JP2592441B2

JP2592441B2 - 免疫インタフエロンおよびその精製方法

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Publication number: JP2592441B2
Application number: JP59196499A
Authority: JP
Inventors: 進本多; クングフシアングーフ; 弘杉野
Original assignee: EFU HOFUMAN RA ROSHU AG; Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: EFU HOFUMAN RA ROSHU AG; Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1983-09-20
Filing date: 1984-09-19
Publication date: 1997-03-19
Anticipated expiration: 2012-03-19
Also published as: IL72986A0; ES8606886A1; DK162604C; GB8423748D0; GB2146998B; NZ209588A; IL72986A; KR850002285A; ZA846554B; FI843669L; HUT35289A; NO843750L; ES536028A0; GB2146998A; EP0138087B1; FI843669A0; FI80293B; DK447784D0; EP0138087A1; MC1627A1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、次に示すアミノ酸配列を有し、 Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln その配列はアミノ末端にさらに任意にメチオニン残基を
含み、本質的にそのたん白分解断片を有しないヒト免疫
インタフエロンに関するものであり、またそのようなヒ
ト免疫インタフエロンを含有する医薬組成物に関するも
のである。本発明はまた本質的にそのたん白分解断片を
含まない完全なヒト免疫インタフエロンの製造法に関す
るものであり、該製造法は完全な組み換えヒト免疫イン
タフエロンをそれを含む形質転換微生物よりプロテアー
ゼまたは酵素活性は阻害するが免疫インタフエロンの生
物活性には影響しないような抗たん白分解試薬、例えば
グアニジン塩酸、で抽出し、得られる抽出インタフエロ
ンを免疫インタフエロンに対する新規なモノクローナル
抗体を用いて精製することより成る。

先行技術の発明でインタフエロンとして知られる抗ウ
イルス性たん白質群の抽出および精製を行なういろいろ
な方法が考案されている。現在、インタフエロンには三
種の主要グループが知られている:IFN-α（白血球イン
タフエロン）、IFN-β（線維芽細胞インタフエロン）お
よびIFN-γ（免疫インタフエロン）である。これらのイ
ンタフエロン群は、抗ウイルス性、増殖阻害活性あるい
は構造配列の点から類似しているが、これら全ての群の
インタフエロンを抽出、精製する統一的な方法は確立さ
れていない。実際に白血球インタフエロンを他のたん白
質や細胞残渣の粗混合物より抽出し、精製するのに有効
な方法の多くは、同様な粗混合物より線維芽細胞インタ
フエロンまたは免疫インタフエロンを抽出、精製するこ
とは出来ない。

従来知られる精製での抽出は、多くの場合組換え技術
を用いて目的の“異種たん白”を生産した微生物を、物
理的（例えば音波破砕）或いは化学的溶接菌により破壊
するのが典型であった。しかし、この物理的または化学
的な溶菌工程中に細胞の種種のプロテアーゼも混合液中
に遊離する。これらのプロテアーゼは液中の異種たん白
質に自由に酵素的に作用し、分解できる。従つてこれら
のプロテアーゼは“異種”たん白を完全なまたは仕上つ
た生物的活性型の単一物質として精製するのを妨げ、或
いは阻害する。

従つて、先行技術の抽出および精製法の限界を克服す
る方法を提供し、それにより免疫インタフエロンの完全
配列の型を得、精製免疫インタフエロン標品からたん白
分解による断片を除去することが本発明の目的である。

さらに、均質で完全な型の免疫インタフエロンを得る
ことが本発明の目的である。

免疫インタフエロンの場合、先行技術に記載される従
来のいかなる抽出および精製技術を用いてもそのまゝ
の、または完全なアミノ酸配列を有する完全に均質な免
疫インタフエロン標品を得ることが出来ない。最近にな
りはじめて組換え技術の進歩により十分量のrIFN-γを
得て性質を明かにし、そのアミノ酸配列を決定すること
が可能になつた。従来の先行技術を用いてrIFN-γの抽
出を行ない、精製標品のアミノ酸配列を決定すると、精
製標品が、事実、異なる分子量の各種関連たん白種より
成ることがわかつた。アミノ酸配列決定によりさらにこ
れらのたん白種は完全なたん白の断片の多くを組み合せ
た免疫インタフエロンそのまゝの配列であることがわか
つた。驚くことに、先行技術の標品は完全な免疫インタ
フエロンとその断片を含んでいることがわかつたが、こ
のような混合物成分も生物活性を維持していることがわ
かつた。

rIFN-γの抽出は音波処理または化学的溶菌を用いて
行なう。しかしrIFN-γ（それから得られるDNA塩基配列
およびアミノ酸配列は参考文献１に記載される）は音波
処理または化学溶菌の工程で分解される。しかし凍結細
胞の音波処理では主として15K rIFN-γ、即ち、第132番
目から146番目のＣ末端アミノ酸残基を除去したrIFN-
γ、が得られる。このような分解は抽出の際塩酸グアニ
ジンのようなrIFN-γの生物活性やアミノ酸配列に抽出
条件下では影響しない試薬を用いることにより防止でき
る。さらに驚くことに、免疫インタフエロンは精製標品
にグアニジン塩酸を加えると生物活性が失なわれるにも
拘ず、塩酸グアニジン抽出しても生物活性が保持される
ことが明かとなつた。

従つて、本発明はそのまゝの完全な配列を有する組換
えヒト免疫インタフエロンより成る。本たん白質はそれ
を含む形質転換微生物より、抽出過程でプロテアーゼや
酵素活性を阻害するが抽出条件下で目的たん白の活性に
は影響しないと思われる試薬（またはその混合物）、例
えばたん白変性剤であるグアニジン塩酸塩を用いて該微
生物を処理することにより得られる。精製rIFN-γは抽
出上澄液を、出来れば適当に希釈した後、直接精製、好
ましくはモノクローナル抗体カラムにのせることにより
得られる。抽出および精製工程は大量製産の場合自動化
できる。従つて、本発明によりはじめて多量の均質rIFN
-γが供給可能となり、その結果大々的な臨床試験、生
物試験、Ｘ−線結晶回析および構造活性研究が出来るよ
うになる。

本発明で用いる抗たん白分解剤はグアニジン塩のいず
れでもよい。グアニジン塩としては例えば酢酸のような
有機酸塩、或いは例えばハロゲン化水素、即ち、臭化水
素、塩化水素、弗化水素および沃化水素のような鉱酸と
の塩などがある。好ましいグアニジン塩は塩酸グアニジ
ンである。微生物を処理する時のグアニジン塩の濃度は
決定的ではなく、効果のある濃度なら使用できる。しか
し微生物処理には３−7Mのグアニジン塩溶液を使用し、
菌体１グラム当り３−９倍容量の塩溶液を用いるのが好
ましい。塩溶液は水または水性緩衝液、例えば酢酸アン
モニウム、ピリジン／酢酸等、を溶媒として作製する。
また本発明の実施においては、例えば尿素や硫シアン酸
塩などのような他のプロテアーゼ阻害剤も使用できる。

さらに好ましい具体例を以下の明細および実施例で示
す。

E.coli中に生産された組換えヒト免疫インタフエロン
は凍結細胞より7M−塩酸グアニジンで抽出し、好ましく
は新規のモノクローナル抗体アフイニテイ−カラムを用
いた精製方法で精製する。グアニジンによりSDS-PAGEに
おける見かけの分子量18,000ダルトン（18K）の精製イ
ンタフエロンが得られ、グアニジン非存在下の音波処理
抽出ではより低分子の種（主要種はおよそ15,000ダルト
ン、15K）が単離される。18Kおよび15Kの両たん白共ア
ミノ末端配列はこのヒト免疫インタフエロンたん白をコ
ードするDNAから予想される配列と一致した。

本発明を通して記載される18K免疫インタフエロンのD
NA配列は下の式の通りである：但し、“X"の下の塩基はリボゾーム結合部位および翻
訳開始シグナルをコードし、“Y"の上の塩基は翻訳停止
シグナルをコードする。

18K rITF-γから遊離するＣ−末端ペプチドを精製後
分析および配列決定して決定したＣ末端配列はrIFN-γ
の予想されるアミノ配列と一致し、これは18K種が完全
な分子であることを示す。本明細書に記載する18K免疫
インタフエロンのアミノ酸配列は次の式で示される： Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln 免疫インタフエロンたん白のアミノ末端にさらにメチ
オニン（Met）残基を含むものも本発明の考察範囲に含
まれる。従つて18K rIFN-γはアミノ末端がメチオニン
或いはシステインで始まるポリペプチドおよびそれらの
混合物より成る。

本発明の好ましい具体例では、醗酵工程で受容菌とし
て用いられ、他に記載がない限りは、使用する微生物は
英国特許No.2055382Aに記載されるEscherichia coli K-
12 294株であり、本菌は1978年10月28日付けでAmerican
Type Culture CollectionにNo.31446の番号で寄託され
ている。さらに全ての組換えDNA実験はNational Instit
utes of Healthの適用ガイドラインに沿つて行なわれ
た。

しかし、本発明は上述のE.coil K-12 294株のみを含
蓄するものでなく、他のE.coil株、例えばE.coli MA210
あるいはE.coli RR1（ATCC-31343）、または多くが公的
に入手可能か、American Type Culture Collection（AT
CCカタログ参照）などの認められた微生物寄託機関に寄
託され、入手可能であるような他の微生物をも含蓄す
る。

本発明に従えば上述の新規免疫インタフエロンは他の
既知のインタフエロンと同じ目的、即ち、ウイルス性ま
たは腫瘍性疾患の予防や治療、或いは免疫抑制状態の治
療の目的に使用できる。インタフエロンは医薬的に容認
される経口用、注射用または局所用組成および方式で投
与される。投与量および投与回数は既知インタフエロン
の臨床応用に現在用いられているものと対応し、典型的
にはおよそ毎日1-200×10⁶単位である。本発明による医
薬組成物は共存し得る医薬的に容認される担体物質と合
わせてインタフエロンを含有する。従来のいかなる担体
物質も利用できる。担体物質は内服、経皮または非経口
投用に適した有機、無機の不活性担体である。適当な担
体としては水、ゼラチン、アラビアゴム、乳糖、でん
粉、ステアリ酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリア
ルキレングリコール、黄色ワセリンなどが含まれる。さ
らに医薬調合剤は他の活性剤も含むことがある。香味
剤、保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝液などのような添加
剤も医薬品製剤の容認される習慣に従つて添加されるこ
とができる。

医薬品調合剤はいかなる慣習的な型にも作り上げるこ
とができる。例えば;a）錠剤、カプセル、丸剤、粉末、
粒剤などのような経口投与用の固体;b）溶液、シロツ
プ、けん濁液、エリキシルなどのような経口投与用の液
体;c）滅菌した溶液、けん濁液または乳化液のような注
射用調合剤；およびｄ）溶液、けん濁液、軟こう、クリ
ーム、ゲル、微小粉末、エアゾールなどのような局部投
与用調合である。医薬調合剤は滅菌し、かつ／または保
存剤、安定剤、浸潤剤、乳化剤、浸透圧変化用の塩およ
び／または緩衝液のようなアジユバントを含有する。

非経口投与用形態は静脈内または筋肉内注入できる注
入液または注射液である。これらの調合剤もまた他の医
薬的活性物質を含有できる。保存剤、安定剤、乳化剤、
緩衝液のような添加物が医薬品製剤の容認される慣習に
従つて添加される。

〈実施例１〉抗原として用いた担体たん白−ポリペプチド複合体の合
成ポリペプチドH-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Ph
e-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OHをGood friendら、S
cienee 144巻、1334頁（1964年）の方法に従つてチログ
ロブリン（以後TGと略す）とカツプルさせた。

ペプチド自身は従来から知られるペプチド合成の方法
で作製した。多くの場合液相合成法の方が有利であつた
が、固相、液相の両法とも使用できる。そのようペプチ
ド合成法は例えば“The Peptides"、第１巻、Academic
Press,New York,USA,1966年中でSchroderおよびLubkeに
より、“Peptide Syutheses"、丸善、東京、1975年中で
泉谷らにより、或いは“Experiments in Biochemistry"
（生化学実験講座）、第１巻、207-400頁、東京化学同
人、1977年中で矢島治明により記載されており、アジド
法、塩化法、無水酸法、混合酸無水物法、DCC法、活性
エステル法、Woodwaid試薬Ｋを使用する方法、カルボジ
イミダゾール法、酸化−還元法およびDCC/添加物（例え
ば HONB、HOBt、HOSu）法などがある。

IFN-γの131-136断片の調製の詳細な記載は欧州特許
出願No.103898参照のこと。

2.5mgの該ポリペプチドを3.75mgのTGと混ぜ、50mMり
ん酸緩衝液を2ml添加した後、混合物を氷冷浴中でよく
攪拌した。これに200mlの蒸溜水に30.4mgの塩酸カルボ
ジイミドを溶解した溶液を一滴ずつ徐々に添加した。そ
の後、混合物を氷冷浴中で３時間攪拌した。反応終了後
蒸溜水に対して十分透析を行ない、凍結乾燥して4.7mg
のたん白複合体を得た。

〈実施例２〉抗体検出用酵素免疫アツセイ（EIA）のための酵素結合
抗原の調製 EIAのための酵素結合抗原はJournal of Biochemistry
79巻、233頁（1976年）の北川らの方法により調製し
た。

（１）ポリペプチドへのマレイミド基の導入実施例１で
得られたポリペプチド（350nmole）を100mMりん酸緩衝
液（pH6.8）1mlに溶解し、この溶液を585μｇ（1.75μm
ole）のＮ−（４−カルボキシシクロヘキシルメチル）
マレイミドＮ−ヒドロキシ−コハク酸イミドエステル
を70μｌのN,N−ジメチルホルムアミドに溶解した溶液
に添加した。混合液を30℃で30分間攪拌した。反応終了
後、セフアデツクスG-25のカラムで分画を行ない、マレ
イミド基が導入されたポリペプチド画分185nmoleを得
た。

（２）マレイミド基含有ポリペプチドとβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼとのカプリングマレイミド基含有ポリペプチド（16.5nmole）を3.3nm
oleのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼと混合した。４℃で18
時間反応後、反応を停止するため412.5nmoleのβ−メル
カプトエタノールを添加した。β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ結合ポリペプチドをセフアロース6Bのカラムで分画
し、以後の実験に使用した。

〈実施例３〉免疫化７〜８週令のBALB/C雌マウス６匹に実施例１で得られ
たたん白複合体の40μｇ（たん白量として）をフロイン
ド完全アジユバントとの親和性混和物として抗原として
皮下注射した（一次免疫）。一次免疫２週間後に再び上
記と同じ量の抗原をフロインド不完全アジュバンドとの
親和性混和物としてマウスに皮下注射した（二次免
疫）。さらに２週間後に二次免疫と同じようにして三回
目の免疫を行なつた。三次免疫の６日後にマウスより血
液を一部採取し、下に述べるEIA法により血清抗体の力
価を測定した（Immunopharmacology1巻、３頁［1978
年］参照）。γ−２と命名したマウスが最も高い抗体力
価を示したので最終免疫を0.5mlの塩化ナトリウム溶液
に溶解した120μｇの抗原で静脈注射により行なつた。
各マウスの抗体力価の値を第１表に示す。

EIA法実施例２で得られるたん白複合体で免疫したマウスの
血清中、或いはハイブリドーマ上澄液中の抗体活性の検
出はEIA法［Immuaophormacology1巻、３頁（1978年）］
により行なつた。即ち、血清またはハイブリドーマ上澄
液を緩衝液Ａ（20mM Na₂HPO₄、100mM NaCl、0.1％Na
N₃、1mM MgCl₂、pH7.0）で希釈し、希釈液100μｌを100
μｌの酵素結合ポリペプチド誘導体（実施例２）と混ぜ
て反応を24℃24時間進行させた。次にウサギの抗マウス
IgGとカップルさせた３％セルロースを100μｌ添加し、
反応を24℃４時間進行させた。反応終了後、0.5％のTwe
en20を含む緩衝液Ａでセルロースをより洗い、20μg/ml
の４−メチルウンベリフエリル−β−Ｄ−ガラクトシド
500μｌを添加して37℃２時間反応後、反応を停止する
ため3mlの100mM炭酸緩衝液（pH10.5）を加えた。螢光強
度を螢光計で測定した（励起:365nm;発光;450nm）。

〈実施例４〉細胞融合実施例３に記載した最終免疫の３日後に、γ−２マウ
スより脾臓を摘出し、ステンレス製メシュで加圧濾過後
イーグル最少必須培地（MEM）にけん濁して脾臓細胞け
ん濁液を得た。細胞融合にはBALB/Cマウス由来のP3-X6
3.Ag 8.U1（P3U1）骨髄腫細胞を用いた［Current Topic
s in Microbiology and Immunology、81巻、１頁（1978
年）］。細胞融合はＫhlerおよびMilstein、Nature 2
56巻、495-497頁（1975年）の最初の方法により行なつ
た。即ち、脾臓細胞とP3U1細胞を別々に血清無添加MEM
で３回洗滌し、5:1の割合（細胞数として）で混合し
た。混合物を800rpmで15分間遠心分離して細胞を沈でん
させた。上澄液を完全に除去してから沈でんを軽くほぐ
し、0.3mlの45％ポリエチレングリコール（PEG）6000
（Koch-Light）を加えてから37℃の湯浴中で７分間静置
して細胞融合を行なつた。その後MEMを毎分2mlの割合で
添加し、合計12mlのMEMを添加後得られた混液を600rpm1
5分間遠心分離し、続いて上澄液を除去した。細胞沈で
ん物を10％胎児仔ウシ血清を含むRPMI-1640培地（RPMI1
640-10FCS）に２×10⁵P3U1細胞/mlの濃度となるように
けん濁し、24穴−マルチディッシュ（Linbro）の144ウ
エルのそれぞれにこのけん濁液を1mlずつ接種した。接
種後細胞を37℃にて５％炭酸ガスインキュベーター中で
インキュベートした。24時間後にHAT（１×10^-4Ｍヒポ
キサンチン、４×10^-7Ｍアミノプテリン、1.6×10^-5Ｍ
チミジン）添加RPMI1640-10FCS培地をウエル当り1mlず
つ加えてHAT選択培養を開始した。HAT選択培養は培養開
始後3,5および７日目に古い培地を1mlのHAT培地と交換
して続けた。ハイブリドーマの生育は細胞融合後、10〜
14日目に認められた。培養液が黄色に変化したら（およ
そ１×10⁶個/ml）上澄液を集めてEIA法により抗体の
存在を確認した。このようにしてハイブリドーマの生育
が認められた141個のウエルの上澄液を試験した。２個
のウエル（γ2-11およびγ2-100）が強い抗体活性を示
し、他の２個（γ2-62およびγ2-70）が弱い抗体活性を
示した。

〈実施例５〉クローニング抗体活性が陽性であつた３個のウエル（γ2-11、γ2-
62およびγ2-100）からのハイブリドーマを制限希釈法
でクローン化した。即ち、ハイブリドーマ細胞をRPMI16
40-20FCSに少なくとも1ml当り２個となるようけん濁
し、その0.1mlずつを96−穴のマイクロプレートのウエ
ルに分注した。各ウエルに５×10⁵個のBALB/Cマウス胸
腺細胞をフィーダー細胞として添加した。その結果、お
よそ２週間のうちに細胞増殖が観察された。上澄液を集
めて実施例３に記載のEIA法で抗体の存在を調べた。γ2
-11からの19個のクローン中８個、γ2-62からの54クロ
ーンの中３クローン、γ2-100からの47クローン中５ク
ローンに抗体活性が認められた（第２表）。

〈実施例６〉モノクローナル抗体のIFN-γへの結合能モノクローナル抗体のIFN-γへの結合能を次の方法で
測定した。ウサギの抗マウスIgG抗体とカップルさせた
セルロースの３％溶液300μｌにγ2-11、γ2-62および
γ2-100のウエルの夫々よりの各２〜３クローン細胞の
上澄液300μｌを添加し、室温で12-20時間反応させた。
次にセルロースを生理的食塩水で十分洗滌し、それに下
に示す方法で得たIFN-γの550U/mlを加えた。反応３〜
４時間後に上澄液を集め、そのIFN-γ活性をマイクロプ
レートを用いる細胞毒性効果（CPE）判定法［Applied M
icrobiology 16巻、1706頁（1968年）］により測定し
た。

即ち、96-穴のマイクロプレートの各ウエルに50μｌのM
EMを入れ、最初のウエルには50μｌのIFN標品を加えて
から順次２倍希釈を行なった。このようにして準備した
ウエルにWISH細胞の20％FCS含有MEMけん濁液（４×10⁵
個/ml）50μｌを添加し、炭酸ガスインキュベーター中3
7℃で24時間インキュベートした。その後2000TCID₅₀（T
CID₅₀：平均組織培養感染量）に調整した水疱性口内炎
ウイルス（New Jersey株）50μｌを各ウエルに加え、炭
酸ガスインキュベーター中37℃でインキュベージョンを
行なった。約35時間の後、IFN標品無添加ウエル中の細
胞が100％CPEを示したら、各ウエルを顕鏡してCPEを判
定し、50％CPEを示すウエルのIFN標品の希釈係数の逆数
をIFNの力価とした。

使用したIFN-γの標品はヒト末梢リンパ球細胞を40μ
g/mlコンカナバリンＡおよび15ng/mlの12−０−テトラ
−デカノイルホルボール−13−アセテートで刺激して72
時間後に採取した上澄液である。この培養上澄液は1ml
当り4400単位のヒトIFN-γ（熱および酸不安定）を含有
していた。クローン化細胞培養濾液にIFN-γとの結合能
を有する抗体が存在すれば、添加したIFN-γはセルロー
ス上の抗体に結合し、上澄液のIFN-γ活性は低下する筈
である。その結果、クローンr2-11に比較的強いIFN-rと
の結合能が認められ、添加したIFN-r（550単位/ml）の5
0-75％が抗体と結合した（第３表）。

〈実施例７〉モノクローナル抗体産生ハイブリドーマによる腹水の生
成腹水の生成は鉱油で前処理したBALB/cマウスにIFN-γ
との結合活性を有する抗体産生能を持つγ2-11、１クロ
ーン化細胞を１×10⁶個腹腔内投与して起した。ハイブ
リドーマを腹腔内投与して10日後に腹水を取つて抗体活
性を10⁷倍希釈まで調べた。対応するクローン細胞培養
濾液の抗体活性は10⁴倍希釈まで検出されたが、腹水生
成（腹水化）により抗体活性はおよそ1000倍増加した。

〈実施例８〉モノクローナル抗体の精製実施例７で得られた腹水4mlを出発原料としてモノク
ローナル抗体の精製をStaehelinらの方法（Journal of
Biological Chemistry256巻、9750頁［1981年］）によ
り行なった。即ち、腹水をまず10,000rpm15分間遠心分
離してフイブリン様物質を除去し、りん酸緩衝液−食塩
水（PBS:8.1mM NaH₂PO₄、1.5mM KH₂PO₄、2.7mM KCl、13
7mM NaCl;pH7.2）で希釈して濃度が280nmの吸収（A28
0）が12から14の範囲になるようにした。その後、飽和
硫酸アンモニア溶液を硫酸濃度が47％となるように添加
した。混合物を４℃で60分間攪拌して塩析を行ない、遠
心分離（10,000rpm、15分）で沈でんを得た。沈でんを5
0mM NaCl含有の20mM Tris緩衝液（pH7.9）に溶解し、２
リットルの同じ緩衝液に対して透析を行なった。２時間
後に透析液を新しい同じ溶液と交換し、さらに透析を15
時間続けた。次に沈でんを10,000rpm15分遠心分離して
除去し、上澄液をA280の値が20-30となるような濃度に
調整した。このサンプルを50mM NaCl含有Tris緩衝液（p
H7.9）で十分平衡化したDEAE−セルロースカラム（8m
l、Whatman DE₅₂）にかけて分画し、50mM NaCl含有のTr
is緩衝液で1.5m/分の速度で溶出を行なった。この条件
下で抗体活性は主に溶出液区分に検出された。精製標品
が抗体であるという確認はLaemmliら、Nature 227巻、6
80頁（1970年）により記載されるSDS-PAGE法により行な
った。即ち、硫酸、アンモニウム塩析およびDEAE-セル
ロース分画で得られたいくつかの区分につき2-メルカプ
トエタノールで還元し、続いて17％SDSゲル電気泳動を3
0ボルトで24時間かけた。抗体活性のピークと一致して
二つのバンドがおよそ55キロダルトン（Ｈ−鎖）および
およそ28キロダルトン（Ｌ−鎖）の分子量に相当する位
置に認められた。このようにして精製した抗体の画分17
についてIFN-γ（2200U/ml）を添加してIFN-γ結合活性
を調べた。その結果、約50％のIFN-γが抗体と結合する
ことがわかった（第４表）。

〈実施例９〉モノクローナル抗体が属するサブクラス精製した抗体の画分17（実施例８）を10倍希釈して寒
天上の免疫沈降反応（オークテルロニー・テスト:Immnu
ological Methods,Gel−Diffusion Techniques,Blackwe
ll,Oxford,1964年）を山羊の抗マウスIgG1、G2a、G2bお
よびG3抗体（Miles）を用いて行ない、γ2-11、１モノ
クローナル抗体が属するIgGサブクラスの同定をした。
モノクローナル抗体と山羊の抗マウスIgG2b抗体との間
にはっきりした一本のバンドが見られ、モノクローナル
抗体と他の抗−抗体との間にはバンドの形成が認められ
なかった。従って該モノクローナル抗体はIgG2bに属す
ることが判明した（第５表）。

〈実施例 10〉実施８の方法で精製した溶出区分からのモノクローナ
ル抗体25ml（65.3mg）を0.1M NaHCO₃（pH8.3）に対して
一晩透析を行なった。別に25mlのAFF1-GEL 10（Bio-Ra
d）をガラスフイルターを用いて水で十分洗滌し、0.1M
NaHCO₃（pH8.3）にけん濁してから上述の抗体と混合し
た。混合物を４℃で４時間静かに攪拌して反応を進行さ
せ、４℃で一晩静置した。AFF1-GEL 10をガラスフイル
ターを用いて0.1M NaHCO₃（pH8.3）でよく洗った。この
ゲルに0.1Mエタノールアミンと0.15M NaClを含む溶液を
25ml加えた。混合物を４℃で１時間振とうして未反応の
活性基を阻害した。次にゲルをPBSで十分洗滌し、0.1％
NaN₃含有PBS25mlにけん濁した。けん濁液を４℃で保
存した。添加した抗体量と回収した上澄液の抗体量とよ
り、抗体はゲルに2.35mg/mlの割合で結合したことがわ
かつた。このようにして得られた反応生成物をカラムに
充填して抗体カラムとして使用した。

〈実施例 11〉 E.coli RR1（pRK248cIts,pRC231/IFI-900）（本組換
え微生物の構築はヨーロツパ特許出願No.99084に詳細に
記載されている）をrIFN-γの生産に使用した。プラス
ミドpRK248cItsおよびpRC231/IFI-900はそれぞれ温度感
受性ラムダレプレツサーおよびIFN-γ遺伝子を含んでい
る。rIFN-γ遺伝子の発現はP_Lプロモーターの調節下に
ある。

E.coli RR1（pRK248cIts,pRC231/IFI-900）の一晩培
養物をLB培地中30℃で増殖させた。１リツトルの培養物
をカザミノ酸含有最少Ｍ−９培地で10倍に希釈した。対
数増殖期に培養を30℃から42℃にシフトし、42℃で２〜
３時間増殖を続けた。遠心分離により集菌し、菌体ペレ
ツトは使用するまで−20℃で保存した。全ての醗酵およ
び操作はNational Institutes of Healthの組換えDNA実
験ガイドラインに従って行なった。

rIFN-γの131-146のＣ末端合成ペプチドに対するモノ
クローナル抗体を上述の如く作製した。精製にはモノク
ローナル抗体M₀ γ2-11.1を使用した。モノクローナル
抗体カラムは実施例10に記載した通り調整した。

¹⁴C−ヨード酢酸によるrIFN-γのカルボキシメチル化
は参考文献（３）に記載されるように6M塩酸グアニジン
の存在下で行なった。過剰の試薬はC8−逆相カラムのHP
LCにて除去した。カルボキシペプチダーゼ消化は0.2M H
N₄HCO₃中で参考文献（４）に記載される通り行なった。

rIFN-γを参考文献（５）に記載される通り、70％ギ
酸中でCNBr（メチオニンに対して100倍モル量）で処理
した。CNBrペプチドをC-18逆相カラムを用いたHPLCで分
離した。ペプチドの溶出は0.1％トリフルオロ酢酸中０
から70％のCH₃CNグレジエントで行なった。

たん白またはペプチド標品は封管したN₂−注入吸引管
中、４％チオグリコール酸含有の沸とう塩酸中で20-24
時間加水分解を行なった。アミノ酸分析は参考文献
（６）に記載されるフルオレスカミン−アミノ酸分析計
を用いて行なった。

カルボキシメチル化たん白の配列分析には、参考文献
（７）に記載されているABI（Applied Biosystem,In
c.）の気相シークエンサー 470Aを用いた。PTH−アミ
ノ酸のサンプルは参考文献（８）に記載されている超粒
子ODSカラムの逆相HPLCで同定した。

全ての精製工程は４℃で行なった。凍結細胞（25g）
を３倍量（75ml）の7M塩酸グアニジン（pH7）にけん濁
した。けん濁液を１時間攪拌後、30,000×ｇで１時間遠
心分離した。上澄液をPBSまたは0.15Mホウ酸ナトリウム
緩衝液（pH9.5）で10倍に希釈し、30,000×ｇで30分間
遠心分離した。もう一つの方法としては、凍結細胞（25
g）を1.5倍量（37.5ml）の0.15Mホウ酸ナトリウム緩衝
液（pH9.5）にけん濁し、１時間攪拌した。混合物を30
秒ずつ５回音波処理し、30,000×ｇで１時間遠心分離し
た。塩酸グアニジン抽出または音波処理の上澄液をPBS
で前洗滌したシリカ25mlと回転振とう機上で１時間混合
した。混合物をカラムに注ぎ、カラム容量の20-30倍の1
M NaClでカラムを洗った。次にカラムを0.01Mホウ酸ナ
トルウム緩衝液（pH8.0）中の0.5M塩化テトラメチルア
ンモニウムで溶出した。インタフエロン活性はおよそ20
0ml中に溶出し、４つの区分に分離された。各区分をPBS
で平衡化したモノクローナル抗体（γ2-11.1）アフイニ
テイカラム（容量4ml）にかけた。カラム10倍量のPBSで
洗滌後、1M塩酸グアニジンまたは1M NaClおよび20mMり
ん酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）含有の50％エチレング
リコールで溶出した。インタフエロン活性は最初の20ml
に溶出した。

SDS-PAGEはLaemwli（参考文献９）により記載される
通りに行なった。たん白質は結晶ウシ血清アルブミンを
対照標準としてフルオレスカミン分析で測定した。イン
タフエロン活性は参考文献10に報告されている通り、水
疱性口内炎ウイルスおよびヒトWISH細胞を用いた細胞毒
性効果阻害アツセイにより測定した。インタフエロンカ
価は部分精製したヒト免疫インタフエロンの対象標準に
対して基準化した相対単位/mlで表示した。

抽出および精製工程の要約を第６表に示す。全体の回
収率は25〜32％で精製度は約100〜769倍であり、平均比
活性は１×10⁷単位/mlであった。rIFN-γの全収量はグ
アニジン抽出の方が３〜４倍高かった。精製最終段階の
SDS-PAGEを第１図に示す。グアニジン抽出からの精製標
品はおよそ18,000ダルトン（18K rIFN-γ）に単一バン
ドを示したが、音波処理からの物は主要バンドを約15,0
00ダルトン（15K rIFN-γ）に、また薄いバンドを約17,
000ダルトンに示した（第1A図）。非還元性ゲルではrIF
N-γの二量体やオリゴマーが形成した（第1B図）。

18K rIFN-γは均質でそのアミノ酸組成はDNA配列から
予想されるものと一致した。15Kおよび18KのrIFN-γの
アミノ酸組成を第７表に示す。数百ピコモルの還元カル
ボキシメチル化15Kおよび18Kたん白を自動気相たん白／
ペプチドシ−クエンサ−中でエドマン分解を行なった。
15Kおよび18Kたん白のアミノ酸末端のそれぞれ最初の32
および26残基の配列はDNA配列から予想されるものと一
致した（第２図）。¹⁴C−カルボキシメチル化システイ
ンは配列分析の一番目と三番目のサイクルに検出され
た。Ｎ−末端のメチオニンは検出されなかった。18Kお
よび15KのrIFN-γのＮ末端配列分析の結果、両たん白の
この領域の配列はDNA配列から予想されるものと同一で
あることがわかった。Ｃ末端ペプチドも分析してこの領
域に変化や欠落が起っているか調べた。カルボキシペプ
チダーゼＡ（CPA）分解物のアノミ酸分析の結果、18K r
IFN-γからはセリンおよび／またはグルタミン（Ｃ末端
アミノ酸）が遊離し、15K rIFN-γは同じ条件下でCPAに
より分解されないことがわかった。Ser-GlnはrIFN-γの
Ｃ末端配列であるので、18K種はそのまゝのＣ末端を有
し、他方15K種はCPAで分解されない他のＣ末端残基（Ly
s）を有することが明らかとなった。

DNA配列から予想したＣ末端残基はさらにCNBr処理後
のＣ末端ペプチドの配列分析により確認した。Ｃ末端ペ
プチドはC-18の逆相カラムによるHPLCで分離した（第３
図）。グレジエントの最初の部分で溶出される鋭いペプ
チドピーク（ピークII）は15K rIFN-γからは得られた
が、18K rIFN-γのCNBr分解混合物からは認められなか
った。このペプチドのアミノ酸分析の結果、本ペプチド
はホモセリンまたはホモセリンラクトンを有しないこと
がわかり、従って15Kたん白のＣ末端CNBrペプチドであ
ろうと思われる。アミノ酸分析（第８表）に基づいて、
本ペプチドはIFN-γの121-131のアミノ酸残基に対応し
た（アルギニンは検出されなかった）。11個のアミノ酸
の配列はシークエンシング分析により確認された（第２
図）18K rIFN-γの場合には、溶出の初期に比較的ブロ
ードなピークが得られた。このピークはゆるやかなグレ
ジエントによりさらに２個のピークに分離した。アミノ
酸分析により最初のピークが18Kたん白のCNBr化Ｃ末端
ペプチドであり（第８表）、アミノ酸組成は第138-146
のアミノ酸残基に対応した。９個のアミノ酸の配列をシ
ークエンシングにより決めた（第２図）。15Kたん白の
Ｃ末端アミノ酸はリジンであると決定された。

これらの結果は18K種は rIFN-γのそのままの分子で
あり、15K種はそのたん白分解産物であることを示す。1
5K種では131番目と132番のアミノ酸残基（Lys-Arg）の
間のペプチド結合が切断したものである。

〈実施例 12〉 18K rIFN-γのトリプシン分解ペプチド地図 18K rIFN-γのトリプシン分解ペプチド地図作成を行
なった。18K rIFN-γ（43μｇ）をTPCK−トリプシン
（1.1μｇ、Washington;米国）を用い、147μｌの25mM
酢酸アンモニウム−NaOH（pH8.0）中37℃で18時間分解
を行なった。２−メルカプトエタノール（0.6μｌ）を
分解液に添加してインキユベーシヨンを２時間続けた。
反応を停止するために53μｌの１％トリフルオロ酢酸
（TFA）を添加した。分解物全体を、0.02％TFA-5％アセ
トニトリルで平衡化した超粒子オクチルカラムでクロマ
トグラフイーを行なった。溶出は30℃、5-70％のアセト
ニトリルの直線グレジエントにて1.0ml/minの速度で行
なった。溶出液はフルオレスカミンを用いた螢光光度計
によりモニターした。得られた地図を第４図に示す。

〈実施例 13〉 18K rIFN-γのＣ末端アミノ酸の決定 18K rIFN-γのＣ末端アミノ酸を成田らの方法（J.Bio
chem、［東京］59巻、170頁［1966年］）の方法に従
い、ヒドラジン分解により決定した。18K rIFN-γ（185
μｇ）を無水ヒドラジンと100℃で６時間加熱した。ヒ
ドラジン分解物の凍結乾燥物を水に溶かし、ベンズアル
デヒドを添加した。混合物を室温で１時間激しく振とう
し、遠心分離した。上澄液を凍結乾燥し、アミノ酸分析
にかけた。しかし、その結果アミノ酸は何も検出されな
かった。この結果は18K種のＣ末端アミノ酸がグルタミ
ンである事実と一致する。

第８表 15Kおよび18KのCNBrC末端ペプチド 15K 18K Thr 0.9（１） Ser 1.1（１） 0.84（１） Glu 1.1（１） 1.1（１） Pro ＊（１） Gly 1.5（１） 1.3（１） Ala 2.4（３） 1.1（１） Leu 1.0（１） 1.1（１） Phe 1.0（１） Lys 1.9（２） 2.8（３）配列中の位置 121-131 138-146 カツコ内の数字はDNA配列から予想される残基数＊測定せず参考文献 1.グレイ他（Gray,P.W.,et al.），ネイチヤー（Natur
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ブレー（Shively,J.E.）,Anal.Biochem.120,302-311（1
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J.）Virol.37,755-758（1981）．

【図面の簡単な説明】

第１図は還元条件下（A:0.7M β−メルカプトエタノー
ル）および非還元条件下（Ｂ）における精製組換えヒト
免疫インタフエロンのドデシル硫酸ナトリウム−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を示す。第２図は組換えヒト免疫インタフエロンの予想アミノ酸
配列とrIFN-γの15Kおよび18K種の実際のDNA配列の比較
を示す。第３図はCNBγ処理後の15Kおよび18K rIFN-γのＣ末端
ペプチドのHPLCでの分離を示す。第４図は18K rIFN-γのトリプシン分解ペプチド地図を
示す。

フロントページの続き (72)発明者フシアングーフクングアメリカ合衆国ニユージヤージー州ベロナ，ウエストリンカーンストリート 21 (72)発明者杉野弘京都市上京区室町通鞍馬口下ル東入ル上御霊中町458番地の６ (56)参考文献特開昭58−90514（ＪＰ，Ａ) 欧州公開88540（ＥＰ，Ａ１) Ｎａｔａｒｅ，295［11］（1982）Ｐ. 503−508 ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａｃｈ 11［６］（1983）Ｐ．1707− 1723 Ｎａｔａｒｅ，296［11］（1982）Ｐ. 503−508

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】完全な組換えヒト免疫インタフェロンを形
質転換微生物よりグアニジニウム塩とともに抽出し、抽
出インタフェロン溶液を希釈し、そして得られた抽出さ
れ、希釈されたインタフェロン溶液を、以下に示すアミ
ノ酸配列を有する組換えヒト免疫インタフェロンの第13
1-146位に対応するペプチドを抗原として生成されたモ
ノクローナル抗体を用いて精製することよりなる、以下
に示すアミノ酸配列を有し、Ｃ−末端を欠失したそのた
ん白分解断片を本質的に含有しない組換えヒト免疫イン
タフェロンの調製方法。 Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln
【請求項２】グアニジニウム塩がグアニジニウム塩酸で
ある特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】グアニジウム塩を溶液とした特許請求の範
囲第２項に記載の方法。
【請求項４】形質転換微生物をグアニジン塩酸溶液にけ
ん濁する特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項５】溶液中のグアニジン塩酸濃度が少なくとも
約4Mである特許請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項６】形質転換微生物１グラム当り少なくとも約
３倍容のグアニジウム塩溶液を用いる特許請求の範囲第
４項または第５項のいずれか一つに記載の方法。