JP3049613B2 - 組換えマウスｉｌ―６レセプターの製造方法 - Google Patents
組換えマウスｉｌ―６レセプターの製造方法Info
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- JP3049613B2 JP3049613B2 JP21588690A JP21588690A JP3049613B2 JP 3049613 B2 JP3049613 B2 JP 3049613B2 JP 21588690 A JP21588690 A JP 21588690A JP 21588690 A JP21588690 A JP 21588690A JP 3049613 B2 JP3049613 B2 JP 3049613B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は可溶性のマウスインターロイキン−６（マウ
スIL−６）レセプター、及び遺伝子組換法によるその製
造方法、並びにこの方法に使用するための遺伝子及び発
現ベクターに関する。
スIL−６）レセプター、及び遺伝子組換法によるその製
造方法、並びにこの方法に使用するための遺伝子及び発
現ベクターに関する。
インターロイキン−６（BSF2/以下IL−６と略す）
は、種々の重要な生理活性を有し、広く細胞の増殖分化
に関与しているタンパク質である。さらにIL−６の異常
産生が種々の自己免疫疾患の病因因子である可能性が報
告されている（岸本、平野、Ann.Rev.Immunol.,6,p485,
1988年参照）。
は、種々の重要な生理活性を有し、広く細胞の増殖分化
に関与しているタンパク質である。さらにIL−６の異常
産生が種々の自己免疫疾患の病因因子である可能性が報
告されている（岸本、平野、Ann.Rev.Immunol.,6,p485,
1988年参照）。
IL−６の阻害剤として、細胞膜上のヒトIL−６レセプ
ターあるいは細胞表層より離脱している（以下、可溶性
と呼ぶ。）ヒトIL−６レセプター、及びヒトIL−６レセ
プターに対する抗体が期待されるが、これらをマウス等
の実験動物に投与して、その効果を調べることが必須と
なる。しかし、可溶性ヒトIL−６レセプターあるいはヒ
トIL−６レセプターに対する抗体をマウス等の実験動物
に投与しても、実験動物のIL−６作用を抑制することが
期待できない。実験動物の中では、マウスが、取り扱い
の容易さにおいて、さらにはIL−６過剰産生により自己
免疫疾患になるストレスが確立されているという点にお
いて、最もその使用が望まれる。従って、可溶性ヒトIL
−６レセプターあるいはヒトIL−６レスプターに対する
抗体を薬剤として開発するには、可溶性マウスIL−６レ
セプターあるいはマウスIL−６レセプターに対する抗体
をマウスに投与してその薬効を調べることが重要にな
る。
ターあるいは細胞表層より離脱している（以下、可溶性
と呼ぶ。）ヒトIL−６レセプター、及びヒトIL−６レセ
プターに対する抗体が期待されるが、これらをマウス等
の実験動物に投与して、その効果を調べることが必須と
なる。しかし、可溶性ヒトIL−６レセプターあるいはヒ
トIL−６レセプターに対する抗体をマウス等の実験動物
に投与しても、実験動物のIL−６作用を抑制することが
期待できない。実験動物の中では、マウスが、取り扱い
の容易さにおいて、さらにはIL−６過剰産生により自己
免疫疾患になるストレスが確立されているという点にお
いて、最もその使用が望まれる。従って、可溶性ヒトIL
−６レセプターあるいはヒトIL−６レスプターに対する
抗体を薬剤として開発するには、可溶性マウスIL−６レ
セプターあるいはマウスIL−６レセプターに対する抗体
をマウスに投与してその薬効を調べることが重要にな
る。
IL−６レセプターの様な生体内の存在量が極めて微量
な蛋白質を大量に生産するためには、遺伝子工学的な手
法が一般に用いられる。この手法では、目的とする蛋白
質をコードするDNA配列を発現させるためのプロモータ
ー等のDNA配列を、翻訳時に該DNAから目的蛋白質が生産
されるように読取り可能に結合させ、このDNA配列を宿
主として選定された微生物または培養細胞を形質転換可
能なベクターに導入し、このベクターで宿主を形質転換
した後該DNA配列を発現させる方法である。しかし、IL
−６レセプターの様な本来膜上に存在する蛋白質を可溶
剤で発現させる場合、IL−６レセプター遺伝子に適当な
変異を挿入し、該遺伝子からIL−６と結合能を有する可
溶性IL−６レセプターが発現されなければならない。さ
らに発現されたIL−６レセプターを同定し、IL−６との
結合能を有する蛋白質を分離回収しなければならない。
な蛋白質を大量に生産するためには、遺伝子工学的な手
法が一般に用いられる。この手法では、目的とする蛋白
質をコードするDNA配列を発現させるためのプロモータ
ー等のDNA配列を、翻訳時に該DNAから目的蛋白質が生産
されるように読取り可能に結合させ、このDNA配列を宿
主として選定された微生物または培養細胞を形質転換可
能なベクターに導入し、このベクターで宿主を形質転換
した後該DNA配列を発現させる方法である。しかし、IL
−６レセプターの様な本来膜上に存在する蛋白質を可溶
剤で発現させる場合、IL−６レセプター遺伝子に適当な
変異を挿入し、該遺伝子からIL−６と結合能を有する可
溶性IL−６レセプターが発現されなければならない。さ
らに発現されたIL−６レセプターを同定し、IL−６との
結合能を有する蛋白質を分離回収しなければならない。
本発明者は、IL−６レセプターについて鋭意研究を行
った結果、マウスIL−６レセプター遺伝子に適当な変異
を挿入し、該遺伝子からIL−６と結合能を有する可溶性
IL−６レセプターを適当な宿主−ベクター系で発現さ
せ、発現した該蛋白質を同定し、遺伝子工学的に大量に
該蛋白質を生産し、さらにIL−６との結合能を有した状
態で効率良く該蛋白質を分離回収する方法を確立した。
った結果、マウスIL−６レセプター遺伝子に適当な変異
を挿入し、該遺伝子からIL−６と結合能を有する可溶性
IL−６レセプターを適当な宿主−ベクター系で発現さ
せ、発現した該蛋白質を同定し、遺伝子工学的に大量に
該蛋白質を生産し、さらにIL−６との結合能を有した状
態で効率良く該蛋白質を分離回収する方法を確立した。
従って本発明は、可溶性のマウスインターロイキン−
６（マウスIL−６）レセプター、及びそれをコードする
遺伝子を含有する発現ベクターにより形質転換された宿
主を培養し、そして当該培養物からマウスIL−６レセプ
ター又はその誘導体を採取することを特徴とする可溶性
マウスIL−６レセプターの製造方法、並びにこの方法に
おいて使用するための遺伝子及び発現ベクターを提供す
るものである。
６（マウスIL−６）レセプター、及びそれをコードする
遺伝子を含有する発現ベクターにより形質転換された宿
主を培養し、そして当該培養物からマウスIL−６レセプ
ター又はその誘導体を採取することを特徴とする可溶性
マウスIL−６レセプターの製造方法、並びにこの方法に
おいて使用するための遺伝子及び発現ベクターを提供す
るものである。
〔発明の具体的な説明〕 1. 可溶性マウスIL−６レセプター 本発明は、可溶性マウスIL−６レセプターに関する。
第７図にはマウスIL−６レセプターをコードするcDNAの
塩基配列、及びそれに対応するアミノ酸配列が示されて
おり、このアミノ酸配列は460アミノ酸残基からなり、
Ｎ末端側から第２番目に位置するロイシンから第19番目
に位置するアラニンにかけても、第358番目に位置する
セリンから第385番目に位置するロイシンにかけての部
分に疎水性アミノ酸残基が位置している、この２つの疎
水性領域は、前者がシグナルペプチド領域、後者が膜貫
通領域であると考えられる。
第７図にはマウスIL−６レセプターをコードするcDNAの
塩基配列、及びそれに対応するアミノ酸配列が示されて
おり、このアミノ酸配列は460アミノ酸残基からなり、
Ｎ末端側から第２番目に位置するロイシンから第19番目
に位置するアラニンにかけても、第358番目に位置する
セリンから第385番目に位置するロイシンにかけての部
分に疎水性アミノ酸残基が位置している、この２つの疎
水性領域は、前者がシグナルペプチド領域、後者が膜貫
通領域であると考えられる。
そこで、本発明においてはアミノ酸位置第323位の次
に部位特異的変異により翻訳終止コドンを挿入し、この
変異DNAを発現させることにより第323位で終るアミノ酸
配列を有する蛋白質が宿主細胞から分泌される可溶性で
あり且つIL−６に結合する能力を有することを見出し
た。この結果、少なくとも323位のアミノ酸までのアミ
ノ酸配列を含み、且つ第358位のセリンから始まると予
想される膜貫通領域を含有しない蛋白質は可溶性マウス
IL−６レセプターであることが明らかにされた。従って
本発明は、第２位のロイシンから第323位のイソロイシ
ンまでのアミノ酸配列を有する可溶性マウスIL−６レセ
プターを提供する。本発明はさらに上記アミノ酸配列に
１〜少数個のアミノ酸が付加されているか、又は上記ア
ミノ酸から１〜少数個のアミノ酸が欠失しているアミノ
酸配列を有しなおIL−６に結合することができる蛋白質
を包含する。
に部位特異的変異により翻訳終止コドンを挿入し、この
変異DNAを発現させることにより第323位で終るアミノ酸
配列を有する蛋白質が宿主細胞から分泌される可溶性で
あり且つIL−６に結合する能力を有することを見出し
た。この結果、少なくとも323位のアミノ酸までのアミ
ノ酸配列を含み、且つ第358位のセリンから始まると予
想される膜貫通領域を含有しない蛋白質は可溶性マウス
IL−６レセプターであることが明らかにされた。従って
本発明は、第２位のロイシンから第323位のイソロイシ
ンまでのアミノ酸配列を有する可溶性マウスIL−６レセ
プターを提供する。本発明はさらに上記アミノ酸配列に
１〜少数個のアミノ酸が付加されているか、又は上記ア
ミノ酸から１〜少数個のアミノ酸が欠失しているアミノ
酸配列を有しなおIL−６に結合することができる蛋白質
を包含する。
2. IL−６レセプターをコードするDNA 本発明で提供される遺伝子工学的にマウスIL−６レセ
プターを生産するために用いるIL−６レセプターをコー
ドするDNA配列とは、前記1.において記載した塩基配列
を有するDNA、または、該配列中の１個あるいは複数個
のヌクレオチドが他のヌクレオチド配列に置換されてお
り、そして／または１個あるいは複数個のヌクレオチド
が欠失しており、そして／または１個あるいは複数個の
ヌクレオチドが付加されているDNA配列である。該DNA配
列はマウスIL−６レセプターcDNA等を出発材料として作
製してもよいし、化学的に合成してもよい。
プターを生産するために用いるIL−６レセプターをコー
ドするDNA配列とは、前記1.において記載した塩基配列
を有するDNA、または、該配列中の１個あるいは複数個
のヌクレオチドが他のヌクレオチド配列に置換されてお
り、そして／または１個あるいは複数個のヌクレオチド
が欠失しており、そして／または１個あるいは複数個の
ヌクレオチドが付加されているDNA配列である。該DNA配
列はマウスIL−６レセプターcDNA等を出発材料として作
製してもよいし、化学的に合成してもよい。
前記のごとき種々のDNA配列は、特願平１−292230並
びに本明細書の参考例１及び第７図に記載されており、
この記載に基づいて本発明のマウスIL−６レセプターを
コードするDNAを得ることができる。
びに本明細書の参考例１及び第７図に記載されており、
この記載に基づいて本発明のマウスIL−６レセプターを
コードするDNAを得ることができる。
3. 発現ベクター 本発明で提供されるマウスIL−６レセプターをコード
するDNA配列を発現、即ちIL−６レセプターを生産しう
る複製可能な発現ベクターは、前項で説明したIL−６レ
セプターをコードするDNA配列、該DNA配列を発現させる
ためのDNA配列、及び宿主中でベクターDNAを複製するた
めの複製起点等を有し、選定した宿主を形質転換できる
ものであれば、制限無く適宜選定して使用できる。該DN
A配列を発現させるためのDNA配列としてはプロモーター
系が重要であり、乳糖プロモーター系、トリプトファン
プロモーター系、GAL4プロモーター系、SV40プロモータ
ー系、アデノウイルスプロモーター系等が例示できるが
宿主との関係において適宜選定する必要がある。またこ
れらベクターは、これらベクターを用いて選定された宿
主を形質転換させる操作に当たり、ベクターが導入され
なかった宿主と導入された宿主との選別を可能にするた
め例えば、アンピシリン等の薬剤に対する耐性を宿主に
付与するためのDNA配列を含んでいることが望ましい。
するDNA配列を発現、即ちIL−６レセプターを生産しう
る複製可能な発現ベクターは、前項で説明したIL−６レ
セプターをコードするDNA配列、該DNA配列を発現させる
ためのDNA配列、及び宿主中でベクターDNAを複製するた
めの複製起点等を有し、選定した宿主を形質転換できる
ものであれば、制限無く適宜選定して使用できる。該DN
A配列を発現させるためのDNA配列としてはプロモーター
系が重要であり、乳糖プロモーター系、トリプトファン
プロモーター系、GAL4プロモーター系、SV40プロモータ
ー系、アデノウイルスプロモーター系等が例示できるが
宿主との関係において適宜選定する必要がある。またこ
れらベクターは、これらベクターを用いて選定された宿
主を形質転換させる操作に当たり、ベクターが導入され
なかった宿主と導入された宿主との選別を可能にするた
め例えば、アンピシリン等の薬剤に対する耐性を宿主に
付与するためのDNA配列を含んでいることが望ましい。
4. 宿 主 本発明では、特別の制限なしに通常の遺伝子工学的に
蛋白質を生産するために用いられる微生物または培養細
胞が使用できる。微生物としてはＫ−12等の種々の大腸
菌類、枯草菌類、酵母等を例示できる。培養細胞として
は、COS細胞（猿の腎臓線維芽細胞）、CHO細胞（チャイ
ニーズハムスターの卵巣細胞）、C127細胞（マウス癌細
胞）等を例示することができる。
蛋白質を生産するために用いられる微生物または培養細
胞が使用できる。微生物としてはＫ−12等の種々の大腸
菌類、枯草菌類、酵母等を例示できる。培養細胞として
は、COS細胞（猿の腎臓線維芽細胞）、CHO細胞（チャイ
ニーズハムスターの卵巣細胞）、C127細胞（マウス癌細
胞）等を例示することができる。
5. マウスIL−６レセプターの精製 本発明で提供されるマウスIL−６レセプターの遺伝子
工学的生産法により生産されたIL−６レセプターは、生
産に用いた微生物あるいは培養細胞中から、あるいはそ
の培養液中から、通常の生理活性蛋白質回収法によって
分離回収することができる。この方法としては、市販の
各種HPLC、カラムを用いたクロマトグラフィー等を例示
できる。また培養液中から該蛋白質を分離回収するため
には、培養液中の他の蛋白質量の減少、例えば培養細胞
を無血清培地で培養して該蛋白質を発現させることによ
り、効率を高めることができる。
工学的生産法により生産されたIL−６レセプターは、生
産に用いた微生物あるいは培養細胞中から、あるいはそ
の培養液中から、通常の生理活性蛋白質回収法によって
分離回収することができる。この方法としては、市販の
各種HPLC、カラムを用いたクロマトグラフィー等を例示
できる。また培養液中から該蛋白質を分離回収するため
には、培養液中の他の蛋白質量の減少、例えば培養細胞
を無血清培地で培養して該蛋白質を発現させることによ
り、効率を高めることができる。
以下本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示
すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
実施例1. CHO細胞でのマウスIL−６レセプター発現用
プラスミドの作製 可溶性マウスIL−６レセプターを製造するため、マウ
スIL−６レセプター蛋白質のＣ末端側の膜貫通領域及び
細胞内領域が除去されたマウスIL−６レセプターをCHO
細胞で発現することができるプラスミドpECEdhfrm323を
作製した。
プラスミドの作製 可溶性マウスIL−６レセプターを製造するため、マウ
スIL−６レセプター蛋白質のＣ末端側の膜貫通領域及び
細胞内領域が除去されたマウスIL−６レセプターをCHO
細胞で発現することができるプラスミドpECEdhfrm323を
作製した。
まず、Lambda P1〔特願平１−（平成１年11月13日出
願）、及び本明細書の参考例１を参照のこと〕よりマウ
スIL−６レセプターをコードするcDNAを含むEcoR I−Ec
oR I断片を切りだし、M13mp18のEcoR Iサイトに挿入し
た。次に、オリゴヌクレオチド５′−AATCCTCTAGAACCCC
A−３′を用いて、オリゴヌクレオチドを用いた部位特
異的in vitro変異体作製システム（アマーシャム）によ
り、323番目のアミノ酸をコードするDNAの直後に終止コ
ドンを挿入し、mp18−MIL6R323を作製した。
願）、及び本明細書の参考例１を参照のこと〕よりマウ
スIL−６レセプターをコードするcDNAを含むEcoR I−Ec
oR I断片を切りだし、M13mp18のEcoR Iサイトに挿入し
た。次に、オリゴヌクレオチド５′−AATCCTCTAGAACCCC
A−３′を用いて、オリゴヌクレオチドを用いた部位特
異的in vitro変異体作製システム（アマーシャム）によ
り、323番目のアミノ酸をコードするDNAの直後に終止コ
ドンを挿入し、mp18−MIL6R323を作製した。
次に、SV40初期プロモーター及び後期プロモーターを
有するプラスミドpECE（L.Ellisら、Cell,45,p721,1986
年参照）のPvu II部位に、VIII−Ｂ−ｂ−ｉ−４由来の
dhfr遺伝子を発現可能な方向に挿入し、新しいプラスミ
ドpECEdhfrを作製した。さらこれをKpn I及びXba Iによ
り切断し、mp18−MIL6R323の２本鎖DNAをKpn I及びXba
Iで切断することにより得られるIL−６レセプターcDNA
を含む断片をこの部位に挿入し、pECEdhfrm332を作製し
た。第１図にpECEdhfrm323の作製法を示し、第２図にpE
CEdhfrm323の構造を示す。
有するプラスミドpECE（L.Ellisら、Cell,45,p721,1986
年参照）のPvu II部位に、VIII−Ｂ−ｂ−ｉ−４由来の
dhfr遺伝子を発現可能な方向に挿入し、新しいプラスミ
ドpECEdhfrを作製した。さらこれをKpn I及びXba Iによ
り切断し、mp18−MIL6R323の２本鎖DNAをKpn I及びXba
Iで切断することにより得られるIL−６レセプターcDNA
を含む断片をこの部位に挿入し、pECEdhfrm332を作製し
た。第１図にpECEdhfrm323の作製法を示し、第２図にpE
CEdhfrm323の構造を示す。
実施例2. マウスIL−６レセプター高発現CHO細胞の作
製 pECEdhfrm323をChenらの方法（Mol.Cell.Biol.,7,p27
45,1987年参照）により、dhfr遺伝子欠損CHO細胞株DXB
−11（G.Urlandら、Proc.,N.A.S.,77,p4216,1980年参
照）に導入し、MTX（メソトレキセート；シグマ社製）
でスクリーニングをし、可溶性マウスIL−６レセプター
高産生株MR25を作製した。
製 pECEdhfrm323をChenらの方法（Mol.Cell.Biol.,7,p27
45,1987年参照）により、dhfr遺伝子欠損CHO細胞株DXB
−11（G.Urlandら、Proc.,N.A.S.,77,p4216,1980年参
照）に導入し、MTX（メソトレキセート；シグマ社製）
でスクリーニングをし、可溶性マウスIL−６レセプター
高産生株MR25を作製した。
培養上清中の可溶性IL−６レセプターの検出は以下の
方法により行った。すなわち２μg/mlのMT18抗体（抗ヒ
トIL−６レセプターモノクローナル抗体、特願昭63第19
4885号参照）を含むPBSを96穴のマイクロタイタープレ
ートに１ウエルあたり100μ加え、１晩４℃で放置し
た。洗浄後、１ウエルあたり100μの１％BSA−PBSを
加え、２時間室温で放置した。洗浄後、100μの可溶
性ヒトIL−６レセプターを発現しているCHO細胞の培養
上清（特願昭63第194885号参照）を加え、２時間室温で
放置することにより該IL−６レセプターをプレートに固
定した。洗浄後、125I−ヒトIL−６（20,000cpm）と、
可溶性マウスIL−６レセプターを発現している細胞培養
上清の濃縮液とをそれぞれ50μづつ加え、２時間室温
で放置した。洗浄後、各ウエルを切断し、プレートに固
定された放射能をγ−カウンターで測定した〔第３図
（ａ）〕。対照としてpECEdhfrm323が導入されていない
細胞株DXB−11を同様に処理し放射能を測定した〔第３
図（ｂ）〕。
方法により行った。すなわち２μg/mlのMT18抗体（抗ヒ
トIL−６レセプターモノクローナル抗体、特願昭63第19
4885号参照）を含むPBSを96穴のマイクロタイタープレ
ートに１ウエルあたり100μ加え、１晩４℃で放置し
た。洗浄後、１ウエルあたり100μの１％BSA−PBSを
加え、２時間室温で放置した。洗浄後、100μの可溶
性ヒトIL−６レセプターを発現しているCHO細胞の培養
上清（特願昭63第194885号参照）を加え、２時間室温で
放置することにより該IL−６レセプターをプレートに固
定した。洗浄後、125I−ヒトIL−６（20,000cpm）と、
可溶性マウスIL−６レセプターを発現している細胞培養
上清の濃縮液とをそれぞれ50μづつ加え、２時間室温
で放置した。洗浄後、各ウエルを切断し、プレートに固
定された放射能をγ−カウンターで測定した〔第３図
（ａ）〕。対照としてpECEdhfrm323が導入されていない
細胞株DXB−11を同様に処理し放射能を測定した〔第３
図（ｂ）〕。
第３図はMR25が可溶性マウスIL−６レセプターを産生
していることを示している。
していることを示している。
実施例3. 可溶性マウスIL−６レセプター発現細胞の大
量培養 MR25を10層式細胞培養装置（Nunc社、セルファクトリ
ー）を用いて、10％牛胎児血清入α−MEM培地２リット
ルで密な状態まで培養後、培地を除き、PBSで洗浄後、M
EM non−essential aminoacid solution（Sigma社）及
びＬ−グルタミン（Sigma社）を含むエスクロンSF−０
無血清培地（三光純薬社）２リットルに置換し培養し
た。３日後、培養上清を回収し、新たな２リットルのエ
スクロンSF−０培地でさらに４日間培養した。こうして
計４リットルの可溶性IL−６レセプター含有無血清培養
上清を得た。
量培養 MR25を10層式細胞培養装置（Nunc社、セルファクトリ
ー）を用いて、10％牛胎児血清入α−MEM培地２リット
ルで密な状態まで培養後、培地を除き、PBSで洗浄後、M
EM non−essential aminoacid solution（Sigma社）及
びＬ−グルタミン（Sigma社）を含むエスクロンSF−０
無血清培地（三光純薬社）２リットルに置換し培養し
た。３日後、培養上清を回収し、新たな２リットルのエ
スクロンSF−０培地でさらに４日間培養した。こうして
計４リットルの可溶性IL−６レセプター含有無血清培養
上清を得た。
実施例4. 可溶性IL−６レセプターの分離精製 実施例３に記載の４リットルの可溶性IL−６レセプタ
ー含有培養上清の遠心分離機5000g,10分間遠心し沈澱を
除き、0.22μｍのフィルターで濾過した。濾過液を排除
分子量１万の中空系型限外濾過システム（東ソー）を用
いて500mlまで濃縮した。さらに、排除分子量１万の簡
易型窒素加圧式膜濃縮装置を用いて50mlまで濃縮した。
濃縮液を、20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）、0.1
5M NaClで透析した後、TSK gel Blue−5PWカラム（東ソ
ー、21.5mm×15cm）にかけ、０から3Mのチオシアン酸カ
リウムの直線濃度勾配法により溶出した。各フラクショ
ンを実施例２に記載の方法、すなわち固相勝した抗IL−
６レセプターモノクローナル抗体MT18に結合した可溶性
ヒトIL−６レセプターへの125I−ヒトIL−６の結合に対
する、溶出画分の阻害活性を指標として、可溶性マウス
IL−６レセプターを含む画分を得た。
ー含有培養上清の遠心分離機5000g,10分間遠心し沈澱を
除き、0.22μｍのフィルターで濾過した。濾過液を排除
分子量１万の中空系型限外濾過システム（東ソー）を用
いて500mlまで濃縮した。さらに、排除分子量１万の簡
易型窒素加圧式膜濃縮装置を用いて50mlまで濃縮した。
濃縮液を、20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）、0.1
5M NaClで透析した後、TSK gel Blue−5PWカラム（東ソ
ー、21.5mm×15cm）にかけ、０から3Mのチオシアン酸カ
リウムの直線濃度勾配法により溶出した。各フラクショ
ンを実施例２に記載の方法、すなわち固相勝した抗IL−
６レセプターモノクローナル抗体MT18に結合した可溶性
ヒトIL−６レセプターへの125I−ヒトIL−６の結合に対
する、溶出画分の阻害活性を指標として、可溶性マウス
IL−６レセプターを含む画分を得た。
この画分を10mMトリス塩酸緩衝液（PH8.0）で透析
し、同液で平衡したTSK gel DEAEカラム（東ソー、21.5
mm×15cm）にかけた。上記の方法で可溶性マウスIL−６
レセプターを含む画分を集め、さらに濃縮した。これを
20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）,0.15M NaClで平
衡化したTSK gel G3000SWカラム（東ソー、21.5mm×60c
m）にかけ、可溶性マウスIL−６レセプター精製標品を
得た。
し、同液で平衡したTSK gel DEAEカラム（東ソー、21.5
mm×15cm）にかけた。上記の方法で可溶性マウスIL−６
レセプターを含む画分を集め、さらに濃縮した。これを
20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）,0.15M NaClで平
衡化したTSK gel G3000SWカラム（東ソー、21.5mm×60c
m）にかけ、可溶性マウスIL−６レセプター精製標品を
得た。
第４図は、各種カラムクロマトグラフィーのパターン
を、そして第５図は可溶性マウスIL−６レセプター精製
標品のSDS/PAGEのパターンを示す。
を、そして第５図は可溶性マウスIL−６レセプター精製
標品のSDS/PAGEのパターンを示す。
本発明で提供されるマウスIL−６レセプターの遺伝子
工学的生産法、及び外蛋白質の分離回収法により、自然
状態では極めて微量にしか生産されないIL−６レセプタ
ーを大量に生産することが可能である。また本発明で提
供される該蛋白質を生産および分離回収する方法に基づ
くことにより、種々の変異を挿入したマウスIL−６レセ
プターを短期間で大量に生産することが可能となる。こ
のように本発明はIL−６作用を調節する新しい治療薬と
して期待の大きい可溶性IL−６レセプターの開発、及び
IL−６のシグナル伝達機構の研究に大きな意義をもつ。
工学的生産法、及び外蛋白質の分離回収法により、自然
状態では極めて微量にしか生産されないIL−６レセプタ
ーを大量に生産することが可能である。また本発明で提
供される該蛋白質を生産および分離回収する方法に基づ
くことにより、種々の変異を挿入したマウスIL−６レセ
プターを短期間で大量に生産することが可能となる。こ
のように本発明はIL−６作用を調節する新しい治療薬と
して期待の大きい可溶性IL−６レセプターの開発、及び
IL−６のシグナル伝達機構の研究に大きな意義をもつ。
参考例1. マウスIL−６レセプターcDNAの単離 一連の遺伝子組み換え操作方法（ｍ−RNAの抽出、DNA
の制限酵素による切断等）は、マニアティスらの方法
（Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory
1982年参照）、ハーウィンらの方法（DNA cloning,a Pr
actical Approaoh vol.1,p49,IRL,Oxford,1985年参照）
を参考にして行った。
の制限酵素による切断等）は、マニアティスらの方法
（Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory
1982年参照）、ハーウィンらの方法（DNA cloning,a Pr
actical Approaoh vol.1,p49,IRL,Oxford,1985年参照）
を参考にして行った。
まず、マウス・ミエローマ細胞株P3U1（AT CC CRL 19
57）からmRNAを抽出し、ラムダファージgt10（アマーシ
ャム）を用いてcDNAライブラリーを作製した。次にpBSF
2R.236（K.Yamasakiら、Science,241,p825,1988年参
照）のインサートcDNAのFsp I−Ban I断片をプローブと
して用い、7.3×105クローンを以下の条件でスクリーニ
ングした。プラークをブロットするフィルターにはナイ
ロンフィルターであるジーンスクリーンプラス（NEN
社）を用いた、ハイブリーダイゼーションは、１％SDS,
1M NaCl,0.05M Tris HCl（pH7.5）,5×デンハルト溶
液、200μ/mlサケ精子DNA存在下で、65℃で16時間行
った。その後、２×SSC,1％SDSで、60℃にてフィルター
を洗って非特異的にフィルターに結合したプローブを分
離させ、乾燥後、オートラジオグラフィーを行った。
57）からmRNAを抽出し、ラムダファージgt10（アマーシ
ャム）を用いてcDNAライブラリーを作製した。次にpBSF
2R.236（K.Yamasakiら、Science,241,p825,1988年参
照）のインサートcDNAのFsp I−Ban I断片をプローブと
して用い、7.3×105クローンを以下の条件でスクリーニ
ングした。プラークをブロットするフィルターにはナイ
ロンフィルターであるジーンスクリーンプラス（NEN
社）を用いた、ハイブリーダイゼーションは、１％SDS,
1M NaCl,0.05M Tris HCl（pH7.5）,5×デンハルト溶
液、200μ/mlサケ精子DNA存在下で、65℃で16時間行
った。その後、２×SSC,1％SDSで、60℃にてフィルター
を洗って非特異的にフィルターに結合したプローブを分
離させ、乾燥後、オートラジオグラフィーを行った。
なお、前記プラスミドpBSF2R.236を制限酵素Xho Iで
部分消化し、BSF2レセプターをコードする塩基配列をす
べて含有するDNA断片を得、これを市販のベクターpIBI7
6（IBI社）のSal I部位に挿入してプラスミドpIBIBSF2R
を作製した。このプラスミドpIBIBSF2Rを含有する大腸
菌HB101−pIBIBSF2Rは、工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研条寄第2232号（FERM BP−2232）として寄託
されている。このプラスミドから、常法に従って適当な
制限酵素によりBSF2レセプター蛋白質をコードするDNA
断片を切り出し、本発明で用いるプローブを作製するこ
とができる。
部分消化し、BSF2レセプターをコードする塩基配列をす
べて含有するDNA断片を得、これを市販のベクターpIBI7
6（IBI社）のSal I部位に挿入してプラスミドpIBIBSF2R
を作製した。このプラスミドpIBIBSF2Rを含有する大腸
菌HB101−pIBIBSF2Rは、工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研条寄第2232号（FERM BP−2232）として寄託
されている。このプラスミドから、常法に従って適当な
制限酵素によりBSF2レセプター蛋白質をコードするDNA
断片を切り出し、本発明で用いるプローブを作製するこ
とができる。
このようにして単離された１つのクローンをラムダP1
（lambda P1）と名付けた。第６図にラムダPQの制限酵
素地図および対応するIL−６レセプター蛋白質の模式図
を示す。しかしながら、ラムダP1のインサートcDNAの塩
基配列を決定した結果、ヒトIL−６レセプターとの比較
より、完全長のマウスIL−６レセプターがコードされて
いないことが判明した。
（lambda P1）と名付けた。第６図にラムダPQの制限酵
素地図および対応するIL−６レセプター蛋白質の模式図
を示す。しかしながら、ラムダP1のインサートcDNAの塩
基配列を決定した結果、ヒトIL−６レセプターとの比較
より、完全長のマウスIL−６レセプターがコードされて
いないことが判明した。
そこで、完全長のマウスIL−６レセプターcDNAを単離
する目的で、上記方法でBALB/cの脾臓からmRNAを抽出
し、gt10を用いてcDNAライブラリーを作製した。プロー
ブとして第６図のプローブを用い、通常の方法でスクリ
ーニングした結果、１つのスローン、ラムダ301（lambd
a 301）を単離した。ラムダ301のインサートcDNAの塩基
配列を決定した結果、ヒトIL−６レセプターとの比較よ
り、完全長のマウスIL−６レセプターがコードされてい
ることが判明した。
する目的で、上記方法でBALB/cの脾臓からmRNAを抽出
し、gt10を用いてcDNAライブラリーを作製した。プロー
ブとして第６図のプローブを用い、通常の方法でスクリ
ーニングした結果、１つのスローン、ラムダ301（lambd
a 301）を単離した。ラムダ301のインサートcDNAの塩基
配列を決定した結果、ヒトIL−６レセプターとの比較よ
り、完全長のマウスIL−６レセプターがコードされてい
ることが判明した。
ラムダP1とラムダ301のそれぞれコードするマウスIL
−６レセプターcDNA塩基配列を比較したところ、第１番
目のメチオニンから第385番目のロイシンまでをコード
するDNA配列は一致したが、それ以降のアミノ酸をコー
ドするDNA配列は全く異なっていた。さらに詳細な塩基
配列の解析を行ったところ、ラムダP1の第386番目以降
のアミノ酸をコードするDNA配列は、intra−cysternal
A−particle（IAP）遺伝子由来であることが判明した。
−６レセプターcDNA塩基配列を比較したところ、第１番
目のメチオニンから第385番目のロイシンまでをコード
するDNA配列は一致したが、それ以降のアミノ酸をコー
ドするDNA配列は全く異なっていた。さらに詳細な塩基
配列の解析を行ったところ、ラムダP1の第386番目以降
のアミノ酸をコードするDNA配列は、intra−cysternal
A−particle（IAP）遺伝子由来であることが判明した。
第６図に、ラムダ301の制限酵素地図および対応するI
L−６レセプター蛋白質の模式図を示す。第７図は、ラ
ムダ301のインサートcDNAの塩基配列および塩基配列か
ら推定されるマウスIL−６レセプターのアミノ酸配列を
示す。
L−６レセプター蛋白質の模式図を示す。第７図は、ラ
ムダ301のインサートcDNAの塩基配列および塩基配列か
ら推定されるマウスIL−６レセプターのアミノ酸配列を
示す。
第１図は、プラスミドpECEdhfrm323の作製過程を示す。
図中、B,E,F,H,K,P、及びＳは、BamH I,EcoR I,Fok I,H
ind III,Kpn I,Pst I、及びSma Iサイトをそれぞれ示
す。 第２図は、プラスミドpECEdhfrm323の構造を示す。 第３図は、（ａ）MR25細胞及び（ｂ）DXB−11細胞の無
血清培養上清を10倍に濃縮したもののIL−６結合活性
を、実施例２に示す方法で測定したのプレートの残存放
射能を示す。 第４図は、（Ａ）群特異性アフィニティーカラムクロマ
トグラフィー、（Ｂ）陰イオン交換カラムクロマトグラ
フィー、及び（Ｃ）ゲル濾過カラムクロマトグラフィー
の溶出パターン（実線がOD280、矢印が可溶性マウスIL
−６レセプター分画を示す。）を示す。 第５図は、精製された可溶性マウスIL−６レセプターの
SDS/PAGEのパターンを示す。 第６図は、ラムダP1及びラムダ301のcDNAの制限酵素地
図並びにマウスIL−６レセプター蛋白質の模式図、さら
にはプローブ１の位置を示す。ＢはBamH Iサイト、Ｅは
EcoR Iサイト、ＦはFok Iサイト、ＨはHind IIIサイ
ト、ＫはKpn Iサイト、ＰはPst Iサイト、ＳはSma Iサ
イトをそれぞれ示す。また、SSはシグナル配列、ECは細
胞外領域、TMは膜貫通領域、Ｃは細胞内領域を示す。 第７図は、ラムダ301のインサートcDNA、すなわちマウ
スIL−６レセプターをコードするDNA配列についてその
塩基配列を解析した結果、およびこのDNA配列が発現さ
れた場合に生産される蛋白質すなわちマウスIL−６レセ
プターの推定されるアミノ酸配列を示す。下線部分はＮ
末端側の疎水性アミノ酸領域を示し、二重下線部分はＣ
末端側の疎水性アミノ酸領域を示す。
図中、B,E,F,H,K,P、及びＳは、BamH I,EcoR I,Fok I,H
ind III,Kpn I,Pst I、及びSma Iサイトをそれぞれ示
す。 第２図は、プラスミドpECEdhfrm323の構造を示す。 第３図は、（ａ）MR25細胞及び（ｂ）DXB−11細胞の無
血清培養上清を10倍に濃縮したもののIL−６結合活性
を、実施例２に示す方法で測定したのプレートの残存放
射能を示す。 第４図は、（Ａ）群特異性アフィニティーカラムクロマ
トグラフィー、（Ｂ）陰イオン交換カラムクロマトグラ
フィー、及び（Ｃ）ゲル濾過カラムクロマトグラフィー
の溶出パターン（実線がOD280、矢印が可溶性マウスIL
−６レセプター分画を示す。）を示す。 第５図は、精製された可溶性マウスIL−６レセプターの
SDS/PAGEのパターンを示す。 第６図は、ラムダP1及びラムダ301のcDNAの制限酵素地
図並びにマウスIL−６レセプター蛋白質の模式図、さら
にはプローブ１の位置を示す。ＢはBamH Iサイト、Ｅは
EcoR Iサイト、ＦはFok Iサイト、ＨはHind IIIサイ
ト、ＫはKpn Iサイト、ＰはPst Iサイト、ＳはSma Iサ
イトをそれぞれ示す。また、SSはシグナル配列、ECは細
胞外領域、TMは膜貫通領域、Ｃは細胞内領域を示す。 第７図は、ラムダ301のインサートcDNA、すなわちマウ
スIL−６レセプターをコードするDNA配列についてその
塩基配列を解析した結果、およびこのDNA配列が発現さ
れた場合に生産される蛋白質すなわちマウスIL−６レセ
プターの推定されるアミノ酸配列を示す。下線部分はＮ
末端側の疎水性アミノ酸領域を示し、二重下線部分はＣ
末端側の疎水性アミノ酸領域を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 斎藤 貴司 神奈川県横浜市神奈川区大磯町石神台１ ―５―９ (72)発明者 保川 清 神奈川県相模原市相模大野７―37―17 (72)発明者 福永 剛 神奈川県横浜市旭区上白根町２―44―１ (72)発明者 二木 研輔 神奈川県横浜市緑区たちばな台２―７― ３ (72)発明者 大杉 義征 静岡県御殿場市駒門１丁目135番地 中 外製薬株式会社内 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/00 - 16/46 C12N 15/00 - 15/90 C12P 21/00 - 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】第７図中の第２位のロイシンから第323位
のイソロイシンまでのアミノ酸配列を有するマウスIL−
６レセプター蛋白質。 - 【請求項２】第７図中の第20位のロイシンから第323位
のイソロイシンまでのアミノ酸配列を有する可溶性マウ
スIL−６レセプター蛋白質。 - 【請求項３】請求項１または２に記載の蛋白質をコード
するDNA。 - 【請求項４】請求項３に記載のDNAが該DNAを発現させ得
る制御配列と連結されているDNA。 - 【請求項５】請求項４に記載のDNAを含んで成る発現ベ
クター。 - 【請求項６】請求項５に記載の発現ベクターにより形質
転換された宿主を培養し、そして培養物から可溶性マウ
スIL−６レセプター蛋白質を採取することを特徴とする
可溶性マウスIL−６レセプター蛋白質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21588690A JP3049613B2 (ja) | 1990-08-17 | 1990-08-17 | 組換えマウスｉｌ―６レセプターの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21588690A JP3049613B2 (ja) | 1990-08-17 | 1990-08-17 | 組換えマウスｉｌ―６レセプターの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0499800A JPH0499800A (ja) | 1992-03-31 |
| JP3049613B2 true JP3049613B2 (ja) | 2000-06-05 |
Family
ID=16679890
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21588690A Expired - Lifetime JP3049613B2 (ja) | 1990-08-17 | 1990-08-17 | 組換えマウスｉｌ―６レセプターの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3049613B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3458512B2 (ja) | 1995-02-23 | 2003-10-20 | 東ソー株式会社 | 骨密度の変動推定方法又は骨そしょう症の診断方法及びこれに用いる試薬キット |
-
1990
- 1990-08-17 JP JP21588690A patent/JP3049613B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0499800A (ja) | 1992-03-31 |
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