JPH06510419A - インターフェロン−γに誘発されるモノカイン−ＭＩＧ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インターフェロン−γに誘発されるモノカインーＭＩＧ発明の分野 本発明は、サイトカインの分野に関する。さらに具体的には、血小板第４因子フ アミリーのメンバーであるサイトカインに関する。

背景技術 活性化マクロファージは抗原の産出、炎症性細胞の回復、細胞増殖の促進、さら に病原体および癌細胞の破壊などの広範囲に及ぶ活性を有する。サイトカインは 、マクロファージ活性化因子（Ａｄａｍｓ、　（１９８９）　Ｉｍｍｕｎｏｌ、 　Ｔｏｄａｙ　１０：３３−３５）及びマクロファージ活性媒介因子（Ｎａｔｈ ａｎ、　（１９８７）　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７９：３１９−３ ２６）としてマクロファージ生理機能において中心的な役割を果たしてＬＡる。

最もよく性質の知られているマクロファージ活性化サイトカインは、インターフ ェロン−γ（ＩＦＮ−γ）であり、これは、主要組織適合性抗原系クラス■抗原 の発現を誘発しくＲｏｓａ、ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　ＥＩＩＢＯ１，２： １５８５４５８９）　、マクロファーシカ（病原体および癌細胞を殺すのに重要 な活性酸素中間体を放出するのを触発しくＮａｔｈａｎ。

ｅｔ　ａｔ、　（１９８４）　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６０：６００−６ ０５）　、さらに、多面発現性マクロファージの生産物である腫瘍壊死因子（Ｔ ＮＦ）およびインターロイキン１（ＩＬ−１）の発現を促進することができる（ Ｃｏｌｌａｒｔ、　ｅｔ　ａＬ、　（１９８６）、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ。

１６４＋２１１３−２１１８）。

ＩＦＮ−γ（タイプＩＩＩＦＮ）、および、リボ多糖（ＬＰＳ）およびタイプ■ ＩＦＮ　（ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β）などの他のマクロファージ活性化因子 １よ遺伝子の発現を変化させることによって活性化する（Ｒｅｖｅｌ、　ｅｔ　 ａｌ、　（１９８６）　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、　１１：１ ６６−１７０；　Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）、　Ｊ 、　Ｉｍｍ浮獅盾戟A　１４０ ３６４０−３６４５）。これらの因子によって誘導される遺伝子の組は重なって ＬＸる力（、それぞれタイプＩｔ　Ｉ　Ｆ　Ｎ　（Ｌｕｓｔｅｒ、　ｅｔ　ａｌ 、、　（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ　３１５：６７２−６７６：　ＦａｎB ｅｔ　ａｔ、、　（１９８９）　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、　９：１９２ ２−１９２８）　、タイプＩ　Ｉ　Ｆ　Ｎ　（Ｒｅｖｅｌ、@ｅｔ ａｌ、上記）、またはＬ　Ｐ　Ｓ　（Ｔａｎｎｅｂａｕｍ、　ｅｔ　ａｌ、、上 記）によって選択的に活性イヒされる遺伝子は明らかにされている。ＩＦＮｓに 関しては、タイブエ及びタイプＩＩＩＦＮｓによって異なって制御される遺伝子 の分子メカニズムは明らかにされていない。

活性化マクロファージによって生産されるサイトカインには、ＴＮＦおよび■Ｌ −１のように詳細に研究されている媒介因子の他に、Ｉ　Ｐ−１０（Ｌｕｓｔｅ ｒ、　ｅｔａｌ、、　（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ　３１５：６７２−６７６） 、ＩＬ−８（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）。

Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６７：１８８３−１８９３）及びマクロファージ 炎症性タンパク質２（ＭＩＰ−２）　（Ｗｏｌｐｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９ ８９）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　８６：６ １２−１W９３） を含む血小板第４因子（ＰＦ−４）ファミリーのメンバーのような分泌性タンパ ク質が含まれる。ＩＬ−８およびＭＩＰ−２は共にヒト好中球の化学誘因物質で あることが示されており、ＩＬ−８は好中球の内皮細胞への付着を修飾すること が明らかにされている（Ｇｉｍｂｒｏｎｅ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　５ ｃｉｅｎｃｅ　２４６：１６０１−１６０３）。

活性化マクロファージの活性の媒介因子として機能する、まだ未発見のマクロフ ァージ生産物が存在することが予想される。活性化マクロファージがどのように してその作用を及ぼすのかを知ること、および、マクロファージ活性を媒介する 因子を同定・単離することは当該技術分野にとって必要である。

発明の概要 この発明の目的は、哺乳動物の新規なサイトカインを提供することである。

この発明の別の目的は、哺乳動物の新規なサイトカインをコードするｃＤＮＡ分 子を提供することである。

この発明のまた別の目的は、哺乳動物の新規なサイトカインをコードするｃＤＮ Ａ分子を有する宿主細胞を提供することである。

この発明のさらに別の目的は、哺乳動物の新規なサイトカインの製造方法を提供 することである。

この発明の目的は、哺乳動物の新規なサイトカインをコードするＤＮＡ分子にハ イブリダイズするヌクレオチドプローブを提供することである。

この発明のさらに別の目的は、哺乳動物の新規なサイトカインに特に免疫反応性 である抗体を提供することである。

この発明のまた別の目的は、哺乳動物の新規なサイトカインに特異的に結合する 受容体を提供することであり、サイトカインはこの受容体を通じて感受性細胞に 作用を及ぼす。

この発明のこれらの目的および別の目的は、下記に示す１つまたは複数の様態に よって提供される。この発明のある様態では、哺乳類のＭＩＧをコードするイン トロン非介在ＤＮＡ分子を提供し、これはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２または４に 示されている塩基配列を有する第２ＤＮＡ分子にハイブリダイズする。

この発明の発明の別の様態では、インターフェロン−γ誘導性の哺乳動物タンパ ク質を提供し、これはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２または４に示されている塩基配列 を有する第２ＤＮＡ分子にハイブリダイズするイントロン非介在ＤＮＡ分子によ ってコードされ、また、実質的に他の哺乳動物のタンパク質を含まない。

この発明のさらに別の発明では、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２または４に示されてい る塩基配列を有する第２ＤＮＡ分子にハイブリダイズする哺乳類のＭＩＧをコー ドするイントロン非介在ＤＮＡ分子を含む宿主細胞を提供する。

この発明のまた別の様態では、 ＳＥＱ　ＴＤ　ＮＯ：２または４に示されている塩基配列を有する第２ＤＮＡ分 子にハイブリダイズする哺乳類のＭＩＧをコードするイントロン非介在ＤＮＡ分 子を含む宿主細胞を準備し； インターフェロン−γ誘導性の哺乳動物タンパク質が培地中に分泌されるように 宿主細胞を栄養培地中で培養し：そして栄養培地からインターフェロン−γ誘導 性の哺乳動物タンパク質を回収する工程から成るインターフェロン−γ誘導性の 哺乳動物タンバグ質の製造方法が提供される。

この発明のさらにまた別の様態では、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２または４に示され ている塩基配列を有する第２ＤＮＡ分子にハイブリダイズする哺乳類のＭＩＧを コードするイントロン非介在ＤＮＡ分子にハイブリダイズするヌクレオチドプロ ーブを提供する。

この発明のさらに別の様態では、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１または３に示されてい る塩基配列から選択される配列を有する哺乳類のＭＩＧと免疫反応性の抗体を含 む組成物を提供する。

この発明のこれらの様態および他の様態は、下記にさらに詳細に記述されるが、 免疫学的刺激及び炎症性刺激に対する反応に関係する新規な分子を当該技術分野 に提供する。

図面の簡単な説明 図１は、ＲＡＷ２６４．７細胞系におけるＭＩＧ−１ｍＲＮＡのＲＮＡプロット 分析を示す。パネルＡ：コンカナパインＡ　（Ｃａｎ＾）刺激膵臓細胞由来のな らし培地で処理した細胞：３２Ｐ標識したｍｌ　１９　（ＭＩＧ−１）およびア ルドラーゼＡ　ｃＤＮＡからなるプローブ。パネルＢ：示したようにポリ多糖（ ＬＰＳ）、ＩＦＮ−α、−βおよび一部で処理した細胞ニブローブはパネルＡと 同じ。パネルＣ：ＩＦＮ−γ（１００ｕｎｉｔ／ｍｌ）に対する反応のタイムコ ース。

図２は、示したように刺激に対して反応した腹腔滲出細胞中でのＭＩＧ−１ｍＲ ＮＡの発現を明らかにしている。

図３は、マウスの細胞から単離されたＭＩＧ−１のＣＤＮＡ配列及び予想される アミノ酸配列を示す。

図４は、ＭＩＧ−１のアミノ酸配列を密接に関連した血小板因子４フアミリー（ ＰＦ４）のメンバーと比較している。

図５は、ヒトの細胞から単離されたＭＩＧ−２の部分ｃＤＮＡ配列及び予想され るアミノ酸配列を示す。

図６は、ヒトＭＩＧ−２のｃＤＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列と対応する マウスＭＩＧ−１の予想されたアミノ酸配列の比較を示す。ミスマツチは垂直線 及びＭＩＧ−１配列において小文字で示しである。

図７は、ＭＩＧ−２配列をプローブに用いた場合のヒトＲＮＡのノザンプロット を示す。ＲＮＡを調製する前に培地中にインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）お よびシクロへキシミド（ＣＨＸ）が存在したか否かを各レーンの上に示しである 。

図８は、ＭＩＧ−１およびＭＩＧ−２のｃＤＮＡプローブをプローブに用いたマ ウスゲノムＤＮＡのサザンプロットを示す。レーンの記号：　ＲＩ（ＥｃｏＲＩ ）、　ＲＶ（ＥｃｏＲＶ）、５ｔ（Ｓａｃｌ）、Ｂｌ（Ｂａｌｌ）、Ｍ（７−カ ー）果を示す。さらに、イヌのミクロソーム存在下での翻訳の結果も示す。レー ンの記号：ａ：アンチセンスＲＮＡ　；　ｓ　：センスＲＮＡ、および　ｍ：セ ンスＲＮＡおよびミクロソーム 図１０は、ＭＩＧ特異的な血清を得るための抗原として有用な、ＭＩＧ関連タン パク質の大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）中での製造を示す。

発明の詳細な説明 この発明において、インターフェロン−γで処理した哺乳動物の単球によって産 出される新規なサイトカイン類を発見した。これらのサイトカインは、インター フェロン−γに反応したマクロファージによって発揮される機能のうち少な（と も一部を媒介すると考えられる。よって、これらのサイトカインはインターフェ ロンの作用の少なくとも一部を模倣するのに用いることができると期待される。

人間の健康と病気に関連した過程においてマクロファージは幅広く関わっている ので、これらのサイトカインには治療上の価値が潜在する。

これらのサイトカインは２種類（ここではＭ　Ｉ　Ｇ　ｓ　（ｍｏｎｏｋｉｎｅ ｓ　ｐｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｇａｍｔｎａ　１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）と呼ぶ）が 同定され詳しく解析されている。１種類はマウス単球／マクロファージ細胞系に おいて同定され、ＭＩＧ−１と呼ばれており、もう一種類はヒト単球細胞系にお いて同定されＭＩＧ−２と呼ばれる。これらのタンパク質は双方ともサイトカイ ンの血小板第４因子フアミリーのメンバーで、このファミリーとおよそ１３−３ ５％の相同性を有する。ＭＩＧ−１とＭＩＧ−２は互いに約７０％の相同性を有 する。これらのサイトカインは互いにマウス：ヒトの相同遺伝子ではないと思わ れる。これらの伝達ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）の長さはそれぞれ約１．６ｋｂと約２ ．８ｋｂである。さらに、サザンプロット解析においてマウスのゲノムＤＮＡを ＭＩＧ−１及びＭＩＧ−２由来のプローブを用いてハイブリダイズさせると、２ つのプローブで異なるゲノム断片が検出される。

このことは、ＭＩＧ−２に対してＭＩＧ−１よりも高い相同性を示す未同定のマ ウス遺伝子の存在を示唆している。

ＳＥＱ　ｒＤＮｏ、１に示されているように、ＭＩＧ−１は１２６７ミ／酸残基 の配列からなる。予想されるシグナル配列とタンパク質の成熟した形の間はグＤ ＮＯ：２に示された配列を有するｃＤＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳産物をイヌの ミクロソームによって切断したものは、予想されるシグナルペプチド及び分泌さ れたタンパク質ＭＩＧ−１と一致する。ＭＩＧ−２は１２５アミノ酸残基からな る。

ミクロソームの非存在下、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで翻訳されたＭＩＧ−２の分子量は 、ＳＤＳゲルを用いた測定によると約１４から１８ｋＤで、これもイヌのミクロ ソーム系において切断されて１４．３ｋＤマーカータンパク賀と同程度の泳動度 を有する種類になる。

ＭＩＧタンパク質、塩基配列、プローブ及び抗体はインターフェロン−γのバイ オアッセイに用いることができる。例えば、未知量のインターフェロン−γを含 む試料中のインターフェロン−γの量を測定するために、試料の一部をマクロフ ァージまたは単球の細胞系に適用する。適用されたインターフェロン−γに反応 して生成された、ＭＩＧタンパク質またはＭＩＧ伝達ＲＮＡの量を測定すること ができる。定量化は、放射線免疫測定法、ノザンプロット、ウェスタンプロット 、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）などの当該技術分野において知られているいか なる方法を用いても行うことができる。適用されたインターフェロン−γに反応 して細胞で生成されたＭＩＧタンパク質またはｍＲＮＡは試料中のインターフェ ロン−γの量に相関する。

ＭＩＧタンパク質はまた、インターフェロン−γの活性の一部を模倣するのに用 いることができる。癌（Ｖｏｌｂｅｒｄｉｎｇ、　１９８５３ｅｍｉｎ、　０ｎ ｃｏ１．　ｖｏｌ、　１２．　（４５ｕｐｐｌ）ｐｐ、　２−６）および感染病 （ＪａｃｙｎａＳ１９９０．　Ｂｒ、　Ｍｅｄ、　Ｂｕｌｌ、　ｖｏｌ　４６． 　ｐｐ、３６８−３８２）に対するインターフェロンの治療上の使用は拡大し続 けているが、毒性があるためその治療上の実用性は制限されている（Ｓａｒｎａ 、　１９８７．　”Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ　ａｎｄ　１ｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ −２ａｓ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｆｏｒ　ａ＋ａｌｉｇｎａｎｃｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ 　ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｉｍａ＋ｕｎｏｄ■■奄モ奄■獅モ■ ｓｙｎｄｒｏｍｅ−、ｐｐ、　２６０−２６３．　ｉｎ　Ｆａｈｅｙ、　Ｊ、　 Ｌｏｍｏｄｅｒａｔｏｒ、　Ｉｍｍｕｎｅ　１ｎｔｅｒｖｅ獅狽奄盾獅刀@ｉｎ 　ｄ ｉｓｅａｓｅ、＾ｎｎ、　Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｍｅｄ、　１０６：２５６−２７４ ）　、　Ｍ　ＩＧを用いることによって、毒性を伴うことなくインターフェロン −γの治療上の恩恵を完成することができる。

この発明の哺乳動物のＭＩＧは、様々な種に由来することができる。ここでは、 ヒトおよびマウスのＭＩＧについて詳細に記載するが、他の動物に由来するもの も適用できる。例えば、ウシ、ヒツジ、ブタおよびラットのゲノムもすべてＭＩ Ｇ遺伝子を含んでいると期待されている。哺乳動物のＭＩＧは、ＭＩＧ−１およ びＭＩＧ−２と著しい相同性を有するタンパク質を含む。これは、ＭＩＧ　１ま たはＭＩＧ−２と少な（とも約７０％のアミノ酸相同性を有するタンパク質、望 ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸相同性を有するタンパク質を含む。ＭＩ Ｇ−１およびＭＩＧ−２に密接に関連したまた別のＭＩＧタンパク質がヒトやマ ウスから単離されるかもしれない。哺乳動物のＭＩＧタンパク質はインターフェ ロン−γに誘導されるであろう。

別のＭＩＧ遺伝子は、マウス（ｍａｒｉｎｓ）のＭＩＧ配列が単離された方法、 またはヒトのＭＩＧ配列が単離された方法によって単離することができる。これ らの方法については下記にさらに詳しく記載する。簡単には、マウスのＭＩＧ配 列はディファレンシャルハイブリダイゼーションを用いて単離された。２種類の プローブを準備した＝（１）マイトジェン刺激マウス膵臓細胞由来のリンフ才力 イン−リッチのならし培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｉｄｉｕｍ）で刺激し たマクロファージ細胞系から調製したｃＤＮＡ；および（２）リンフォカインー リンチのならし培地で処理を行っていないマクロファージ細胞系のコントロール 細胞から調製したｃＤＮＡ０刺激されたマクロファージ細胞から単離されたｍＲ ＮＡから一部のｃＤＮＡを得た：このｃＤＮＡの集団から単離されたＭＩＧｃＤ ＮＡは、第一プローブへのハイブリダイゼーションの優先性に基づいて選択され た。インターフェロン−γをリンフ才力イン−リッチのならし培地の代わりに用 いることもできる。刺激したヒトの単球からヒトＭＩＧｃＤＮＡ配列を単離し、 マウスＭＩＧｃＤＮＡ配列をプローブとして用いてスクリーニングした。これに ついては下記にさらに詳しく記載する。

この発明における”イントロン非介在ＤＮＡ分子”は、哺乳動物細胞から単離さ れたｍＲＮＡを逆転写酵素によって転写させたｃＤＮＡであってよい。または、 既に記載したようにｍＲＮＡを他の細胞内でクローン化ＤＮＡとして増幅させる ことによって得られたものでもよい。従って、イントロン非介在ＤＮＡはプラス ミドまたはファージの配列のような複製を促進する他の配列と共有結合している 。

この発明のイントロン非介在ＤＮＡ分子は哺乳動物ＭＩＧｓをコードし、配列が 特定された参照ＤＮＡ分子とハイブリダイズする。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２およ び４を御覧いただきたい。様々な条件下でハイブリダイゼーションを行う方法が 当該技術分野において知られている。相同性が異なる配列がハイブリダイズする ように条件を操作することも知られている。やや相同性の低い配列を有する分子 でもハイブリダイズする弱い条件も知られている。ハイブリダイズするのに高い 相同性を必要とする強い条件も知られている。本発明における強い条件とは、１ ０％以上異なる配列はハイブリダイズしないような条件である。このような条件 は密接に関連した配列を検出するのに有用である。より弱い条件下では、約３０ ％まで異なる配列でも検出できる。相同性を比較するのに重要な配列はコード配 列である。非コード領域の相同性は上に述べた値よりも低いけれども、ＭＩＧフ ァミリーのメンバーとしての各配列の関係には変わりがないということもある。

本発明におけるＭＩＧタンパク質は、他の哺乳動物のタンパク質を実質的に含ん でいない。これは、一般にタンパク質の調製品中で哺乳動物のタンパク質の少な くとも９５％そして望ましくは９８％がＭＩＧから成ることを意図している。

このレベルの純度は、哺乳動物のＭＩＧタンパク質を原核生物のような非哺乳動 物の細胞で発現させることによって容易に到達することができる。このような条 件下では、未精製のＭＩＧでも他の哺乳動物のタンパク質を実質的に含まない。

代わりに、ＭＩＧタンパク質を哺乳動物の細胞または組織で発現させた場合、哺 乳動物のＭＩＧと免疫反応性の抗体を使用し、免疫アフィニティークロマトグラ フィーまたは免疫沈降などの免疫学的技術を用いることによって容易に精製を行 うことができる。そのような抗体については、下記にさらに詳しく記載する。標 準的なタンパク質精製技術もまたＭＩＧタンパク質の精製に利用することができ る。

本発明における宿生細胞は、哺乳動物のＭＩＧタンパク質の全体または部分をコ ードするイントロン非介在性ＤＮＡ分子を有している。宿主細胞に形質変換、注 入、融合、電気穿孔法、若しくは別の方法による修飾などを施して本発明のイン トロン非介在性ＤＮＡ分子を導入する。適切な宿主細胞を選択することは当業者 にとって容易である。Ｅ、ｃｏｌｉのような原核生物の細胞は、ＤＮＡ分子を複 製し異種タンパク質を発現させるためにしばしば用いられる。本発明のある形態 によると、バクテリオファージタンパク質の一部と哺乳動物ＭＩＧの全体または 一部を含む融合タンパク質が生成される。遺伝子融合およびタンパク質の発現の 方法は当業者にとってよく知られている。

この発明の別の様態において、この発明のイントロン非介在性ＤＮＡ分子を真核 細胞中で複製し発現させる。これらの細胞は、ＭＩＧ　ｍＲＮＡの一次翻訳産物 にプロセシングを施し、成熟したＭＩＧタンパク質を生成することができる。

典型的なプロセシングは、ノブナル配列の切断およびそれに伴って細胞膜を通り 抜けて細胞外環境に移動することを含む。従って、真核細胞では存在するＭ　Ｉ 　Ｇ配列の程度によって発現したＭＩＧは栄養培地中に分泌される。このような 真核細胞はしばしば発現したタンパク質をグリコジル化する。グリコジル化のノ くターンが、哺乳動物のＭＩＧが天然源から単離された場合と同様である場合も 異なる場合もあるであろう。

ＭＩＧ配列検出のためのヌクレオチドプローブも考え出された。上述したように マウスのＭＩＧをプローブとして用いてヒトのＭＩＧを単離したのと同様に、他 の橿原から新規なＭ　Ｉ　Ｇ　ｓを単離するのにこれらのプローブを用いること ができる。また、プローブをＭＩＧに特異的なｍＲＮＡの量を測定するのに用い ることができる。ヌクレオチドプローブは通常少なくとも１４塩基の長さで、こ の出願で開示されたＭＩＧ塩基配列の１つに配列が一致している。典型的プロー ブは放射活性グループまたはビオチン結合グループを用いて標識され、プローブ を含む形成されたバイブリドの検出を可能にする。

さらに、哺乳動物のＭＩＧタンパク質と免疫反応性の抗体も本発明において考え 出された。このような抗体は、ＭＩＧ−１およびＭＩＧ−２の双方または片方に 特異的に結合する。抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である 。特定のタンパク質に対して特異的な抗体の製造技術は当該技術分野においてよ く知られている。抗体は、各ＭＩＧタンパク質全体、ＭＩＧタン／＜り質双方の 混合物、合成ポリペプチドのようなＭＩＧタンパク質の一部分、または、ＭＩＧ タンパク質の全体若しくは一部を含む融合タンパク質で免疫した動物から単離さ れる。

ＭＩＧタンパク質の受容体は、例えばイムノアフィニティー技術を用いて単離す ることができる。つまり、哺乳動物の細胞のホモ７エネートをイムノアフィニテ ィーカラムクロマトグラフィーに適用し、カラムに結合するタンパク質をＭＩＧ レセプターの候補とすることができる。溶解型の受容体はＭＩＧの天然の細胞標 的と競合してＭＩＧの活性を抑制するのに用いることができる。

以下の実施例は本発明の様々な様態を示すために提供される。

この実施例は、ＭＩＧ−１をコードするｃＤＮＡクローンの単離について記載す る。

ＲＡＷ２６４゜７細胞（Ｒａｓｃｈｋｅ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９７８）、　Ｃ ｅ１ｌ　１５：２６１−２６７）をＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）より得て、１０％ウシ胎児血清を加えた ＲＰＭＩ−１６４０中で培饗した。リンフ才力インリッチならし培地（ＣＭ）は 、Ｍａｒｃｕｃｃｉら（（１９ｇ２）、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　 １２ニア８７−７９０）の方法に従って、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのオス由来のコ ンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ）刺激膵臓細胞を用いて調製された。

ポリ（Ａ）”ＲＮＡは、シクロへキシミド（ＣＨＸ）１０μｇ／ｍｌ存在下でＣ ｏｎ　Ａ刺激膵臓細胞由来の２０％ＣＭに３時間さらしたＲＡＷ２６４．７細ｐ Ｉ）、　４９−７８）。すぐ前に記載したように刺激されたＲＡＷ細胞から調製 したｃＤＮＡプローブ、および、同一の濃度のＣｏｎ　ＡとＣＨＸは用いるが膵 臓細胞ＣＭは用いずに３時間処理したコントロールＲＡＷ細胞から調製したｃＤ ＮＡプローブを用いて、ディファレンシャルプラークハイブリダイゼーション（ Ｌａｕ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：１１８２−１１８６）によってライブラリーをスクリ ーニングした。

膵臓細胞ＣＭにさらした後、ＲＡＷ２６４．７細胞に蓄積する１１種のｍＲＮＡ を明らかにするｃＤＮＡクローンが単離された。図ＩＡに示されているように、 １，２キロベースでｍ１１９と名付けたｃＤＮＡクローンは、Ｃｏｎ　Ａ刺激膵 臓細胞由来のＣＭによってＲＡＷ細胞中に誘導されたが、コントロールのＲＡＷ 細胞では長時間露光したオートラジオグラフでも検出できない約１．　６ｋｂの 主なｍＲＮＡ種にハイブリダイズした。ＣＨＸはｍ１１９ｍＲＮＡの発現を抑制 しなかったので、これは誘導に際して新たにタンパク質が合成される必要のない ことを示唆している。ｍ１１９プローブは、１．６ｋｂのバンドの他に約３゜２ と１．８ｋｂの顕著に誘導されるｍＲＮＡ種を同定した。１．８ｋｂのバンドは 、ＣＨＸ存在下で刺激された細胞から調製したＲＮＡにのみ検出された。複数の ｍ１１９　ｃＤＮＡクローンおよびｍ１１９ゲノムクローンの分析による予備的 な証拠は、１．８ｋｂ種はｍ１１９　ｍＲＮＡが異なってスプライシングされた ものであることを示している。３．２ｋｂ種はおそら＜１．６ｋｂｍＲＮＡ種の 前駆体であると思われるがまだその特徴は明らかにされていない。コントロール として示したアルドラーゼＡのｍＲＮＡのレベルは、ＲＡＷ細胞をＣｏｎ　Ａ刺 激膵臓細胞由来のＣＭにさらすことによって影響を受けなかった。

実施例２： この実施例は、マクロファージ活性化因子によるｍ１１９ｍＲＮＡの誘導を明ら かにする。

ｍ１１９ｍＲＮＡの誘導の要因であると思われる、膵臓細胞ＣＭ中のリンフ才力 インを同定するために、かつ、他のどのマクロファージ活性化因子がｍ１１９遺 伝子の発現を高めることができるのかを調べるために、様々の試薬で３および６ 時間処理したＲＡＷ細胞から全ＲＮＡを調製しノザンプロットで解析した。

ＩＦＮ−γで処理した場合にのみｍ１１９ｍＲＮＡの著しい誘導が観察された。

ＩＦＮ−α、１ＦＮ−β、ＩＦＮ−γおよびＬＰＳを用いた実験の結果を図ＩＢ に示している。ｒＦＮ−７は、≧１０７ｕｎｉｔｓ／ｌｌ１ｇ　（＾ａ＋ｅｇｅ ｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）または１．２　Ｘ　１０７ｕｎｉｔｓ／ｍｇの（ Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈより提供していただいた）の比活性を有するマウスの組み換 えタンパク質であった。ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βは、各々１．４　Ｘ　１０ ’　１ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｕｎｉｔｓ　（ＩＲＬ Ｉ）　／ｍｇおよび１．３　Ｘ　１０’@ＩＲ Ｕ／ｍｇの比活性を有するマウスの天然産物であった（Ｌｅｅ　ＢｉｏＭｏｌｅ ｃｕｌａｒ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）　。他のサイトカインはすべてＧｅ ｎｚｙｍｅ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡから購入した。ノクロヘキシミド（ＣＨＸ ）を用いる時は１０μｇ／ｍｌをアクチベーターと同時に加えた。内毒素の分析 において、各サイトカインによる以下の処理に耐えたＲＡＷ２６４．７細胞の培 地は＜０．５内毒素ｕｎｉｔｓ／ｍｌのレベルを０）から得た。

ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＩＦＮ−ｒによるｍ１１９　ｍＲＮＡの選択的誘 導は再現性を有するが、ＲＡＷ２６４．７細胞がＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β若しく はＬＰＳに反応できないわけではない。例えば、図ＩＢに示したように、Ｃ０ｎ Ａ刺激牌臓細胞由来のＣＭに反応性の遺伝子として同定された別の遺伝子Ｃｒｇ −２が全てのＩＦＮｓおよびＬＰＳによって誘導された。ＩＦＮ−α、ＩＦＮ− βおよびＬＰＳの結果に加えて、組み換えマウスＩＬ−１α、組み換えマウスＩ Ｌ−３、組み換えマウスＩＬ−４、組み換えマウス顆粒球／マクロファージコロ ニー刺激因子、組み換えヒトコロニー刺激因子１、ポリ（１）−ポリ（Ｃ）、カ ルシウムイオノフオアＡ２３１８７、ホルボール１２−ミリステート　１３−ア セテート、および、Ａ２３１８７とホルボールミリステートアセテートを組み合 わせたものでＲＡＷ細胞を処理すると、ｍ１１９ｍＲＮＡが誘導されなくなり、 血清枯渇したＢＡＬＢ／ｃ　３Ｔ３繊維芽細胞を血清（すなわちマイトジェン） 刺激してもｍ１１９ｍＲＮＡは誘導されなかった（データは省略）。

ＩＦＮ−γに対する反応によるｍ１１９ｍＲＮＡの誘導のタイムコースを測定す るために、０−２４時間処理したＲＡＷ細胞からＲＮＡを調製した。図ＩＣに示 したようにｍ１１９　ｍＲＮＡは急速にそして劇的に誘導され、６−２４時間の 間に最高値に達する。膵臓細胞ＣＭで処理した場合と同様にＩＦＮ−γによる誘 導の場合も新たにタンパク質が合成される必要はないと思われた。実際、ＣＨＸ を加えるとｍ１１９ｍＲＮＡの発現のスーパーインダクションが生じた。

ＩＦＮ−γはｍ１１９遺伝子の発現を急速に著しく刺激するが、特に著しいのは ＩＦＮ−γによるｍ１１９遺伝子の誘導の特異性であり、従来ＩＦＮ−γによっ 現の制御という点においても、またＩＦＮ−γの生物学的活性という点において もＩＦＮ−１とｍ１１９が特別な関係を有していることを示唆している。

実施例３： この実施例は、通常のマクロファージにおけるＭＩＧ　１　ｍＲＮＡの誘導につ いて示している。

通常のマクロファージの活性化によりｍ１１９ｍＲＮＡが誘導されることを確認 するために、Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪおよびＢＡＬＢ／ｃＪマウス双方から得られた スターチ誘導腹腔滲出細胞由来の付着性集団におけるｍ１１９遺伝子の発現を分 析した。図２に示すように、これらの細胞（形態学によって決定したところ８０ ％以上がマクロファージ）をＣｏｎ　Ａ刺激膵臓細胞由来のＣＭにさらすとｍ１ １９ｍＲＮＡが誘導された。Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪ細胞をＩＦＮ−７にさらすと同 様にｍ１１９遺伝子の発現を引き起こした。腹腔細胞由来のｍ１１９ｍＲＮＡ種 の電気泳動度はＲＡＷ細胞由来のものと比較して同じであった。

実施例４： この実施例は、ＭＩＧ−１ｃＤＮＡおよび予想されるＭＩＧ−１タンパク質の配 列を示す。

販売元のプロトコールに従ってエンドヌクレアーゼ■、バッファー、Ｓ１ヌクレ アーゼおよびＴ、ＤＮＡライゲース（Ｐｒｏａ＋ｅｇａ社）を用い、Ｂｌｕｅｓ ｃｒｆｐｔ　ｐｈａｇｅｍｉｄ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に挿入させたｃＤ ＮＡクローンのシーケンス用のオーバーラツプディリージョンを作成した。ＤＮ ＡシーケンスはＵｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ１社の試薬 を用い、グイデオキシチェインターミネータ−法（Ｓａｎｇｅｒ、　ｅｔ　ａｌ 。

（１９７７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４ ：５４６３−５４６７）によって行った。

元の１．２ｋｂ　ｍ１１９　ｃＤＮＡクローンの一部分をプローブとして用い、 はぼ全長に相当する１、４ｋｂ　ｃＤＮＡを得た。その配列を図３に示した。Ｉ ＦＮ−γで刺激したＲＡＷ細胞由来のＲＮＡを用いてプライマー伸長法を行い、 ｍ１１９ｍＲＮＡ種の５′末端として隣接する５箇所を同定しくデータは省略） 、予想される転写開始部位を図３に矢印で示した。ＢＡＬＢ／ｃマウスのライブ ラリー（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からｍ１１９のゲノム クローンを単離し、１゜７　ｋ　ｂ　ＥｃｏＲＩ断片を用いてゲノム配列を決定 したところｍ１１９　ｃＤＮＡの５′末端と重なっており、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクロ ーンから欠落したｍＲＮＡの配列を提供した。図３に示すように、ゲノム配列は −３２から−２２の部位にＡ＋Ｔリッチ領域（ＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＴ）を有し ており、これはいくつかの可能な”ＴＡＴＡボックス”を含んでいる。ｍ１１９ ｍＲＮＡはポリ（Ａ）鎖を除いて１２４７塩基から成り、＋５８番目の塩基から 始まる最初のＡＵＧメチオニンコドンから４３６−４３８番目のＵＡＡ終始コド ンまでの単一の長い読み取り枠を含んでいる。この読み取り枠は、相対分子量（ Ｍｒ）　１４，４６１で１２６アミノ酸残基から成る予想されるタンパク質をコ ードしている。予想される開始コドンの直前のＧＣジン列を持たず、ポリ（Ａ） 鎖の２２塩基５′側にＡＧＴＡＡＡという配列を有しているが、これはポリアゾ ニレ−ジョンシグナルとして機能すると報告されている（Ｕｃｋｅｒ（１９８３ ）　Ｍｏｌ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　３＋５５１−５６１）。

予想されたｍ１１９タンパク質のＮ−末端配列は、分泌性タンパク質または膜貫 通タンパク質のシグナルペプチドの特徴を有しており、ヘイジンの−３，−１法 則（（１９８６）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：４６８３− ４６９０）によりＧｌｙ−２１の後ろでシグナルペプチドが切断されると予想さ れる。ｍ１１９は２番目の長い疎水性配列を欠（ので膜貫通タンパク質ではない と思われる。Ａｓｎ−５８には、予想される唯一のＮ−結合グリコシル化部位が ある。さらに付は加えると、Ｃ−末端の配列が著しく塩基性に富んでいる。

実施例４： この実施例は、ＭＩＧ−１とＰＦ４ファミリーの他のメンバーとの関係を明らか にする。

ｍ１１９タンパク質の配列をＮａｔｉｏｎａｌ　ＢｉｏＩｌｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　１ｉｂｒａｒｙ　（Ｊｕｎｅ、　１９９ ０）中の配列と比較すると、ＭＩＧ−１は血小板顆粒タンパク質であるＰＦ４と 関連した祖先をもつタンパク質のファミリーの新規なメンバーであることが示さ れた（Ｄｅｕｅｌ　ｅｔ　ａｔ、　（１９８１）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７８：４５８４−４５８７）。ｍ１１９の予想さ れるアミノ酸配列とファミリーの中で最も密接に関連しているメンバーの配列を 比較したものを図４に示した。配列の比較から、ＭＩＧ−１はこれらのファミリ ーの他のメンバーと関連してはいるが、既に報告されているこれらのメンノく− と同一ではなく、またこれらのメンノく−のマウスの相同遺伝子でもないと考え られる。

ＰＦ４ファミリーのメン／く−は低分子量の因子で、繊維芽細胞、マクロファー ジおよび内皮細胞などを含む細胞から、成長因子、インターフェロン、ウィルス 形質転換および微生物の産物のような様々な刺激番＝反応して分泌される。この ファミリーに属するいくつかのメンノく−の生物学的な活性が明ら力１（こされ ており、その中にはＧｒｏ／ＭＧＳＡによるヒト黒色腫系の自己分泌増殖束す激 （Ｒｉｃｈｍｏｎｄ　ｅｔ　ａＬ、、　（１９８８）　ＥＭＢＯＪ　７：２０２ ５−２０３３）　、Ｉ　ｔ、−８＋こよる好中球−内皮細胞付着の制御（Ｇｉｍ ｂｒｏｎｅ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：１６ ０１−１６０３）　、Ｐ　Ｆ　４１こよる血圧安定活性（ｉｌａｉｏｎｅ　ｅｔ 　ａｔ、　（１９９０）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：７７−７９）　、および 、ＰＦ４（Ｄｅｕｅｌ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８１）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７８：４５８４−４５１１ｉ７）　、h　Ｌ −８ （Ｍａｔｓｕｓｈｉａ＋ａ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）、　Ｊ、　Ｅｘｐ、 　Ｍｅｄ、　１６７：１８８３−１８９３）　、Ｍ　Ｉ　Ｐ@−２（Ｗ ｏｌｐｅ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　［ＩＳＡ　８６：６１２−６１６）およびβ−g ロンボグロブ’Ｊ　＞　（Ｓｅｎｉｏｒ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）、　Ｊ 、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　９６：３８２−３８５）　ｌ■■ る走化性活性などが含まれる。これらのサイトカイン（ま免疫反応、炎症性反応 、組織の損傷、成長および修復の制御に関与して０ると考えられる。マクロファ ージにおいてＩＦＮ−γに対してＭＩＧ−１遺伝子力く選択的（こ反応すること （よ、マクロファージの活性酸素中間体の解離を促進する（Ｎａｔｈａｎ、　ｅ ｔ　ａｔ、　（１９８４）、　Ｊ。

抗原系クラス■抗原の誘導（Ｒｏｓａ、ｅｔ　ａｔ、　（１９８３）、　ＥＭＢ ＯＪ、　ｇ：１５８５−１５８９）のようなＩＦＮ−γ特異的な池の活性も媒介 するかもしれな（Ｘ０ヒトの単球細胞系ＴＨＰ−１をＡＴ　ＣＣ（Ａｍｅｒｉｃ ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）胞をｌ０００Ｕ／ｍ ｌの組み換えヒト　γ−インターフェロン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ社）で８時間刺激し、ＦａｓｔＴｒａｃｋ　ＲＮ　Ａ単離用キット （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて２７μｇのポリ（Ａ）”ＲＮＡを調製した 。５μｇのポリ（Ａ）”ＲＮＡを用いてＵｎｉ−ＺＡＰ”　ＸＲベクター（Ｓｔ ｒａｔａｇｅｎｅ社）中にｃＤＮＡライブラリーを作成した。ライブラリーの作 成はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のプロトコールおよび試薬を適用したが、ｃＤＮＡ 第−鎖の合成は、ＢＲＬ社の逆転写酵素５ｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴ′およびバッ ファーを用いて行った。作成したライブラリーを１９見宿王菌株Ｐ　Ｌ　Ｆ　− Ｆ　’　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて増幅させた。ライブラリーをＰＬ Ｆ−Ｆ′細胞上にプレートし、全長１１９／ＭＩＧ　ｃＤＮＡ　（ｃＤＮＡ　１ １９／２４）からニックトランスレーションによって調製したプローブでスクリ ーニングした。

プローブは１　ｘ　１０’　ｃｐｍ／μｇの比活性を有し、１．６　Ｘ　１０’ 　ｃｐｍ／ｍｌの濃度で用いられた。ハイブリダイゼーションは、ＬＭ　ＮａＣ Ｌ　５ｈＭリン酸ナトリウムｐＨ６，５，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％Ｓ　Ｄ　 Ｓ　、　１０　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ中、６５℃、２０時間行い、続いて ６５℃で次に示すように順に洗浄していった＋１ＭＮａＣ１，５０ｍＭＴＲＩ　 ５−ＨＣ１ｐＨ８，６，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％　ＳＤＳで１時間×２回；Ｑ、 ５ＭＮａＣＬ２５ｍＭリン酸ナトリウムｐ１１６．５．０．５％ＳＤＳで１回； ０．５Ｍ　ＮａＣＬ　２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８，５，２ｍＭ　ＥＤＴＡ 、０．５％ＳＤＳで１時間。最後のリンスは２ｘＳＳＣを用い室温で行った。

ハイブリダイズしたプラークを拾い、続いてプラークの純度を高めるためにブレ ーティングおよびハイブリダイゼーションを行った。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社の プロトコールに従い、Ｒ４０８ヘルパーフアージと試薬を用いて陽性の組み換え ファージからプラスミドレスキューを行った。アルカリ　リシス／ＳＤＳ法を用 いてプラスミドＤＮＡを調製し、Ｃ８Ｃ１勾配で精製した。最も大きいｃＤＮＡ クローン、Ｈ−１−３は２．５ｋｂであった。ｃＤＮＡクローンの端のシーケン スは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＴ３およびＴ７プライマー、およびＵｎｉｔｅ ｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ１社の試薬とプロトコールを用いてグイ デオキシチェインターミネータ−法によって行われた。ｃＤＮＡＨ−１−３、Ｈ −５−２ｃＳＨ−２−２およびＨ−４−２の配列は、それぞれが独立でかつオー バーラツプしているｃＤＮＡクローンであることを明らかにした。図５に示され た配列は、ｃＤＮＡクローン、Ｈ−１−３とＨ−５−２ｃの配列を合わせたもの で、大部分の配列はそれぞれの場合の一本鎖から得られた結果を示している。開 始メチオニンは、マウスＭＩＧ−１配列との一致を基に決めた。

実施例６： マウスＭＩＧ−１およびヒトＭＩＧ−２の予想されるアミノ酸配列を並べて比較 したものを図６に示した。ＭＩＧ−２の１２５個のアミノ酸残基のうち、若しく はＭＩＧＩの１２６個のアミノ酸残基のうち８８個が同一であった。同一性を計 算する際に図に示したように２カ所のギヤ・ノブを導入した。

実施例７： この実施例は、ヒト単球細胞における組み換えヒトインターフェロン−γによる ＭＩＧ−２ｍＲＮＡの誘導、およびタンパク質合成阻害剤であるシクロへキンミ ド（ＣＨＸ）によってＭＩＧ−２ｍＲＮＡの誘導が著しく抑制されることを示し ている。

ヒト単球細胞、ＴＨＰ−１およびＵ９３７をインターフェロン−γ（１０００Ｕ ／ｍｌ）で８時間処理した。シクロへキンミドを用いるときは、インターフェロ ン−γを加える前に、５０μｇ／１ｌ１１の濃度で１５分間加えた。処理した細 胞からＲＮＡを抽出し、ノザンプロットでＭＩＧ−２ｃＤＮＡと／１イブリダイ ズさせた。図７に示すように、ヒトの細胞で、ＩＦＮ−γによって誘導される２ 、８ｋｂのメ・ラセンジャーＲＮ、Ａが検出された。この誘導はシクロへキシミ ドによって著しく阻害され、このことはタンノ（り質が新たに合成されることが ＭＩＧ−２の誘導に必要であることを示唆している。対照的に、マウス細胞中の ＭＩＧ−１の誘導１まシクロへキシミドに非感受性である。

実施例８： この実施例は、ＭＩＧ−１およびＭＩＧ−２プローブは同一のマウスのゲノム断 片にはハイブリダイズしないことを示している。

４４μｇのマウスゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、５ａｃＩおよびＢｇ ｌＩで消化して２つに分け、１枚の０７％アガロースケルで泳動した。トランス ファーを行った後、フィルターを２つに切断した。ＭＩＧ−１およびＭＩＧ２ｃ ＤＮＡプローブを用いてＩＭＮａＣ！を含むバッファー中で６５℃で一日、さら に６０℃で三日、ハイブリダイゼーションを行い、０．５ＭＮａＣｌ、６０°Ｃ で洗浄した。マーカーレーン（Ｍ）はＤＮＡラダーを含んでおり、数本の断片が プローブにハイブリダイズした。１１９／ＭＩＧ−１遺伝子のＥｃｏＲＩ断片、 およびラダー断片のうちの一本のサイズを示しである。

図８かられかるように、ＭＩＧ−２プローブはマウスのＤＮＡのうちＭＩＧ−１ に相当しない少なくとも一本のゲノム断片にハイブリダイズした。さらに、ＭＩ Ｇ−２はＭＩＧ−１遺伝子に相当するいかなる断片にもハイブリダイズしなかっ た。この結果はＭＩＧ−１とＭＩＧ−２は真の意味での相同遺伝子ではないこと を示している。サザンプロットからマウスには少な（とも１つの別のＭＩＧ−２ 関連遺伝子が存在すると予想される。最近の証拠からＰＦ４ファミリーにｇｒ。

／ＭＩＰ−２関連遺伝子グループの存在することが示されているように（Ｔｅｋ ａｍｐ−Ｏｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１７２：９ １１−９１９（１９９０））　、１１９／Ｍ　Ｉ　Ｇ−１関連遺伝子のグループ もあるかもしれない。いずれにせよ、ＭＩＧ−２はＰＦ−４フアミリーに属する ガンマＩＦＮ誘導性のヒトのメンバーとして新たに同定されたちこの実施例は、 ＭＩＧ−１およびＭＩＧ−２は共に分泌性タンパク質であることを示している。

ＭＩＧ−１およびＭＩＧ　２　ｃＤＮＡクローンから籾懸勺巴でＲＮＡを転写し 、該ＲＮＡを用いてミクロソーム膜を加えて、あるいは加えずにｉｎ　ｖｉｔｒ 。

翻訳を行った。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社の試薬およびプロトコールを使用し、Ｂ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ｐｈａｇｅｍｉｄに組み込まれたｃＤＮＡから功科１四で センスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡの転写、キャッピングを行った。Ｐｒｏ ｍｅｇａ社の試薬およびプロトコールを使用し、領　５μｇのＲＮＡを用い２５ μｍ反応液中でイヌ膵臓ミクロソーム膜を加えて、あるいは加えずに翻訳を行っ た。ＭＩＧ−２反応液には［３５Ｓ］−システィンを含ませ、池の反応液には［ ３５Ｓ］−メチオニンを含ませた。各々の場合について（ＭＩＧ−２を除く）各 レーンあたり１．２５μｍの反応液を、ＭＩＧ２については０８μｌの反応液を 用いて泳動した。試料を変性し、１２％ゲルで分析した。ＭＩＧ−２のレーンの ６．２と１４．３ｋＤａの間のしみは［”Ｓ］−７ステインの使用と関係してい る。

図９は、各場合においてミクロソーム膜が翻訳産物の移動度を増加させることを 明らかにし、シグナルペプチドの認識および切断は、これらのタンパク質が分泌 されることと矛盾のないことを示している。注目すべきことは、ＭＩＧ−１の場 合にしクロソームを用いて翻訳を行うと、＞１８．４ｋＤａの移動度の低い薄い バンドが再現的に見られることで、これは配列から予想されたようにＭＩＧ−１ がグリコジル化される可能性を示している。ＭＩＧ−１ポリペプチドの移動度は 、ＭＩＧ−１の予想されるアミノ酸配列から期待されるよりは小さいが、この現 象はＰＦ４ファミリーの他のメンバーにおいても観察される（Ｒｉｃｈｉｏｎｄ 　ｅｔ　ａｔ。

、　（１９８８）　ＥＭＢＯＪ、　ｖｏｌ　７．　ｐｐ、　２０２５−３３；　 ａｎｄ　Ｌｅｏｎａｒｄ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９９０）　hｍｍｕｎｏｌ。

Ｔｏｄａｙ、　ｖｏｌ　１１．　ｐｐ、９７−１０１）。

実施例１０： この実施例は、ＭＩＧ−１およびＭＩＧ−２抗原の発現および抗ＭＩＧ抗血清の 生成について明らかにする。

シグナルペプチドをコードする配列を除いたＭＩＧ−１およびＭＩＧ−２ｃＤＮ Ａを、ＭＩＧ−１およびＭＩＧ−２配列に融合させたＴ７遺伝子上旦のタンパク 質の１３アミノ酸残基をコードする配列とともにｐＥＴ−３ｂベクター（Ｓｔの 培養物の抽出物を変性５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図１０）。ＭＩＧ−１融合 タンパク質を生成する２つの異なる培養物を分析しパネルＡに示した。ＭＩＧ− １配列を逆向きに組み込んだｐＥＴ−３ｂプラスミドを有する細胞もコントロー ルとして含ませた。上方の矢印、下方の矢印はそれぞれＭＩＧ−１融合タンパク 質、ＭＩＧ−２融合タンパク質を示し、各々は異なるレーンに存在している。

シグナルペプチドを欠＜ＭＩＧ−１非融合タンパク質をｐＥＴ−８ｃｍＭＩＧプ ラスミドを用いて発現させその結果をパネルＢに示した。レーンは、細菌の培養 物１００μｌのライセードを既に示したように処理し、クマジーブルー染色によ って分析したものである。矢印はＭＩＧ−１タンパク質を示す。融合タンパク質 を大量に調製し、抗血清を生成するためにウサギに注入した。非融合タンパク質 は抗体を精製するための免疫アフィニティーの試薬としておそらく有効で、生物 学的活性も有している可能性がある。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１ １　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ６　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌ ｅｕ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇ ｌｙ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇ撃■ ２２　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｃ ｙｓ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　`ｒｇ ３８　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌ ｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　oｒ。

５４　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｉ ｌｅ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　fｌｙ ７０　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｓ ｅｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　lｅｔ ８６　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｇ ｉｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　fｌｙ １０２　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　 Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ@Ｇ１ｎ １１８　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　 ＴｈｒＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２ ＴＴＴＣＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＴＧＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＡＣＡＴＧＣＴＣＴ ＣＴＡＡＡＧＡＣＡＴＴＣＴＣＧ　１４ＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧ ＴＧＡＣＴＣＡＡＴＡＧＡＡＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＣＡＴＧ　ＡＡＧ　ＴＣＣ ＧＣＴ　ＧＴＴ　７Q ＣＴＴ　ＴＴＣＣＴＴ　ＴＴＧ　ＧＧＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧ　ＧＡＧ　Ｃ ＡＧ　ＴＧＴ　ＧＧＡ　ＧＴＴ　ＣＧＡ　ＧＧＡ　１２０ＡＣＣＣＴＡ　ＧＴＧ 　ＡＴＡ　ＡＧＧ　ＡＡＴ　ＧＣＡ　ＣＧＡ　ＴＧ（、ＴＣＣＴＧＣＡＴＣＡＧ ＣＡＣＣＡＧＣＣＧＡ　１６８ＧＧＣＡＣＧ　ＡＴＣＣＡＣＴＡＣＡＡＡ　ＴＣ ＣＣＴＣＡＡＡ　ＧＡＣＣＴＣＡＡＡ　ＣＡＧ　ＴＴＴ　ＧＣＣＣＣＡ　２１６ ＡＧＣＣＣＣＡＡＴ　ＴＧＣＡＡＣＡＡＡ　ＡＣＴ　ＧＡＡ　ＡＴＣＡＴＴ　Ｇ ＣＴ　ＡＣＡ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＡＡＣＣＧＡ２６４ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＡＣＣＴ ＧＣＣＴＡ　ＧＡＴ　ＣＣＧ　ＧＡＣＴＣＧ　ＧＣＡ　ＡＡＴ　ＧＴＧ　ＡＡＧ 　ＡＡＧ　ＣＴＧ　ＡＴＧ　３１Q ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＴＧＧ　ＧＡＡ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＡＴＣＡＡＣＣＡＡ　ＡＡ Ｇ　ＡＡＡ　ＡＡＧ　ＣＡＡ　ＡＡＧ　ＡＧＧ　ＧＧＧ　３U０ ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＣＡＴ　ＣＡＡ　ＡＡＧ　ＡＡＣＡＴＧ　ＡＡＡ　ＡＡＣＡＧ Ａ　ＡＡＡ　ＣＣＣＡＡＡ　ＡＣＡ　ＣＣＣＣＡＡ４０８ＡＧＴ　ＣＧＴ　ＣＧ Ｔ　ＣＧＴ　ＴＣＡ　ＡＧＧ　ＡＡＧ　ＡＣＴ　ＡＣＡ　ＴＡＡ　ＧＡＧＡＣＣ ＡＴＴＡＣＴＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＧ@４６１ ＣＴＧＧＴＧＡＧＣＴＡＧＡＴＡＧＡＣＣＴＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧ ＣＣＣＴＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＴＧＧＧＴＣＡＧＣＣX０２ ＴＡＧＡＧＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＧＴＧＴＣＴＣＡＧＡＧＡＴＧＧＴＧ ＣＴＡＡＴＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＴＴＣＴＡＣＡＧＴＧＧＡ@９６５ ＧＴｒＴＣＡＣＡＡＧＴＡＡＡＣＡＣＴＴＣＧＣＴＧＣＴＡＴＣＴＡＳＥＱ　Ｉ Ｄ　Ｎｏ：　３ ＭｅｔＬｙｓＬｙｓＳｅｒＧｌｙＶａｌＬｅｕＰｈｅＬｅｕＬｅｕＧｌ　ｙ　Ｉ 　ｌｅ　Ｉ　１ｅＬｅｕＬｅｕ　Ｖａ　ｌ　Ｌｅｕ　Ｉ　１　ｅＧｌｙＶａ　Ｉ 　Ｇｌ　ｎＧ　１　ｙＴｈ窒oｒｏＶａｌＶａ　ｌ　Ａｒｇ ＬｙｓＧｌｙＡｒｇＣｙｓＳｅｒＣｙｓ　Ｉ　ｌ　ｅｓｅｒＴｈｒＡｓｎＧｌ　 ｎＧｌｙＴｈｒ　Ｉ　１ｅＨｉ　５ＬｅｕＧ１　ｎ５ｅｒＬ■浮kｙｓ ＾５ｐＬｅｕＬｙｓＧ　１ｎＰｈｅＡ　１　ａＰｒｏｓｅｒＰｒｏｓｅｒｃｙｓ Ｇｌ　ｕＬｙｓ　Ｉ　１ｅＧ　ｌ　ｕＩ　１ｅＩ　１ｅＡ　PａＴｈｒＬｅｕ ＬｙｓＡｓｎＧ１ｙＶａＩＧＩｎＴｈｒＣｙｓＬｅｕＡｓｎＰｒｏＡｓｐＳｅｒ Ａ１ａＡｓｐＶａｌＬｙｓＧ１ｕＬｅｕ１１ｅＬｙｓＬｙｓＴｒｐＧ　１　ｕＬ ｙｓＧｌｎＶａ　１ｓｅｒＧ１　ｎＬｙｓＬｙｓＬｙｓＧｌｎＬｙｓＡｓｎＧｌ 　ｙＬｙｓＬｙｓＨｉ　５Ｇ１ｎkｙｓ ＬｙｓＬｙｓ　Ｖａ　Ｉ　ＬｅｕＬｙｓ　ＶａＩ　Ａ　ｒｇＬｙｓＳｅｒＧｌ　 ｎＡｒｇＳｅｒＡｒｇＧｌ　ｎＬｙｓＬｙｓＴｈｒＴｈｒＳＥＱ　ｆＤ　ＮＯ： 　４ ａ　ｔｃｃａａ　ｔａｃａｇｇａｇｔｇａｃ　ｔ　ｔｇｇａａｃ　ｔｃｃａ　ｔ 　ｔｃｔａｔｃａｃ　ｔａ　ｔｇａａｇａａａａｇｔｇｇｔ■狽狽メ@ｔ　ｔ ｔ　ｔｃｃ　ｔｃ　ｔ　ｔｇｇｇｃａ　ｔｅａ　ｔｃｔ　ｔｇｃ　ｔｇｇｔ　ｔ ｃ　ｔｇａ　ｔ　ｔｇｇａｇｔｇｃａａｇｇａａｃｃｃｃａ■狽≠■狽■≠■■ ａｇａａａｇ　ｔ　ｔｃ　ｔｇａａａｇ　ｔ　ｔｃｇａａａａ　ｔｃｔｃａａｃ ｇｔ　ｔｃ　ｔｃｇ　ｔｃａａａａｇａａｇａｃ　ｔａｃａ@ｔａａ ＦＩＧ、　ｉＡ ＋ＣＨＸ　−ＣＨＸ ＠　ＬＰＳ、ｌｎｇ／ｍｌ ｚ＠　ＬＰＳ、１０ｎｇ／ｍｌ 二：、＠　ＬＰＳ、　ｌｏｎｇ／ｍｌ　＋　ＰＢ−無添加 ＩＩＩ　＠　ＬＰＳ、　１１０００ｎ／ｍｌ・　ポリミキシンＢ ・　無添加 ＦＩＧ、　３ ３１１　Ｇ工ｙ　Ｔｈｒ　ｒｌｅ　ＨＬｓ　Ｔｙ　Ｌｙｓ　Ｓａｒ　Ｌｅｕ　Ｌ ＋ｙｓ　入ｓｐ　ｔａｕ　ＬＹＳ　Ｇｉｎ　Ｐｈ＠　Ａよａ@Ｐｒ。

５４　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　ΔＷ　Ｌ’ｌＳ　丁ｈｒ　ＧＬｕ　ｒ ｌｅ　ＩＩｓ　Ａユ１　Ｔｈｒ　ｔａｕ　ＬＹＳ　Ａ１１ｎ@Ｇｌｙ ７０　ｋｓｐ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｇｐ　Ｓ ｅｔ　八ｘａ　ＡＪｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ｔａｕ　Cｅｅ ８６　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ｒｌａ　Ａｓｎ　Ｇ Ｌｒ、　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　ＬＹＳ　Ａｚｇ@Ｇｌｙ １０２　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｗ＠ｅ　Ｌｙｓ　 ｋｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｔｈｔ　Ｐｒｏ@Ｇｉｎ 入ＧＴ　ＣＧ’ｒ　ＣＧ？　ＣＧ？　？ＣＡ　ＡＧＧ　ＡＡＧ　ＡＣＴ　ＡＣＡ 　ＴＡＡ　ＧＡＧＡＣＣＡＴＴＡＣＴＴ？ＡＣＣＡＡＣＡＡf　４６１ １ｉｅ　Ｓａｒ　Ａｒｑ　Ａｒｑ　入ｘｑ　ｓｅｒ　入ｒｇ　Ｌ、ｙ５　ＴＭ　 Ｔｈｒ　会Φ ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、７ ヒト単球細胞（こおける旧Ｎ−ｙｌこよるＭＩＧ２　ｍＲＮＡの誘導ＦＩＧ、８ ＦＩＧ、９ ＭＩＧ　ＭＩＧ−２ ＦＩＧ　ｌ○ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１３１００　 ８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　５／１０ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｋ　８２１４−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） Ａ６１Ｋ　３７１０２　ＡＢＥ　８３１４−４ＣＩ

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動物ＭＩＧをコードし、ＳＥＱＩＤＮＯ．４に示された塩基配列を有す る第二ＤＮＡ分子に強い条件下でハイブリダイズするイントロン非介在性ＤＮＡ 分子。
2. ２．ＳＥＱＩＤＮＯ．４に示された塩基配列を有する請求項１に記載のイントロ ン非介在性ＤＮＡ分子。
3. ３．ＳＥＱＩＤＮＯ．３に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードす る請求項１に記載のイントロン非介在性ＤＮＡ分子。
4. ４．ヒトに由来する請求項１に記載のイントロン非介在性ＤＮＡ分子。
5. ５．ヒトに由来する請求項２に記載のイントロン非介在性ＤＮＡ分子。
6. ６．ヒトに由来する請求項３に記載のイントロン非介在性ＤＮＡ分子。
7. ７．請求項１に記載のイントロン非介在性ＤＮＡ分子にコードされ、実質的に他 の哺乳動物タンパク質を含まない哺乳動物ＭＩＧタンパク質。
8. ８．ＳＥＱＩＤＮＯ．３に示されたアミノ酸配列を有する請求項７に記載の哺乳 動物のタンパク質。
9. ９．ＳＥＱＩＤＮＯ．３に示されたアミノ酸配列を有し、ヒトに由来する請求項 ８に記載のタンパク質。
10. １０．請求項１に記載のＤＮＡ分子を有する宿主細胞。
11. １１．ＳＥＱＩＤＮＯ．４に示された塩基配列を有するＤＮＡ分子を有する請求 項１０に記載の宿主細胞。
12. １２．ＳＥＱＩＤＮＯ．３に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコード するＤＮＡ分子を有する請求項１０に記載の宿主細胞。
13. １３．請求項１に記載のＤＮＡ分子を有する宿主細胞を準備し；哺乳動物ＭＩＧ タンパク質が培地中に分泌されるように宿主細胞を栄養培地中で培養し；そして 栄養培地から哺乳動物ＭＩＧタンパク質を回収する：工程からなる哺乳動物ＭＩ Ｇタンパク質の製造方法。
14. １４．ＤＮＡ分子がＳＥＱＩＤＮＯ．４に示された塩基配列を有する請求項１３ に記載の方法。
15. １５．ＤＮＡ分子がＳＥＱＩＤＮＯ．３に示されたアミノ酸配列を有するタンパ ク質をコードする請求項１３に記載の方法。
16. １６．請求項１に記載のＤＮＡ分子にハイブリダイズするヌクレオチドプローブ 。
17. １７．ＳＥＱＩＤＮＯ．４に示された塩基配列を有するＤＮＡ分子にハイプリダ イズする請求項１６に記載のヌクレオチドプローブ。
18. １８．ＳＥＱＩＤＮＯ．３に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコード するＤＮＡ分子にハイブリダイズする請求項１６に記載のヌクレオチドプローブ 。
19. １９．ＳＥＱＩＤＮＯ．４に示された塩基配列を有する第二ＤＮＡ分子に強い条 件下でハイブリダイズするイントロン非介在性ＤＮＡ分子を有する宿主細胞を準 備し； ＭＩＧタンパク質が発現されるように宿主細胞を栄養培地中で培養し；そして 宿主細胞からＭＩＧタンパク質を回収する：工程からなる哺乳動物ＭＩＧタンパ ク質の製造方法。
20. ２０．宿主細胞が原核生物である請求項１９に記載の方法。
21. ２１．宿主細胞が真核生物である請求項１９に記載の方法。
22. ２２．ＭＩＧタンパク質がＭＩＧの一部分と微生物のタンパク質の一部分からな る融合タンパク質である請求項１９に記載の方法。
23. ２３．ＳＥＱＩＤＮＯ．３に示された配列を有する哺乳動物ＭＩＧには免疫反応 性であるが、ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示された配列を有する哺乳動物ＭＩＧには免 疫反応性でない、抗体からなる組成物。
24. ２４．抗体がポリクローナルである請求項２３に記載の組成物。
25. ２５．抗体がモノクローナルである請求項２３に記載の組成物。