JP2935511B2 - ヒトｉｌ―６レセプターの製造方法 - Google Patents
ヒトｉｌ―６レセプターの製造方法Info
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- JP2935511B2 JP2935511B2 JP27186589A JP27186589A JP2935511B2 JP 2935511 B2 JP2935511 B2 JP 2935511B2 JP 27186589 A JP27186589 A JP 27186589A JP 27186589 A JP27186589 A JP 27186589A JP 2935511 B2 JP2935511 B2 JP 2935511B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒトインターロイキン−６（ヒトIL−６）レ
セプター及びその誘導体の遺伝子組換え法による製造方
法、並びにこの方法に使用するための発現ベクター及び
該発現ベクターにより形質転換された宿主に関する。
セプター及びその誘導体の遺伝子組換え法による製造方
法、並びにこの方法に使用するための発現ベクター及び
該発現ベクターにより形質転換された宿主に関する。
インターロイキン−６（BSF2/以下IL−６と略す）
は、種々の重要な生理活性を有し、広く細胞の増殖分化
に関与しているタンパク質である。さらにIL−６の異常
産生が種々の自己免疫患者の病因因子である可能性が報
告されている（岸本、平野、Ann.Rev.Immunol,6,p485,1
988年参照）。
は、種々の重要な生理活性を有し、広く細胞の増殖分化
に関与しているタンパク質である。さらにIL−６の異常
産生が種々の自己免疫患者の病因因子である可能性が報
告されている（岸本、平野、Ann.Rev.Immunol,6,p485,1
988年参照）。
IL−６と特異的に結合する細胞膜上のIL−６レセプタ
ーは、田賀らにより解析され、各細胞上の数、IL−６と
の結合定数が報告されている（J.Exp.Med.,196,p967,19
87年参照）。ヒトIL−６レセプターをコードするcDNAは
山崎らにより単離され、１次構造が報告されている（Sc
ience,241,p825,1988年参照）。さらにIL−６のシグナ
ル伝達が田賀らにより解析され、IL−６との結合能を有
する、細胞膜上のIL−６レセプター又は細胞表層より離
脱している（以下、可溶性と呼ぶ）IL−６レセプター
は、IL−６と結合後、細胞膜上のIL−６のシグナル伝達
に関与する蛋白質に結合し、シグナルが伝達されること
が示された（Cell,58,p573,1989年参照）。したがっ
て、IL−６と結合したIL−６レセプターが上記蛋白質に
結合しない場合はIL−６作用を阻害すると考えられる。
このように細胞膜上のIL−６レセプターあるいは可溶性
IL−６レセプターはIL−６のシグナル伝達を解析するた
めの材料としてもIL−６作用を増強あるいは阻害する物
質としても有用である。特に可溶性IL−６レセプター
は、細胞膜から離脱した状態で細胞膜上の場合と同じ構
造、機能を取りうるならば、細胞膜上のIL−６レセプタ
ーよりも蛋白質としての取り扱い、例えば水溶液への溶
解性、分離回収法の確立等において有利であると考えら
れる。
ーは、田賀らにより解析され、各細胞上の数、IL−６と
の結合定数が報告されている（J.Exp.Med.,196,p967,19
87年参照）。ヒトIL−６レセプターをコードするcDNAは
山崎らにより単離され、１次構造が報告されている（Sc
ience,241,p825,1988年参照）。さらにIL−６のシグナ
ル伝達が田賀らにより解析され、IL−６との結合能を有
する、細胞膜上のIL−６レセプター又は細胞表層より離
脱している（以下、可溶性と呼ぶ）IL−６レセプター
は、IL−６と結合後、細胞膜上のIL−６のシグナル伝達
に関与する蛋白質に結合し、シグナルが伝達されること
が示された（Cell,58,p573,1989年参照）。したがっ
て、IL−６と結合したIL−６レセプターが上記蛋白質に
結合しない場合はIL−６作用を阻害すると考えられる。
このように細胞膜上のIL−６レセプターあるいは可溶性
IL−６レセプターはIL−６のシグナル伝達を解析するた
めの材料としてもIL−６作用を増強あるいは阻害する物
質としても有用である。特に可溶性IL−６レセプター
は、細胞膜から離脱した状態で細胞膜上の場合と同じ構
造、機能を取りうるならば、細胞膜上のIL−６レセプタ
ーよりも蛋白質としての取り扱い、例えば水溶液への溶
解性、分離回収法の確立等において有利であると考えら
れる。
IL−６レセプターの様な生体内の存在量が極めて微量
な蛋白質を大量に生産するためには、遺伝子工学的な手
法が一般に用いられる。この手法では、目的とする蛋白
質をコードするDNAを発現させるためのプロモーター等
のDNAを、翻訳時に該DNAから目的蛋白質が生産されるよ
うに読取り可能に結合させ、このDNAを、宿主として選
定された微生物または培養細胞を形質転換することがで
きるベクターに導入し、このベクターで宿主を形質転換
した後該DNA配列を発現させる方法である。しかし、IL
−６レセプターの様な膜上の蛋白質を可溶形で発現させ
る場合、IL−６レセプター遺伝子に適当な変異を挿入
し、該遺伝子からIL−６と結合能を有する可溶性IL−６
レセプターが発現されなければならない。さらに発現さ
れたIL−６レセプターを同定し、IL−６との結合能を有
した状態で分離回収しなければならない。
な蛋白質を大量に生産するためには、遺伝子工学的な手
法が一般に用いられる。この手法では、目的とする蛋白
質をコードするDNAを発現させるためのプロモーター等
のDNAを、翻訳時に該DNAから目的蛋白質が生産されるよ
うに読取り可能に結合させ、このDNAを、宿主として選
定された微生物または培養細胞を形質転換することがで
きるベクターに導入し、このベクターで宿主を形質転換
した後該DNA配列を発現させる方法である。しかし、IL
−６レセプターの様な膜上の蛋白質を可溶形で発現させ
る場合、IL−６レセプター遺伝子に適当な変異を挿入
し、該遺伝子からIL−６と結合能を有する可溶性IL−６
レセプターが発現されなければならない。さらに発現さ
れたIL−６レセプターを同定し、IL−６との結合能を有
した状態で分離回収しなければならない。
本発明者は、IL−６レセプターについて鋭意研究を行
った結果、IL−６レセプター遺伝子に適当な変異を挿入
し、該遺伝子からIL−６と結合能を有する可溶性IL−６
レセプターを適当な宿主−ベクター系で発現させ、発現
した該蛋白質を同定し、遺伝子工学的に大量に該蛋白質
を生産し、さらにIL−６との結合能を有した状態で効率
良く該蛋白質を分離回収する方法を確立した。
った結果、IL−６レセプター遺伝子に適当な変異を挿入
し、該遺伝子からIL−６と結合能を有する可溶性IL−６
レセプターを適当な宿主−ベクター系で発現させ、発現
した該蛋白質を同定し、遺伝子工学的に大量に該蛋白質
を生産し、さらにIL−６との結合能を有した状態で効率
良く該蛋白質を分離回収する方法を確立した。
従って本発明は、ヒトインターロイキン−６（ヒトIL
−６）レセプター又はその誘導体をコードする遺伝子を
含有する発現ベクターにより形質転換された宿主を培養
し、そして当該培養物からヒトIL−６レセプター又はそ
の誘導体を採取することを特徴とするヒトIL−６レセプ
ター又はその誘導体の製造方法、並びにこの方法におい
て使用するための発現ベクター及び該発現ベクターによ
り形質転換された宿主を提供するものである。
−６）レセプター又はその誘導体をコードする遺伝子を
含有する発現ベクターにより形質転換された宿主を培養
し、そして当該培養物からヒトIL−６レセプター又はそ
の誘導体を採取することを特徴とするヒトIL−６レセプ
ター又はその誘導体の製造方法、並びにこの方法におい
て使用するための発現ベクター及び該発現ベクターによ
り形質転換された宿主を提供するものである。
1. IL−６レセプターをコードするDNA配列 本発明で提供される遺伝子工学的にIL−６レセプター
を生産するために用いるIL−６レセプターをコードする
DNA配列とは、報告されているIL−６レセプターをコー
ドするDNA配列、または、該配列中の１個あるいは複数
個のヌクレオチドが他のヌクレオチド配列に置換されて
おり、そして／または１個あるいは複数個のヌクレオチ
ドが欠失しており、そして／または１個あるいは複数個
のヌクレオチドが付加されているDNA配列である。ヌク
レオチド配列の置換としては、あるアミノ酸をコードす
るヌクレオチドから終止コドンへの変換等を例示するこ
とができる。該DNA配列はヒトIL−６レセプターcDNA等
を出発材料として作製してもよいし、合成してもよい。
を生産するために用いるIL−６レセプターをコードする
DNA配列とは、報告されているIL−６レセプターをコー
ドするDNA配列、または、該配列中の１個あるいは複数
個のヌクレオチドが他のヌクレオチド配列に置換されて
おり、そして／または１個あるいは複数個のヌクレオチ
ドが欠失しており、そして／または１個あるいは複数個
のヌクレオチドが付加されているDNA配列である。ヌク
レオチド配列の置換としては、あるアミノ酸をコードす
るヌクレオチドから終止コドンへの変換等を例示するこ
とができる。該DNA配列はヒトIL−６レセプターcDNA等
を出発材料として作製してもよいし、合成してもよい。
前記のごとき種々のDNA配列は、K.Yamasakiら、Scien
ce,241,p825,1988、及び特願平１−9774に記載されてお
り、これらの記載に基いて本発明のIL−６レセプターを
コードするDNAを得ることができる。
ce,241,p825,1988、及び特願平１−9774に記載されてお
り、これらの記載に基いて本発明のIL−６レセプターを
コードするDNAを得ることができる。
2. 発現ベクター 本発明で提供されるIL−６レセプターをコードするDN
A配列を発現する、即ちIL−６レセプターを生産しうる
複製可能な発現ベクターは、前項で説明したIL−６レセ
プターをコードするDNA配列、該DNA配列を発現させるた
めのDNA配列、及び宿主中でベクターDNAを複製するため
の複製起点等を有し、選定した宿主を形質転換できるも
のであれば、制限無く適宜選定して使用できる。該DNA
配列を発現させるためのDNA配列としてはプロモーター
系が重要であり、乳糖プロモーター系、トリプトファン
プロモーター系、GAL4プロモーター系、SV40プロモータ
ー系、アデノウイルスプロモーター系等が例示できるが
宿主との関係において適宜選定すればよい。またこれら
ベクターは、これらベクターを用いて選定された宿主を
形質転換させる操作に当たり、ベクターが導入されなか
った宿主と導入された宿主との選別を可能にするため例
えば、アンピシリン等の薬剤に対する耐性を宿主に付与
するためのDNA配列を含んでいることが望ましい。
A配列を発現する、即ちIL−６レセプターを生産しうる
複製可能な発現ベクターは、前項で説明したIL−６レセ
プターをコードするDNA配列、該DNA配列を発現させるた
めのDNA配列、及び宿主中でベクターDNAを複製するため
の複製起点等を有し、選定した宿主を形質転換できるも
のであれば、制限無く適宜選定して使用できる。該DNA
配列を発現させるためのDNA配列としてはプロモーター
系が重要であり、乳糖プロモーター系、トリプトファン
プロモーター系、GAL4プロモーター系、SV40プロモータ
ー系、アデノウイルスプロモーター系等が例示できるが
宿主との関係において適宜選定すればよい。またこれら
ベクターは、これらベクターを用いて選定された宿主を
形質転換させる操作に当たり、ベクターが導入されなか
った宿主と導入された宿主との選別を可能にするため例
えば、アンピシリン等の薬剤に対する耐性を宿主に付与
するためのDNA配列を含んでいることが望ましい。
3. 宿主 本発明では、特別な制限なしに通常の遺伝子工学的に
蛋白質を生産するために用いられる微生物または培養細
胞が使用できる。微生物としてはＫ−12等の種々の大腸
菌類、枯草菌類、酵母等を例示できる。培養細胞として
は、COS細胞（猿の腎臓線維芽細胞）、CHO細胞（チャイ
ニーズハムスターの卵巣細胞）、C127細胞（マウス癌細
胞）を例示することができる。
蛋白質を生産するために用いられる微生物または培養細
胞が使用できる。微生物としてはＫ−12等の種々の大腸
菌類、枯草菌類、酵母等を例示できる。培養細胞として
は、COS細胞（猿の腎臓線維芽細胞）、CHO細胞（チャイ
ニーズハムスターの卵巣細胞）、C127細胞（マウス癌細
胞）を例示することができる。
4. IL−６レセプターの精製 本発明で提供されるIL−６レセプターの遺伝子工学的
生産法により生産されたIL−６レセプターは、生産に用
いた微生物あるいは培養細胞中から、あるいはその培養
液中から、通常の生理活性蛋白質回収法によって分離回
収することができる。方法としては、市販の各種HPLC、
カラムを用いたクロマトグラフィー等を例示できる。ま
た培養液中から該蛋白質を分離回収するためには、培養
液中の他の蛋白質量の減少、例えば培養細胞を無血清培
地で培養して該蛋白質を発現させることにより、効率を
高めることができる。
生産法により生産されたIL−６レセプターは、生産に用
いた微生物あるいは培養細胞中から、あるいはその培養
液中から、通常の生理活性蛋白質回収法によって分離回
収することができる。方法としては、市販の各種HPLC、
カラムを用いたクロマトグラフィー等を例示できる。ま
た培養液中から該蛋白質を分離回収するためには、培養
液中の他の蛋白質量の減少、例えば培養細胞を無血清培
地で培養して該蛋白質を発現させることにより、効率を
高めることができる。
以下本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示
すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
実施例1. CHO細胞でのヒトIL−６レセプター発現用プ
ラスミドの作製 可溶性IL−６レセプターを製造するため、IL−６レセ
プター蛋白質のＣ末端側の膜貫通領域及び細胞内領域が
除去されたIL−６レセプターをCHO細胞で発現すること
ができるプラスミドpECEdhfr345を作製した。
ラスミドの作製 可溶性IL−６レセプターを製造するため、IL−６レセ
プター蛋白質のＣ末端側の膜貫通領域及び細胞内領域が
除去されたIL−６レセプターをCHO細胞で発現すること
ができるプラスミドpECEdhfr345を作製した。
まず、プラスミドpBSF2R.236（K.Yamasakiら、Scienc
e,241,p825,1988年、及び特願平１−9774参照）をSph I
により切断して、IL−６レセプター−Ｎ−末端側の402
個アミノ酸をコードする部分を含むcDNA断片を得た。こ
れをファージベクターmp18のSph I部位に挿入した後、
オリゴヌクレオチド５′−ATATTCTCTAGAGAGATTCT−３′
を用いて、オリゴヌクレオチド部位特異的invitro変異
体作製システム（アマーシャム）により、344個のアミ
ノ酸の後にTAGの終止コドンを挿入し、mp18−345を作製
した。
e,241,p825,1988年、及び特願平１−9774参照）をSph I
により切断して、IL−６レセプター−Ｎ−末端側の402
個アミノ酸をコードする部分を含むcDNA断片を得た。こ
れをファージベクターmp18のSph I部位に挿入した後、
オリゴヌクレオチド５′−ATATTCTCTAGAGAGATTCT−３′
を用いて、オリゴヌクレオチド部位特異的invitro変異
体作製システム（アマーシャム）により、344個のアミ
ノ酸の後にTAGの終止コドンを挿入し、mp18−345を作製
した。
なお、前記プラスミドpBSF2R,236中のIL−６レセプタ
ー遺伝子を市販のプラスミドpIBI76に挿入して得たプラ
スミドpIBIBSF2Rが微工研条寄第2232号（FERM BP−223
2）として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され
ている。
ー遺伝子を市販のプラスミドpIBI76に挿入して得たプラ
スミドpIBIBSF2Rが微工研条寄第2232号（FERM BP−223
2）として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され
ている。
次に、SV40初期プロモーター及び後期プロモーターを
有するプラスミドpECE（L.Ellisら、Cell,45,p721,1986
年参照）のPvu II部位に、pSV2−dhfr（Vectors for an
imal cells VIII−Ｂ−ｂ−ｉ−４）のdhfr遺伝子を発
現可能な方向に挿入し、新しいプラスミドpECEdhfrを作
製した。さらにこれをHind III及びSal Iにより切断
し、mp18−345の２本鎖DNAをHind III及びSal Iで切断
することにより得られるIL−６レセプターcDNAを含む断
片をこの部位に挿入し、pECEdhfr345を作製した。第１
図にpECEdhfr345の作製法を示し、第２図にpECEdhfr345
の構造を示す。
有するプラスミドpECE（L.Ellisら、Cell,45,p721,1986
年参照）のPvu II部位に、pSV2−dhfr（Vectors for an
imal cells VIII−Ｂ−ｂ−ｉ−４）のdhfr遺伝子を発
現可能な方向に挿入し、新しいプラスミドpECEdhfrを作
製した。さらにこれをHind III及びSal Iにより切断
し、mp18−345の２本鎖DNAをHind III及びSal Iで切断
することにより得られるIL−６レセプターcDNAを含む断
片をこの部位に挿入し、pECEdhfr345を作製した。第１
図にpECEdhfr345の作製法を示し、第２図にpECEdhfr345
の構造を示す。
実施例2. ヒトIL−６レセプター高発現CHO細胞の作製 pECEdhfr345をChenらの方法（Mol.Cell.Biol.,7,p274
5,1987年参照）により、dhfr遺伝子欠損CHO細胞株DXB−
11（G.Urlandら、Proc.N.A.S.,77,p4216,1980年参照）
に導入し、MTXでスクリーニングをし、IL−６レセプタ
ー高産生株TS3441を作製した。
5,1987年参照）により、dhfr遺伝子欠損CHO細胞株DXB−
11（G.Urlandら、Proc.N.A.S.,77,p4216,1980年参照）
に導入し、MTXでスクリーニングをし、IL−６レセプタ
ー高産生株TS3441を作製した。
培養上清中の可溶性IL−６レセプターの検出は昭和63
年特許願第194885号記載の方法により行った。すなわち
１μg/mlのMT18抗体（抗IL−６レセプター−モノクロー
ナル抗体）を含むPBSを96穴のマイクロタイタープレー
トに１ウエルあたり100μを加え、１晩４℃で放置し
た、洗浄後、１ウエルあたり100μの１％BSA−PBSを
加え、２時間室温で放置した。洗浄後、100μのCHO細
胞の培養上清（あるいはその希釈液）を加え、２時間室
温で放置した。洗浄後、100μの125I−IL−６を１ウ
エルあたり20,000cpm加え、２時間室温で放置した。洗
浄後、各ウエルを切断し、γ−カウンターで測定した。
この結果、発現プラスミドにより形質転換されていない
対照株の培養上清では約100cpmであるのに対して、TS34
41株の培養上清では約2700cpmであり、TS3441が可溶性I
L−６レセプターを産生していることが確認された。
年特許願第194885号記載の方法により行った。すなわち
１μg/mlのMT18抗体（抗IL−６レセプター−モノクロー
ナル抗体）を含むPBSを96穴のマイクロタイタープレー
トに１ウエルあたり100μを加え、１晩４℃で放置し
た、洗浄後、１ウエルあたり100μの１％BSA−PBSを
加え、２時間室温で放置した。洗浄後、100μのCHO細
胞の培養上清（あるいはその希釈液）を加え、２時間室
温で放置した。洗浄後、100μの125I−IL−６を１ウ
エルあたり20,000cpm加え、２時間室温で放置した。洗
浄後、各ウエルを切断し、γ−カウンターで測定した。
この結果、発現プラスミドにより形質転換されていない
対照株の培養上清では約100cpmであるのに対して、TS34
41株の培養上清では約2700cpmであり、TS3441が可溶性I
L−６レセプターを産生していることが確認された。
実施例3. 可溶性IL−６レセプター発現細胞の大量培養 TS3441を10層式細胞培養装置（Nunc社、セルファクト
リー）を用いて、10％牛胎児血清入αMEM培地２で密
な状態まで培養後、培地を除き、PBSで洗浄後、MEM non
−essential amino acid solution（Sigma社）及びＬ−
Glutamine（Sigma社）を含むエスクロンSF−Ｏ向血清培
地（三光純薬社）２に置換し培養した。３日後、培養
上清を回収し、新たな２のエスクロンSF−Ｏ培地でさ
らに４日間培養した。こうして計４の可溶性IL−６レ
セプター含有培養上清を得た。
リー）を用いて、10％牛胎児血清入αMEM培地２で密
な状態まで培養後、培地を除き、PBSで洗浄後、MEM non
−essential amino acid solution（Sigma社）及びＬ−
Glutamine（Sigma社）を含むエスクロンSF−Ｏ向血清培
地（三光純薬社）２に置換し培養した。３日後、培養
上清を回収し、新たな２のエスクロンSF−Ｏ培地でさ
らに４日間培養した。こうして計４の可溶性IL−６レ
セプター含有培養上清を得た。
実施例4. 可溶性IL−６レセプターの分離精製 実施例３に記載の４の可溶性IL−６レセプター含有
培養上清を遠心分離機5000rpm,10分間遠心し沈澱を除
き、0.22μｍのフィルターで濾過した。濾過液を排除分
子量１万の中空糸用限外濾過システム（東ソー）を用い
て500mlまで濃縮した。さらに、排除分子量１万の簡易
型窒素加圧式膜濃縮装置を用いて50mlまで濃縮した。濃
縮液は、20mMトリス塩酸緩衝液（pH8.5）で透析した。
これをTSK gel DEAE−5PWカラム（東ソー、55mm X 20c
m）にかけ、０から1Mの塩化ナトリウムの直線塩濃度勾
配法により溶出した。各フラクションを実施例２に記載
の方法、すなわち抗IL−６レセプターモノクローナル抗
体MT18と125I−IL−６を用いたサンドイッチ法により可
溶性IL−６レセプターを含む画分を得た。
培養上清を遠心分離機5000rpm,10分間遠心し沈澱を除
き、0.22μｍのフィルターで濾過した。濾過液を排除分
子量１万の中空糸用限外濾過システム（東ソー）を用い
て500mlまで濃縮した。さらに、排除分子量１万の簡易
型窒素加圧式膜濃縮装置を用いて50mlまで濃縮した。濃
縮液は、20mMトリス塩酸緩衝液（pH8.5）で透析した。
これをTSK gel DEAE−5PWカラム（東ソー、55mm X 20c
m）にかけ、０から1Mの塩化ナトリウムの直線塩濃度勾
配法により溶出した。各フラクションを実施例２に記載
の方法、すなわち抗IL−６レセプターモノクローナル抗
体MT18と125I−IL−６を用いたサンドイッチ法により可
溶性IL−６レセプターを含む画分を得た。
この画分を濃縮後、20mMリン酸緩衝液（pH7.0）,0.1M
NaClで平衡化したTSK gel G3000SWカラム（東ソー、2
1.5mm X 60cm）にかけた。上記の方法で可溶性IL−６レ
セプターを含む画分を集め、硫酸アンモニウムを加え、
30％（w/v）飽和状態にした。これを同濃度の硫酸アン
モニウム及び50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）で平衡化
したTSK gel Phenyl−5PWカラム（21.5mm X 20cm）にか
け、30％から０％飽和までの硫酸アンモニウムによる濃
度勾配で溶出し、可溶性IL−６レセプター精製標品を得
た。
NaClで平衡化したTSK gel G3000SWカラム（東ソー、2
1.5mm X 60cm）にかけた。上記の方法で可溶性IL−６レ
セプターを含む画分を集め、硫酸アンモニウムを加え、
30％（w/v）飽和状態にした。これを同濃度の硫酸アン
モニウム及び50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）で平衡化
したTSK gel Phenyl−5PWカラム（21.5mm X 20cm）にか
け、30％から０％飽和までの硫酸アンモニウムによる濃
度勾配で溶出し、可溶性IL−６レセプター精製標品を得
た。
第３図は、各種カラムクロマトグラフィーのパターン
を、第４図は可溶性IL−６レセプター精製標品のSDS/PA
GEのパターンを示す。
を、第４図は可溶性IL−６レセプター精製標品のSDS/PA
GEのパターンを示す。
本発明で提供されるIL−６レセプターの遺伝子工学的
生産法、及び該蛋白質の分離回収法により、自然状態で
は極めて微量にしか生産されないIL−６レセプターを大
量に生産することが可能である。また本発明で提供され
る該蛋白質を生産および分離回収する方法により、種々
の変異を挿入したIL−６レセプターを短期間で大量に生
産することが可能となる。このように本発明はIL−６作
用を調節する新しい治療薬として期待の大きい可溶性IL
−６レセプターの開発、及びIL−６のシグナル伝達機構
の研究に大きな意義をもつ。
生産法、及び該蛋白質の分離回収法により、自然状態で
は極めて微量にしか生産されないIL−６レセプターを大
量に生産することが可能である。また本発明で提供され
る該蛋白質を生産および分離回収する方法により、種々
の変異を挿入したIL−６レセプターを短期間で大量に生
産することが可能となる。このように本発明はIL−６作
用を調節する新しい治療薬として期待の大きい可溶性IL
−６レセプターの開発、及びIL−６のシグナル伝達機構
の研究に大きな意義をもつ。
また本発明で提供される該蛋白質はIL−６と強く結合
するので、該蛋白質を用いたIL−６濃度の測定法は、組
換え体IL−６を免疫原として作製した抗体を用いるIL−
６濃度測定法よりも有効であることが期待できる。
するので、該蛋白質を用いたIL−６濃度の測定法は、組
換え体IL−６を免疫原として作製した抗体を用いるIL−
６濃度測定法よりも有効であることが期待できる。
第１図は、プラスミドpECEdhfr345の作製過程を示す。 第２図は、プラスミドpECEdhfr345の構造を示す。 第３図は、（Ａ）イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー、（Ｂ）ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、（Ｃ）
疎水カラムクロマトグラフィーの溶出パターン（実線が
OD280、破線が可溶性IL−６レセプターの相対量を示
す。）を示す。 第４図は、精製された可溶性IL−６レセプターのSDS/PA
GEのパターンを示す。
ー、（Ｂ）ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、（Ｃ）
疎水カラムクロマトグラフィーの溶出パターン（実線が
OD280、破線が可溶性IL−６レセプターの相対量を示
す。）を示す。 第４図は、精製された可溶性IL−６レセプターのSDS/PA
GEのパターンを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 保川 清 神奈川県相模原市相模大野７―37―17 (56)参考文献 Ｓｃｉｅｎｃｅ（1988）Ｖｏｌ．241, Ｐ．825−828 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/06 C12N 15/24 C07K 14/54 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】膜結合部位が欠失した可溶性の「IL−６レ
セプターをコードする遺伝子」を含有する発現ベクター
により形質転換された宿主を培養して得られる培養物に
対して、少なくとも以下３種類のクロマトグラフィー操
作を行うことを特徴とする、製造された可溶性のIL−６
レセプターの製造方法： （ａ）イオン交換クロマトグラフィーによる分離操作、 （ｂ）ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる分離操
作、及び （ｃ）疎水カラムクロマトグラフィーによる分離操作。 - 【請求項２】膜結合部位が欠失した可溶性のIL−６レセ
プターをコードする遺伝子が、IL−６レセプターのＮ末
端345番目以降のアミノ酸残基を欠失したIL−６レセプ
ターをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項
１の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27186589A JP2935511B2 (ja) | 1989-10-20 | 1989-10-20 | ヒトｉｌ―６レセプターの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27186589A JP2935511B2 (ja) | 1989-10-20 | 1989-10-20 | ヒトｉｌ―６レセプターの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03133390A JPH03133390A (ja) | 1991-06-06 |
| JP2935511B2 true JP2935511B2 (ja) | 1999-08-16 |
Family
ID=17505976
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27186589A Expired - Lifetime JP2935511B2 (ja) | 1989-10-20 | 1989-10-20 | ヒトｉｌ―６レセプターの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2935511B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ724353A (en) * | 2012-11-05 | 2022-05-27 | Regeneron Pharma | Genetically modified non-human animals and methods of use thereof |
-
1989
- 1989-10-20 JP JP27186589A patent/JP2935511B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）Ｖｏｌ．２４１，Ｐ．８２５−８２８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03133390A (ja) | 1991-06-06 |
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