JP2777986B2 - 機能性ポリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、機能性ポリペプチ
ド、特にヒトフィブロネクチン（以下、ＦＮと略記す
る）の機能性ポリペプチド、並びにそれをコードする遺
伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】フィブロネクチンは、ヒト及び動物の血
液や組織に広く分布する多機能糖タンパク質であり、細
胞の接着、伸展、移動、分化、増殖、貪食などの生理作
用に関与し、組織の構築と修復、血液凝固、生体防御な
どに重要な役割を果たしていることが知られている。最
近の分子生物学の進歩により、ＦＮの全アミノ酸配列及
び遺伝子構造が解明された〔ジ エムボ ジャーナル
（ The EMBO Journal ) 、第４巻、第１７５５〜１７５
９頁（１９８５）〕。ＦＮは、最大２３２７アミノ酸か
ら成る分子量約２５万のポリペプチドがＣ末端付近で２
つのＳ−Ｓ結合で２量体を形成している。分子内アミノ
酸配列はＩ型、II型、 III型の繰返し構造を有し、更
に、細胞、コラーゲン、ヘパリン及びフィブリン等に対
する結合領域（ドメイン）がそれぞれ独立に存在する。
ＦＮのこれらの機能は、産業上有用であり、例えば細胞
接着機能は細胞培養基質のコーティング剤、あるいは創
傷治療剤として利用できる。またフィブリン結合能は、
血小板とフィブリンの結合を阻止することによる血液凝
固阻止剤としての用途が考えられる。逆に、細胞接着活
性とフィブリン結合活性の両方の機能を持つペプチド
は、血小板とフィブリンの結合を促進し、創傷治癒効果
を高める。更に、最近の知見から、ＦＮのフィブリン結
合ドメインがインスリン結合活性を有することが明らか
にされ（第４６回日本癌学会総会記事、第１８１頁）、
細胞接着活性とインスリン結合活性の両方の機能を有す
るポリペプチドは、ドラッグデリバリーシステムとして
の用途も考えられる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】このように、ＦＮはそ
れ自体あるいはその機能的断片として有用であるが、血
液から採取するために、高価で採取量にも限界がある。
また、ウイルス感染等の問題もあることから、その利用
は大幅に制限されていた。更にＦＮから特定の機能を有
する領域を取出す方法としては、酵素による限定分解あ
るいは、ブロモシアン等による限定分解等が知られてい
るが、いずれも操作が煩雑で収率も非常に低く実用的と
は言い難い。本発明の目的は、フィブリン結合活性を持
つ新規な機能性ポリペプチドを構築し、それをコードす
る遺伝子、それを用いた遺伝子工学的な該ポリペプチド
の製造方法を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は機能性ポリペプチドに関する発明で
あって、下記式（化１）で示されるアミノ酸配列で表さ
れることを特徴とする。

【０００５】

【化１】 Asn Glu Gly Leu Asn Gln Pro Thr Asp Asp Ser Cys Phe Asp Pro Tyr Thr Val Ser His Tyr Ala Val Gly Asp Glu Trp Glu Arg Met Ser Glu Ser Gly Phe Lys Leu Leu Cys Gln Cys Leu Gly Phe Gly Ser Gly His Phe Arg Cys Asp Ser Ser Arg Trp Cys His Asp Asn Gly Val Asn Tyr Lys Ile Gly Glu Lys Trp Asp Arg Gln Gly Glu Asn Gly Gln Met Met Ser Cys Thr Cys Leu Gly Asn Gly Lys Gly Glu Phe Lys Cys Asp Pro His Glu Ala Thr Cys Tyr Asp Asp Gly Lys Thr Tyr His Val Gly Glu Gln Trp Gln Lys Glu Tyr Leu Gly Ala Ile Cys Ser Cys Thr Cys Phe Gly Gly Gln Arg Gly Trp Arg Cys Asp Asn Cys Arg Arg Pro Gly Gly Glu Pro Ser Pro Glu Gly Thr Thr Gly Gln Ser Tyr Asn Gln Tyr Ser Gln Arg Tyr His Gln Arg Thr Asn Thr Asn Val Asn Cys Pro Ile Glu Cys Phe Met Pro Leu Asp Val Gln Ala Asp Arg Glu Asp Ser Arg Glu

【０００６】本発明の第２の発明は、第１の発明の機能
性ポリペプチドをコードする遺伝子に関する。また本発
明の第３の発明は、上記第１の発明の機能性ポリペプチ
ドをコードする遺伝子を組込んだ組換体プラスミドに関
する。

【０００７】本発明者らは、ＦＮの細胞接着活性ポリペ
プチドに関し、実質的にＦＮと同等の活性を有するポリ
ペプチドの配列を明らかにし、その遺伝子工学的製造方
法を開発して特許出願した〔特願昭６３−１４８号（特
開平１−１８０９００号）、及び同６３−３１８２０号
（特開平１−２０６９９８号）〕。その後、更に研究を
進め、細胞接着活性と他の機能を合せ持つ機能性ポリペ
プチドについて研究を重ねた結果、細胞接着活性ポリペ
プチドとフィブリン結合ドメインペプチドとのハイブリ
ッドポリペプチドを遺伝子工学的に製造することに成功
した。このハイブリッドポリペプチドを単離して、その
生物活性を調べた結果、細胞接着活性とフィブリン結合
活性を合せ持つ多機能性ポリペプチドとしての生物活性
を有することがわかった。本発明は以上の知見に基づい
て完成された。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を具体的に説明す
る。ＦＮの細胞接着活性ポリペプチドとフィブリン結合
ドメインペプチドとのハイブリッドペプチドを遺伝子工
学的に調製する手段としては、細胞接着活性ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡを含むプラスミド及びフィブリン
結合ドメインペプチドをコードするＤＮＡを含むプラス
ミドから、それぞれ必要な断片を取出し、両ＤＮＡ断片
をつなぎ合せた後、適当な発現ベクターに読取りフレー
ムが合うように接続することによって達成される。細胞
接着活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片は、既に
種々の断片がクローン化されている（特開平１−１８０
９００号及び同１−２０６９９８号）。これらのプラス
ミドから、必要な部分を切出すことができる。一方、フ
ィブリンドメインをコードするＤＮＡ断片は、 pLF５、
pLF３、 pLF４及び pLF２のＦＮ ｃＤＮＡ部分をつな
ぎ合せて構築された pLF 2435 〔バイオケミストリー
（ Biochemistry ) 、第２５巻、第４９３６〜４９４１
頁（１９８６）〕から必要な断片を切出すことによって
調製することができる。細胞接着活性ポリペプチドとフ
ィブリンドメインポリペプチドのハイブリッドペプチド
をコードするＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに接続
し、大腸菌に導入することにより、ハイブリッドペプチ
ドを大腸菌で発現させることができる。発現ベクターと
しては、既存のすべてのベクターを使用することができ
る。

【０００９】大腸菌によるハイブリッドペプチドの確認
はイムノブロッティングによって調べられる。全菌体タ
ンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動）で分離した後、泳動パターンをニト
ロセルロースフィルターに移し取り、ＦＮの細胞接着ド
メインを認識するモノクローナル抗体とフィブリンドメ
インを認識するモノクローナル抗体の両方に反応するバ
ンドを検出することができる。発現されたペプチドの精
製には通常のクロマトグラフィーの技術が用いられる。
例えば菌体ペレットをバッファーに懸濁し、超音波処理
により可溶性画分を得る。これを、イムノブロッティン
グに用いた抗体を結合させたセファロース４Ｂのカラム
にかけ、アフィニティ精製を行う。イムノブロッティン
グにより目的画分を集めることによって、細胞接着活性
とフィブリン結合活性の両方の機能を持つ機能性ポリペ
プチドを得ることができる。必要とあれば、ＦＰＬＣ又
はＨＰＬＣで更に精製することができる。

【００１０】このようにして得られた機能性ポリペプチ
ドは、細胞接着活性、フィブリン結合活性及びインスリ
ン結合活性等の生物活性の測定に用いる。細胞接着活性
の測定には、ＮＲＫ細胞を用い、例えば、試料をバッフ
ァーに溶かして、マイクロプレートに吸着させた後、Ｎ
ＲＫ細胞を添加して３７℃で一定時間インキュベートす
る。顕微鏡下で細胞の伸展を観察し、伸展の発現に必要
な最少量を天然のＦＮと比較することにより細胞接着活
性の強さを表すことができる。フィブリン結合活性の測
定にはフィブリンを結合させたセファロース４Ｂ〔文献
トロムボシス リサーチ（ Thrombosis Research )第
２巻、第１３７−１５４頁（１９７３）〕を用いること
ができる。すなわち試料をフィブリン結合カラムに通し
た後、通過液のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことにより、フ
ィブリン結合活性の有無を判定する。インスリン結合活
性は、イムノブロッティングの手法に準拠して行うこと
ができる。すなわち、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し
た後、ニトロセルロースフィルターに移し取り、酵素標
識したインスリンを作用させる。フィルターを洗浄後、
結合したインスリンを酵素活性により判定することがで
きる。

【００１１】このようにして、得られるペプチドの好適
な例としては、ＦＮの細胞接着活性を有するAla¹²³⁵ -
Gln¹⁵¹⁶ （２８２アミノ酸残基ペプチド）又は、Ile
¹⁴¹⁰ -Gln¹⁵¹⁶ （１０７アミノ酸残基ペプチド）と、フ
ィブリン結合ドメインペプチドAsn²¹³³ - Glu²³²⁴ （１
９２アミノ酸残基）の結合したハイブリッドポリペプチ
ドが挙げられる。上記ＦＮの細胞接着活性を有するポリ
ペプチドのアミノ酸配列は下記式（化２）に示すとおり
である：

【００１２】

【化２】₁₂₃₅ Ala Val Pro Pro Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser ₁₄₁₀ Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser ₁₅₁₆ Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Gln

【００１３】また、上記したＦＮのフィブリン結合ドメ
インペプチドのアミノ酸配列は既述の式（化１）に示す
とおりである。

【００１４】

【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。

【００１５】実施例１ ＦＮの細胞接着ドメインIle¹⁴¹⁰ - Met¹⁵¹⁷ （１０８ア
ミノ酸残基）及びフィブリン結合ドメインAsn²¹³³ - Gl
u²³²⁴ （１９２アミノ酸残基）をコードするｃＤＮＡ断
片のクローニング（図１参照） 図１は、本発明による pTF 1301 構築の工程図である。 （１−１）ｃＤＮＡ断片の調製 ＦＮの細胞接着ドメインIle¹⁴¹⁰ - Met¹⁵¹⁷ （１０８ア
ミノ酸残基）をコードするｃＤＮＡ断片を含む７．８ k
b のプラスミド pTF 201（特開平１−１８０９００号）
１００μｇを制限酵素 XbaＩ用バッファー、１００ユニ
ットの XbaＩ及び１００ユニットのEcoRＩを含む１００
μｌの反応液中、３７℃、２時間インキュベートした。
反応液をダイアジェン（ DIAGEN ) 社製ＨＰＬＣカラ
ム、ニュクレオジェン（ Nucleogen )ＤＥＡＥ−４００
０（６×１２５mm）にかけ、０．４１kb断片２μｇを得
た。次に、この断片を２０ユニットの FokＩで３７℃、
１時間処理し、同様の精製法で XbaＩ− FokＩ断片（１
８０ bp ）、 FokＩ− FokＩ断片（２０３ bp ）をそれ
ぞれ２５０ｎｇずつ得た。一方、フィブリン結合ドメイ
ンAsn²¹³³ - Glu²³²⁴ （１９２アミノ酸残基）をコード
するｃＤＮＡ断片を含む５．９ kb のプラスミド pLF 2
435 〔バイオケミストリー、第２５巻、第４９３６〜４
９４１頁（１９８６）〕１００μｇを Hind III 用バッ
ファー、１００ユニットの Hind III 及び１００ユニッ
トの HincIIを含む１００μｌの反応液中、３７℃、２
時間インキュベートした。これをアガロース電気泳動に
かけ、１．２ kb の断片を切出した（収量２μｇ）。こ
の断片１μｇを Sau3AＩで３７℃、１時間処理し、ニュ
クレオジェンＤＥＡＥ−４０００カラムにかけ、 Hinc
II− Sau3AＩ断片（６２１ bp ）を２００ｎｇ得た。 （１−２）合成ＤＮＡアダプターの調製 細胞接着ドメインとフィブリン結合ドメインのｃＤＮＡ
断片を接続するためのアダプター（鎖長２４及び２０、
図１参照）をアプライドバイオシステムズ社のＤＮＡ合
成機を用いて合成し、それぞれ２．７μｇ、２．３μｇ
得た。それぞれ１００ｎｇをアニーリング操作により２
重鎖とした。

【００１６】（１−３）ｃＤＮＡ断片とベクターの結合 （１−１）で得たｃＤＮＡ断片を分泌型発現ベクター p
IN III− omp AＩ〔ジエムボ ジャーナル、第３巻、第
２４３７〜２４４２頁（１９８４）〕と結合させた。す
なわち、 XbaＩ− FokＩ断片（１８０ bp ）１０ｎｇ、
FokＩ− FokＩ断片（２０３ bp ）１０ｎｇ、 Hinc II
− Sau 3AI断片（６２１ bp ）３０ｎｇ、（１−２）で
得た合成ＤＮＡアダプター１０ｎｇ、あらかじめ XbaＩ
−BamHＩ挿入断片を除去した pIN III−ompAＩベクター
５０ｎｇをＴ₄ ＤＮＡリガーゼ用バッファー、０．５mM
ＡＴＰ、１０mM ＤＴＴ及び２．８ユニットのＴ₄ Ｄ
ＮＡリガーゼを含む２０μｌの反応液中、１６℃、一夜
インキュベートした。この反応液を大腸菌の形質転換に
使用した。

【００１７】（１−４）大腸菌の形質転換とプラスミド
の確認 （１−３）で得た反応液２０μｌを用いて大腸菌ＨＢ１
０１を形質転換させた。得られた形質転換体２１クロー
ンについてプラスミドの分析を行った。すなわち、各ク
ローンについて５０μｇ／mlアンピシリンを含む１．５
mlのＬ−ブロスで一夜振とう培養し、ラピッド法により
プラスミドを調製し、その一部を XbaＩと SalＩで２重
消化した。これをアガロース電気泳動で分離し、予想さ
れる XbaＩ− XbaＩ断片（０．５６ kb ）及び XbaＩ−
SalＩ断片（１．５ kb ）のバンドの生成を調べた。そ
の結果、１２クローンに目的のバンドが認められた。更
に、その塩基配列をダイデオキシ法で決定したところ、
細胞接着ドメインの１０８アミノ酸のＣ末端のメチオニ
ンのコドンが欠落している以外は正しい塩基配列を持つ
ことを確認した。この組換体プラスミドを pTF 1301 と
命名した。またこのプラスミドを保持する大腸菌ＨＢ１
０１を Escherichia coli HB101 ／ pTF 1301 と表示
し、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した〔微工
研菌寄第９９４７号（ＦＥＲＭ Ｐ−９９４７）〕。

【００１８】実施例２ ＦＮの細胞接着ドメインAla¹²³⁵ − Gln¹⁵¹⁶（２８２ア
ミノ酸残基）及びフィブリン結合ドメインAsn²¹³³ − G
lu²³²⁴（１９２アミノ酸残基）をコードするｃＤＮＡ断
片のクローニング（図２参照）図２は、本発明による p
TF 1801 構築の工程図である。 （２−１） pTF 901の XbaＩ− Pvu II 断片の調製 細胞接着ドメインAla¹²³⁵ − Met¹⁵¹⁷をコードするｃＤ
ＮＡ断片を含むプラスミド pTF 901（特開平１−１８０
９００号）２０μｇを５０ユニットの XbaＩ及び５０ユ
ニットの Pvu II を含む２００μｌの反応液中、３７
℃、１時間インキュベートした。この反応液をアガロー
ス電気泳動にかけ、 XbaＩ− Pvu II 挿入断片（０．６
１ kb ）を切出した（収量４００ｎｇ）。 （２−２） pTF 1301 の XbaＩ− Pvu II 断片の調製 実施例１で得たプラスミド pTF 1301 ２５μｇを５０ユ
ニットの XbaＩ及び５０ユニットの Pvu II を含む２０
０μｌの反応液中、３７℃、１時間インキュベートし
た。この反応液をアガロース電気泳動にかけ、 XbaＩ−
Pvu II 挿入断片（０．４０ kb ）を切出した（収量４
００ｎｇ）。また、 XbaＩ− XbaＩ挿入断片を欠く８．
０ kb のベクターを同時に切出し（収量２μｇ）、脱リ
ン酸後、クローニングに使用した。

【００１９】（２−３） XbaＩ− Pvu II 断片（０．６
１ kb 及び０．４０ kb ）の結合 （２−１）で得た０．６１ kb 断片４００ｎｇと（２−
２）で得た０．４０ kb 断片４００ｎｇをＴ₄ ＤＮＡリ
ガーゼ用バッファー、０．５mM ＡＴＰ、１０mM ＤＴ
Ｔ及び２．８ユニットのＴ₄ ＤＮＡリガーゼを含む２０
μｌの反応液中、１６℃、３時間インキュベートした。
６５℃、１０分間の処理で反応を止め、バッファーを X
baＩ至適条件にし、１０ユニットの XbaＩを加えて、３
７℃、２時間反応させた。反応液をアガロース電気泳動
にかけ、 XbaＩ− XbaＩ断片（１．０１ kb ）を切出し
た（収量２０ｎｇ）。

【００２０】（２−４） XbaＩ− XbaＩ断片（１．０１
kb ）とベクターの結合 （２−３）で得た XbaＩ− XbaＩ断片（１．０１ kb ）
２０ｎｇと（２−２）で得た８．０ kb のベクター２０
ｎｇをＴ₄ ＤＮＡリガーゼ用バッファー、０．５mM Ａ
ＴＰ、１０mM ＤＴＴ及び２．８ユニットのＴ₄ ＤＮＡ
リガーゼを含む２０μｌの反応液中、１６℃、３時間イ
ンキュベートした。この反応液を大腸菌の形質転換に使
用した。

【００２１】（２−５）大腸菌の形質転換とプラスミド
の確認 （２−４）で得た反応液２０μｌを用いて大腸菌ＨＢ１
０１を形質転換させた。得られた形質転換体中１２クロ
ーンについてプラスミドの確認を行った。ラピッド法で
調製したプラスミドを XbaＩ− Pvu II の２重消化を行
い、アガロース電気泳動にかけ、予想される挿入断片
（０．６１ kb 及び０．４０ kb ）の生成を調べた。そ
の結果１クローンに目的のバンドが認められた。このク
ローンについて、更にEcoRＩ消化を行い、挿入断片の方
向性を調べたところ、正しい方向に挿入されていること
を確認した。また、ダイデオキシ法により塩基配列を決
定し、目的の配列を含むことを確認した。この組換体プ
ラスミドを pTF 1801 と命名した。また、このプラスミ
ドを保持する大腸菌ＨＢ１０１を Escherichia coli HB
101 ／ pTF 1801 と表示し、工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託した〔微工研菌寄第９９４８号（ＦＥＲＭ
Ｐ−９９４８）〕。

【００２２】実施例３ ＦＮのキメラポリペプチド Ile¹⁴¹⁰− Gln¹⁵¹⁶／ Asn
²¹³³− Glu²³²⁴（２９９アミノ酸残基）の生産と精製 実施例１で得たＨＢ１０１／ pTF 1301 を５０μｇ／ml
のアンピシリンを添加した５mlのＬ−ブロスを含む試験
管２本に接種し、３７℃、一夜振とう培養した。これを
５００mlの同培地を含む2 リットルの三角フラスコにそ
れぞれ接種して培養を続け、６６０nmの吸光度が０．３
となったところで２mMのＩＰＴＧ（イソプロピルβ−チ
オガラクトシド）を添加し、２０時間後に集菌した。全
菌体ペレットを１０ mM トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、５ mM ＥＤＴＡを含む溶液に懸濁して、超音波処
理を行い、１２０００rpm 、３０分間遠心して上清４０
mlを得た。これを抗ＦＮモノクローナル抗体（ＦＮ−１
２、宝酒造）を結合させたセファロース４Ｂカラム（８
ml）に通した。カラムを洗浄バッファーＡ（２０ mM ト
リス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄し、更に洗浄バッフ
ァーＢ（２０ mM トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１
Ｍ ＫＣｌ）で洗浄した。最後に溶出バッファー（５０
mM グリシンＨＣｌ、ｐＨ２．３、０．２Ｍ ＫＣｌ）
で溶出した。溶出画分を集め、電気泳動的にほぼ単一な
３４ kd ポリペプチド５００μｇを得た。

【００２３】実施例４ ＦＮのキメラポリペプチド Ala¹²³⁵− Gln¹⁵¹⁶／ Asn
²¹³³− Glu²³²⁴（４７４アミノ酸残基）の生産と精製 実施例２で得たＨＢ１０１／ pTF 1801 を実施例３と同
様の方法で２リットル培養し、抗ＦＮモノクローナル抗
体（ＦＮ−１２）セファロース４Ｂカラムにより精製し
た。この抗体カラム溶出画分には５５ kd の目的のポリ
ペプチドのほかに、その分解物である３５ kd のポリペ
プチドを含んでいた。そこで続いてフィブリン−セファ
ロース４Ｂカラムにより精製した。すなわちＤ．Ｌ．ヘ
ーン（D.L.Heene)らの方法〔トロムボシス リサーチ、
第２巻、第１３７〜１５４頁（１９７３）〕により作製
したフィブリン−セファロース４Ｂカラム（１０ml) に
抗体カラム溶出画分を通した。カラムを洗浄バッファー
（１０ mM トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５０ mM Ｎａ
Ｃｌ、０．５ mM ＥＤＴＡ）で洗浄後、溶出バッファー
（２５ mM トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、６Ｍ 尿素）
で溶出した。溶出画分を集め、電気泳動的に単一な５５
kd のポリペプチド１００μｇを得た。

【００２４】実施例５ 生物活性の測定 実施例３，４で得られたキメラポリペプチド Ile¹⁴¹⁰−
Gln¹⁵¹⁶／ Asn²¹³³−Glu²³²⁴（１０７ＣＢＰ／１９２
ＦＢＰ、２９９アミノ酸残基）、 Ala¹²³⁵− Gln¹⁵¹⁶／
Asn²¹³³− Glu²³²⁴（２８２ＣＢＰ／１９２ＦＢＰ、４
７４アミノ酸残基）を用いて以下の生物活性を測定し
た。 （５−１）細胞接着活性 ルオスラーティー（ Ruoslahti )らの方法〔メソッズ
イン エンザイモロジー（ Methods in Enzymology )第
８２巻、第８０３〜８３１頁（１９８１）〕に準じて細
胞接着活性を測定した。すなわち試料を生理食塩水又は
蒸留水で段階的に希釈し、その５０μｌを９６穴マイク
ロプレートに分注し、4 ℃、一夜インキュベートして試
料をプレートに付着させた。次にＰＢＳバッファーでプ
レートを２回洗浄し、３％ＢＳＡを１００μｌ加え３７
℃、１時間インキュベートしてプレートをブロックし
た。プレートをＰＢＳバッファーで２回洗浄した後、あ
らかじめ、イーグルの最小培地（ＭＥＭ）に１０⁶ 細胞
／mlとなるように懸濁させたラット腎細胞（ＮＲＫ−４
９Ｆ）を１００μｌ／ウエルの割合で分注し、３７℃、
２〜３時間インキュベートした。なお使用したＮＲＫ−
４９Ｆ細胞は凍結保存した株を前培養した後、トリプシ
ン処理したものを用いた。顕微鏡下で細胞の伸展を観察
し、伸展に必要な最少量を最少細胞接着活性として示
す。結果を他の活性と共に、後記表１に示す。１０８ア
ミノ酸残基及び２８３アミノ酸残基の細胞接着ドメイン
のみを有するポリペプチド〔１０８ＣＢＰ及び２８３Ｃ
ＢＰ（ Ile¹⁴¹⁰− Met¹⁵¹⁷及び Ala¹²³⁵− Met¹⁵¹⁷）、
特開平１−１８０９００〕を同時に測定し、キメラポリ
ペプチドと比較検討した。その結果、１０７ＣＢＰ／１
９２ＦＢＰは、１０８ＣＢＰに比し、約５２倍以上の活
性が認められた。２８２ＣＢＰ／１９２ＦＢＰは２８３
ＣＢＰと同等の活性が認められた。

【００２５】（５−２）フィブリン結合活性 関口らの方法〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケ
ミストリー（ Journalof Biological Chemistry )、第
２５６巻、第６４５２〜６４６２頁（１９８１）〕に従
い、フィブリン−セファロース４Ｂカラムへの吸着によ
りフィブリン結合活性を調べた。前記Ｄ．Ｌ．ヘーンら
の方法〔トロムボシス リサーチ、第２巻、第１３７〜
１５４頁（１９７３）〕により作製したフィブリン−セ
ファロース４Ｂカラム（１．４ml) にキメラポリペプチ
ド Ile¹⁴¹⁰− Gln¹⁵¹⁶／ Asn²¹³³− Glu²³²⁴（１０７Ｃ
ＢＰ／１９２ＦＢＰ、２９９アミノ酸残基）５μｇを通
した。７．５mlの洗浄バッファー（１０ mM トリス−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．６、５０ mM ＮａＣｌ、０．５ mM ＥＤ
ＴＡ）で非吸着画分を除いた後、溶出バッファー（２５
mM トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、６Ｍ 尿素）で吸着
画分を溶出させた。各画分を０．５mlずつ分画し、１０
７ＣＢＰ／１９２ＦＢＰの溶出位置を抗ＦＮモノクロー
ナル抗体（ＦＮ−１２、宝酒造）を用いたＥＬＩＳＡ法
により調べた。その結果、１０７ＣＢＰ／１９２ＦＢＰ
は吸着画分に認められ、フィブリン結合活性を有するこ
とが確認された。同様の結果は Ala¹²³⁵− Gln¹⁵¹⁶／ A
sn²¹³³− Glu²³²⁴（２８２ＣＢＰ／１９２ＦＢＰ、４７
４アミノ酸残基）でも確認された。また、フィブリン結
合ドメインを有しない Ile¹⁴¹⁰− Met¹⁵¹⁶（１０８ＣＢ
Ｐ）及び Ala¹²³⁵− Met¹⁵¹⁶（２８３ＣＢＰ）は、フィ
ブリン−セファロース４Ｂへの吸着は認められなかっ
た。（表１参照）

【００２６】（５−３）インスリン結合活性 ＦＮのフィブリン結合ドメインにはインスリンの結合活
性があることが知られている（第４６回日本癌学会総会
記事、第１８１頁）。そこでキメラポリペプチドのイン
スリン結合活性を調べた。１０７ＣＢＰ／１９２ＦＢ
Ｐ、２８３ＣＢＰ／１９２ＦＢＰ、１０８ＣＢＰ、２８
３ＣＢＰを２０μｇより順次１／２希釈したものをバイ
オラッド社製ＢＩＯ−ＤＯＴ^TMを用いてニトロセルロー
ス膜に吸着させた。このニトロセルロース膜を３％ＢＳ
Ａを含むＰＢＳバッファーでブロッキング操作を行った
後、５０μｇ／mlのパーオキシダーゼ標識したインスリ
ン（シグマ社）を含むＰＢＳバッファー中室温、２時間
放置した。次にこのニトロセルロース膜をＰＢＳで５分
間、２回洗浄した後、結合したパーオキシダーゼ−イン
スリンを４−クロロ−１−ナフトール及び過酸化水素を
基質として検出した。その結果１０８ＣＢＰ及び２８３
ＣＢＰでは全く発色がみられないのに対して、１０７Ｃ
ＢＰ／１９２ＦＢＰ及び２８３ＣＢＰ／１９２ＦＢＰで
は濃度に対応した発色がみられた。したがって、１０７
ＣＢＰ／１９２ＦＢＰ及び２８３ＣＢＰ／１９２ＦＢＰ
にはインスリン結合活性があることが確認された（表１
参照）。

【００２７】

【表１】 表 １ ─────────────────────────────────── ポリペプチド 最少細胞接着活性 フィブリン インスリン μｇ／ウエル pmole/ウエル 結合活性 結合活性 ─────────────────────────────────── 108CBP >50 >4400 − − 283CBP 0.03 1.0 − − 107CBP/192FBP 2.8 84 ＋ ＋ 282CBP/192FBP 0.13 2.4 ＋ ＋ FN 0.18 0.8 ＋ ＋ ─────────────────────────────────── 108CBP ： Ile¹⁴¹⁰− Met¹⁵¹⁷ 283CBP ： Ala¹²³⁵− Met¹⁵¹⁷ 107CBP/192FBP ： Ile¹⁴¹⁰− Gln¹⁵¹⁶／ Asn²¹³³− Glu²³²⁴ 282CBP/192FBP ： Ala¹²³⁵− Gln¹⁵¹⁶／ Asn²¹³³− Glu²³²⁴

【００２８】

【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明によ
り、少なくともフィブリン結合活性を持つ機能性ポリペ
プチド、並びにそれをコードする遺伝子が提供された。
上記ポリペプチドは、創傷治癒、ドラッグデリバリーシ
ステムとしてなど各種の用途に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のプラスミド構築の一例を示す工程図で
ある。

【図２】本発明のプラスミド構築の一例を示す工程図で
ある。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 菅原 由起 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (56)参考文献 特開 昭62−89699（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−272975（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−282593（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−236485（ＪＰ，Ａ) 特表 昭59−501548（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/78 C12N 1/21 C12P 21/02 A61K 37/02

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記式（化１）で示されるアミノ酸配列
   で表されることを特徴とする機能性ポリペプチド。 【化１】
2. 【請求項２】 請求項１記載の機能性ポリペプチドをコ
   ードする遺伝子。
3. 【請求項３】 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｈ
   Ｂ１０１／ｐＴＦ１３０１（ＦＥＲＭ Ｐ−９９４７）
   より得られるプラスミドｐＴＦ１３０１、又はＥｓｃｈ
   ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＴＦ１８０
   １（ＦＥＲＭ Ｐ−９９４８）より得られるプラスミド
   ｐＴＦ１８０１に含有されることを特徴とする請求項２
   記載の遺伝子。
4. 【請求項４】 請求項２又は３記載の遺伝子を含有する
   組換体プラスミド。