JPH09118631A

JPH09118631A - 腫瘍壊死因子抑制蛋白質

Info

Publication number: JPH09118631A
Application number: JP8259739A
Authority: JP
Inventors: David Wallach; ヴァラックデビッド; Engelmann Hartmut; エンゲルマンハルトムット; Dan Aderka; アデルカダン; Rubinstein Menachem; ルビンスタインメナケム
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1987-09-13
Filing date: 1996-09-30
Publication date: 1997-05-06
Also published as: JPH02200A; ZA886818B; EP0308378A3; ES2067486T5; GR3014976T3; AU2206888A; IL83878A0; EP0308378B1; ES2067486T3; DE3852255D1; US20050245731A1; EP0308378B2; DE3852255T3; IL83878A; ATE114715T1; US5695953A; US5981701A; DE3852255T2; JP2755394B2; CA1341575C

Abstract

(57)【要約】【課題】腫瘍壊死因子抑制蛋白質の組換えＤＮＡ技術
による製造を提供することを目的とする。【解決手段】腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のレセプターへ
の結合及びＴＮＦの細胞毒性効果を抑制することのでき
るＴＮＦ抑制蛋白質をコードするＤＮＡ分子を含む発現
ベクターで宿主細胞を形質転換し得られる形質転換体を
培養することによりＴＮＦ抑制蛋白質が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、腫瘍壊死因子（Ｔ
ＮＦ）のレセプターへの結合抑制能力及びＴＮＦの細胞
毒性抑制能力を有しＴＮＦの有害な効果に対して使用す
ることのできるＴＮＦ抑制蛋白質、その塩、その機能的
誘導体及びその活性フラクションに関する。また本発明
は、ＴＮＦ抑制蛋白質の精製法、実質的に精製された該
蛋白質、及び組換えＤＮＡ技術による該蛋白質のクロー
ニング並びにその製造に関する。更に本発明は、ＴＮＦ
の有害な効果に対して保護するための、上記蛋白質、そ
の塩、その機能的誘導体、又はその活性フラクションを
含む薬学的組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）及びリン
ホトキシン又はＴＮＦ−α（以後、ＴＮＦ−αとＴＮＦ
−βの両者をＴＮＦと言う）は細胞に対して多くの効果
を及ぼすサイトカンである〔Ｗａｌｌａｃｈ，Ｄ．（１
９８６）；インターフェロン７（ＩｏｎＧｒｅｓｓｅ
ｒ，Ｅｄ．），ｐｐ．８３−１２２，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．とＣ
ｅｒａｍｉ，Ａ．（１９８７），ＮｅｗＥｎｇｌａｎ
ｄＪ．Ｍｅｄ．，３１６：３７９−３８５〕。ＴＮＦ
−α及びＴＮＦ−βは特定の細胞表面レセプターに結合
することによってその効果を始めて発揮する。その効果
のいくつかは組織にとって有益なものである。即ち、Ｔ
ＮＦ−αは、例えば腫瘍細胞またはウイルス感染細胞を
破壊し、顆粒球の抗菌活性を増大する。しかしながら、
ＴＮＦ−αは有害な作用も明らかに有している。ＴＮＦ
−αが過剰に産生されるとそれはいくつかの疾患の主た
る病原体としての役割りを演ずるという明らかな証拠が
ある。しかして、ＴＮＦ−αの管脈構造に及ぼす作用
は、敗血性ショック症状の主たる原因であることが知ら
れている〔Ｔｒａｃｅｙ，Ｋ．Ｊ．ｅｔａｌ．，（１
９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３４；４７０−４７４〕。
いくつかの疾患においては、ＴＮＦはアジポサイトの活
性を抑制するためにあるいは食欲不振を引き起こす（Ｔ
ＮＦ−αはカシエクチンとも言われている）ために、体
重の大幅な減少（悪態症）を起こす原因ともなる。また
ＴＮＦ−αは、リューマチ疾患における組織障害のメデ
ィエイターでもある（Ｂｅｕｔｌｅｒ，上記と同じ）。
またＴＮＦ−αは、移植片対宿主反応において観察され
る障害の主たるメディエイターであることが報告されて
いる。

【０００３】従って、内因的に形成されるＴＮＦ−α又
は外部から投与されるＴＮＦ−αを中和しあるいはその
作用を除去する方法を開発する必要がある。このような
方法を開発する本発明者らの最初の試みは、ＴＮＦ−α
の細胞毒性を中和するモノクローナル抗体を開発するこ
とであった。そしてこのようなモノクローナル抗体は、
敗血性ショックを引き起こすような条件下でＴＮＦ−α
の致死効果に対してマウスを保護する作用を有すること
が明らかにされた（Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＳｅｒｉａ
ｌＮｏ．０６／８０８，２６２；１９８５年１２月１
２日出願）。しかしながら、ムリンモノクローナル抗体
を用いた治療は、特に繰返し投与する場合には、ヒトに
対して適切な治療法とは必ずしも言えないものである。
従って、ＴＮＦ−αの効果を中和することのできる生物
学的試薬を開発することが必要である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本出願の優先権主張出
願日前においては、ＴＮＦ−αの細胞毒性を中和する生
物学的試薬の存在を示す報告はなされていない。８５−
ｋｄａの免疫抑制糖蛋白質であるウロモジリン（ｕｒｏ
ｍｏｄｕｌｉｎ）が妊娠した女性の尿から単離されたこ
とを記載する報告はある〔Ｍｕｃｈｍｏｒｅ，Ａｎｄｒ
ｅｗＶ．とＤｅｃｋｅｒ，ＪｅａｎＭ．（１９８
５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９；４７９−４８１〕。そし
てウロモジリンはインターロイキン１（ＩＬ−１）の高
親和性リガンドでありそしてＩＬ−１の強力な抑制剤で
あることが示されている〔Ｍｕｃｈｍｏｒｅ，Ａｎｄｒ
ｅｗＶ．とＤｅｃｋｅｒ，ＪｅａｎＭ．（１９８
６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１３４０４−１
３４０７；Ｂｒｏｗｎ，Ｋ．Ｍ．ｅｒａｌ．（１９８
６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
３：９１１９−９１２３〕。また後になって、ウロモジ
リンは、正常人の尿中に最も豊富に存在する腎由来の蛋
白質であるタムーホースフォール糖蛋白質と同じである
ことが示された〔Ｐｅｎｎｉｃａ，Ｄｉａｎｅｅｔ
ａｌ，（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６：８３−８
８〕。他の１つのＩＬ−１抑制因子が発熱患者の尿中に
見出されたことがいくつかの文献に報告されている〔Ｌ
ｉａｏ，Ｚｅｎｇｈｖａｅｔａｌ．（１９８４）
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５９：１２６−１３６；Ｓｅｃ
ｋｉｎｇｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｐｅｅｔ．ａｌ．（１
９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：１５４６−１５
４９〕。このＩＬ−１抑制因子は組換えＩＬ−１，ＩＬ
−１α及びＩＬ−１βに対して多くの生物学的活性をあ
る程度及ぼすことが示されている。ヒトＴＮＦ−αはＩ
Ｌ−１のいくつかの生物学的活性と同じ活性を有してい
るが、このＩＬ−１抑制因子はＴＮＦ−αの生物学的活
性を抑制しない〔Ｓｅｃｋｉｎｇｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐ
ｐｅｅｔａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１３９：１５４１−１５４５〕。

【０００５】本出願の優先権主張出願後に、ウロモジリ
ンとタムーホースフォール糖蛋白質はレクチン様相互作
用により組換えＩＬ−１α，ＩＬ−１β及びＴＮＦ−α
と結合することが報告されており、そしてこの事実がこ
れらリンホカインの循環レベルを調節する上で重要な役
割りをはたしていることが提案されている〔Ｈｅｓｓｉ
ｏｎ，Ｃａｔｈｅｒｉｎｅｅｔａｌ．（１９８７）
Ｓｃｉｅｎｃｅ２３７：１４７９−１４８４〕。ウロ
モジリンは、標的腫瘍細胞の溶解によってモニターした
所、ＴＮＦ−αの細胞毒性を抑制はしないが、糖鎖を介
してｒｅｃ．ＴＮＦ−αと相互に作用し、この相互作用
がＴＮＦ及び他のリンホカインの毒性のｉｎｖｉｖｏ
でのクリアランスの促進及び／又は該毒性のｉｎｖｉ
ｖｏでの減少に重要であることが示されている〔Ｓｈｅ
ｒｂｌｏｍ，ＡｎｎｅＰ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：５４１８−５４２４〕。Ｓｅｃ
ｋｉｎｇｅｒｅｔａｌ．の最近の報告によると、発
熱患者の尿から得られるＴＮＦ−αヒト抑制因子はＴＮ
Ｆ−αの細胞毒性を抑制する４０−６０ｋＤａの蛋白質
であることが記載されている〔Ｊ．Ｅｘｐ，Ｍｅｄ．
（１９８８）１６７：１５１１−１５１６〕。そしてそ
れはウロモジリンとも相違し、また上記したＩＬ−１抑
制因子とも相違することが示されている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、ＴＮＦ
の効果を中和することのできるＴＮＦ抑制蛋白質、その
塩、その機能的誘導体及びその活性フラクションが提供
される。この中和作用は、ＴＮＦが細胞表面レセプター
に結合するのを阻害する作用を測定するとともに、ＴＮ
Ｆ−αの細胞毒性の減少度を測定することによって判定
できる。また本発明は、実質的に純粋な形態にあり蛋白
質の不純物を含まない該ＴＮＦ抑制蛋白質に関する。更
に本発明は、ＴＮＦ抑制蛋白質の精製方法に関する。更
に本発明は、該蛋白質をコードするヌクレオチド配列を
含む組換えＤＮＡ分子、該分子を含む発現ベクター、そ
れによって形質転換された宿主細胞、及び該形質転換細
胞を適当な培養培地で培養したＴＮＦ抑制蛋白質を製造
する方法に関する。本発明のＴＮＦ抑制蛋白質、その
塩、その機能的誘導体及びその活性フラクションは、Ｔ
ＮＦの有害な効果に対して哺乳動物を保護するための薬
学的組成物の活性成分として使用される。

【０００７】図１Ａは、ＵｌｔｒｏｇｅｌＡＣＡ４
４ゲル濾過カラムからのＴＮＦ抑制蛋白質の溶出パター
ンを示す。２つの２ｍｌ画分を集め、２５８ｎｍでの吸
収による蛋白質量（────）、¹²⁵Ｉ−ＴＮＦ−αが
その細胞表面レセプターに結合するのを阻止する能力

【外１】及びＴＮＦ−α細胞毒性抑制能

【外２】についてテストした。ＴＮＦ抑制活性の主要ピークは、
主蛋白質ピークの少し前に溶出した。図１Ｂは、Ｕｌｔ
ｒｏｇｅｌＡＣＡ４４ゲル濾過を行なう前に水に対
して透析した場合のＴＮＦ抑制蛋白質の溶出パターンを
示す。図２は、ムリンＡ９細胞を、シクロヘキシミド
（ＣＨＩ）（ａ），ＴＮＦ−α−ＣＨＩ（ｂ），あるい
はＴＮＦ−α−ＣＨＩとＴＮＦ抑制蛋白質（ｃ）で処理
した時の形態を示す。

【０００８】図３は、ＴＮＦ抑制蛋白質の精製の第２工
程の結果を示す。カルボキシメチル（ＣＭ）セファロー
スで精製したＴＮＦ抑制蛋白質を、ＭｏｎｏＳ５／
５カチオン交換カラムの８×２ｍｌ部分に付し、１０ｍ
Ｍクエン酸及び０．０２％ナトリウムアジドを含む０−
３５０ｍＭＮａＣｌバッファー溶液（ｐＨ５．０）の
リニアーグラジエント(- - - - -）で溶出した。流速
０．５ｍｌ／分で溶出せしめて０．５ｍｌ画分を集め、
ムリンＡ９細胞に対するＴＮＦ細胞毒性の抑制について
テストした。ＴＮＦ抑制蛋白質の主要部分は、１８０−
２００ｍＭＮａＣｌの塩濃度で溶出した

【外３】２８０ｎｍでの吸収によって該蛋白質によって該蛋白質
をモニターした（────）。図４は、ＴＮＦ抑制蛋白
質の精製の第３工程の結果を示す。ＣＭ−セファロース
及びＭｏｎｏＳで精製した活性蛋白質を、５ｍＭナト
リウムボレート及び０．０２％ナトリウムアジドを含む
バッファー（ｐＨ９．０）に対して透析し、Ｍｏｎｏ
Ｑ５／５アニオン交換カラムに付した。結合蛋白質
を、０−６０ｍＭＮａＣｌリニアーグラジエント次いで
６０−３００ｍＭＮａＣｌリニアーグラジエントで、
流速０．５ｍｌ／分で溶出させた(- - - - -）。０．５
ｍｌ画分を集め、ムリンＡ９細胞に対するＴＮＦ細胞毒
性の抑制についてテストした。２８０ｎｍでの吸収を測
定することによって、溶出中の蛋白質をモニターした
（────）。図に示したように、３０−４０ｍＭの塩
濃度で活性を示す大部分が溶出した。

【０００９】図５は、逆相ＨＰＬＣでのＴＮＦ抑制蛋白
質の分離を示す。ＭｏｎｏＱ５／５から溶出した活性
蛋白質を、ＡｑｕａｐｏｒｅＲＰ−３００ＨＰＬＣカ
ラム（ＢｒｏｗｎｌｅｅＬａｂｓ）の１．６ｍｌ部分
に注入し、０．３％ＴＦＡ（バッファーＦ）水溶液で流
速０．５ｍｌ／分で流した。次いで、０−２０％アセト
ニトリルバッファーＦ溶液リニアーグラジエントで５分
間溶出し、次いで２０−５０％リニアーグラジエントで
６０分間、更に５０−８０％リニアーグラジエントで５
分間溶出した(- - - - -）。０．５ｍｌ画分を集め、ム
リンＡ９細胞に対するＴＮＦ細胞毒性の抑制についてテ
ストした。フルオレスカミン（ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉ
ｎｅ）で自動的に反応後、それぞれの画分のサンプルの
相対蛍光度を測定することによって、溶出中の蛋白質濃
度をモニターした（────）。ＴＮＦ抑制活性部分
が、分離した蛋白質ピークとともにシャープなピークと
して溶出した。

【００１０】図６は、各精製工程における活性物質のサ
ンプルをＳＤＳＰＡＧＥ〔ＬａｅｍｍｌｉＵ．Ｋ．
ｅｔａｌ．，（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ２２７：６
８０〕で分析した結果を示す。ＣＭ−セファロース、Ｍ
ｏｎｏＳ，ＭｏｎｏＱから溶出した活性画分であっ
てそれぞれ５μｇの蛋白質を含む活性画分のアリコート
を、６％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）及び１５％β−メルカプトエ
タノール（ｖ／ｖ）を含む３倍濃度サンプルバッファー
と混合し、１５％ポリアクリルアミドゲルに付した。Ｈ
ＰＬＣＲＰ３００カラムから溶出した画分２１−２３
（レーンＥ，Ｆ，Ｇ）のサンプルも同様に処理してゲル
に付した。分子量マーカーとして、α−ラクトアルブミ
ン１４．４ｋＤａ、大豆トリプシンインヒビター２０．
１ｋＤａ、カルボニックアンヒドラーゼ３０ｋＤａ、オ
ボアルブミン４３ｋＤａ、ウシ血清アルブミン６７ｋＤ
ａ及びホスホリラーゼｂ．９４ｋＤａの混合物を、レー
ンＡに流した。レーンＨでは、ブランクとしてサンプル
バッファーのみを流した。蛋白質バンドを銀発色により
視覚化せしめた。画分２１，２２及び２３は、見掛け分
子量２６−２８ｋＤａの単一バンドを示した。これらの
画分は、ムリンＡ９細胞に対するＴＮＦ−α細胞毒性の
抑制についてテストした所、活性を示すことが見出され
た。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明によれば、ＴＮＦのレセプ
ターへの結合を抑制しＴＮＦの細胞毒性効果を抑制する
能力のあるＴＮＦ抑制蛋白質、その塩、その機能的誘導
体、及びその活性フラクションが提供される。本発明に
よれば、ＴＮＦ抑制蛋白質はＴＮＦ−α及びＴＮＦ−β
の両者の生物学的活性を抑制できることが見出された。
しかして、ＴＮＦ抑制蛋白質によるこれらの２つのサイ
トカイン（本明細書ではＴＮＦと言う）の抑制も本発明
に包含される。本発明のＴＮＦ抑制蛋白質はヒトの尿中
に見出される。ヒト尿の濃縮物から得られるその粗調製
物を、ＵｌｔｒｏｇｅｌＡＣＡ４４ゲル濾過カラム
を用いたクロマトグラフィーに付した時には、それは４
０−８０ｋＤａの見掛け分子量を示した。蛋白質の不純
物を実質的に含まない、実質的に精製された蛋白質は、
還元条件下でＳＤＳＰＡＧＥにより分析した場合に
は、約２６−２８ｋＤａの見掛け分子量を示し、逆相高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）では単一ピーク
として移動した。その活性は、ヒトＨｅＬａ細胞及びＦ
Ｓ１１線維芽細胞の細胞レセプターへのＴＮＦ−αの結
合を抑制する能力及び／又はムリンＡ９細胞に対するＴ
ＮＦ−αの細胞毒性の抑制能力によって測定した。更に
は、以下に示すアミノ酸配列をそのＮ−末端に含んでい
るという特徴を有する。

【００１２】

【化２】

【００１３】上記式において、１４番目のＸで示される
アミノ酸は同定されなかった。４番目の位置にシステイ
ン（Ｃｙｓ）が存在するのは理論的に裏付けられてい
る。なぜなら、そのようなものとしてＰＴＨ（フェニル
チオヒダントイン）Ｃｙｓを同定することができず、他
のアミノ酸残基もこの位置では検出されなかったためで
ある。

【００１４】本明細書で言う“塩”とは、蛋白質分子の
カルボキシ基の塩及びアミノ基の酸付加塩の両者を指
す。カルボキシ基の塩は公知の方法によって形成するこ
とが出来、例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩、アン
モニウム塩、鉄塩、亜鉛塩などの無機塩；例えば、トリ
エタノールアミン、アルギニンもしくはリシン、ピペリ
ジン、プロカインなどのアミンと形成される有機塩基と
の塩等が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、塩
酸、硫酸などの無機酸との塩；例えば酢酸、オキザル酸
などの有機酸との塩等が挙げられる。

【００１５】本明細書で言う“機能的誘導体”とは、ア
ミノ酸残基の側鎖又はＮもしくはＣ−末端の官能基から
公知の方法によって調製される誘導体を包含するもので
あり、それらが薬学的に許容し得るものである限り、即
ち、それらが蛋白質の活性を破壊せずそしてそれらを含
む組成物に対して毒性を与えるものでない限り本発明に
包含される。これらの誘導体としては、例えば、カルボ
キシ基の脂肪族エステル；アンモニア、第１級アミン又
は第２級アミンとの反応から得られるカルボキシ基のア
ミド；アシル部分（例えばアルカノイル又はカルボサイ
クリックアロイル）との反応で形成されるアミノ酸残基
のフリーアミノ酸のＮ−アシル誘導体；アシル部分との
反応で形成されるフリーカルボキシ基（例えばセリル、
スレオニル残基のカルボキシ基）のＯ−アシル誘導体な
どが挙げられる。

【００１６】ＴＮＦ抑制蛋白質の“活性フラクション”
としては、例えば、蛋白質分子のみのポリペプチド鎖の
断片もしくは前駆体；関連分子あるいは糖残基、リン酸
残基などの残基を有する蛋白質分子のポリペプチド鎖の
断片もしくは前駆体；蛋白質分子あるいは糖残基自体の
凝集体などが包含される。但しこれらのフラクション
は、ＴＮＦのレセプターへの結合を抑制する能力を有し
そしてｉｎｖｉｔｒｏで細胞に対するＴＮＦの細胞毒
性の抑制能力を有していなければならない。

【００１７】

【実施例】

１．ＴＮＦ抑制蛋白質の予備的特徴付け及び最初の精
製粗精製物の状態での予備的特徴付けの段階において、Ｔ
ＮＦ抑制蛋白質の以下の特性及び活性が観察された。（ａ）ＴＮＦ抑制活性は、病人と同様に健常人の尿中
でも見出される。（ｂ）活性蛋白質は、１０ｋＤａ分子量排除膜を通し
ては透析できない。（ｃ）ＵｌｔｒｏｇｅｌＡＣＡ４４ゲル濾過カラ
ムを用いたクロマトグラフィーに付した時の活性ＴＮＦ
抑制蛋白質の見掛け分子量は、４０ｋＤａと８０ｋＤａ
の間であった。水に対して充分に透析した場合でも、こ
の方法での蛋白質の挙動には変化はなかった（図１Ａ及
び図１Ｂ）。（ｄ）分離等電点法で測定した活性蛋白質の等電点
は、ｐＨ６と８の間であった。（ｅ）コンカナバリン−Ａセファロースに活性蛋白質
の１部が結合し、そしてそれはメチル−α−Ｄ−マンノ
ピラノシドで特異的に溶出できた。このことは該蛋白質
が糖蛋白質であることを示している。（ｆ）ＴＮＦ抑制活性は熱に対して不安定であった。（ｇ）ＴＮＦ抑制蛋白質の生物学的活性は、各種のプ
ロテアーゼインヒビターによっては阻害されなかった。
このことは、ＴＮＦ抑制のメカニズムは粗尿中に存在す
る蛋白質加水分解活性によっては説明できないことを示
している。（ｈ）ＴＮＦ−αの細胞表面レセプターへの結合の抑
制は、ＴＮＦ抑制蛋白質をＴＮＦと同時に適用した時に
のみ生じた（表１）。

【００１８】しかして、本発明のＴＮＦ抑制蛋白質は、
上記したいくつかの特性、即ち、（ａ）ゲル濾過での見
掛け分子量、（ｂ）等電点、及び（ｃ）水に対して透析
した時に蛋白質のかなりの程度の凝集は観察されない、
などの特徴から、ウロモジリンとは相違する。部分精製
ＴＮＦ抑制蛋白質調製物は、以下に示す方法により、尿
蛋白質のゲル濾過による分画によって得られる。

【００１９】１０ｋＤａ分子量排除膜を用いた限外濾
過、次いで５０００分子量排除膜（ＡｍｉｃｏｎＹＭ
５メンブレン）を用いた限外濾過により、尿を濃縮す
る。濃縮物を、１ｍＭＭｇ²⁺及び１ｍＭＣａ²⁺を含
むＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）に対して透析し、同じ
緩衝液で平衡化したコンカナバリン−Ａセファロースカ
ラムに付した。カラムを洗浄し、次いでカラムに特異的
に結合した蛋白質を０．５Ｍメチル−α−Ｄ−マンノピ
ラノシドで溶出させた。ＴＮＦ−αのレセプターへの結
合を抑制する活性を示す、全部ではないが大部分はレク
チンに特異的に吸着され、そしてメチル−α−Ｄ−マン
ノピラノシドで溶出できる。

【００２０】コンカナバリン−Ａから溶出される蛋白質
３．５ｍｇのサンプルをＰＢＳに対して透析し、次いで
２×４５ｃｍＵｌｔｒｏｇｅｌＡＣＡ４４カラム
（ＬＫＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いたゲル濾過により分画
した。溶出蛋白質の２５８ｎｍでの吸収を測定した（─
───）。２ｍｌの画分を集め、１：２０に希釈して、
後述する２．１の方法

【外４】及び２．２の方法によりＴＮＦ−αに対する保護能力を
調べた。２．２の方法は、７５Ｕ／ｍｌ濃度のＴＮＦ−
αが適用できＢａｌｂ／ｃ−ＣＬ。７細胞が使用できる
ように改良したものである。１２時間後に、中性赤色染
料の取り込みを測定することによって

【外５】（第１Ａ図）、細胞の生存を調べた。

【００２１】コンカナバリン−Ａから溶出する同じサン
プルを、蒸留水に対して４８時間透析に付し、次いで不
溶性蛋白質を除くためにスピンした。次いで凍結乾燥
し、更にＰＢＳ中で再構成し、上記と同様にしてＵｌｔ
ｒｏｇｅｌＡＣＡ４４カラムを用いたクロマトグラ
フィーに付した。画分を集め、上記と同様にしてアッセ
イした。保護活性の分画パターンには有意な変化は認め
られなかった（第１Ｂ図）。分子量マーカー（ウシ血清
アルブミン６７ｋＤａ、オボアルブミン４３ｋＤａ、大
豆トリプシシインヒビター２０．１ｋＤａ及びチトクロ
ームＣ１２．３ｋＤａ）の保持時間と比較した所、約５
０−７０ｋＤａの見掛け分子量の最大活性を有する主要
蛋白質のピークの少し前に、活性部分が溶出することが
見出された。

【００２２】

【表１】

【００２３】¹²⁵Ｉ−ＴＮＦ−αと蛋白質とを共に細胞
に適用した時にのみ、尿濃縮物中に存在するＴＮＦ抑制
蛋白質による¹²⁵Ｉ−ＴＮＦ−αの細胞への結合の減少
が観察され、蛋白質を細胞に最初に適用しＴＮＦ−αを
適用する前に蛋白質を除いた場合には、このような結合
の減少は観察されなかった。この事実は、ＴＮＦの細胞
への結合の抑制は、ＴＮＦ抑制蛋白質の細胞に対する効
果によるものでもなく、また尿中にＴＮＦ−α自身が存
在することによるものでもなく、むしろ本発明の蛋白質
とＴＮＦ−αとのある種の相互作用によるものであるこ
とを示すものである。

【００２４】２．本発明のＴＮＦ抑制蛋白質のアッセ
イ各精製工程においては、２つのアッセイ法を用いて、異
なる画分中のＴＮＦ抑制蛋白質の活性をモニターした。２．１レセプターへのＴＮＦ−αの結合の抑制細胞に結合したＴＮＦの量のアッセイは、Ｉｓｒａｅ
ｌ，Ｓ．ｅｔａｌ．（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌ
ｅｔｔｅｒｓ１２：２１７−２２４；Ｈｏｌｔｍａｎ
ｎ，Ｈ．とＷａｌｌａｃｈ，Ｄ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１３９：１１６１−１１６７に記載された
方法と同様にして実施した。１５ｍｍウエルプレート中
のＤＭＥＭ（ダルベッコの修正イーグル最少必須培地）
に、２．５×１０⁸セル／ウェルの密度で細胞（ＨｅＬ
ａ又はＦＳ１１包皮線維芽細胞）を接種した。５％Ｃ０
₂で３７℃で２４時間インキュベーション後、プレート
を氷に移し、生育培地を除き、ＴＮＦ抑制蛋白質を含む
サンプルのアリコートを、ラベル化¹²⁵Ｉ−ＴＮＦ−α
（１０⁵ｃｐｍ）１０ユニツを含む０．１５ｍｌリン酸
緩衝化食塩水（ＰＢＳ）〔１ｍＭＣａ²⁺，１ｍＭＭ
ｇ²⁺，０．５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
及び０．１％ナトリウムアジド（ＰＢＳ／ＢＳＡ）を添
加〕と混合し、細胞に適用し、次いで４℃で２時間イン
キュベートした。次いで細胞をＰＢＳ／ＢＳＡでリンス
し、放射活性測定用バイアルに移し、ガンマカウンター
でラベル量を定量した。アッセイ系に非ラベル化ＴＮＦ
を過剰に加えて、非特異的結合量を測定し、全ての場合
においてこの値を差し引いた。

【００２５】２．２ＴＮＦ−αの細胞毒性の抑制このバイオアッセイは、シクロヘキシイミド（ＣＨＩ）
感作細胞に対するＴＮＦの細胞毒性効果及び中性赤色染
料取り込み法によるその定量〔Ｗａｌｌａｃｈ，Ｄ（１
９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：２４６４−２４
６９〕に基づき開発したものである。蛋白質の存在をテ
ストすべきサンプルを、４℃でＤＭＥＭで一連の２倍希
釈を行ない、これに４０Ｕｇ／ｍｌＴＮＦ−α及び４
００μｇ／ｍｌシクロヘキシイミド（ＣＨＩ）を含む同
様の培地の等量を加える。９６−ウェル丸底マイクロプ
レートに１００μｌＤＭＥＭ−ＣＳ（５％胎児ウシ血
清及び５％ウシ血清を含む）とともにムリンＡ９細胞を
接種する（１．５×１０⁴セル／ウェル）。

【００２６】一連の希釈した蛋白質−ＴＮＦ−α−ＣＨ
Ｉ混合物の１００μｌアリコートをそれぞれのウェルに
適用し、更に細胞を１４時間インキュベートした。中性
レッドと共に２時間インキュベートし、過剰の染料を洗
い流し、Ｓｏｒｅｎｓｏｎクエン酸緩衝液−エタノール
混合物で細胞に取り込まれた中性レッドを抽出し、次い
でＭｉｃｒｏｅｌｉｓａオートリーダーにより５７０ｎ
ｍで比色定量を行なうことによって、細胞の生存を測定
した。ＴＮＦ抑制活性の１Ｕ／ｍｌを、ＴＮＦ殺効果に
対する有意な保護を与える希釈倍率として定義した（Ｐ
＜０．０５）。このバイオアッセイは労力をあまり必要
とせずまた放射ラベル化物質を使用しないため、精製工
程における蛋白質活性をモニターするのには好ましく用
いることができる。このバイオアッセイにおいては、個
々のウェルから細胞をカウント用バイアルに移す必要が
なく、またＭｉｃｒｏｅｌｉｓａオートリーダーを用い
ることにより多くのアッセイ結果をより迅速に記録する
ことができる。

【００２７】このバイオアッセイ条件で処理したムリン
Ａ９細胞の形態は図２に示した通りである。図２の
（ａ）には、ＣＨＩだけでインキュベートした細胞が示
されており、（ｂ）にはＴＮＦ−α−ＣＨＩ混合物でイ
ンキュベートした細胞が示されており、（ｃ）にはＴＮ
Ｆ抑制蛋白質（前記したＣＭセファロースで精製後のも
の）とともにＴＮＦ−α−ＣＨＩ混合物でインキュベー
トした細胞が示されている。ＴＮＦ−αの細胞毒性に対
するＴＮＦ抑制蛋白質の保護効果は（ｃ）から極めて明
らかである。

【００２８】３．ＴＮＦ抑制蛋白質の精製本発明の好ましい態様においては、本発明の実質的に精
製された蛋白質は、以下に示す工程から得られる。（ａ）、ヒト尿の透析濃縮物から粗蛋白質画分を回収す
る；（ｂ）、工程（ａ）で得られる粗蛋白質画分をイオン交
換クロマトグラフィーに付して、ＴＮＦのレセプターへ
の結合抑制能力及びＴＮＦの細胞毒性抑制能力で規定さ
れる部分精製されたＴＮＦ抑制蛋白質の活性画分を得；（ｃ）、工程（ｂ）で得られる部分精製されたＴＮＦ抑
制蛋白質の活性画分を逆相高圧液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）に付して、ＴＮＦのレセプターへの結合抑
制能力及びＴＮＦの細胞毒性抑制能力で規定される実質
的に精製されたＴＮＦ抑制蛋白質の活性画分を得；次い
で、（ｄ）、工程（ｃ）の実質的に精製された蛋白質であっ
て、還元条件下でのＳＤＳＰＡＧＥで約２６−２８ｋ
Ｄａの分子量を有し、逆相ＨＰＬＣで単一ピークとして
移動し且つＴＮＦのレセプターへの結合抑制能力及びＴ
ＮＦの細胞毒性抑制能力を有する蛋白質を回収する。

【００２９】上記工程（ｂ）のイオン交換クロマトグラ
フィーは、カルボキシメチルセファロース、Ｍｏｎｏ
ＳＨＲ５／５ＦＰＬＣ及びＭｏｎｏＱＨＲ５／５
ＦＰＬＣカラムを好ましくはこの順序で用いて３ステッ
プで実施するのが好ましい。逆相ＨＰＬＣはＡｑｕａｐ
ｏｒｅＲＰ３００カラムで実施するのが好ましい。好
ましい態様においては、精製の全ての工程において、蛋
白質濃度を測定し（２８０ｎｍでの吸光度、又は代表的
なアリコートとフルオレスカミンとの自動化反応後に相
対蛍光度を測定することによる）、そして前記２．２で
述べたバイオアッセイによりＴＮＦ−α細胞毒性の抑制
を測定して、条精製工程をモニターした。

【００３０】３．１尿濃縮物の調製健常人ドナーから得た女性の尿２００リットルを、孔サ
イズ０．４５μｍのＰｅｌｌｉｃｏｎメンブレンでのマ
イクロ濾過に付す。次いで、得られる濾液を、１０ｋＤ
ａの分子量排除Ｐｅｌｌｉｃｏｎメンブレンを用いた限
外濾過で濃縮して終濃度５００ｍｌとする。得られる濃
縮物を、１ｍＭベンズアミジン及び０．１％ナトリウム
アジドを含むリン酸緩衝化食塩水に対して透析する。

【００３１】３．２カルボキシメチル（ＣＭ）セファ
ロースクロマトグラフィー２．７×１０ｃｍＣＭセファロースカチオンイオン交
換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、０．０２％ナトリ
ウムアジドを含む１ＭＮａＣｌ，１０ｍＭクエン酸緩
衝液（ｐＨ５．０）（バッファーＣ）であらかじめ洗浄
し、０．０２％ナトリウムアジドを含む１０ｍＭクエン
酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した。上記した３．１
の工程の尿濃縮物を、１００倍容量のバッファーＡで２
回透析し、８０００ｒｐｍで１５分間スピンした。得ら
れる上清を４℃で流速２ｍｌ／分でＣＭ−セファロース
カラムに付し、５０ｍｌ画分を集めた。蛋白質が検出さ
れなくなるまでバッファーＡ（約１５００ｍｌ）でカラ
ムを洗浄し、次いで０．０２％ナトリウムアジドを含む
２００ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ
５．０）（バッファーＢ）の５倍カラム容量で溶出し
（５画分）、次いでバッファーＣの３倍カラム容量で溶
出した（３画分）。画分を集め、前記したテストを行な
った。ＴＮＦ抑制蛋白質の生物学的活性を示す主要部分
は、バッファーＢによる溶出の第２番目の画分中に見出
された。

【００３２】３．３カチオン交換ＭｏｎｏＳＨＲ
５／５ＦＰＬＣクロマトグラフィーＭｏｎｏＳＨＲ５／５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）を、０．０２％ナトリウムアジドを含む１０ｍＭク
エン酸緩衝液（ｐＨ５．０）（バッファーＡ）で、安定
なベースラインが得られるまで（２８０ｎｍにてＵＶデ
ィテクターでもモニターした）洗浄した。ＣＭ−セファ
ロースカラムから溶出した活性画分を集め、１００倍容
量のバッファーＡで２回透析した。得られるサンプル
を、カラムの最大結合能が達成されるまで（２８ｍｇ）
カラムの８×２ｍｌ部分に注入した。平らなベースライ
ンが観察されるまで、カラムをバッファーＡで洗浄し
た。結合蛋白質を、バッファーＡのリニアーＮａＣｌグ
ラジエント（０−３５０ｍＭ）で溶出した。グラジエン
トを流速０．５ｍｌ／分で４０分間流した。次いでカラ
ムを３５０ｍＭＮａＣｌバッファーＡ（バッファー
Ｄ）で１０分間洗浄した。３５０ｍＭＮａＣｌの濃度
で溶出しなかった蛋白質が、バッファーＣでカラムから
溶出した。０．５ｍｌ画分を集め、前記したようにして
テストした。得られる結果は図３に示した。活性を示す
主要部分は、１８０−２２０ｍＭＮａＣｌの濃度に対
応する画分２０−２３に溶出していることが判った。

【００３３】３．４アニオン交換ＭｏｎｏＱＨＲ
５／５ＦＰＬＣクロマトグラフィーＭｏｎｏＱＨＲ５／５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）を、安定なベースラインが得られるまで、０．０２
％ナトリウムアジドを含む５ｍＭナトリウムボレート緩
衝液（ｐＨ９．０）（バッファーＥ）で洗浄した。Ｍｏ
ｎｏＳカラムから溶出した活性画分を集め、１００倍
容量のバッファーＥで２回透析した。得られるサンプル
をカラムの２ｍｌ部分に注入し、ベースラインが平らに
なるまでバッファーＥをカラムに流した。バッファーＥ
のリニアーＮａＣｌグラジエント０−６０ｍＭで３０分
間、次いでバッファーＥのリニアーＮａＣｌグラジエン
ト６０−３００ｍＭで３０分間、結合蛋白質を溶出させ
た。カラムを、３００ｍＭＮａＣｌバッファーＥで１０
分間次いで１ＭＮａＣｌバッファーＥで流速０．５ｍ
ｌ／分で４分間洗浄した。０．５ｍｌ画分を集め、活性
及び蛋白質量をテストした。図４に示したように、活性
を示す大部分は、約４０ｍＭのＮａＣｌ濃度の画分１５
−１８中に溶出した。

【００３４】３．５逆相高圧液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）逆相ＨＰＬＣカラムＡｑｕａｐｏｒｅＲＰ３００
４．６×３０ｎｍ（ＢｒｏｗｎｌｅｅＬａｂｓ）を、
フルオレスカミン検出系で安定なベースラインが得られ
るまで、０．３％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液
（バッファーＦ）であらかじめ洗浄した。ＭｏｎｏＱ
カラムから溶出した活性画分を集め、カラムの１．６ｍ
ｌ部分に注入した。蛍光光度計で蛋白質が検出されなく
なるまで、カラムにバッファーＦを流速０．５ｍｌ／分
で流した。次いで、バッファーＦの０−２０％アセトニ
トリルリニアーグラジエントで５分間、２０−５０％ア
セトニトリルリニアーグラジエントで６０分間、最後に
５０−８０％アセトニトリルリニアーグラジエントで５
分間、流速０．５ｍｌ／分で溶出した。次いで、８０％
アセトニトリルで１５分間カラムを洗浄した。０．５ｍ
ｌ画分を集め、蛋白質量及び活性をアッセイした。図４
に示されるように、単離された蛋白質ピークと共に画分
２１−２３（画分２２にピークを有する）に活性部分が
シャープに溶出した。これらの画分は２７％アセトニト
リルに対応していた。

【００３５】３．６ＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製結果をモニターするために、ＬａｅｍｍｌｉＵ．
Ｋ．，ｅｔａｌ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ２２
７：６８０に記載された方法により、ナトリウムドデシ
ルスルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）を実施した。上記工程３．２、３．３及
び３．４のイオン交換カラムから溶出した５μｇ蛋白質
を含む活性画分のサンプル（レーンＢ：ＣＭ−セファロ
ースカラムから溶出した活性画分；レーンＣ：Ｍｏｎｏ
Ｓカラムから溶出した活性画分；レーンＤ：Ｍｏｎｏ
Ｑカラムから溶出した活性画分）、あるいは逆相ＨＰ
ＬＣで得られる画分２１−２３の４０μｌサンプル（レ
ーンＥ−Ｇ）を、６％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）及び１５％（ｖ
／ｖ）β−メルカプトエタノールを含む３倍濃度のサン
プルバッファーと混合し、１５％アクリルアミドゲルに
付した。対照分子量として、分子量マーカー混合物（α
−ラクトアルブミン１４．４ｋＤａ、大豆トリプシンイ
ンヒビター２０．１ｋＤａ、カルボニックアンヒドラー
ゼ３０ｋＤａ、オボアルブミン４３ｋＤａ、ウシ血清ア
ルブミン６７ｋＤａ及びホスホリラーゼｂ９４ｋＤａ）
を上記と同様に処理し、レーンＡに付した。サンプルバ
ッファーをブランクとしてレーンＨに付した。ゲルを１
６０ボルトで流し、蛋白質バンドを銀染色により発色さ
せた〔Ｏａｋｌｅｙ，Ｂ．Ｒ．ｅｔａｌ．Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５：３６１〕。図６に示したよう
に、精製したＴＮＦ抑制蛋白質は、見掛け分子量２６−
２８ｋＤａを有する単一ピークとして移動した（レーン
Ｅ−Ｇ）。

【００３６】３．７蛋白質マイクロ配列自動分析本発明の実質的に精製されたＴＮＦ抑制蛋白質のサンプ
ル（１−５μｇ，それぞれ５０−２００ｐｍｏｌ）を、
あらかじめ処理したバイオブレン被覆ガラスファイバー
ディスに適用した。この乾燥ディスクを、オンラインＨ
ＰＬＣＰＴＨ−アミノ酸アナライザー（Ｍｏｄｅｌ
１２０）及びデータ入手とプロセッシングユニットＭｏ
ｄｅｌ９００を備えた自動パルス液ガス相蛋白質マイ
クロ配列分析機（Ｍｏｄｅｌ４７５）（全てＡｐｐｌ
ｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍＩｎｃ．Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ）でＥｄｍａｎ分解繰返し
サイクルに付した。コンピューターで得られる配列をな
まデータと比較し、必要に応じて修正した。配列データ
を確認するため、それぞれ独立に３回分析を実施した。
最初の収率は４０％以上であり、このことは、調製物中
の主要蛋白質（２７ｋＤａバンド）は得られる配列と関
連していることを示している。ＴＮＦ抑制蛋白質のＮ−
末端配列は、以下に示すアミノ酸配列を有している。

【００３７】

【化３】

【００３８】１４番目のアミノ酸は同定されなかった。
４番目のシステイン残基については、その存在は理論的
である。なぜなら、ＰＴＨ（フェニルチオヒダントイ
ン）ｃｙｓがそのように同定できず、他のアミノ酸残基
はこの位置では検出されなかったためである。ＦＡＳＴ
Ｐ法によるＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ
ＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ蛋白質ライブ
ラリー（Ｎｏ．１６まで）のコンピューターサーチで
は、公知の蛋白質と有意な相同性を示さなかった。

【００３９】４．ＴＮＦ抑制蛋白質の遺伝子工学更に本発明は、本発明のＴＮＦ抑制蛋白質をコードする
ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子を含
む複製可能な発現ベクター、該ベクターによって形質転
換された宿主に関する。ここで言う“ＤＮＡ分子”と
は、ゲノムＤＮＡ，ｃＤＮＡ，合成ＤＮＡ及びそれらの
組合わせを含む意味である。ＴＮＦ抑制蛋白質のクロー
ニングはいくつかの異なる方法によって実施することが
できる。その１つのアプローチは、ＴＮＦ抑制蛋白質に
対して特異的抗体（ポリクローナル又はモノクローナ
ル）を得、これを用いてＴＮＦ抑制蛋白質のｃＤＮＡを
クローン化する方法である。このアプローチは以下に示
す３つの工程からなる。

【００４０】（ａ）、抗体の調製ＴＮＦ抑制蛋白質に対する抗体は以下のいずれかの方法
を用いることにより得られる。即ち、本発明の実質的に
精製されたＴＮＦ抑制蛋白質を用いる方法；ＴＮＦ抑制
蛋白質の知られた配列、例えばＮ−末端配列などと同じ
１つまたはそれ以上の合成ペプチドを用いる方法；ある
いは、ＴＮＦ抑制蛋白質のアミノ酸配列から推定される
可能なヌクレオチド配列の１つをプロテインＡをコード
する遺伝子と融合しＥ．ｃｏｌｉにてプロテインＡ−Ｔ
ＮＦ抑制蛋白質融合体を発現せしめることによる方法に
よって得られる。ポリクローナル抗体を得るには、実質
的に精製されたＴＮＦ抑制蛋白質又はその合成ペプチド
を担体蛋白質に結合したものをラビットに注射する。モ
ノクローナル抗体を得るには、プロテインＡ−ＴＮＦ抑
制蛋白質融合合成遺伝子をＥ．ｃｏｌにて発現せしめ、
生成する融合蛋白質をＩｇＧセファロースカラムを用い
たアフィニティークロマトグラフィーにより精製しマウ
スに注射する。あるいは、本発明の実質的に精製された
ＴＮＦ抑制蛋白質をマウスに直接注射する。

【００４１】（ｂ）、ＴＮＦ抑制蛋白質産生細胞のアッ
セイＴＮＦ抑制蛋白質に対する抗体を用いて、蛍光抗体法又
はウエスタンブロット法によりＴＮＦ抑制蛋白質産生細
胞を捜す。（ｃ）、産生細胞からのｃＤＮＡの調製ＴＮＦ抑制蛋白質産生細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転
写酵素を用いてｃＤＮＡを調製する。得られるｃＤＮＡ
をλｇｔ１１などの発現ベクターにクローン化し、抗
体を用いてスクニーニングする。λｇｔ１１発現ベク
ターは、そのβ−ガラクトシダーゼ終止コドンから５３
塩基上流の非反復Ｅ₁₀ＲＩ部位に７ｋｂまでのＤＮＡを
挿入するのに用いることができる。従って、外来配列Ｄ
ＮＡをこの部位に挿入し、適当な条件下で融合蛋白質と
して発現することができる。λｇｔ１１発現ベクター
は、抗体プローブを用いたスクリーニングを行なうｃＤ
ＮＡライブラリーの構築に特に有用である〔Ｈｕｙｎ
ｈ，Ｔ．Ｖ．ｅｔａｌ：ＤａｖｉｄＧｌｏｖｅｒ
（ｅｄ．），ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，
ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４）ｐｐ．
４９−７８〕。

【００４２】他の１つの方法では、ＴＮＦ抑制蛋白質の
断片の配列、例えばＮ−末端アミノ酸配列などから得ら
れる配列を有する合成オリゴヌクレオチド又はその混合
物を調製し、このオリゴヌクレオチド又はその混合物
を、ＴＮＦ抑制蛋白質をコードするゲノムＤＮＡ又はｃ
ＤＮＡをクローニングするためのプローブとして用い
る。ゲノムＤＮＡには天然に生じるイントロンが含まれ
る場合もあり含まれない場合もある。ゲノムＤＮＡは、
例えば、適当な細胞から抽出し公知の方法により精製し
て得ることができる。ヒトゲノムＤＮＡなどの好適なＤ
ＮＡ調製物は、制限酵素によって酵素的に開裂すること
ができ、またランダムに切ることができ、得られる断片
は遺伝子ライブラリーを構築するために適当な組換えベ
クターに挿入される。次いで、得られるベクターは、本
発明のＴＮＦ抑制蛋白質をコードする配列を同定するた
めに合成オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニング
することができる。

【００４３】あるいはまた、ｍＲＮＡを本発明のＴＮＦ
抑制蛋白質を発現する細胞から単離し、これを用いて公
知の方法によりｃＤＮＡを調製することができる。得ら
れるｃＤＮＡは、２本鎖に変換後、クローン化し、得ら
れるクローンについて、適当なプローブを用いて目的と
する配列をコードするｃＤＮＡであるか否かをスクリー
ニングする。目的とするクローンが単離されると、ゲノ
ムＤＮＡと実質的に同様の方法によりｃＤＮＡを増幅す
る。しかしながら、ｃＤＮＡの場合にはイントロンや介
在配列は存在しない。プローブとして用いるオリゴヌク
レオチドを合成するために、インタクトＴＮＦ抑制蛋白
質の配列分析を実施するか、あるいはそのペプチド断片
を得そのアミノ酸配列の特徴付けを行なうことができ
る。ペプチド断片を得るには、精製された蛋白質調製物
を、公知の方法〔Ｏｉｋｅ，Ｙ．ｅｔａｌ．（１９８
２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：９７５１−９７
５８〕により、例えばトリプシン、キモトリプシン、パ
パインなどのプロテアーゼを用いた消化などのフラグメ
ンテーションに付す。消化により得られるペプチド断片
を逆相ＨＰＬＣで分離し、自動アミノ酸配列分析法によ
り配列決定を行なう。前記したように、ＴＮＦ抑制蛋白
質のＮ−末端部分の最初の１６個のアミノ酸に対応する
配列を、自動配列分析機を用いて決定した。そして以下
に示すアミノ酸配列が得られた。

【００４４】

【化４】

【００４５】１つまたはそれ以上の適当なペプチド断片
の配列が決定され、または蛋白質の部分配列が決定され
たら、それらをコードするＤＮＡ配列について調べる。
遺伝子コドンの縮重により、１つまたはそれ以上のコド
ンを用いて特定のアミノ酸をコードすることができ、従
って１つまたはその以上の異なるオリゴヌクレオチドを
調製することができ、これらのいずれもがＴＮＦ抑制蛋
白質ペプチド断片をコードすることができる〔Ｗａｔｓ
ｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ
ｏｆｔｈｅＧｅｎｅ；３ｒｄｅｄ．；Ｗ．Ａ．
Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，Ｃ
Ａ（１９７７），ｐｐ．３５６−３５７〕。しかしなが
ら、これらのオリゴヌクレオチドのうち１つだけが、遺
伝子のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含ん
でいる。このようなオリゴヌクレオチドが存在しており
そしてそのオリゴヌクレオチドは他のオリゴヌクレオチ
ドが存在していてもＤＮＡとハイブリダイズすることが
出来るため、単一のオリゴヌクレオチドを用いてペプチ
ドをコードする遺伝子をクローン化するのと同じ方法
で、一連の未分画のオリゴヌクレオチドをそのまま用い
ることができる。ペプチドをコードするオリゴヌクレオ
チド、あるいはＴＮＦ抑制蛋白質断片をコードすること
のできる理論的に“最も可能性の高い”配列を含む一連
のヌクレオチド（ヌクレオチドのセット）を用いること
により〔Ｌａｔｈｅ，Ｒ．ｅｔａｌ．（１９８５）；
Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１８３：１−１２に記載さ
れた“コドン使用ルール”に従い〕、相補性オリゴヌク
レオチドの配列を同定することが出来、あるいはＴＮＦ
抑制蛋白質もしくはその少なくとも１部をコードする
“最も可能性の高い”配列とハイブリダイズすることの
できるヌクレオチドのセットもしくはそのような配列の
セットを同定することが出来る。次いで、このような相
補性配列を含むヌクレオチドを合成し、本発明のＴＮＦ
抑制蛋白質の遺伝子を同定し単離するためのプローブと
して用いることができる〔Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ
ａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）〕。

【００４６】ＴＮＦ抑制蛋白質の断片をコードすること
のできる１つの適当なオリゴヌクレオチド又はオリゴヌ
クレオチドのセット（あるいはそのようなオリゴヌクレ
オチドと相補性を示すオリゴヌクレオチド又はオリゴヌ
クレオチドのセット）が上記したようにして同定される
とそれらオリゴヌクレオチドが合成され、次いで、ＤＮ
Ａにハイブリダイズされる。好ましくは目的とする遺伝
子を発現できる細胞から誘導されたｃＤＮＡ調製物とハ
イブリダイズされる。そしてかかるハイブリダイズは、
好ましくは、目的とする遺伝子を高レベルで産生する細
胞からＲＮＡを抽出し逆転写酵素を用いて対応するｃＤ
ＮＡに変換すること等によってｃＤＮＡ源が目的とする
配列を豊富に含むようにした後に、行なうのが好い。核
酸のハイブリダイゼーション法は一般的な技術であり、
例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎ
ｕａｌ（上記と同じ）；Ｈａｙｍｅｓ，Ｂ．Ｔ．，ｅｔ
ａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａ
ｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａ
ｎｄ（１９８５）に記載されている。上記したヌクレオ
チド又はオリゴヌクレオチドのセットのプローブを用い
てハイブリダイゼーションを行なうことにより、ｃＤＮ
Ａ又はゲノムライブラリーからハイブリダイズするＤＮ
Ａ配列を同定することができ、次いで、得られるＤＮＡ
配列は分析に付されて、本発明のＴＮＦ抑制蛋白質のコ
ード配列をどの程度含んでいるか測定される。

【００４７】同様の方法によって、組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターなどのいくつかのヒト蛋白質の遺伝子
がクローン化されている〔Ｐｅｎｎｉｃａ，Ｄ．ｅｔ
ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ３０１：２１４−２
２１〕。上記した方法によって得られる本発明のＴＥＦ
抑制蛋白質をコードするＤＮＡ分子は、一般的方法〔Ｍ
ａｎｎｉａｔｉｓｅｔａｌ（上記と同）〕により、
適当に構築された発現ベクターに挿入される。ホモポリ
マーティル化、又は合成ＤＮＡリンカーもしくは平滑末
端リゲーションを用いた連結化により、２本鎖ｃＤＮＡ
がプラスミドベクターに連結される。ＤＮＡリガーゼを
用いてＤＮＡ分子が連結され、アルカリホスファターゼ
処理によって望ましくない連結が除かれる。

【００４８】目的とする蛋白質を発現できるためには、
遺伝子発現を可能にし蛋白質の産生を可能にするよう
に、目的とする蛋白質をコードするＤＮＡに転写及び翻
訳調節領域が結合された特定のヌクレオチド配列が、発
現ベクターに含まれていなければならない。最初に、遺
伝子が転写されるためには、ＲＮＡポリメラーゼによっ
て認識されるプロモーターがその遺伝子の上流に存在し
ていなければならず、このプロモーターにポリメラーゼ
が結合して転写工程が開始される。このようなプロモー
ターには各種のプロモーターが使用でき、これらはそれ
ぞれ相違する効果（強力プロモーター及び弱いプロモー
ターなど）を持っている。プロモーターは、真核細胞、
原核細胞によっても相違する。本発明で使用されるプロ
モーターには、例えば、バクテリオファージλのｉｎｔ
プロモーター、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子
のｂＩａプロモーター、ｐＰＲ３２５のクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼのＣＡＴプロモータ
ーなどの構成（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）プロモータ
ー、あるいはバクテリオファージλのメジャーライト及
びレフトプロモーター（Ｐ_L及びＲ_R）、Ｅ．ｃｏｌｉ
のｔｒｐ，ｒｅｃＡ，ｌａｃＺ，ｌａｃＩ，ｏｍｐＦ及
びｇａｌプロモーター，ｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプ
ロモーターなどの誘導プロモーター〔Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．
Ｒ．（１９８７）Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
１：２７７−２８２〕がある。

【００４９】ｍＲＮＡの産生量を多くするために強力な
プロモーターを使用する外に、原核細胞にて高レベルの
遺伝子発現を達成するためには、ｍＲＮＡの有効な転写
を確かなものにすることのできるリボゾーム結合部位を
使用することも必要である。この１つの例が、開始コド
ンの上流の適当な位置にあり１６ＳＲＮＡの３′−末
端配列と相補性を示すシャイン−ダルガノ配列（ＳＤ配
列）である。真核生物宿主の場合には、宿主の性質に応
じて、異なる転写及び翻訳調節配列が使用される。これ
らは、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミ
ニアンウイルスなどのウイルスから誘導できる。これら
の場合には、調節シグナルは、高レベルの発現を有する
特定の遺伝子に関連している。例えば、ヘルペスウイル
スのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵
母ｇａｌ４遺伝子プロモーターなどが挙げられる。抑
制及び活性化のいずれもが可能な転写開始調節シグナル
を選ぶこともでき、この場合には遺伝子の発現を調節す
ることが可能となる。

【００５０】本発明のＴＮＦ抑制蛋白質をコードするヌ
クレオチド配列、及び作動可能なように連結された転写
及び翻訳調節シグナルを含むＤＮＡ分子は、目的とする
遺伝子を宿主細胞のクロモゾームに組込むことのできる
ベクターに挿入される。ＤＮＡ分子をそのクロモゾーム
に安定に組込んだ細胞は、１つもしくはそれ以上のマー
カーによって選択できる。このマーカーは、発現ベクタ
ーを保持する宿主細胞の選択を可能にするものである。
マーカーは、栄養要求性宿主に対して原栄養性を与える
もの、あるいは抗生物質、銅などの重金属等の抗微生物
剤に対して耐性を与えるものである。選択マーカー遺伝
子は、発現すべきＤＮＡ遺伝子配列に直接連結してもよ
く、あるいは一緒にトランスフェクトして同じ細胞に導
入してもよい。更には、１本鎖結合蛋白質ｍＲＮＡの合
成を最適に行なうためのエレメントも必要である。この
ようなエレメントとしては、転写プロモーター、エンハ
ンサー、終止シグナルと共にスプライスシグナルなどが
ある。このようなエレメントを導入したｃＤＮＡ発現ベ
クターとしては、例えばＯｋａｙａｍａ，Ｈ．，（１９
８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０に記載さ
れたものなどがある。

【００５１】好ましい態様においては、得られるＤＮＡ
分子は、宿主において自己複製可能なプラスミドもしく
はウイルスベクターに導入される。特定のプラスミドも
しくはウイルスベクターを選択する上で重要な要素は、
該ベクターが導入された細胞が容易に認識され且つ該ベ
クターが導入されない細胞から区別して容易に選択でき
るかというその容易性；宿主細胞において存在する目的
とするベクターのコピー数；及び、異なる種の宿主細胞
間でベクターを望ましく移動できるか否かという点であ
る。好ましい原核生物ベクターとしては、例えば、ｐＢ
Ｒ３２２，ＣｏｌＥ１，ｐＳＣ１０１，ｐＡＣＹＣ１
８４などのＥ．ｃｏｌｉで複製可能なプラスミド〔Ｍａ
ｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ
（上記と同じ）〕；ｐＣ１９４，ｐｃ２２１，ｐＴ１２
７などのバチルスプラスミド〔Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔ．，
ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆ
ｔｈｅＢａｃｉｌｌｉ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓ
ｓ，ＮＹ（１９８２），ｐｐ．３０７−３２９〕；ｐＩ
Ｊ１０１などのストレプトマイセスプラスミド〔Ｋｅｎ
ｄａｌｌ，Ｋ．Ｊ．ｅｔａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１８３〕；φＣ
３１などのストレプトマイセスバクテリオファージ〔Ｃ
ｈａｔｅｒ，Ｋ．Ｆ．ｅｔａｌ．，ＳｉｘｔｈＩｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ
ＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓＢｉｏｌｏｇｙ，Ａ
ｋａｄｅｍｉａｉＫａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈ
ｕｎｇａｒｙ（１９８６），ｐｐ．４５−５４〕；シュ
ードモナスプラスミド〔Ｊｏｈｎ，Ｊ．Ｆ．ｅｔａ
ｌ．，（１９８６）Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．
８：６９３−７０４）；Ｉｚａｋｉ．Ｋ．（１９７８）
Ｊｐｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３：７２９−７４
２〕などがある。好ましい真核原物プラスミドとして
は、例えばＢＰＶ，ワクシニア，ＳＵ４０，２−ミクロ
ンサークル，これらの誘導体などが挙げられる。このよ
うなプラスミドはよく知られたものである〔Ｂｏｔｓｔ
ｅｉｎ，Ｄ．ｅｔａｌ．（１９８２）ＭｉａｍｉＷ
ｉｎｔ，Ｓｙｍｐ．１９：２６５−２７４；Ｂｒｏａｃ
ｈ，Ｊ．Ｒ．，：ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏ
ｌｏｇｙｏｆｔｈｅＹｅａｓｔＳａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ：ＬｉｆｅＣｙｃｌｅａｎｄＩｎｈ
ｅｒｉｔａｎｃｅ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．ｐｐ．４４５−４９０（１９８
１）；Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．，（１９８２）Ｃｅｌｌ
２８：２０３−２０４；Ｂｏｌｌｏｎ，Ｄ．Ｐ．，ｅ
ｔａｌ．（１９８０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏ
ｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：３９−４８；Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ，Ｔ．，ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＣｏｍｐｒ
ｅｈｅｎｓｉｖｅＴｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３：Ｇ
ｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰ
ｒｅｓｓ，ＮＹ．ｐｐ．５６３−６０８（１９８
０）〕。

【００５２】構築体を含むベクター又はＤＮＡ配列が発
現用に調製されたら、形質転換、トランスフェクショ
ン、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレク
トロポレーション、リン酸カルシウム沈澱、直接マイク
ロインジェクションなどの各種の方法によって、ＤＮＡ
構築体は適当な宿主に導入される。本発明に用いる宿主
細胞は原核細胞又は真核細胞のいずれでもよい。好まし
い原核細胞宿主としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ，バチ
ルス、ストレプトマイセス、プソイドモナス、サルモネ
ラ、セラチアなどのバクテリア等がある。最も好ましい
原核細胞宿主はＥ．ｃｏｌｉである。特に興味あるバク
テリア宿主は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２株２９４
（ＡＴＣＣ３１４４６６）；Ｅ．ｃｏｌｉＸ１７６６
（ＡＴＣＣ３１５３７）；Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０
〔Ｆ^-，ラムダ ^-，原栄養性（ＡＴＣＣ２７３２
５）〕；サルモネラチフィムリウム、セラチアマルセッ
センス、各種のプソイドモナスなどの腸内バクテリア等
がある。このような宿主の場合には、蛋白質はグリコシ
ル化されない。また、原核細胞宿主は、発現プラスミド
のレプリコーン配列及びコントロール配列と親和性を有
していなければならない。

【００５３】好ましい真核細胞宿主は、ヒト、モンキ
ー、マウス、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細
胞などの哺乳動物細胞であり、これらの細胞は、正確な
構成もしくは正確な部位でのグリコシル化などの、蛋白
質分子に対する翻訳後の修正を行なうことができる。ま
た、酵母もグリコシル化などの、翻訳後のペプチド修正
を行なうことができる。強力プロモーター配列、及び酵
母での目的とする蛋白質の産生に利用される高コピー数
プラスミドを用いた多くの組換えＤＮＡ技術が知られて
いる。酵母は、クローン化された哺乳動物遺伝子生産物
のリーダー配列を認識することができ、リーダー配列を
保持したペプチド（即ちプレペプチド）を分泌する。

【００５４】ベクターの導入後、宿主細胞は、ベクター
を保有する細胞の生育を選択することのできる選択培地
で生育される。クローン化遺伝子配列の発現により、目
的とするＴＮＦ抑制蛋白質又はその断片が産生される。
次いで、発現された蛋白質が、本明細書において記述し
た精製法（セクション３）により、あるいは抽出、沈
澱、クロマトグラフィー、電気泳動などを用いた他の慣
用的方法により、単離精製される。本発明の蛋白質を精
製するのに好ましく用いることのできる更なる精製手段
は、アフィニティークロマトグラフィーである。この目
的のために、ＴＮＦ抑制蛋白質に対するモノクローナル
抗体が調製され、カラム中のゲルマトリックスに吸着さ
れる。組換え蛋白質を含む粗調製物がカラムに流され
る。この時に、蛋白質は特異的抗体に結合し、他方不純
物はカラムから流出される。洗浄後、ｐＨもしくはイオ
ン強度を変化させて目的とする蛋白質をゲルから溶出す
る。

【００５５】本発明に用いるモノクローナル抗体は、慣
用的ハイブリドーマ法〔Ｋｏｈｌｅｒｅｔａｌ．
（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５；Ｋｏｈｌ
ｅｒｅｔａｌ．（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．６：５１１〕によって調製できる。一般的にこの
方法は、目的とする精製蛋白質抗原、又はウシ血清アル
ブミンなどの適当な担体に結合した目的とする蛋白質の
Ｎ−末端部分の配列を有する合成ペプチドで動物を免疫
化する工程をその方法の１工程として含んでいる。免疫
化された動物の脾細胞を単離し、適当なミエローマセル
ラインと融合させる。融合後、得られるハイブリドーマ
細胞をＨＡＴ培地中で維持し、次いでクローン化する。
かくして得られるハイブリドーマ細胞をアッセイして、
ＴＮＦ抑制蛋白質と結合する抗体を分泌するクローンを
同定する。同定後、サスペンジョンカルチャーで、又は
適当な宿主マウスの腹膜にクローン化細胞を注射して腹
水液中で、目的とするクローン化細胞を大量に生育させ
る。免疫吸着カラムを用いたアフィニティー精製法で
は、このようにしてハイブリドーマから得られそして精
製後カラムに吸着されたモノクローナル抗体は、ＴＮＦ
抑制蛋白質の精製に極めて有効である。

【００５６】５．有用性及び組成物ＴＮＦ抑制蛋白質、その塩、その機能的誘導体及びその
活性フラクションは、哺乳動物でのＴＮＦの有害な効果
を中和するために、即ち、過剰なＴＮＦが内因的に形成
されるあるいは外部から投与される状態を処置するため
に使用される。更に本発明は、薬学的に許容し得る担
体、及び活性成分としての本発明のＴＮＦ抑制蛋白質、
その塩、その機能的誘導体又はその活性フラクションを
含む薬学的組成物に関する。かかる組成物は、敗血性シ
ョック、悪態症、移植片対宿主反応、リウマチ性関節炎
などの自己免疫疾患等の、内因的なＴＮＦの産生過剰状
態に対して使用することができる。投与方法は、同様の
薬剤の投与法と同様であり、そして投与対象者の状態に
よってその方法は変動する。即ち、例えば、敗血症ショ
ックの場合には静注であり、リウマチ性関節炎の場合に
は局部注射（例えばひざ）あるいは継続点滴などであ
る。本発明の組成物は、ＴＮＦの過剰投与によるＴＮＦ
中毒の状態に使用することもできる。

【００５７】本発明の薬学的組成物は、蛋白質又はその
誘導体と生理学的に許容し得る担体、安定化剤、希釈剤
などと混合することによって調製することが出来、そし
て例えば投与用バイアル中で凍結乾燥することにより単
位投与形態とすることができる。投与すべき活性化合物
の量は、投与ルート、病気、患者の状態などによって変
動する。リウマチ性関節炎の炎症状態の場合の局所注射
は、敗血性ショックなどの静脈点滴の場合より、より少
ないＴＮＦ抑制蛋白質量が体重に応じて投与される。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】図１Ａは、ＵｌｔｒｏｇｅｌＡＣＡ４４
ゲル濾過カラムからのＴＮＦ抑制蛋白質の溶出パターン
を示す。

【図１Ｂ】図１Ｂは、ＵｌｔｒｏｇｅｌＡＣＡ４４
ゲル濾過に付す前に水に対して透析した場合のＴＮＦ抑
制蛋白質の溶出パターンを示す。

【図２】図２は、生物の形態を示す写真であり、シクロ
ヘキシイミド（ＣＨＩ）（ａ），ＴＮＦ−α−ＣＨＩ
（ｂ），あるいはＴＮＦ抑制蛋白質とともにＴＮＦ−α
−ＣＨＩ（ｃ）で処理したムリンＡ９細胞の形態を示
す。

【図３】図３は、ＴＮＦ抑制蛋白質の第２の精製工程の
結果を示す。

【図４】図４は、ＴＮＦ抑制蛋白質の第３の精製工程の
結果を示す。

【図５】図５は、逆相ＨＰＬＣによるＴＮＦ抑制蛋白質
の分離を示す。

【図６】図６は、粒子構造を示す写真であって、各精製
工程における活性物質を含むサンプルをＳＤＳＰＡＧ
Ｅで分析した結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ０７Ｋ 14/525 Ｃ１２Ｐ 21/00 16/24 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＦ // Ｃ０７Ｋ 14/525 ＡＢＮ 16/24 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ダンアデルカイスラエル国ホロン，アビビムストリート４ (72)発明者メナケムルビンスタインイスラエル国ギバットシュムエル，ハトマーストリート 16

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のレセプ
ターへの結合及びＴＮＦの細胞毒性効果を抑制すること
のできる；（ｂ）その尿粗調製物をＶｌｔｒｏｇｅｌＡＣＡ４
４ゲル濾過カラムを用いたクロマトグラフィーに付した
時に、ＴＮＦ抑制蛋白質の主要ピークは主蛋白質の少し
前に溶土し、約４０−８０ｋＤａの見掛け分子量を有す
る；（ｃ）その尿粗調製物を分析した時に、その活性蛋白質
の等電点はｐＨ６と８の間にある；及び（ｄ）以下に示すアミノ酸配列【化１】（ここでＸは未同定のアミノ酸残基を示す）をそのＮ末
端にする；という特徴を有するＴＮＦ抑制蛋白質、その
機能的誘導体、あるいはその活性フラクションであって
ＴＮＦのレセプターへの結合及びＴＮＦの細胞毒性効果
を抑制することのできる活性フラクションをコードする
ヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子。
【請求項２】ヌクレオチド配列がゲノムＤＮＡ又はｃ
ＤＮＡである請求項１のＤＮＡ分子。
【請求項３】請求項１または２のＤＮＡ分子を保持
し、形質転換宿主細胞にて請求項１のＴＮＦ抑制蛋白質
を発現することのできる複製可能な発現ベクター。
【請求項４】請求項３の複製可能な発現ベクターで形
質転換された宿主細胞。
【請求項５】請求項４の原核宿主細胞。
【請求項６】請求項４の真核宿主細胞。
【請求項７】（ａ）、請求項４の形質転換宿主細胞を
適当な培養培地で培養し；次いで（ｂ）、ＴＮＦ抑制蛋
白質を単離する；ことを含むＴＮＦ抑制蛋白質の製造
法。
【請求項８】組換え蛋白質である請求項１のＴＮＦ抑
制蛋白質。
【請求項９】原核細胞、好ましくはＥ．ｃｏｌあるい
は真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞である請求項８の
ＴＮＦ抑制蛋白質。
【請求項１０】請求項７の製造法によって製造される
請求項８のＴＮＦ抑制蛋白質。
【請求項１１】請求項１のＴＮＦ抑制蛋白質に対する
抗体。
【請求項１２】モノクローナル抗体である請求項１１
の抗体。