに
続く抗IFNベータセファロース（セルテック，スロー）
への免疫吸着の結果濃縮が起こる。これらの免疫吸着マ
トリックスは未変性繊維芽得細胞インターフェロンに対
するモノクローナル抗体を含有し、製造元による免疫結
合反応の至適条件下における吸着および脱着は合成分子
の同一性により一方向であり、同等の抗体を擁して行う
ELISAを併用して定量化し得る。さらに洗浄工程を行いF
PLC−ゲルろ過をもって終了すれば低分子量および高分
子量の不純物が除去される。
続く抗IFNベータセファロース（セルテック，スロー）
への免疫吸着の結果濃縮が起こる。これらの免疫吸着マ
トリックスは未変性繊維芽得細胞インターフェロンに対
するモノクローナル抗体を含有し、製造元による免疫結
合反応の至適条件下における吸着および脱着は合成分子
の同一性により一方向であり、同等の抗体を擁して行う
ELISAを併用して定量化し得る。さらに洗浄工程を行いF
PLC−ゲルろ過をもって終了すれば低分子量および高分
子量の不純物が除去される。
特徴 生物学的効果： FS−４細胞由来の天然型IFNベータの検出を行うバイ
オアッセイは、抗ウイルス活性を利用し、指示細胞（FS
−４）を用いムリネム・エンセファロミオカルディティ
ス・ウイルス（EMcV）に対する細胞病原性効果の阻害を
定量化するもので、ハーベル（Havell）ら（1972）の改
変であり、BIC細胞由来のIFNベータを検定するに際し何
ら制限なく使用し得る。この試験とローリ（Lowry）ら
（1951）の蛋白質定量法とを用いて測定した比活性は、
FS−４インターフェロンについての測定データと正確性
の制限において２〜３×108IEをもって対応する。
オアッセイは、抗ウイルス活性を利用し、指示細胞（FS
−４）を用いムリネム・エンセファロミオカルディティ
ス・ウイルス（EMcV）に対する細胞病原性効果の阻害を
定量化するもので、ハーベル（Havell）ら（1972）の改
変であり、BIC細胞由来のIFNベータを検定するに際し何
ら制限なく使用し得る。この試験とローリ（Lowry）ら
（1951）の蛋白質定量法とを用いて測定した比活性は、
FS−４インターフェロンについての測定データと正確性
の制限において２〜３×108IEをもって対応する。
免疫学的特徴： BIC由来のIFNベータを濃縮する免疫アフィニティクロ
マトグラフと並んで、新しく開発されたELISAおよび免
疫ブロット技術を補助的に用いて天然型および組換えIF
Nベータの分子的特性の広範な相関の検定を行う。抗体
を用いるに際し、マウスハイブリドーマ（MAK BO−2,セ
ルテック）由来のモノクローナルおよびヤギのポリクロ
ーナルIgG（レガ・インスティテュート，ロイベン）が
肝要である。
マトグラフと並んで、新しく開発されたELISAおよび免
疫ブロット技術を補助的に用いて天然型および組換えIF
Nベータの分子的特性の広範な相関の検定を行う。抗体
を用いるに際し、マウスハイブリドーマ（MAK BO−2,セ
ルテック）由来のモノクローナルおよびヤギのポリクロ
ーナルIgG（レガ・インスティテュート，ロイベン）が
肝要である。
蛋白質化学的特徴： アミノ酸分析およびＮ末端の15のアミノ酸配列決定に
より免疫学的手法で測定したデータを補完する。これに
よりクナイト（Knight）ら（1980）の天然型と組換えIF
Nベータとの間には全く相違はないことが示される。組
換えIFNベータについて炭水化物部分を調べることによ
り、天然型IFNベータが炭水化物の不均質性を示すのに
対し、極めて均質に配糖化されていることが示される。
より免疫学的手法で測定したデータを補完する。これに
よりクナイト（Knight）ら（1980）の天然型と組換えIF
Nベータとの間には全く相違はないことが示される。組
換えIFNベータについて炭水化物部分を調べることによ
り、天然型IFNベータが炭水化物の不均質性を示すのに
対し、極めて均質に配糖化されていることが示される。
材料： イー・コリK12 DH1（DSM4079）CHO DUK DHFR- BF（PH
LS No.87041401）これらのセルラインは、ラインCHO−K
1（ATCCCL61）よりジヒドロ葉酸レダクターゼ非存在下
で変異および選抜を経て誘導されたものである（ウルラ
ウブ（Urlaub）ら（1980））。
LS No.87041401）これらのセルラインは、ラインCHO−K
1（ATCCCL61）よりジヒドロ葉酸レダクターゼ非存在下
で変異および選抜を経て誘導されたものである（ウルラ
ウブ（Urlaub）ら（1980））。
pBR13（DSM4074）： このプラスミドはボリバ（Bolivar）ら（1977）のク
ローン化プラスミドpBR325の誘導体である点で肝要であ
り、この唯一のEcoRI切断部位に1.83kbの長さのDNA断片
が挿入される。この断片はコスミドpCosIFNベータ中に
含まれ（グロス（Gross）ら、1981）、少なくともヒト
胎盤DNAのコスミドバンクの一部である。
ローン化プラスミドpBR325の誘導体である点で肝要であ
り、この唯一のEcoRI切断部位に1.83kbの長さのDNA断片
が挿入される。この断片はコスミドpCosIFNベータ中に
含まれ（グロス（Gross）ら、1981）、少なくともヒト
胎盤DNAのコスミドバンクの一部である。
pSVd2−３（DSM4075P）： このプラスミドはクローン化ベクタpAT153の誘導体で
あり、真核DNAウイルスSV40由来の配列（フィールス（F
iers）ら（1978））を含む。対応するベクタープラスミ
ドを構成する特定のプラスミドは、マウスのジヒドロ葉
酸レダクターゼの発現について構成したものである（ス
ブラマニ（Subramani）ら（1981））。発現ベクタpSVに
つき用いた改変は、ヘルン・ディ・フイレブロエク博士
によってなされ、必須であるとしてフランセン（Franse
n）ら（1985）の研究において記載されたものである。
あり、真核DNAウイルスSV40由来の配列（フィールス（F
iers）ら（1978））を含む。対応するベクタープラスミ
ドを構成する特定のプラスミドは、マウスのジヒドロ葉
酸レダクターゼの発現について構成したものである（ス
ブラマニ（Subramani）ら（1981））。発現ベクタpSVに
つき用いた改変は、ヘルン・ディ・フイレブロエク博士
によってなされ、必須であるとしてフランセン（Franse
n）ら（1985）の研究において記載されたものである。
pAdD26SV（Ａ）−３（DSM4076P）： クローン化ベクタpBR322由来で1.1kbの長さのDNA断片
を欠損させて作成されたプラスミド誘導体である（ルス
キ（Lusky）ら（1981））。さらに、このプラスミドに
はマウス由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子のcDNA
のみならず真核DNAウイルスアデノ２由来の翻訳開始シ
グナル（アデノウイルス主要後期プロモータ）も含まれ
ている。ポリアデニル化シグナルおよびSV40由来の転写
開始部を伴う200bpの長さの断片である（カウフマン（K
aufman）ら、1982a）。
を欠損させて作成されたプラスミド誘導体である（ルス
キ（Lusky）ら（1981））。さらに、このプラスミドに
はマウス由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子のcDNA
のみならず真核DNAウイルスアデノ２由来の翻訳開始シ
グナル（アデノウイルス主要後期プロモータ）も含まれ
ている。ポリアデニル化シグナルおよびSV40由来の転写
開始部を伴う200bpの長さの断片である（カウフマン（K
aufman）ら、1982a）。
発現系 使用した発現系は矮形チャイニーズハムスタ（CHO,AT
CC CCL61 CHO−K1）の保存株細胞由来のセルラインによ
るものであり、変異により酵素ジヒドロ葉酸脱水酵素を
欠損するものとして作成された（ウルラウブ（Urlaub）
ら（1980））。インキュベートの過程でDNAとこの細胞
とによりリン酸カルシウム沈澱が生成し得、極めて低頻
度であるが細胞内へのDNAの導入が起こる（グラハム（G
raham）ら（1973））。細胞内で開裂したDNAは大部分が
連結され、係属する細胞に組込まれる。そこでそれは、
細胞のDNA複製過程で、または細胞染色体における組換
え過程で特異的に増加または変化し、細胞遺伝子の組込
み天然型構成成分を包含する。特定の場合、ヒトIFNベ
ータ遺伝子を発現させる発現プラスミドは、またCHO細
胞内でマウス由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子cD
NAを発現させるプラスミドを併用して用いるに際し開裂
される。発原プラスミドの状態はいわゆるサザンブロッ
ト技術を用いて検出する。細胞DNAを制限エンドヌクレ
アーゼを用いて切断し、電界中でアガロースゲル電気泳
動を行う。DNA切断生成物は、その後ナイロンフィルタ
膜に結合させ、DNA−DNAハイブリダイゼーションにより
放射能活性マーカプラスミドDNAを用いて検出する。
CC CCL61 CHO−K1）の保存株細胞由来のセルラインによ
るものであり、変異により酵素ジヒドロ葉酸脱水酵素を
欠損するものとして作成された（ウルラウブ（Urlaub）
ら（1980））。インキュベートの過程でDNAとこの細胞
とによりリン酸カルシウム沈澱が生成し得、極めて低頻
度であるが細胞内へのDNAの導入が起こる（グラハム（G
raham）ら（1973））。細胞内で開裂したDNAは大部分が
連結され、係属する細胞に組込まれる。そこでそれは、
細胞のDNA複製過程で、または細胞染色体における組換
え過程で特異的に増加または変化し、細胞遺伝子の組込
み天然型構成成分を包含する。特定の場合、ヒトIFNベ
ータ遺伝子を発現させる発現プラスミドは、またCHO細
胞内でマウス由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子cD
NAを発現させるプラスミドを併用して用いるに際し開裂
される。発原プラスミドの状態はいわゆるサザンブロッ
ト技術を用いて検出する。細胞DNAを制限エンドヌクレ
アーゼを用いて切断し、電界中でアガロースゲル電気泳
動を行う。DNA切断生成物は、その後ナイロンフィルタ
膜に結合させ、DNA−DNAハイブリダイゼーションにより
放射能活性マーカプラスミドDNAを用いて検出する。
インターフェロンベータ遺伝子の単離 DNA制限断片を単離する出発プラスミドとしてIFNベー
タ遺伝子と共にプラスミドpBR13を用いた。このプラス
ミドを調製するに際し、まずFS4繊維芽細胞由来のIFNベ
ータをコードするmRNAをcDNA中で交叉させ、ハイブリダ
イゼーションにより相補的染色体DNAを用いてIFNベータ
遺伝子を含むコスミドpCOSIFNベータを遺伝子バンク
（ヒト胎盤）から単離した。次にプラスミドpBR13を制
限エンドヌクレアーゼEcoRIで切断するに際し、pCosIFN
ベータ由来のIFNベータ遺伝子を用いて断片を処理し、
続いて広範な制限酵素Hind II,bzw.Nco I並びにHind II
Iを用いIFNベータ遺伝子を備える短いDNA小片を単離し
て得た。
タ遺伝子と共にプラスミドpBR13を用いた。このプラス
ミドを調製するに際し、まずFS4繊維芽細胞由来のIFNベ
ータをコードするmRNAをcDNA中で交叉させ、ハイブリダ
イゼーションにより相補的染色体DNAを用いてIFNベータ
遺伝子を含むコスミドpCOSIFNベータを遺伝子バンク
（ヒト胎盤）から単離した。次にプラスミドpBR13を制
限エンドヌクレアーゼEcoRIで切断するに際し、pCosIFN
ベータ由来のIFNベータ遺伝子を用いて断片を処理し、
続いて広範な制限酵素Hind II,bzw.Nco I並びにHind II
Iを用いIFNベータ遺伝子を備える短いDNA小片を単離し
て得た。
発現プラスミドの構成 ヒトIFNベータを発現させるプラスミドを構成するた
めpSVd2−３と呼ばれる発現ベクタを用いた。このベク
タの機能的構成部分がイー・コリ内での自動的DNA複製
を保証するのみならず、イー・コリ細胞のアンピシリン
培地での選択を可能にする（転移陰性プラスミドpAT153
およびβ−ラクタマーゼ遺伝子の複製の開始）。真核細
胞を特定する機能についての構成部分はウイルスSV40の
初期遺伝子のプロモータ−エンハンサ領域から付加遺伝
子の転写開始部まで存在し、さらにSV40ウイルスがポリ
Ａ配列を転写mRANに付加するポリアデニル化シグナル部
分は挿入遺伝子を欠落しこの種のシグナル配列は存在す
べきでない。翻訳開始のシグナルとポリアデニル化配列
との間にさらに合成的に生成せしめた制限エンドヌクレ
アーゼ認識および切断配列を存在させて発現すべきDNA
を挿入した。ヌクレアーゼXba Iの切断部位をこのベク
タ内にヒトイIFNベータDNAをクローン化すべく設けた。
よってベクタをXba Iで切断する。次にプラスミドpBR13
からIFNベータ遺伝子を有するEcoRI断片を、およびさら
にこれからIFNベータ遺伝子を有するNco I−Hind III小
断片を単離する。制限エンドヌクレアーゼを用いる切断
により得られた突出する一本鎖DNA末端部をヌクレオチ
ド三リン酸およびイー・コリ由来のDNAポリメラーゼと
インキュベータすることにより埋めた。このように作成
した段片のDNA平滑末端を次に制限エンドヌクレアーゼX
ba Iの認識配列を有する合成的に調製したオリゴヌクレ
オチドと連結したヌクレアーゼXba Iとのインキュベー
トにより過剰のオリゴヌクレオチドを除去し、同時にベ
クタDNAに相補的な突出する一本鎖部分を生成せしめ
た。ベクタDNAとIFNベータDNAとを酵素的に連結しイー
・コリ細胞に導入した。IFNベータDNAを有する細胞をDN
A−DNAハイブリダイゼーションにより同定し精製を行う
べく多量のプラスミドDNAを調製した。種々の制限エン
ドヌクレアーゼを用いる切断によりこのプラスミドDNA
の特徴を調べ、さらなる実験に備えてプラスミドを選択
し、pSV IFN Nco（DSM4077P）と命名したものが予定し
たものと一致した。次いでこのプラスミドpSV IFN Nco
を酵素Xba Iで部分的に切断し、切断断片をゲル電気泳
動により分離した。線状プラスミドに対応するバンド
を、蛍光色素エチジウムブロミドを用いる染色の後にUV
ライトの下で目視可能にして切り出しDNAを単離した。
単離したDNAをヌクレアーゼAsu IIと共にインキュベー
トした後酵素的に閉環した。このような手順により、も
との発現プラスミドpSV IFN NcoからXba I−Asu II断片
が欠落したものが結果的に得られた。このように調製し
た発現プラスミドをpSV IFN Asn（DSM4078P）と命名
し、ジヒドロ葉酸レダクターゼを欠損するCHOセルライ
ンの細胞に挿入感染させるべく、これにこの発現プラス
ミドpSV IFN Asuを用いて感染させそのDNAを細胞ゲノム
に組込ませ、mRNA形成を図るが、これはSV40の特定配列
由来の60ヌクレオチド長い断片であり、このように連結
してほぼ標準的なIFNベータmRNAを実現した。このmRNA
を細胞の蛋白質合成装置でIFNベータ蛋白質に翻訳す
る。そのアミノ末端領域およびアミノ酸組成はヒト繊維
芽細胞由来の天然型IFNベータ蛋白質と一致しイー・コ
リが生産した蛋白質とは異なり配糖化されている。
めpSVd2−３と呼ばれる発現ベクタを用いた。このベク
タの機能的構成部分がイー・コリ内での自動的DNA複製
を保証するのみならず、イー・コリ細胞のアンピシリン
培地での選択を可能にする（転移陰性プラスミドpAT153
およびβ−ラクタマーゼ遺伝子の複製の開始）。真核細
胞を特定する機能についての構成部分はウイルスSV40の
初期遺伝子のプロモータ−エンハンサ領域から付加遺伝
子の転写開始部まで存在し、さらにSV40ウイルスがポリ
Ａ配列を転写mRANに付加するポリアデニル化シグナル部
分は挿入遺伝子を欠落しこの種のシグナル配列は存在す
べきでない。翻訳開始のシグナルとポリアデニル化配列
との間にさらに合成的に生成せしめた制限エンドヌクレ
アーゼ認識および切断配列を存在させて発現すべきDNA
を挿入した。ヌクレアーゼXba Iの切断部位をこのベク
タ内にヒトイIFNベータDNAをクローン化すべく設けた。
よってベクタをXba Iで切断する。次にプラスミドpBR13
からIFNベータ遺伝子を有するEcoRI断片を、およびさら
にこれからIFNベータ遺伝子を有するNco I−Hind III小
断片を単離する。制限エンドヌクレアーゼを用いる切断
により得られた突出する一本鎖DNA末端部をヌクレオチ
ド三リン酸およびイー・コリ由来のDNAポリメラーゼと
インキュベータすることにより埋めた。このように作成
した段片のDNA平滑末端を次に制限エンドヌクレアーゼX
ba Iの認識配列を有する合成的に調製したオリゴヌクレ
オチドと連結したヌクレアーゼXba Iとのインキュベー
トにより過剰のオリゴヌクレオチドを除去し、同時にベ
クタDNAに相補的な突出する一本鎖部分を生成せしめ
た。ベクタDNAとIFNベータDNAとを酵素的に連結しイー
・コリ細胞に導入した。IFNベータDNAを有する細胞をDN
A−DNAハイブリダイゼーションにより同定し精製を行う
べく多量のプラスミドDNAを調製した。種々の制限エン
ドヌクレアーゼを用いる切断によりこのプラスミドDNA
の特徴を調べ、さらなる実験に備えてプラスミドを選択
し、pSV IFN Nco（DSM4077P）と命名したものが予定し
たものと一致した。次いでこのプラスミドpSV IFN Nco
を酵素Xba Iで部分的に切断し、切断断片をゲル電気泳
動により分離した。線状プラスミドに対応するバンド
を、蛍光色素エチジウムブロミドを用いる染色の後にUV
ライトの下で目視可能にして切り出しDNAを単離した。
単離したDNAをヌクレアーゼAsu IIと共にインキュベー
トした後酵素的に閉環した。このような手順により、も
との発現プラスミドpSV IFN NcoからXba I−Asu II断片
が欠落したものが結果的に得られた。このように調製し
た発現プラスミドをpSV IFN Asn（DSM4078P）と命名
し、ジヒドロ葉酸レダクターゼを欠損するCHOセルライ
ンの細胞に挿入感染させるべく、これにこの発現プラス
ミドpSV IFN Asuを用いて感染させそのDNAを細胞ゲノム
に組込ませ、mRNA形成を図るが、これはSV40の特定配列
由来の60ヌクレオチド長い断片であり、このように連結
してほぼ標準的なIFNベータmRNAを実現した。このmRNA
を細胞の蛋白質合成装置でIFNベータ蛋白質に翻訳す
る。そのアミノ末端領域およびアミノ酸組成はヒト繊維
芽細胞由来の天然型IFNベータ蛋白質と一致しイー・コ
リが生産した蛋白質とは異なり配糖化されている。
DNA種の挿入により、また発現プラスミドpSV IFN Asu
構成手段によって、mRNAの一次構造が転化するが、これ
は真核生物細胞内でこのプラスミドが染色体に組込まれ
て形成される。相対的切断部位の詳細な表示と共に発現
プラスミドの構造を第２図に示す。遺伝子コードにより
ヌクレオチド配列を翻訳したアミノ酸並列は、ヒト細胞
由来の標準IFNベータ（タベルニル（Tavernier）ら（19
84））の一次構造を与える。
構成手段によって、mRNAの一次構造が転化するが、これ
は真核生物細胞内でこのプラスミドが染色体に組込まれ
て形成される。相対的切断部位の詳細な表示と共に発現
プラスミドの構造を第２図に示す。遺伝子コードにより
ヌクレオチド配列を翻訳したアミノ酸並列は、ヒト細胞
由来の標準IFNベータ（タベルニル（Tavernier）ら（19
84））の一次構造を与える。
感染 発現ベクタDNAのCHOセルラインへの導入は、主とし
て、グラハム（Graham）ら（1973）により記載されビグ
ラ（Wigrler）（1979）により改変された方法で行っ
た。原則的にこの方法で細胞DNAを処理し、CaPO4を用い
る手法により共沈澱を生成させた。その後ファゴサイト
シスによりこのDNAが導入され大部分が共に未解明の機
構で細胞のゲノムに組込まれると推定される。このプロ
セスはDNAの真核細胞に対する感染と呼ばれるものであ
る。酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼを発現させるベクタ
を特定の発現ベクタと共に通常に沈澱させ感染過程の後
にジヒドロ葉酸欠損CHO細胞を利用することによりこの
種の細胞を選択することができるが、これはDNAが導入
され染色体に組込まれているものである。これは、所定
の細胞培養培地で細胞を培養することにより生起し、核
酸合成酵素形成を低下させる。
て、グラハム（Graham）ら（1973）により記載されビグ
ラ（Wigrler）（1979）により改変された方法で行っ
た。原則的にこの方法で細胞DNAを処理し、CaPO4を用い
る手法により共沈澱を生成させた。その後ファゴサイト
シスによりこのDNAが導入され大部分が共に未解明の機
構で細胞のゲノムに組込まれると推定される。このプロ
セスはDNAの真核細胞に対する感染と呼ばれるものであ
る。酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼを発現させるベクタ
を特定の発現ベクタと共に通常に沈澱させ感染過程の後
にジヒドロ葉酸欠損CHO細胞を利用することによりこの
種の細胞を選択することができるが、これはDNAが導入
され染色体に組込まれているものである。これは、所定
の細胞培養培地で細胞を培養することにより生起し、核
酸合成酵素形成を低下させる。
増幅および選択 このように形質転換し選択した細胞の培養分泌物につ
いてベータインターフェロン活性を調べた。この試験で
陽性のクローンに所定の処理を施し、細胞内で導入した
DNAが選択的に増加すると共にインターフェロン遺伝子
のコピー数増加によりベータインターフェロン生産が増
加するとの結果を得た。これは基本的にはジーンドーセ
ジ効果の後に可能である。この目的のために適用する方
法は、酵素阻害剤（＋）アメトプリテンを含有する培養
培地でベータインターフェロンを生産する細胞の選択を
実現する。この阻害剤により、CHO細胞内に感染によっ
て遺伝子を導入した酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼ濃度
に依存して保持される。この阻害によるこの種の細胞は
優勢な増殖を示し、これにより対応するDNAの増加によ
るジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子のジーンドーセジが
起こる。ここでこの種のDNA複製過程では、最も大きな
断片が組込まれ細胞の染色体中で最も近接した感染DNA
種が組込まれるが、これと同時にベータインターフェロ
ン遺伝子のジーンドーセジが起こる。培養培地中の
（＋）アメトプテリン濃度の段階的増加および中間選択
並びに拡大過程により一定の細胞混合物が生成し、これ
により培養培地中に大量のベータインターフェロンが与
えられる。この混合物から培養器内での細胞の希釈接種
および単離により金属性シリンダ状の正常な細胞用ライ
ンを用いて細胞コロニを生産し、これによっても同様に
培養培地中に大量のベータインターフェロンが与えられ
る。
いてベータインターフェロン活性を調べた。この試験で
陽性のクローンに所定の処理を施し、細胞内で導入した
DNAが選択的に増加すると共にインターフェロン遺伝子
のコピー数増加によりベータインターフェロン生産が増
加するとの結果を得た。これは基本的にはジーンドーセ
ジ効果の後に可能である。この目的のために適用する方
法は、酵素阻害剤（＋）アメトプリテンを含有する培養
培地でベータインターフェロンを生産する細胞の選択を
実現する。この阻害剤により、CHO細胞内に感染によっ
て遺伝子を導入した酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼ濃度
に依存して保持される。この阻害によるこの種の細胞は
優勢な増殖を示し、これにより対応するDNAの増加によ
るジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子のジーンドーセジが
起こる。ここでこの種のDNA複製過程では、最も大きな
断片が組込まれ細胞の染色体中で最も近接した感染DNA
種が組込まれるが、これと同時にベータインターフェロ
ン遺伝子のジーンドーセジが起こる。培養培地中の
（＋）アメトプテリン濃度の段階的増加および中間選択
並びに拡大過程により一定の細胞混合物が生成し、これ
により培養培地中に大量のベータインターフェロンが与
えられる。この混合物から培養器内での細胞の希釈接種
および単離により金属性シリンダ状の正常な細胞用ライ
ンを用いて細胞コロニを生産し、これによっても同様に
培養培地中に大量のベータインターフェロンが与えられ
る。
これによる「BIC」細胞と命名したクローンとして適
切な方針に適合する生産細胞バンク（製造用細胞バン
ク）を確立し、この細胞の一部を「公共健康研究サービ
ス、動物細胞培養ヨーロッパコレクション（Public Hea
lth Laboratory Service,European Collection of Anim
al Cell Cultures（PHLC））」に受領No.87040301をも
って寄託した。
切な方針に適合する生産細胞バンク（製造用細胞バン
ク）を確立し、この細胞の一部を「公共健康研究サービ
ス、動物細胞培養ヨーロッパコレクション（Public Hea
lth Laboratory Service,European Collection of Anim
al Cell Cultures（PHLC））」に受領No.87040301をも
って寄託した。
濃縮 製造用細胞バンクに由来するBICの合一定常培養か
ら、24時間周期で15の培養分泌物を平均インターフェ
ロン含量で225000IE/ml蓄積するものとして繰り返し回
収し、陽イオン交換（スルホプロル）を併用して行っ
た。175mlの溶液に３×109IEが含有され、83％の収率が
得られた。続くBETA RESOLUTE（Ｒ）（セルテック）に
対する免疫吸着により溶出容積112mlが得られ、2.2×10
9IEのなお72％のインターフェロンが比活性3.8×108IE/
mg蛋白質を有するものとして含有されていた。最後のゲ
ルろ過により総収量48％を得た。
ら、24時間周期で15の培養分泌物を平均インターフェ
ロン含量で225000IE/ml蓄積するものとして繰り返し回
収し、陽イオン交換（スルホプロル）を併用して行っ
た。175mlの溶液に３×109IEが含有され、83％の収率が
得られた。続くBETA RESOLUTE（Ｒ）（セルテック）に
対する免疫吸着により溶出容積112mlが得られ、2.2×10
9IEのなお72％のインターフェロンが比活性3.8×108IE/
mg蛋白質を有するものとして含有されていた。最後のゲ
ルろ過により総収量48％を得た。
分析 生物学的および免疫学的特徴 組換えBICベータIFNおよび天然型FS4ベータIFNの高度
精製調製物を抗ウイルスバイオアッセイにおけるインタ
ーフェロン含量につき調べた。これに並行してローリに
よる蛋白質定量を行った。ミリグラム蛋白質当り天然型
材料について比活性約2.7〜３×108国際単位（IE）およ
び組換え材料について活性３〜４×108IE/mgが得られ
た。この値は、天然型インターフェロンについての文献
公知データと一致する。バイオアッセイは比較的不正確
であるため比活性の正確な測定は現在の技術の段階では
困難である。
精製調製物を抗ウイルスバイオアッセイにおけるインタ
ーフェロン含量につき調べた。これに並行してローリに
よる蛋白質定量を行った。ミリグラム蛋白質当り天然型
材料について比活性約2.7〜３×108国際単位（IE）およ
び組換え材料について活性３〜４×108IE/mgが得られ
た。この値は、天然型インターフェロンについての文献
公知データと一致する。バイオアッセイは比較的不正確
であるため比活性の正確な測定は現在の技術の段階では
困難である。
出発材料並びに精製および高度精製画分を用い酵素共
役免疫試験（ELISA）による抗ウイルスバイオアッセイ
を行った。
役免疫試験（ELISA）による抗ウイルスバイオアッセイ
を行った。
この試験に際しミクロタイタプレートのプラスチック
表面をヤギのポリクローナル抗IFNベータ抗体で処理し
た。続いて測定するサンプルの希釈を行った。ベータIF
Nは次いで固定化抗体に結合する。次の工程でこの複合
体をマウスのモノクローナル抗IFNベータ抗体の手法を
用いて反応させる。さらに生成する総合複合体を西洋ワ
サビペルオキシダーゼとあらかじめ共役させた抗マウス
IgG抗体と共にインキュベートする。未結合抗体を除去
した後、発色反応により結合したペルオキシダーゼの量
およびこれにより結合したベータIFNの量を測定する。
表面をヤギのポリクローナル抗IFNベータ抗体で処理し
た。続いて測定するサンプルの希釈を行った。ベータIF
Nは次いで固定化抗体に結合する。次の工程でこの複合
体をマウスのモノクローナル抗IFNベータ抗体の手法を
用いて反応させる。さらに生成する総合複合体を西洋ワ
サビペルオキシダーゼとあらかじめ共役させた抗マウス
IgG抗体と共にインキュベートする。未結合抗体を除去
した後、発色反応により結合したペルオキシダーゼの量
およびこれにより結合したベータIFNの量を測定する。
この試験によりFS4繊維芽細胞より得られた天然型ベ
ータIFNを評価した。これにより既知インターフェロン
含量の希釈系列サンプルを国際ベータIFN標準品（NIH,G
−023−902−527）の一部と共に調べた。バイオアッセ
イとELISAとの間には強い相関が認められた。
ータIFNを評価した。これにより既知インターフェロン
含量の希釈系列サンプルを国際ベータIFN標準品（NIH,G
−023−902−527）の一部と共に調べた。バイオアッセ
イとELISAとの間には強い相関が認められた。
BIC細胞の培養分泌物から得られ、濃縮されさらに高
度に濃縮されたIFN調製物についてのELISAでの値は、並
行して行った抗ウイルスバイオアッセイのものと同量と
して対応しつつ測定された。標準化するために全ての場
合につき国際標準品または検量した調製物の一部を用い
た。これにより天然型および組換えベータIFNの間のELI
SAに相関する抗原特性が同一であることも示し得る。
度に濃縮されたIFN調製物についてのELISAでの値は、並
行して行った抗ウイルスバイオアッセイのものと同量と
して対応しつつ測定された。標準化するために全ての場
合につき国際標準品または検量した調製物の一部を用い
た。これにより天然型および組換えベータIFNの間のELI
SAに相関する抗原特性が同一であることも示し得る。
配列／アミノ酸組成 前期した方法によって生産し精製したIFNベータを用
いそのアミノ酸組成およびそのアミノ末端配列について
解析した。
いそのアミノ酸組成およびそのアミノ末端配列について
解析した。
15番目までのアミノ酸の部分配列をエドマン分解によ
り自動気相列決定装置（エフエー・アプリード・ビオシ
ステム，タイプ470A）を用いて行った。これにより結果
的に得られるフェニルヒダントイン誘導体をPTH−C18−
マトリックス上で分離した後に検出する。結果は、ロー
ン（Lawn）ら（1981）、オーノ（Ohno）ら（1981）並び
にデリンク（Derynck）ら（1980）により公表されたデ
ータと一致した。アミノ酸組成の分析に際し、加水分解
後のPTHアミノ酸につき同じ分離手法を施すことにより
クニヒト（Knight）ら（1980）によるFS−４について測
定する値およびCHO由来のIFNベータについて確認し得
る。
り自動気相列決定装置（エフエー・アプリード・ビオシ
ステム，タイプ470A）を用いて行った。これにより結果
的に得られるフェニルヒダントイン誘導体をPTH−C18−
マトリックス上で分離した後に検出する。結果は、ロー
ン（Lawn）ら（1981）、オーノ（Ohno）ら（1981）並び
にデリンク（Derynck）ら（1980）により公表されたデ
ータと一致した。アミノ酸組成の分析に際し、加水分解
後のPTHアミノ酸につき同じ分離手法を施すことにより
クニヒト（Knight）ら（1980）によるFS−４について測
定する値およびCHO由来のIFNベータについて確認し得
る。
配糖化 脱配糖化またはツニカマイシンを用いる配糖化阻害に
より得られたポリペプチドは、同様にしてFS−４から得
られたIFNベータと同じく、変性および未変性条件下で
同一の電気泳動的特性を示す。グリコペプチダーゼ下に
より遊離したオリゴ糖を用いエクソグリコシダーゼによ
る段階的分解の後メチル化分析およびFABマススペクト
ロメトリを行った。これにより炭水化物側鎖の95±５％
が２本のアンテナ状複合体型であり、次に示す構造であ
ることが確認された。
より得られたポリペプチドは、同様にしてFS−４から得
られたIFNベータと同じく、変性および未変性条件下で
同一の電気泳動的特性を示す。グリコペプチダーゼ下に
より遊離したオリゴ糖を用いエクソグリコシダーゼによ
る段階的分解の後メチル化分析およびFABマススペクト
ロメトリを行った。これにより炭水化物側鎖の95±５％
が２本のアンテナ状複合体型であり、次に示す構造であ
ることが確認された。
なお、明細書中に記載した文献を整理すると次の通り
である。
である。
第１図はプラスミドベクタpBR13、IFNβ遺伝子並びにpB
R325の説明図、第２図は本発明による pSV tss- NcoIFNおよび pSV tss- AsuIFNの構成を示す説明図である。
R325の説明図、第２図は本発明による pSV tss- NcoIFNおよび pSV tss- AsuIFNの構成を示す説明図である。
フロントページの続き (72)発明者 ビーラント ボルフ ドイツ連邦共和国、7959 ブロンネン、 フェーレンベーク １番 (56)参考文献 ＤＮＡ，３（４） （1984），Ｐ. 297−308 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４ （１） （1984），Ｐ．166−172 Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，263 （1988），Ｐ．17508−17515 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/21 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (10)
- 【請求項１】図２に示す制限酵素地図を備える組換えDN
A分子pSVtss−AsuIFN（DSM4078P）。 - 【請求項２】特許請求の範囲第１項に記載の組換えDNA
分子をトランスフェクションすることにより得られる、
ヒトインターフェロン−β１を産生する組換え細胞ライ
ン。 - 【請求項３】特許請求の範囲第１項に記載の組換えDNA
分子と、ベクターpAdD26SV（Ａ）−３（DMS4076P）とを
トランスフェクションすることにより得られる、ヒトイ
ンターフェロン−β１を産生する組換え細胞ライン。 - 【請求項４】初期細胞ラインがCHO DHFR-細胞ラインで
ある、特許請求の範囲第２項または第３項記載の組換え
細胞ライン。 - 【請求項５】上記CHO DHFR-細胞ラインが、CHO−K1（AT
CC CCL 61）から誘導される細胞ラインである、特許請
求の範囲第４項記載の組換え細胞ライン。 - 【請求項６】特許請求の範囲第２項記載の組換え細胞ラ
インBIC8622（ECACC87040301）。 - 【請求項７】特許請求の範囲第２〜６項のいずれかに記
載の組換え細胞ラインを培養し、細胞分泌物からインタ
ーフェロン−β１を単離する、ヒトインターフェロン−
β１の構成的生産方法。 - 【請求項８】つぎの（ａ）〜（ｄ）の特徴を有するヒト
インターフェロン−β１。 （ａ）6NのHCl中、110℃で22時間加水分解した後の相対
アミノ酸組成（±10％）が、 （ｂ）Ｎ末端のアミノ酸部分配列が、 である （ｃ）炭水化物側鎖が、双頭アンテナ状複合体型に属
し、95±５％均質であり、つぎの配列および構造を有す
る （ｄ）組換え細胞ラインBIC8622（ECACC87040301）を培
養し、細胞分泌物から単離することにより得ることがで
きる - 【請求項９】特許請求の範囲第７項記載の方法により生
産されたヒトインターフェロン−β１、または、特許請
求の範囲第８項記載のヒトインターフェロン−β１を含
む医薬組成物。 - 【請求項１０】ウイルス感染症治療用の、特許請求の範
囲第９項記載の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3712564.8 | 1987-04-14 | ||
| DE19873712564 DE3712564A1 (de) | 1987-04-14 | 1987-04-14 | Verfahren zur konstruktion einer animalen zellinie fuer die herstellung von humanem interferon-beta |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63269987A JPS63269987A (ja) | 1988-11-08 |
| JP2798674B2 true JP2798674B2 (ja) | 1998-09-17 |
Family
ID=6325567
Family Applications (1)
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