JP3043127B2 - 組換えヒトｇｐ１３０誘導体の製造方法及びそれに用いる組換えベクター - Google Patents
組換えヒトｇｐ１３０誘導体の製造方法及びそれに用いる組換えベクターInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒトｇｐ１３０の膜結合
部位が欠失した誘導体（可溶性ｇｐ１３０）の遺伝子組
換法による製造方法及びこの方法に使用するための発現
ベクタ−に関する。
部位が欠失した誘導体（可溶性ｇｐ１３０）の遺伝子組
換法による製造方法及びこの方法に使用するための発現
ベクタ−に関する。
【０００２】
【従来の技術】インタ−ロイキン−６（以下ＩＬ−６と
略す）は、標的細胞上のＩＬ−６レセプタ−と結合し、
さらにＩＬ−６とＩＬ−６レセプタ−の複合体が細胞上
の膜蛋白質ｇｐ１３０と結合することにより、種々の重
要な生理活性を誘導する（田賀ら、Cell, ５８， p５７
３，１９８９年参照）。最近ＩＬ−６の血小板増多効果
が発見され（石橋ら、 Blood, ７４， p１２４１，１９
８９年参照）、新しい薬剤として期待されている。一方
ＩＬ−６の異常産生が種々の自己免疫疾患の病因因子で
あることが報告されており、ＩＬ−６阻害剤は新しい薬
剤として期待されている（平野ら、Immunology today,
１１， p４４３，１９９０年参照）。例えば、ＩＬ−６
に対する抗体の投与が、末期ミエロ−マの患者に治療効
果を与えたとの報告がされている（B. Kleinら、Eur. C
ytokine Net., １， p１９３，１９９０年参照）が、副
作用の面で種々の問題がある。
略す）は、標的細胞上のＩＬ−６レセプタ−と結合し、
さらにＩＬ−６とＩＬ−６レセプタ−の複合体が細胞上
の膜蛋白質ｇｐ１３０と結合することにより、種々の重
要な生理活性を誘導する（田賀ら、Cell, ５８， p５７
３，１９８９年参照）。最近ＩＬ−６の血小板増多効果
が発見され（石橋ら、 Blood, ７４， p１２４１，１９
８９年参照）、新しい薬剤として期待されている。一方
ＩＬ−６の異常産生が種々の自己免疫疾患の病因因子で
あることが報告されており、ＩＬ−６阻害剤は新しい薬
剤として期待されている（平野ら、Immunology today,
１１， p４４３，１９９０年参照）。例えば、ＩＬ−６
に対する抗体の投与が、末期ミエロ−マの患者に治療効
果を与えたとの報告がされている（B. Kleinら、Eur. C
ytokine Net., １， p１９３，１９９０年参照）が、副
作用の面で種々の問題がある。
【０００３】ｇｐ１３０がＩＬ−６のシグナルを伝達す
る分子として発見されたため、ｇｐ１３０に対する抗体
はＩＬ−６阻害剤として期待される。実際、ヒト細胞か
ら調製した部分精製されたｇｐ１３０をマウスに免疫し
て得られた抗ｇｐ１３０モノクロ−ナル抗体ＡＭ６４
は、ＩＬ−６の高親和性結合を部分的に阻害した（日比
ら、Cell, ６３， p１１４９，１９９０年参照）。ＩＬ
−６阻害効果の強い抗ｇｐ１３０モノクロ−ナル抗体を
作製するためには、精製されたｇｐ１３０をマウスに免
疫し、多くの抗ｇｐ１３０モノクロ−ナル抗体産生ハイ
ブリド−マを作製し、ＩＬ−６阻害効果を指標にハイブ
リド−マを選別しなければならない。従って大量の精製
ｇｐ１３０が必要となる。しかしながら、ｇｐ１３０の
ような生体内の存在量が極めて微量な蛋白質は充分量精
製するのが不可能である。ヒトｇｐ１３０の遺伝子は日
比らにより単離され、ｇｐ１３０をコードするｃＤＮＡ
の塩基配列及びｇｐ１３０のアミノ酸配列が明らかにな
った（Cell, ６３， p１１４９，１９９０年参照）。し
かし、遺伝子工学的手法を用いてｇｐ１３０を充分量精
製するためには、充分量発現し、なおかつＩＬ−６とＩ
Ｌ−６レセプタ−の複合体（以下、複合体という）に結
合できるという性質を保持したｇｐ１３０の誘導体を発
見し、さらに発現ベクタ−、宿主、精製法等を考案しな
ければならないが、これらは依然として不明である。
る分子として発見されたため、ｇｐ１３０に対する抗体
はＩＬ−６阻害剤として期待される。実際、ヒト細胞か
ら調製した部分精製されたｇｐ１３０をマウスに免疫し
て得られた抗ｇｐ１３０モノクロ−ナル抗体ＡＭ６４
は、ＩＬ−６の高親和性結合を部分的に阻害した（日比
ら、Cell, ６３， p１１４９，１９９０年参照）。ＩＬ
−６阻害効果の強い抗ｇｐ１３０モノクロ−ナル抗体を
作製するためには、精製されたｇｐ１３０をマウスに免
疫し、多くの抗ｇｐ１３０モノクロ−ナル抗体産生ハイ
ブリド−マを作製し、ＩＬ−６阻害効果を指標にハイブ
リド−マを選別しなければならない。従って大量の精製
ｇｐ１３０が必要となる。しかしながら、ｇｐ１３０の
ような生体内の存在量が極めて微量な蛋白質は充分量精
製するのが不可能である。ヒトｇｐ１３０の遺伝子は日
比らにより単離され、ｇｐ１３０をコードするｃＤＮＡ
の塩基配列及びｇｐ１３０のアミノ酸配列が明らかにな
った（Cell, ６３， p１１４９，１９９０年参照）。し
かし、遺伝子工学的手法を用いてｇｐ１３０を充分量精
製するためには、充分量発現し、なおかつＩＬ−６とＩ
Ｌ−６レセプタ−の複合体（以下、複合体という）に結
合できるという性質を保持したｇｐ１３０の誘導体を発
見し、さらに発現ベクタ−、宿主、精製法等を考案しな
ければならないが、これらは依然として不明である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、上
記問題点を解決し、遺伝子工学的手法を用いて、大量の
精製ｇｐ１３０を提供しようとするものである。
記問題点を解決し、遺伝子工学的手法を用いて、大量の
精製ｇｐ１３０を提供しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
め、本発明者は、ｇｐ１３０について鋭意研究を行った
結果、ｇｐ１３０遺伝子に適当な変異を挿入し、該遺伝
子から複合体に結合できるという性質を保持した可溶性
ｇｐ１３０を適当な宿主−ベクタ−系で発現させ、発現
した該蛋白質を同定し、遺伝子工学的に大量に該蛋白質
を生産し、さらに複合体に結合できるという性質を保持
した状態で効率良く該蛋白質を分離回収する方法を確立
した。
め、本発明者は、ｇｐ１３０について鋭意研究を行った
結果、ｇｐ１３０遺伝子に適当な変異を挿入し、該遺伝
子から複合体に結合できるという性質を保持した可溶性
ｇｐ１３０を適当な宿主−ベクタ−系で発現させ、発現
した該蛋白質を同定し、遺伝子工学的に大量に該蛋白質
を生産し、さらに複合体に結合できるという性質を保持
した状態で効率良く該蛋白質を分離回収する方法を確立
した。
【０００６】すなわち、本発明は、少なくともヒトｇｐ
１３０の全細胞外部分を有しているが、膜貫通領域の全
部は含まない誘導体をコ−ドする遺伝子を含有する発現
ベクタ−により形質転換された宿主を培養し、そして当
該培養物から少なくともヒトｇｐ１３０の全細胞外部分
を有している、水溶性で、IL-6とIL-6Rとの複合体への
結合性を有する誘導体を採取することを特徴とするヒト
ｇｐ１３０誘導体の製造方法及びこの方法において使用
するための発現ベクターを提供する。
１３０の全細胞外部分を有しているが、膜貫通領域の全
部は含まない誘導体をコ−ドする遺伝子を含有する発現
ベクタ−により形質転換された宿主を培養し、そして当
該培養物から少なくともヒトｇｐ１３０の全細胞外部分
を有している、水溶性で、IL-6とIL-6Rとの複合体への
結合性を有する誘導体を採取することを特徴とするヒト
ｇｐ１３０誘導体の製造方法及びこの方法において使用
するための発現ベクターを提供する。
【０００７】［発明の具体的な説明］ １．可溶性ｇｐ１３０をコ−ドするＤＮＡ配列 本発明で提供される遺伝子工学的に可溶性ｇｐ１３０を
生産するために用いる可溶性ｇｐ１３０をコ−ドするＤ
ＮＡ配列とは、報告されているｇｐ１３０をコ−ドする
ＤＮＡ配列に適当な修飾を加え、本来ならば膜タンパク
質であるｇｐ１３０が、細胞から分泌されるようになっ
た可溶性ｇｐ１３０をコ−ドするＤＮＡ配列である。上
記適当な修飾法として、終止コドンを細胞外領域あるい
は膜貫通領域に挿入する方法、膜貫通領域を除去する方
法等があげられる。図７には、ヒトｇｐ１３０の全アミ
ノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡ配列が示されてお
り、このアミノ酸中、細胞外領域は第２３番目から第６
１９番目のアミノ酸配列に相当し、膜貫通領域は第６２
０番目から第６４１番目のアミノ酸配列に相当する。こ
れらの領域に終止コドンを挿入することは、例えば、イ
ンビトロミュータジェネシステム（アマシャム社製）の
ような、ＤＮＡに突然変異を挿入するための市販のキッ
トを用いることで容易に行なうことができ、また、これ
らの領域を除去することは、上記市販のキットを用いる
ことにより容易に行なうことができる。
生産するために用いる可溶性ｇｐ１３０をコ−ドするＤ
ＮＡ配列とは、報告されているｇｐ１３０をコ−ドする
ＤＮＡ配列に適当な修飾を加え、本来ならば膜タンパク
質であるｇｐ１３０が、細胞から分泌されるようになっ
た可溶性ｇｐ１３０をコ−ドするＤＮＡ配列である。上
記適当な修飾法として、終止コドンを細胞外領域あるい
は膜貫通領域に挿入する方法、膜貫通領域を除去する方
法等があげられる。図７には、ヒトｇｐ１３０の全アミ
ノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡ配列が示されてお
り、このアミノ酸中、細胞外領域は第２３番目から第６
１９番目のアミノ酸配列に相当し、膜貫通領域は第６２
０番目から第６４１番目のアミノ酸配列に相当する。こ
れらの領域に終止コドンを挿入することは、例えば、イ
ンビトロミュータジェネシステム（アマシャム社製）の
ような、ＤＮＡに突然変異を挿入するための市販のキッ
トを用いることで容易に行なうことができ、また、これ
らの領域を除去することは、上記市販のキットを用いる
ことにより容易に行なうことができる。
【０００８】また、該配列中の１個もしくは複数個のヌ
クレオチドが他のヌクレオチド配列により置換されてお
り、そして／または１個もしくは複数個のヌクレオチド
が欠失しており、そして／または１個もしくは複数個の
ヌクレオチドが付加されたものであっても、宿主細胞か
ら分泌され、かつ、ヒトｇｐ１３０の活性を保持するも
のは上記ＤＮＡ配列を有しているものとみなすこととす
る。ヌクレオチド配列の置換としては、あるアミノ酸を
コ−ドするヌクレオチドから別のアミノ酸をコ−ドする
ヌクレオチドへの変換等を例示することができる。該Ｄ
ＮＡ配列はヒトｇｐ１３０ｃＤＮＡ等を出発材料として
作製してもよいし、合成してもよい。
クレオチドが他のヌクレオチド配列により置換されてお
り、そして／または１個もしくは複数個のヌクレオチド
が欠失しており、そして／または１個もしくは複数個の
ヌクレオチドが付加されたものであっても、宿主細胞か
ら分泌され、かつ、ヒトｇｐ１３０の活性を保持するも
のは上記ＤＮＡ配列を有しているものとみなすこととす
る。ヌクレオチド配列の置換としては、あるアミノ酸を
コ−ドするヌクレオチドから別のアミノ酸をコ−ドする
ヌクレオチドへの変換等を例示することができる。該Ｄ
ＮＡ配列はヒトｇｐ１３０ｃＤＮＡ等を出発材料として
作製してもよいし、合成してもよい。
【０００９】２．発現ベクタ− 本発明で提供される可溶性ｇｐ１３０をコ−ドするＤＮ
Ａ配列を発現する、即ち可溶性ｇｐ１３０を生産しうる
複数可能な発現ベクタ−は、前項で説明した可溶性ｇｐ
１３０をコ−ドするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を発現さ
せるためのＤＮＡ配列、及び宿主中でベクタ−ＤＮＡを
複製するための複製起点等を有し、選定された宿主を形
質転換できるものであれば、制限なく適宜選定して使用
できる。該ＤＮＡ配列を発現させるためのＤＮＡ配列と
してはプロモ−タ−系が重要であり、乳糖プロモ−タ−
系、トリプトファンプロモ−タ−系、ＧＡＬ４プロモ−
タ−系、ＳＶ４０プロモ−タ−系、アデノウイルスプロ
モ−タ−系等が例示できるが、宿主との関係において適
宜選定すればよい。またこれらベクタ−は、これらベク
タ−を用いて選定された宿主を形質転換させる操作にあ
たり、ベクタ−が導入されなかった宿主と導入された宿
主との選別を可能にするため例えば、アンピシリン等の
薬剤に対する耐性を宿主に付与するためのＤＮＡ配列を
含んでいることが望ましい。
Ａ配列を発現する、即ち可溶性ｇｐ１３０を生産しうる
複数可能な発現ベクタ−は、前項で説明した可溶性ｇｐ
１３０をコ−ドするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を発現さ
せるためのＤＮＡ配列、及び宿主中でベクタ−ＤＮＡを
複製するための複製起点等を有し、選定された宿主を形
質転換できるものであれば、制限なく適宜選定して使用
できる。該ＤＮＡ配列を発現させるためのＤＮＡ配列と
してはプロモ−タ−系が重要であり、乳糖プロモ−タ−
系、トリプトファンプロモ−タ−系、ＧＡＬ４プロモ−
タ−系、ＳＶ４０プロモ−タ−系、アデノウイルスプロ
モ−タ−系等が例示できるが、宿主との関係において適
宜選定すればよい。またこれらベクタ−は、これらベク
タ−を用いて選定された宿主を形質転換させる操作にあ
たり、ベクタ−が導入されなかった宿主と導入された宿
主との選別を可能にするため例えば、アンピシリン等の
薬剤に対する耐性を宿主に付与するためのＤＮＡ配列を
含んでいることが望ましい。
【００１０】３．宿主 本発明では、特別の制限なしに通常の遺伝子工学的に蛋
白質を生産するために用いられる微生物又は培養細胞が
使用できる。微生物としてはＫ−１２等の種々の大腸菌
類、枯草菌類、酵母等を例示できる。培養細胞として
は、ＣＯＳ細胞（猿の腎臓繊維芽細胞）、ＣＨＯ細胞
（チャイニ−ズハムスタ−の卵巣細胞）、Ｃ１２７細胞
（マウス癌細胞）を例示することができる。
白質を生産するために用いられる微生物又は培養細胞が
使用できる。微生物としてはＫ−１２等の種々の大腸菌
類、枯草菌類、酵母等を例示できる。培養細胞として
は、ＣＯＳ細胞（猿の腎臓繊維芽細胞）、ＣＨＯ細胞
（チャイニ−ズハムスタ−の卵巣細胞）、Ｃ１２７細胞
（マウス癌細胞）を例示することができる。
【００１１】４．可溶性ｇｐ１３０の精製 本発明で提供される可溶性ｇｐ１３０の遺伝子工学的方
法により生産された可溶性ｇｐ１３０は、生産に用いた
微生物あるいは培養細胞中から、あるいはその培養液中
から、通常の生理活性蛋白質回収法によって分離回収す
ることができる。方法としては、市販のＨＰＬＣ、カラ
ムを用いたクロマトグラフィ−等を例示できる。また培
養液中から該蛋白質を分離回収するためには、培養液中
の他の蛋白質の減少、例えば培養細胞を無血清培地で培
養して該蛋白質を発現させることにより効率を高めるこ
とができる。
法により生産された可溶性ｇｐ１３０は、生産に用いた
微生物あるいは培養細胞中から、あるいはその培養液中
から、通常の生理活性蛋白質回収法によって分離回収す
ることができる。方法としては、市販のＨＰＬＣ、カラ
ムを用いたクロマトグラフィ−等を例示できる。また培
養液中から該蛋白質を分離回収するためには、培養液中
の他の蛋白質の減少、例えば培養細胞を無血清培地で培
養して該蛋白質を発現させることにより効率を高めるこ
とができる。
【００１２】
【実施例】以下本発明をさらに詳細に説明するために実
施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。
施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。
【００１３】実施例１．種々の可溶性ｇｐ１３０ｃＤＮ
Ａの作製。 可溶性ｇｐ１３０を製造するため、ｇｐ１３０をコ−ド
するｃＤＮＡの細胞外領域もしくは膜貫通領域に終止コ
ドンを挿入し、あるいは膜貫通領域を除去することによ
り、可溶性ｇｐ１３０ｃＤＮＡを作製した。
Ａの作製。 可溶性ｇｐ１３０を製造するため、ｇｐ１３０をコ−ド
するｃＤＮＡの細胞外領域もしくは膜貫通領域に終止コ
ドンを挿入し、あるいは膜貫通領域を除去することによ
り、可溶性ｇｐ１３０ｃＤＮＡを作製した。
【００１４】まず、プラスミドλｕ−５およびλｕ−７
（Hibi, T.ら、Cell, ６３，１１４９，１９９０年参
照）をEcoR Iにより切断してそれぞれ２１００bpおよび
１０００bpの断片を得た。これらの断片をライゲ−ショ
ンし、ファ−ジベクタ−mp１８に挿入することによっ
て、ｇｐ１３０の全アミノ酸をコ−ドするｃＤＮＡを含
むmp１８gp１３０を得た。mp１８gp１３０にオリゴヌク
レオチド5'-GGAAATATCCGCTCGAGATGTTGACGT-3' を用い
て、部位特異的in vitro変異体作製システム（アマ−シ
ャム）により、開始コドンの5'側にXho I サイトを挿入
し、mp１８gp１３０Xを作製した。
（Hibi, T.ら、Cell, ６３，１１４９，１９９０年参
照）をEcoR Iにより切断してそれぞれ２１００bpおよび
１０００bpの断片を得た。これらの断片をライゲ−ショ
ンし、ファ−ジベクタ−mp１８に挿入することによっ
て、ｇｐ１３０の全アミノ酸をコ−ドするｃＤＮＡを含
むmp１８gp１３０を得た。mp１８gp１３０にオリゴヌク
レオチド5'-GGAAATATCCGCTCGAGATGTTGACGT-3' を用い
て、部位特異的in vitro変異体作製システム（アマ−シ
ャム）により、開始コドンの5'側にXho I サイトを挿入
し、mp１８gp１３０Xを作製した。
【００１５】次に、mp１８gp１３０X にオリゴヌクレオ
チド5'-ACTCCAGTATATTGAGCTCGCTGATGGACCAG-3'及び5'-G
AAATTGAAGCCTGAGCTCATAGTCGTGCCT-3' をそれぞれ用い
て、５０１番目もしくは６２１番目のアミノ酸をコ−ド
するＤＮＡを終止コドンに変換した可溶性ｇｐ１３０ｃ
ＤＮＡ（ sgp５００および sgp６２０）を含むmp１８sg
p ５００およびmp１８sgp ６２０を作製した。
チド5'-ACTCCAGTATATTGAGCTCGCTGATGGACCAG-3'及び5'-G
AAATTGAAGCCTGAGCTCATAGTCGTGCCT-3' をそれぞれ用い
て、５０１番目もしくは６２１番目のアミノ酸をコ−ド
するＤＮＡを終止コドンに変換した可溶性ｇｐ１３０ｃ
ＤＮＡ（ sgp５００および sgp６２０）を含むmp１８sg
p ５００およびmp１８sgp ６２０を作製した。
【００１６】また、mp１８gp１３０X にオリゴヌクレオ
チド5'-CAAGGAGAAATTGAAAATAAGCGAGACCTA-3'を用いて、
６２０番目から６４１番目の膜貫通部分のアミノ酸をコ
−ドするＤＮＡを除去した可溶性ｇｐ１３０ｃＤＮＡ
（ sgpΔtm）を含むmp１８sgpΔtmを作製した。第１図
に作製した可溶性ｇｐ１３０ｃＤＮＡを示す。
チド5'-CAAGGAGAAATTGAAAATAAGCGAGACCTA-3'を用いて、
６２０番目から６４１番目の膜貫通部分のアミノ酸をコ
−ドするＤＮＡを除去した可溶性ｇｐ１３０ｃＤＮＡ
（ sgpΔtm）を含むmp１８sgpΔtmを作製した。第１図
に作製した可溶性ｇｐ１３０ｃＤＮＡを示す。
【００１７】実施例２．可溶性ｇｐ１３０ｃＤＮＡの発
現およびＩＬ−６とＩＬ−６レセプタ−の複合体への結
合の確認 前記実施例１において得られた種々の可溶性ｇｐ１３０
ｃＤＮＡすなわちsgp５００、 sgp６２０、 sgpΔtmを
動物細胞発現ベクタ−であるpSVL（ファルマシア）のXh
o I-Sac I 制限部位にそれぞれ挿入して pSVLsgp５０
０、 pSVLsgp６２０、pSVL sgpΔtmを作製した。これら
を、ＤＥＡＥデキストラン法によりＣＯＳ７細胞に導入
し、３日後、２mlのラベル用培地（メチオニンフリ−Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地、１０％透析ＦＣＳ）で３７℃、１
５分間プレインキュベ−トし、さらに 0.5mCi35 S-メニ
チオンを含む１mlのラベル用培地で３７℃、６時間イン
キュベ−トした後、培養液を回収した。
現およびＩＬ−６とＩＬ−６レセプタ−の複合体への結
合の確認 前記実施例１において得られた種々の可溶性ｇｐ１３０
ｃＤＮＡすなわちsgp５００、 sgp６２０、 sgpΔtmを
動物細胞発現ベクタ−であるpSVL（ファルマシア）のXh
o I-Sac I 制限部位にそれぞれ挿入して pSVLsgp５０
０、 pSVLsgp６２０、pSVL sgpΔtmを作製した。これら
を、ＤＥＡＥデキストラン法によりＣＯＳ７細胞に導入
し、３日後、２mlのラベル用培地（メチオニンフリ−Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地、１０％透析ＦＣＳ）で３７℃、１
５分間プレインキュベ−トし、さらに 0.5mCi35 S-メニ
チオンを含む１mlのラベル用培地で３７℃、６時間イン
キュベ−トした後、培養液を回収した。
【００１８】回収した培養液２００μl に５μg/mlの可
溶性ＩＬ−６レセプタ−を２００μl 加えた。２等分
し、一方には 5μg/mlのＩＬ−６（ＰＢＳに溶解）を１
００μl 、もう一方にはコントロ−ルとしてPBS を１０
０μl 加えた。それぞれに５μg/mlの抗ＩＬ−６レセプ
タ−モノクロ−ナル抗体ＭＴ１８（Hirata, Y.ら、J. I
mmunol. １４３， p２９００, １９８９年参照）を２μ
l 加え、４℃、１５時間インキュベ−トした。それぞれ
に、プロテインＡ−セファロース（ファルマシア）を１
５μl 加え、さらに４℃、１時間インキュベ−トし、遠
心した。免疫沈降体は１％ジギトニン洗浄液（１％ジギ
トニン、１０mMトリエタノ−ルアミン pH7.5、 0.15M Ma
Cl ）で４回洗浄したのち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−２
０% グラジエントゲル）、オ−トラジオグラフィ−を行
った。その結果第２図より明らかなように、レ−ン６と
レ−ン８にはそれぞれ可溶性ｇｐ１３０に相当するバン
ドが検出された。このことは、６２１番目のアミノ酸を
コ−ドするＤＮＡを終止コドンに変換したｃＤＮＡ由来
の可溶性ｇｐ１３０（レ−ン６）および膜貫通領域を除
去した可溶性ｇｐ１３０（レ−ン８）は、複合体と結合
することを示す。
溶性ＩＬ−６レセプタ−を２００μl 加えた。２等分
し、一方には 5μg/mlのＩＬ−６（ＰＢＳに溶解）を１
００μl 、もう一方にはコントロ−ルとしてPBS を１０
０μl 加えた。それぞれに５μg/mlの抗ＩＬ−６レセプ
タ−モノクロ−ナル抗体ＭＴ１８（Hirata, Y.ら、J. I
mmunol. １４３， p２９００, １９８９年参照）を２μ
l 加え、４℃、１５時間インキュベ−トした。それぞれ
に、プロテインＡ−セファロース（ファルマシア）を１
５μl 加え、さらに４℃、１時間インキュベ−トし、遠
心した。免疫沈降体は１％ジギトニン洗浄液（１％ジギ
トニン、１０mMトリエタノ−ルアミン pH7.5、 0.15M Ma
Cl ）で４回洗浄したのち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−２
０% グラジエントゲル）、オ−トラジオグラフィ−を行
った。その結果第２図より明らかなように、レ−ン６と
レ−ン８にはそれぞれ可溶性ｇｐ１３０に相当するバン
ドが検出された。このことは、６２１番目のアミノ酸を
コ−ドするＤＮＡを終止コドンに変換したｃＤＮＡ由来
の可溶性ｇｐ１３０（レ−ン６）および膜貫通領域を除
去した可溶性ｇｐ１３０（レ−ン８）は、複合体と結合
することを示す。
【００１９】実施例３．ＣＨＯ細胞での可溶性ｇｐ１３
０発現プラスミドの作製 宿主としてＣＨＯ細胞を使用するための、可溶性ｇｐ１
３０発現プラスミドを作製した。
０発現プラスミドの作製 宿主としてＣＨＯ細胞を使用するための、可溶性ｇｐ１
３０発現プラスミドを作製した。
【００２０】前記実施例１において得られた可溶性ｇｐ
１３０ｃＤＮＡを含むmp１８sgp ６２０をXho I - Sac
I で切断し、プラスミドpECEdhfr（Yasukawa, K.ら、J.
Biochem., １０８，６７３，１９９０年参照）のSal
I - Sac I 制限部位に挿入し、 pECEdhfrsgp６２０を作
製した。第３図に pECEdhfrsgp６２０の構造を示す。
１３０ｃＤＮＡを含むmp１８sgp ６２０をXho I - Sac
I で切断し、プラスミドpECEdhfr（Yasukawa, K.ら、J.
Biochem., １０８，６７３，１９９０年参照）のSal
I - Sac I 制限部位に挿入し、 pECEdhfrsgp６２０を作
製した。第３図に pECEdhfrsgp６２０の構造を示す。
【００２１】実施例４．可溶性ｇｐ１３０高発現ＣＨＯ
細胞の作製 pECEdhfrsgp６２０をChenらの方法（Mol. Cell. Biol.,
７， p２７４５，１９８７年参照）により、dhfr遺伝
子欠損ＣＨＯ細胞株DXB-１１（G.Urlandら、Proc. N.
A. S., ７７， p４２１６，１９８０年参照）に導入
し、ＭＴＸ（メソトレキセ−ト）でスクリ−ニングを
し、可溶性ｇｐ１３０高産生株 g１６を作製した。
細胞の作製 pECEdhfrsgp６２０をChenらの方法（Mol. Cell. Biol.,
７， p２７４５，１９８７年参照）により、dhfr遺伝
子欠損ＣＨＯ細胞株DXB-１１（G.Urlandら、Proc. N.
A. S., ７７， p４２１６，１９８０年参照）に導入
し、ＭＴＸ（メソトレキセ−ト）でスクリ−ニングを
し、可溶性ｇｐ１３０高産生株 g１６を作製した。
【００２２】培養上清中の可溶性ｇｐ１３０の検出は以
下のように行った。２μg/mlの抗ｇｐ１３０モノクロ−
ナル抗体ＡＭ６４（Taga, T.ら、Cell, ６３， p１１４
９，１９９０年参照）を含むコ−ト用緩衝液（0.05M 炭
酸ナトリウム、pH 9.6）を９６穴マイクロタイタ−プレ
−トに１ウエルあたり１００μl 加え、１晩４℃で放置
した。洗浄後、１ウエルあたり１００μl の１％BSA-PB
S を加え、１晩４℃で放置した。洗浄後、１００μl の
ＣＨＯ細胞の培養上清（あるいはその希釈液）を加え、
２時間室温で放置した。洗浄後、ＩＬ−６とＩＬ−６レ
セプタ−をそれぞれ５μg/ml含む１％BSA-PBS を１ウエ
ルあたり１００μl 加え、２時間室温で放置した。洗浄
後、５μg/mlのモルモット由来抗ヒトＩＬ−６レセプタ
−ポリクロ−ナル抗体を１ウエルあたり１００μl 加
え、１晩４℃で放置した。洗浄後、１０００倍希釈した
アルカリホスファタ−ゼ標識ウサギ由来抗モルモットイ
ムノグロブリン抗体（コスモバイオ）を１ウエルあたり
１００μl加え、２時間室温で放置した。洗浄後、１mg/
mlのアルカリホスファタ−ゼ基質（シグマ社製）を１
ウエルあたり１００μl 加え、３７℃で約３０分放置し
た後、４０５nmの発色を測定した。
下のように行った。２μg/mlの抗ｇｐ１３０モノクロ−
ナル抗体ＡＭ６４（Taga, T.ら、Cell, ６３， p１１４
９，１９９０年参照）を含むコ−ト用緩衝液（0.05M 炭
酸ナトリウム、pH 9.6）を９６穴マイクロタイタ−プレ
−トに１ウエルあたり１００μl 加え、１晩４℃で放置
した。洗浄後、１ウエルあたり１００μl の１％BSA-PB
S を加え、１晩４℃で放置した。洗浄後、１００μl の
ＣＨＯ細胞の培養上清（あるいはその希釈液）を加え、
２時間室温で放置した。洗浄後、ＩＬ−６とＩＬ−６レ
セプタ−をそれぞれ５μg/ml含む１％BSA-PBS を１ウエ
ルあたり１００μl 加え、２時間室温で放置した。洗浄
後、５μg/mlのモルモット由来抗ヒトＩＬ−６レセプタ
−ポリクロ−ナル抗体を１ウエルあたり１００μl 加
え、１晩４℃で放置した。洗浄後、１０００倍希釈した
アルカリホスファタ−ゼ標識ウサギ由来抗モルモットイ
ムノグロブリン抗体（コスモバイオ）を１ウエルあたり
１００μl加え、２時間室温で放置した。洗浄後、１mg/
mlのアルカリホスファタ−ゼ基質（シグマ社製）を１
ウエルあたり１００μl 加え、３７℃で約３０分放置し
た後、４０５nmの発色を測定した。
【００２３】実施例５．可溶性ｇｐ１３０発現細胞の大
量培養 g１６を１０層式細胞培養装置（Nunc社、セルファクト
リ−）を用いて、１０％牛胎児血清入α-MEM（核酸−）
培地２リットルで密な状態まで培養後、培地を除き、PB
S で洗浄後、MEM non-essential amino acid solution
（Sigma 社）およびL-Glutamine （Sigma 社）を含むエ
スクロン SF-０無血清培地（三光純薬社）２リットルに
置換し培養した。３日後、培養上清を回収し、新たな２
リットルエスクロン SF-０培地でさらに４日間培養し
た。この操作を５回繰り返して計２０リットルの可溶性
ｇｐ１３０含有培養上清を得た。
量培養 g１６を１０層式細胞培養装置（Nunc社、セルファクト
リ−）を用いて、１０％牛胎児血清入α-MEM（核酸−）
培地２リットルで密な状態まで培養後、培地を除き、PB
S で洗浄後、MEM non-essential amino acid solution
（Sigma 社）およびL-Glutamine （Sigma 社）を含むエ
スクロン SF-０無血清培地（三光純薬社）２リットルに
置換し培養した。３日後、培養上清を回収し、新たな２
リットルエスクロン SF-０培地でさらに４日間培養し
た。この操作を５回繰り返して計２０リットルの可溶性
ｇｐ１３０含有培養上清を得た。
【００２４】実施例６．可溶性ｇｐ１３０の分離精製 実施例５に記載の２０リットルの可溶性ｇｐ１３０含有
培養上清を遠心分離器で５０００rpm,１０分間遠心し、
沈殿を除き、0.22μm のフィルタ−で濾過した。濾過液
を排除分子量３万の中空糸型限外濾過システム（東ソ
−）を用いて1.5リットルまで濃縮した。さらに排除分
子量３万の卓上型平膜限外濾過システム（東ソ−）を用
いて１００mlまで濃縮した。濃縮液は、１０mMトリス塩
酸緩衝液（pH 8.0）で透析した。これを２回に分けてア
フィニティ−カラムすなわちＡＭ６４固定化済みTSKgel
Tresyl-５PWカラム（東ソ−、7.5mm × 7.5cm）にか
け、０から３M のチオシアン酸カリウムの直線塩濃度勾
配法により溶出した。各フラクションを実施例４に記載
の方法、すなわち抗ｇｐ１３０抗体ＡＭ６４と、複合体
によるサンドイッチ法によりアッセイした結果、可溶性
ｇｐ１３０を含む画分を得た。この画分を濃縮後、１０
mMリン酸緩衝液（pH 7.2）、0.15M NaClで平衡化したTS
Kgel G３０００SWカラム（東ソ−、21.5mm×60cm）にか
けることにより、可溶性ｇｐ１３０精製品を得た。
培養上清を遠心分離器で５０００rpm,１０分間遠心し、
沈殿を除き、0.22μm のフィルタ−で濾過した。濾過液
を排除分子量３万の中空糸型限外濾過システム（東ソ
−）を用いて1.5リットルまで濃縮した。さらに排除分
子量３万の卓上型平膜限外濾過システム（東ソ−）を用
いて１００mlまで濃縮した。濃縮液は、１０mMトリス塩
酸緩衝液（pH 8.0）で透析した。これを２回に分けてア
フィニティ−カラムすなわちＡＭ６４固定化済みTSKgel
Tresyl-５PWカラム（東ソ−、7.5mm × 7.5cm）にか
け、０から３M のチオシアン酸カリウムの直線塩濃度勾
配法により溶出した。各フラクションを実施例４に記載
の方法、すなわち抗ｇｐ１３０抗体ＡＭ６４と、複合体
によるサンドイッチ法によりアッセイした結果、可溶性
ｇｐ１３０を含む画分を得た。この画分を濃縮後、１０
mMリン酸緩衝液（pH 7.2）、0.15M NaClで平衡化したTS
Kgel G３０００SWカラム（東ソ−、21.5mm×60cm）にか
けることにより、可溶性ｇｐ１３０精製品を得た。
【００２５】第４図は、アフィニティ−カラムクロマト
グラフィ−のパタ−ンを、第５図はTSKgel G３０００SW
カラムクロマトグラフィ−のパタ−ンを示す。また第６
図には、可溶性ｇｐ１３０精製品のSDS-PAGEのパタ−ン
を示す。
グラフィ−のパタ−ンを、第５図はTSKgel G３０００SW
カラムクロマトグラフィ−のパタ−ンを示す。また第６
図には、可溶性ｇｐ１３０精製品のSDS-PAGEのパタ−ン
を示す。
【００２６】
【発明の効果】本発明で提供される可溶性ｇｐ１３０の
遺伝子工学的生産法、及び該蛋白質の分離回収法によ
り、自然状態では極めて微量にしか生産されないｇｐ１
３０と同等のものとして可溶性ｇｐ１３０を大量に生産
することが可能である。このことは、固体発生及び免疫
機構の研究、さらにはそれらの成果に基づく治療薬診断
薬等の開発に大きな意義を持つ。また抗ｇｐ１３０抗体
を作製するための免疫原、さらにはｇｐ１３０の免疫化
学的測定方法の標準物質として用いることもできる。
遺伝子工学的生産法、及び該蛋白質の分離回収法によ
り、自然状態では極めて微量にしか生産されないｇｐ１
３０と同等のものとして可溶性ｇｐ１３０を大量に生産
することが可能である。このことは、固体発生及び免疫
機構の研究、さらにはそれらの成果に基づく治療薬診断
薬等の開発に大きな意義を持つ。また抗ｇｐ１３０抗体
を作製するための免疫原、さらにはｇｐ１３０の免疫化
学的測定方法の標準物質として用いることもできる。
【図１】 種々の可溶性ｇｐ１３０ｃＤＮＡ。ＳＳはシ
グナルペプチド、ＥＣは細胞外部分、ＴＭは細胞膜貫通
部分、Ｃは細胞内部分をそれぞれコ−ドする領域を示
す。図の上部の数字は、それぞれの領域のＤＮＡがコ−
ドするアミノ酸の数を示す。
グナルペプチド、ＥＣは細胞外部分、ＴＭは細胞膜貫通
部分、Ｃは細胞内部分をそれぞれコ−ドする領域を示
す。図の上部の数字は、それぞれの領域のＤＮＡがコ−
ドするアミノ酸の数を示す。
【図２】 種々の可溶性ｇｐ１３０のＩＬ−６レセプタ
−との結合活性。レ−ン１および２はpSVL、レ−ン３お
よび４は pSVLsgp５００、レ−ン５および６は pSVLsgp
６２０、レ−ン７および８はpSVL sgpΔtmをそれぞれ導
入したＣＯＳ７細胞の培養液を、実施例２の方法により
レ−ン１、３、５、７はＩＬ−６非存在下で、レ−ン
２、４、６、８はＩＬ−６存在下でそれぞれ免疫沈降し
たものである。
−との結合活性。レ−ン１および２はpSVL、レ−ン３お
よび４は pSVLsgp５００、レ−ン５および６は pSVLsgp
６２０、レ−ン７および８はpSVL sgpΔtmをそれぞれ導
入したＣＯＳ７細胞の培養液を、実施例２の方法により
レ−ン１、３、５、７はＩＬ−６非存在下で、レ−ン
２、４、６、８はＩＬ−６存在下でそれぞれ免疫沈降し
たものである。
【図３】 プラスミド pECEdhfrsgp６２０の構造。
【図４】 アフィニティ−カラムクロマトグラフィ−の
溶出パタ−ン。←→は、可溶性ｇｐ１３０の活性画分を
示す。
溶出パタ−ン。←→は、可溶性ｇｐ１３０の活性画分を
示す。
【図５】 ゲル濾過カラムクロマトグラフィ−の溶出パ
タ−ン。←→は、可溶性ｇｐ１３０の活性画分を示す。
タ−ン。←→は、可溶性ｇｐ１３０の活性画分を示す。
【図６】 精製した可溶性ｇｐ１３０のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅのパタ−ン。
Ｅのパタ−ン。
【図７】 ヒトｇｐ１３０のアミノ酸配列及びそれをコ
ードするＤＮＡ配列を示す図。
ードするＤＮＡ配列を示す図。
フロントページの続き (72)発明者 岸本 忠三 大阪府富田林市中野町３丁目５番31号 (56)参考文献 Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．63，Ｎｏ．３ （1990），Ｐ．1149−1157 大沢利昭 編集，現代化学 増刊18 「サイトカインー免疫応答および細胞の 増殖・分化因子−」，（1990年４月26 日），株式会社 東京化学同人，ｐ．78 −83 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/08 C12N 5/00 - 5/28 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】 少なくともヒトｇｐ１３０の全細胞外部
分を有しているが、膜貫通領域の全部は含まない誘導体
をコ−ドする遺伝子を含有する発現ベクタ−により形質
転換された宿主を培養し、そして当該培養物から少なく
ともヒトｇｐ１３０の全細胞外部分を有している、水溶
性で、IL-6とIL-6Rとの複合体への結合性を有する誘導
体を採取することを特徴とするヒトｇｐ１３０誘導体の
製造方法。 - 【請求項２】 請求項１に記載の発現ベクタ−がプラス
ミドである請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記プラスミドがSV４０プロモ−タ−を
有する請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記プラスミドが発現可能なdhfr遺伝子
を有することを特徴とする請求項１ないし３のいずれか
１項に記載の方法。 - 【請求項５】 前記該宿主が動物細胞である請求項１に
記載の方法。 - 【請求項６】 前記動物細胞がＣＨＯ細胞である請求項
５に記載の方法。 - 【請求項７】 少なくともヒトｇｐ１３０の全細胞外部
分を有しているが、膜貫通領域の全部は含まない誘導体
をコ−ドするＤＮＡを含有する、請求項１ないし６のい
ずれか１項に記載の方法を行うための発現ベクタ−。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3217924A JP3043127B2 (ja) | 1991-08-02 | 1991-08-02 | 組換えヒトｇｐ１３０誘導体の製造方法及びそれに用いる組換えベクター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3217924A JP3043127B2 (ja) | 1991-08-02 | 1991-08-02 | 組換えヒトｇｐ１３０誘導体の製造方法及びそれに用いる組換えベクター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0622786A JPH0622786A (ja) | 1994-02-01 |
| JP3043127B2 true JP3043127B2 (ja) | 2000-05-22 |
Family
ID=16711867
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3217924A Expired - Lifetime JP3043127B2 (ja) | 1991-08-02 | 1991-08-02 | 組換えヒトｇｐ１３０誘導体の製造方法及びそれに用いる組換えベクター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3043127B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6579697B1 (en) | 1995-05-11 | 2003-06-17 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Modulator of TNF/NGF superfamily receptors and soluble oligomeric TNF/NGF superfamily receptors |
| US5683987A (en) * | 1994-07-12 | 1997-11-04 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Therapeutic oligonucleotides targeting the human MDR1 and MRP genes |
| GB9419021D0 (en) * | 1994-09-21 | 1994-11-09 | Applied Research Systems | Therapeutic protein |
| KR100754787B1 (ko) * | 2005-09-14 | 2007-09-06 | 알메탈주식회사 | 고내압 헤더탱크의 어셈블리 구조 |
-
1991
- 1991-08-02 JP JP3217924A patent/JP3043127B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．３（１９９０），Ｐ．１１４９−１１５７ |
| 大沢利昭 編集，現代化学 増刊１８「サイトカインー免疫応答および細胞の増殖・分化因子−」，（１９９０年４月２６日），株式会社 東京化学同人，ｐ．７８−８３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0622786A (ja) | 1994-02-01 |
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