JPH0499800A - 組換えマウスil―6レセプターの製造方法 - Google Patents
組換えマウスil―6レセプターの製造方法Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
IL−6)レセプター、及び遺伝子組換法によるその製
造方法、並びにこの方法に使用するための遺伝子及び発
現ベクターに関する。
す)は、種々の重要な生理活性を有し、広く細胞の増殖
分化に関与しているタンパク質である。
因因子である可能性が報告されている(岸本、平野、A
nn、Rev、lml1luno1.、6. p485
.1988年参照)。
セプターあるいは細胞表層より離脱している(以下、可
溶性と呼ぶ、)ヒ) I L−6レセプター、及びヒト
I L−6レセプターに対する抗体が期待されるが、こ
れらをマウス等の実験動物に投与して、その効果を調べ
ることが必須となる。
I L−6レセプターに対する抗体をマウス等の実験動
物に投与しても、実験動物のI L−6作用を抑制する
ことが期待できない。実験動物の中では、マウスが、取
り扱いの容易さにおいて、さらにはr >6過剰産生に
より自己免疫疾患になるストレインが確立されていると
いう点において、最もその使用が望まれる。従って、可
溶性ヒトIL−6レセプターあるいはヒトIL−6レセ
プターに対する抗体を薬剤として開発するには、可溶性
マウスI L−6レセプターあるいはマウスI L−6
レセプターに対する抗体をマウスに投与してその薬効を
調べることが重要になる。
量な蛋白質を大量に生産するためには、遺伝子工学的な
手法が一般に用いられる。この手法では、目的とする蛋
白質をコードするDNA配列を発現させるためのプロモ
ーター等のDNA配列を、翻訳時に該DNAから目的蛋
白質が生産されるように読取り可能に結合させ、このD
NA配列を宿主として選定された微生物または培養細胞
を形質転換可能なベクターに導入し、このベクターで宿
主を形質転換した後該DNA配列を発現させる方法であ
る。しかし、IL−6レセプターの様な本来膜上に存在
する蛋白質を可溶型で発現させる場合、IL−6レセプ
ター遺伝子に適当な変異を挿入し、該遺伝子からTL−
6と結合能を有する可溶性I L−6レセプターが発現
されなければならない。さらに発現されたIL−6レセ
プターを同定し、IL−6との結合能を有する蛋白質を
分離回収しなければならない。
った結果、マウスIL−6レセプター遺伝子に適当な変
異を挿入し、該遺伝子からIL−6と結合能を有する可
溶性IL−6レセプターを適当な宿主−ベクター基で発
現させ、発現した該蛋白質を同定し、遺伝子工学的に大
量に該蛋白質を生産し、さらにIL−6との結合能を有
した状態で効率良く該蛋白質を分離回収する方法を確立
した。
(マウスI L−6)レセプター、及びそれをコードす
る遺伝子を含有する発現ベクターにより形質転換された
宿主を培養し、そして当該培養物からマウスIL−6レ
セプター又はその誘導体を採取することを特徴とする可
溶性マウスIL6レセプターの製造方法、並びにこの方
法において使用するための遺伝子及び発現ベクターを提
供するものである。
溶性マウスI L−6レセプターに関する。第7図には
マウスI L−6レセプターをコードするcDNAの塩
基配列、及びそれに対応するアミノ酸配列が示されてお
り、このアミノ酸配列は460アミノ酸残基からなり、
N末端側から第2番目に位置するロイシンから第19番
目に位置するアラニンにかけてと、第358番目に位置
するセリンから第385番目に位置するロイシンにかけ
ての部分に疎水性アミノ酸残基が位置している、この2
つの疎水性領域は、前者がシグナルペプチド領域、後者
が膜貫i!i領域であると考えられる。
に部位特異的変異により翻訳終止コドンを挿入し、この
変異DNAを発現させることにより第323位で終るア
ミノ酸配列を有する蛋白質が宿主細胞から分泌される可
溶性であり且つI L−6に結合する能力を有すること
を見出した。この結果、少なくとも323位のアミノ酸
までのアミノ酸配列を含み、且つ第358位のセゾンか
ら始まると予想される膜貫通領域を含有しない蛋白質は
可溶性マウスI L−6レセプターであることが明らか
にされた。従って本発明は、第2位のロイシンから第3
23位のイソロイシンまでのアミノ酸配列を有する可溶
性マウスI L−6レセプターを提供する。本発明はさ
らに上記アミノ酸配列に1〜少数個のアミノ酸が付加さ
れているか、又は上記アミノ酸から1〜少数個のアミノ
酸が欠失しているアミノ酸配列を有しなおIL−6に結
合することができる蛋白質を包含する。
供される遺伝子工学的にマウスIL6レセプターを生産
するために用いるIL−6レセプターをコードするDN
A配列とは、前記1゜において記載した塩基配列を有す
るDNA、または、該配列中の1個あるいは複数個のヌ
クレオチドが他のヌクレオチド配列に置換されており、
そして/または1個あるいは複数個、のヌクレオチドが
欠失しており、そして/または1個あるいは複数個のヌ
クレオチドが付加されているDNA配列である。1DN
A配列はマウスIL−6レセプターcDNA等を出発材
料として作製してもよいし、化学的に合成してもよい。
0並びに本明細書の参考例1及び第8図に記載されてお
り、この記載に基づいて本発明のマウスI L−6レセ
プターをコードするDNAを得ることができる。
ドするDNA配列を発現、即ちI L−6レセプターを
生産しうる複製可能な発現ベクターは、前項で説明した
I L−6レセプターをコードするDNA配列、該DN
A配列を発現させるためのDNA配列、及び宿主中でベ
クターDNAを複製するための複製起点等ををし、選定
した宿主を形質転換できるものであれば、制限無く適宜
選定して使用できる。該DNA配列を発現させるための
DNA配列としてはプロモーター系が重要であり、乳糖
プロモーター系、トリプトファンプロモーター系、GA
L4プロモーター系、SV40プtl−E−一ター系、
アデノウィルスプロモーター系等が例示できるが宿主と
の関係において適宜選定する必要がある。
れた宿主を形質転換させる操作に当たり、ベクターが導
入されなかった宿主と導入された宿主との選別を可能に
するため例えば、アンピシリン等の薬剤に対する耐性を
宿主に付与するためのDNA配列を含んでいることが望
ましい。
白質を生産するために用いられる微生物または培養細胞
が使用できる。微生物としてはに−12等の種々の大腸
菌類、枯草菌類、酵母等を例示できる。培養細胞として
は、CO3細胞(猿の腎臓線維芽細胞)、CHO細胞(
チャイニーズハムスターの卵巣細胞) 、C127細胞
(マウス癌細胞)等を例示することができる。
工学的生産法により生産されたI L−6レセプターは
、生産に用いた微生物あるいは培養細胞中から、あるい
はその培養液中から、通常の生理活性蛋白質回収法によ
って分離回収することができる。この方法としては、市
販の各種HPLC、カラムを用いたクロマトグラフィー
等を例示できる。また培養液中から該蛋白質を分離回収
するためには、培養液中の他の蛋白質量の減少、例えば
培養細胞を無血清培地で培養して該蛋白質を発現させる
ことにより、効率を高めることができる。
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
ウスI L−6レセプターを製造するため、マウスI
L−6レセプター蛋白質のC末端側の膜貫通領域及び細
胞内領域が除去されたマウスIL−6レセプターをCf
(O細胞で発現することができるプラスミドpEcEd
hfrm323を作製した。
1月13日出願)、及び本明細書の参考例1を参照のこ
と〕よりマウスI L−6レセプターをコードするcD
NAを含むEcoRI −EcoRI断片を切りだし、
M13mp18のEcoRIサイトに挿入した。次に、
オリゴヌクレオチド5 ’ −AATCCTCTAGA
ACCCCA −3’を用いて、オリゴヌクレオチドを
用いた部位特異的in vitro変異体作製システム
(アマ−ジャム)により、323番目のアミノ酸をコー
ドするDNAの直後に終止コドンを挿入し、mp18
MIL6R323を作製した。
を有するプラスミドpECE(L、Ellisら、Ce
1l。
に、■−B−b−3−4由来のdhfr遺伝子を発現可
能な方向に挿入し、新しいプラスミドpECEdhfr
を作製した。
plB−MIL6R323の2本鎖DNAをKpn I
及びXba Iで切断することにより得られるI L−
6レセプターcDNAを含む断片をこの部位に挿入し、
pEcEdhfrm323を作製した。第1図にpEc
Edhfrm323の作製法を示し、第2図にpEcE
dhfrm323の構造を示す。
1.Ce11.Biol、。
遺伝子欠損CHO細胞株DXB−11(G、Urlan
dら、Proc、N、A、S。
X (メソトレキセート;シグマ社製)でスクリーニン
グをし、可溶性マウスI L−6レセブタ一高産生株M
R25を作製した。
の方法により行った。すなわち2 Irg/ dのMT
18抗体(抗ヒトI L−6レセプタ一モノクローナル
抗体、特願昭63第194885号参照)を含むPBS
を96穴のマイクロタイタープレートにlウェルあたり
100J1!加え、1晩4°Cで放置した。洗浄後、1
ウエルあたり100mの1%BSA −PBSを加え、
2時間室温で放置した。洗浄後、100mの可溶性ヒト
I L−6レセプターを発現しているCHO細胞の培養
上清(特願昭63第194885号参照)を加え、2時
間室温で放置することにより該IL−6レセプターをプ
レートに固定した。洗浄後、″5I〜ヒトI L −6
(20、000cpa+)と、可溶性マウスI L−6
レセプターを発現している細胞培養上清の濃縮液とをそ
れぞれ50idづつ加え、2時間室温で放置した。洗浄
後、各ウェルを切断し、プレートに固定された放射能を
γ−カウンターで測定した[第3図(a))。対照とし
てpECEdhfrm323が導入されていない細胞株
DXB−11を同様に処理し放射能を測定した〔第3図
(b)〕。
を産性していることを示している。
O層層線細胞培養装置Nur+s社、セルフアクドリー
)を用いて、10%牛脂児血清人α−MEM培地2リッ
トルで密な状態まで培養後、培地を除き、PBSで洗浄
後、MEM non−essential amin。
−グルタミン(Sigma社)を含むニスクロン5F−
0無血清培地(三光純薬社)2リツトルに置換し培養し
た。3日後、培養上清を回収し、新たな2リツトルのニ
スクロン5F−0培地でさらに4日間培養した。
無血清培養上清を得た。
の4リツトルの可溶性I L−6レセプター含有培養上
清を遠心分離機5000g 、 10分間遠心し沈澱を
除き、0.221Mのフィルターで濾過した。濾過液を
排除分子量1万の中空糸型限外濾過システム(東ソー)
を用いて500−まで濃縮した。さらに、排除分子量1
万の簡易型窒素加圧成膜濃縮装置を用いて50M1まで
濃縮した。濃縮液を、20−Mリン酸ナトリウム緩衝液
(pH7,4) 、0.15MNaC1で透析した後、
TSK gel Blue−5P−カラム(東ソー、2
1.5謹X15C1+)にかけ、0から3Mのチオシア
ン酸カリウムの直線濃度勾配法により溶出した。各フラ
クションを実施例2に記載の方法、すなわち固相化した
抗I L−6レセプタ一モノクローナル抗体MT18に
結合した可溶性ヒ) I L−6レセプターへの125
1−ヒトI L−6の結合に対する、溶出画分の阻害活
性を指標として、可溶性マウスI L−6レセプターを
含む両分を得た。
で透析し、同波で平衡化したTSK get DEAE
カラム(東ソー、21.5+amX15Ω)にかけた。
分を集め、さらに濃縮した。これを20s+Mリン酸ナ
トリウム緩衝液(pH7,4)、 0.15M NaC
l1で平衡化したTSK gel G3000S−カラ
ム(東ソー、21.5mm X60cm)にかけ、可溶
性マウスI L−6レセプタ一精製標品を得た。
、そして第5図は可溶性マウスI L−6レセブタ一精
製標品のSDS/PAGEのパターンを示す。
子工学的生産法、及び該蛋白質の分離回収法により、自
然状態では極めて微量にしか生産されないI L−6レ
セプターを大量に生産することが可能である。また本発
明で提供される該蛋白質を生産および分離回収する方法
に基づくことにより、種々の変異を挿入したマウスIL
−6レセプターを短期間で大量に生産することが可能と
なる。
療薬として期待の大きい可溶性I L−6レセプターの
開発、及びI L−6のシグナル伝達機構の研究に大き
な意義をもつ。
プターcDNへの一連の遺伝子組み換え操作方法(a+
−RNAの抽出、DNAの制限酵素による切断等)は、
マニアティスらの方法(Molecular Clon
ing+ Co1d SpringHarbor La
boratory 1982年参照)、バーウィンらの
方法(DNA cloning、 a Practic
al Approach vol。
5年参照)を参考にして行った。
CCRL 1957)からmRNAを抽出し、ラムダフ
ァージgtlO(アマ−ジャム)を用いてcDNAライ
ブラリーを作製した。次にpBSF2R,236(K、
Yamasakiら、5cience、 241. p
825.1988年参照)のインサートcDNAのFs
p 1−Ban I断片をプローブとして用い、7.3
X10’クローンを以下の条件でスクリーニングした。
ターであるシーンスクリーンプラス(NEN社)を用い
た、ハイブリーダイゼーションは、1%SOS 、 I
M NaC1、0,05M Tris HCj2 (
pH7,5)、5Xデンハルト溶液、200眉/dサケ
精子DNA存在下で、65°Cで16時間行った。その
後、2XSSC,1%SDSで、60°Cにてフィルタ
ーを洗って非特異的にフィルターに結合したプローブを
分離させ、乾燥後、オートラジオグラフィーを行った。
Xho Iで部分消化し、B5F2レセプターをコード
する塩基配列をすべて含有するDNA断片を得、これを
市販のベクターpIB176(181社)の5a11部
位に挿入してプラスミドplBIBsF2Rを作製した
。このプラスミドplBIBsF2Rを含有する大腸菌
88101plBIBsF2Rは、工業技術院微生物工
業技術研究所に微工研条寄第2232号(FEI?M
BP−2232)として寄託されている。このプラスミ
ドから、常法に従って適当な制限酵素によりB5F2レ
セプター蛋白質をコードするDNA断片を切り出し、本
発明で用いるプローブを作製することができる。
1 (lambda PI)と名付けた。第6図にラム
ダP1の制限酵素地図および対応するI L−6レセプ
ター蛋白質の模式図を示す。しかしながら、ラムダP1
のインサートcDNAの塩基配列を決定した結果、ヒト
IL−6レセプターとの比較より、完全長のマウスIL
−6レセプターがコードされていないことが判明した。
を単離する目的で、上記方法でBALB/cの肺臓から
mRNAを抽出し、gtloを用いてcDNAライブラ
リーを作製した。プローブとして第6図のプローブを用
い、通常の方法でスクリーニングした結果、1つのクロ
ーン、ラムダ301(lambda 301)を単離し
た。ラムダ301のインサートcDNAの塩基配列を決
定した結果、ヒトI L−6レセプターとの比較より、
完全長のマウスI L−6レセプターがコードされてい
ることが判明した。
IL−6レセプターcDNA塩基配列を比較したところ
、第1番目のメチオニンから第385番目のロイシンま
でをコードするDNA配列は一致したが、それ以降のア
ミノ酸をコードするDNA配列は全く異なっていた。さ
らに詳細な塩基配列の解析を行ったところ、ラムダP1
の第386番目以降のアミノ酸をコードするDNA配列
は、1ntracysternal A−partic
le(IAP)遺伝子由来であることが判明した。
I L−6レセプター蛋白質の模式図を示す。
列および塩基配列から推定されるマウスI L−6レセ
プターのアミノ酸配列を示す。
過程を示す。図中、B、E、F、H,に、P、及びSは
、BamHI 、 EcoRI 、 FokI 、
HindI[[、KpnI 。 P s t I s及びSma Iサイトをそれぞれ示
す。 第2図は、プラスミドpEcEdhfra+323の構
造を示す。 第3図は、(a ) MR25細胞及び(b)DXB−
11細胞の無血清培養上清を10倍に濃縮したもののI
L6結合活性を、実施例2に示す方法で測定したのプレ
ートの残存放射能を示す。 第4図は、(A)群特巽性アフィニティーカラムクロマ
トグラフィー (B)陰イオン交換カラムクロマトグラ
フィー、及び(C)ゲル濾過カラムクロマトグラフィー
の溶出パターン(実線が0D28G、矢印が可溶性マウ
ス■L−6レセプター分画を示す。)を示す。 第5図は、精製された可溶性マウスI L−6レセプタ
ーの505/PAGEのパターンを示す。 第6図は、ラムダP1及びラムダ301のcDNAの制
限酵素地図並びにマウスIL−6レセプター蛋白質の模
式図、さらにはプローブlの位置を示す。 BはBamHIサイト、EはEcoRrサイト、FはF
ok 1サイト、Hは旧ndII[サイト、KはKpn
Iサイト、PはPstlサイト、SはSma Iサイ
トをそれぞれ示す。また、SSはシグナル配列、ECは
細胞外領域、TMは膜貫通領域、Cは細胞内領域を示す
。 第7図は、ラムダ301のインサートcDNA、すなわ
ちマウスI L−6レセプターをコードするDNA配列
についてその塩基配列を解析した結果、およびこのDN
A配列が発現された場合に生産される蛋白質すなわちマ
ウスI L−6レセプターの推定されるアミノ酸配列を
示す。下線部分はN末端側の疎水性アミノ酸領域を示し
、二重下線部分はC末端側の疎水性アミノ酸領域を示す
。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、マウスインターロイキン−6(マウスIL−6)と
特異的に結合することができ、細胞内領域を有しない可
溶性マウスIL−6レセプター蛋白質。 2、第7図中の第2位のロイシンから第323位のイソ
ロイシンまでのアミノ酸配列、あるいはこのアミノ酸配
列中の1又は複数個のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基
により置換されているか又は前記アミノ酸配列に1又は
複数個のアミノ酸残基が付加されているか又は前記アミ
ノ酸配列から1又は複数個のアミノ酸残基が欠失してい
る、アミノ酸配列を有する請求項1に記載のマウスIL
−6レセプター蛋白質。 3、請求項1に記載の蛋白質をコードするDNA。 4、請求項2に記載の蛋白質をコードするDNA。 5、請求項3又は4に記載のDNAが該DNAを発現さ
せ得る制御配列と連結されているDNA。 6、請求項5に記載のDNAを含んで成る発現ベクター
。 7、請求項6に記載の発現ベクターにより形質転換され
た宿主を培養し、そして培養物から可溶性マウスIL−
6レセプター蛋白質を採取することを特徴とする可溶性
マウスIL−6レセプター蛋白質の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP21588690A JP3049613B2 (ja) | 1990-08-17 | 1990-08-17 | 組換えマウスil―6レセプターの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP21588690A JP3049613B2 (ja) | 1990-08-17 | 1990-08-17 | 組換えマウスil―6レセプターの製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0499800A true JPH0499800A (ja) | 1992-03-31 |
JP3049613B2 JP3049613B2 (ja) | 2000-06-05 |
Family
ID=16679890
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP21588690A Expired - Lifetime JP3049613B2 (ja) | 1990-08-17 | 1990-08-17 | 組換えマウスil―6レセプターの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3049613B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6258552B1 (en) | 1995-02-23 | 2001-07-10 | Tosoh Corporation | Estimation of change in bone mineral density and diagnosis of osteoporosis |
-
1990
- 1990-08-17 JP JP21588690A patent/JP3049613B2/ja not_active Expired - Lifetime
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US6258552B1 (en) | 1995-02-23 | 2001-07-10 | Tosoh Corporation | Estimation of change in bone mineral density and diagnosis of osteoporosis |
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