JPH04262792A

JPH04262792A - 蛋白質の精製法

Info

Publication number: JPH04262792A
Application number: JP3001790A
Authority: JP
Inventors: Tadashi Nishimura; 紀西村; Hiroaki Omae; 大前　弘明; Susumu Iwasa; 岩佐　進
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-01-12
Filing date: 1991-01-11
Publication date: 1992-09-18

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は動物細胞の培養上清中に
蓄積された蛋白質の精製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年遺伝子工学および細胞工学技術の進
歩にともなって、動物細胞を培養することによって得ら
れる蛋白質、特にモノクローナル抗体の生化学および医
薬品分野等における利用が急速に広まり、その精製法に
関してもおびただしい数の報告（例えば「ライフサイエ
ンスのための高速液体クロマトグラフィー　　−基礎と
実験」２７１頁　　中川照真，牧野圭祐著　　広川書店
　　１９８８年を参照）がなされている。最近では、硫
酸アンモニウム等による沈澱，ついでＤＥＡＥ（ジエチ
ルアミノエチル）イオン交換クロマトグラフィーによる
従来からの精製法に加えて、固定化プロテインＡやＧを
用いるアフィニティークロマトグラフィーによる精製が
主流となりつつある。

【０００３】一方、最近の抗体産生ハイブリドーマ作成
技術の進歩は新しいタイプのトリオーマやテトラオーマ
といったポリドーマの出現をもたらし［Ｃ．　Ｍｉｌｓ
ｔｅｉｎ：ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３０５，５３
７（１９８３）；Ｍ．　Ｒ．　Ｓｕｒｅｓｈら：プロシ
ーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス，ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．），８３，　７９８９
（１９８６）］、新しい機能をもった第２世代の抗体と
もいうべき二重特異性を有する抗体の作製を可能にした
［特開昭５８−５９９９４号公報，特開昭６３−１２２
７６号公報］。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】一般に、培養上清中の
微量のＩｇＧに代表される免疫グロブリン特にヒト−ヒ
トハイブリドーマ培養上清中に蓄積される微量のＩｇＧ
型ヒトモノクローナル抗体を通常の硫酸アンモニウム等
による塩析法で集めることはロスが多く効率的ではない
。一方、アフィニティークロマトグラフィーによるＩｇ
Ｇ画分の捕捉法はカラムから脱離してくるプロテインＡ
やＧの混入が危惧されることから、他の有効なＩｇＧの
分離精製法が求められている。

【０００５】一方、上記したトリオーマやテトラオーマ
といったポリドーマは通常のハイブリドーマのように１
種類のモノクローナル抗体を産生するのではなく、理論
的には目的の二重特異性抗体を含めて１０種類のＩｇＧ
分子を産生し、これらを完全に分離することはきわめて
困難であった。従来からの精製法では、イオン交換クロ
マトグラフィーやヒドロキシアパタイト（ＨＣＡ）クロ
マトグラフィー，特に蛋白分離能に優れた後者のＨＣＡ
クロマトグラフィーが繁用されてきたが、それでもなお
二重特異性抗体の単離が困難な例が数多く見られた。ま
た、純度の高い対象抗原が多量に得られる時は、これを
担体に結合させ抗原カラムを作成してアフィニティーク
ロマトグラフィーに供することにより精製でき、この場
合対象となる２種の抗原カラムを用いることにより、二
重特異性抗体を精製することが可能である。しかしこの
方法では抗原カラムに結合した二重特異性抗体を溶離す
るために、強酸性もしくは強アルカリ性水溶液などを用
いる必要があり、これを２度繰り返すことによる二重特
異性抗体の活性低下が無視しえない。さらに、純度の高
い該抗原を２種とも多量に取得することが困難である場
合があり、特に癌関連抗原や細胞表面マーカーあるいは
生体の微量活性成分が抗原である場合には抗原カラムの
作成がほとんど不可能である。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の問題
点を解決するため、塩析法やアフィニティークロマトグ
ラフィーを用いることなく、免疫グロブリン産生細胞の
培養上清中に蓄積された微量の抗体を精製する方法につ
いて鋭意検討を進めた。その結果、疎水クロマトグラフ
ィーを用いて、培養上清中の微量の免疫グロブリン画分
を濃縮・捕捉して該免疫グロブリン画分を精製する効率
的な精製法を見い出した。

【０００７】また、本発明者らは、抗体分子間のわずか
な構造の相違を認識し、かつ大量の二重特異性抗体含有
培養上清から純度の高い二重特異性抗体のみを単離する
精製法についても鋭意検討を進めた。その結果、意外に
も疎水クロマトグラフィーに無機塩の濃度勾配溶出法を
組み合わせることにより、二重特異性抗体を大量にかつ
効率的に精製する方法を見い出し、さらにこの疎水クロ
マトグラフィーにヒドロキシアパタイト（ＨＣＡ）カラ
ムを用いる吸着クロマトグラフィーを組み合わせること
により、高純度の二重特異性抗体の単離が可能になるこ
とをも見い出した。

【０００８】これらの知見をもとに、本発明者らは、こ
の方法が一般的に動物細胞の培養上清中に蓄積される蛋
白質の基本的かつ有効な精製法となり得ることを見い出
し、さらに研究を進め本発明を完成するに至った。すな
わち本発明は、動物細胞の培養上清中に蓄積された蛋白
質を無機塩の存在下疎水担体に吸着させ、次いで塩濃度
を下げることにより蛋白質画分を分離・採取することを
特徴とする蛋白質の精製法を提供するものである。特に
、本発明はハイブリドーマ上清中に蓄積された免疫グロ
ブリンを無機塩の存在下疎水担体に吸着させ、次いで塩
濃度を下げることにより免疫グロブリンを取得すること
を特徴とする免疫グロブリンの精製法を提供するもので
あり、さらに本発明は、二重特異性抗体産生細胞の培養
上清中に蓄積された該抗体を高濃度無機塩の存在下、疎
水担体に吸着させ、次いで濃度勾配により塩濃度を下げ
ることにより、二重特異性抗体画分を単離することを特
徴とする二重特異性抗体の精製法をも提供するものであ
る。さらには、上記のごとく疎水クロマトグラフィーに
より得られた二重特異性抗体画分を、吸着クロマトグラ
フィーに供し、より純度の高い二重特異性抗体を取得す
ることを特徴とする精製法をも提供するものである。

【０００９】本発明における蛋白質としては、動物細胞
の培養上清中に蓄積されうる蛋白質であればいずれでも
よいが、なかでも分子量が約５，０００〜９００，００
０の蛋白質が好ましく、さらに分子量が約１０，０００
〜２００，０００の有用生理活性蛋白質が好ましく、と
りわけ免疫グロブリン（例、ＩｇＧなど）が好ましく用
いられる。ここで、免疫グロブリンは抗体活性（抗原に
対する結合能）を有するものであればいずれでもよく、
例えば蛋白分解酵素処理などにより得られるＦ（ａｂ′
）２やＦａｂ断片など、あるいはマウス−ヒトキメラ抗
体などであってもよい。

【００１０】免疫グロブリン産生細胞としては、免疫グ
ロブリンを産生しうる細胞であればいずれの細胞を用い
てもよいが、なかでもモノクローナル抗体を産生する細
胞が好ましく用いられ、とりわけＩｇＧ型モノクローナ
ル抗体を安定に産生するハイブリドーマが好ましい。ヒ
トＩｇＧ型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマとし
ては、例えばＨＢｓＡｇ（ヒトＢ型肝炎ウイルス表面抗
原）に対するヒトモノクローナル抗体を産生するヒト−
ヒトハイブリドーマＨＢＷ−４．１６，ＨＢＷ−６．２
０，　Ｗ４７１−７．２４［ＩＦＯ　　５００９４］〔
バイオテクノロジー，７，３７４（１９８９）参照〕な
どが挙げられる。ＩｇＧはいずれのサブクラスに属する
ものであっても本発明の精製法に用いることができるが
、ヒトモノクローナル抗体の場合にはＩｇＧ１またはＩ
ｇＧ２とりわけＩｇＧ１が好都合に用いられる。

【００１１】二重特異性抗体産生細胞としては、二重特
異性抗体を産生しうるいずれの細胞を用いてもよいが、
特にＩｇＧ型モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）を安定的
に産生するポリドーマが好ましい。特に、２種の異なっ
たＩｇＧサブクラスもしくは抗体Ｌ鎖（κ鎖およびλ鎖
）を産生するポリドーマの場合に本発明は好ましく用い
られる。ポリドーマとしては、例えばアンサマイトシン
（ＡＮＳ）およびヒトトランスフェリンレセプター（ｈ
ＴｆＲ）に対する二重特異性ＩｇＧ　ＭｏＡｂを産生す
るマウステトラオーマＡＴＦ１−１７０［ＩＦＯ　　５
０１８２，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２２３４；特願平１−３
３３７２０号明細書（ＥＰ公開第３７６１７６号公報）
参照］，組織プラスミノ−ゲンアクチベータ（ＴＰＡ）
およびフィブリンに対する二重特異性ＩｇＧ　ＭｏＡｂ
を産生するマウステトラオーマＦＴ２−１４［ＩＦＯ　
　５０１８０，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２１５８；ＥＰ公開
第３６３７１２号公報参照］，ウロキナーゼ（ＵＫ）お
よびフィブリンに対する二重特異性ＩｇＧ　　ＭｏＡｂ
を産生するマウステトラオーマＦＵ１−７４［ＩＦＯ　
　５０１８５，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２３３４；ＥＰ公開
第３６３７１２号公報参照］，ＴＰＡおよび西洋ワサビ
パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）に対する二重特異性ＩｇＧ
　ＭｏＡｂを産生するマウステトラオーマＨＴ２−２６
３［ＩＦＯ　　５０２３５，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２８１
７；特願平２−６６８１０号明細書参照］，ヒトリンホ
トキシン（ｈＬＴ）およびＨＲＰに対する二重特異性Ｉ
ｇＧＭｏＡｂを産生するマウストリオーマＰＬＴＩ−１
０９［ＩＦＯ　　５０１６６，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１８
４０；ＥＰ公開第３３８４９７号公報参照］などが挙げ
られる。

【００１２】動物細胞なかでも上記した免疫グロブリン
（例、ＩｇＧなど）産生細胞の培養は、通常液体培地中
または動物の腹腔内（通常は同系マウスまたはヌードマ
ウス等哺　乳動物の腹腔内）で行うが、なかでも液体培
地における培養上清が本発明の精製　法に好ましく用い
られる。液体培地としては、例えば動物細胞培養用基礎
培地〔イスコフ培地とハムＦ１２培地の等量混合培地（
Ｉ・Ｈ培地）やＲＰＭＩ　　１６４０培地など〕に牛胎
児血清（ＦＣＳ）等を添加したもの、あるいはＧＩＴ培
地（和　光純薬工業株式会社販売）（哺乳動物の血清を
混在微生物の不活化工程および塩析，脱塩工程を含む精
製処理に付すことによって製造される哺乳動物血清由来
の動物細胞培養用組成物；特開昭６０−１４５０８８号
公報参照）、ＰＥＧ８６−１　培地〔北野ら：第４回次
世代産業基盤技術シンポジウム−バイオテクノロジー　
　−予稿集，ｐ　５１（１９８６），Ａｐｐｌ．　Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　２７，
５３３（１９８８）〕、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）
添加培地などの無血清培地などが挙げられるが、なかで
も無血清培地が本発明の精製法に有利に用いられる。培
養は通常約３〜６０日間，好ましくは約５〜１０日間，
約３０〜３８℃，好ましくは約３７℃で行う。

【００１３】動物細胞の培養上清をそのまま以下に示す
本発明の精製法に付すことにより、動物細胞の培養上清
中に蓄積された蛋白質（例、ＩｇＧなどの免疫グロブリ
ンなど）を精製することができる。すなわち、動物細胞
の培養上清に無機塩を添加し、ついで蛋白質画分を疎水
担体に吸着させる。ここで、無機塩としては、硫酸アン
モニウム，硫酸ナトリウム，塩化ナトリウムなどが挙げ
られるが、なかでも硫酸アンモニウムが好ましい。無機
塩の添加量は、例えば硫酸アンモニウムを用いる場合に
は、所望の蛋白質が塩析されない濃度であればいくらで
もよいが、塩析される直前の濃度が、疎水担体への吸着
効率の点からより好ましく、例えば所望蛋白質が免疫グ
ロブリンの場合には飽和度約２５〜３２％が好ましい。吸着に用いる疎水担体としては蛋白質の疎水基と相互作
用しうるものであればいずれでもよく、例えば疎水基と
してプロピル基，ブチル基，オクチル基，フェニル基，
エーテル基等を有する疎水担体のいずれも用いることが
できるが、中でもブチル基を有する疎水担体［例えばブ
チル−トヨパール（東ソー（株）），ブチル−セルロフ
ァイン（チッソ（株））など］やエーテル基を有する疎
水担体［例えばエーテル−トヨパール（東ソー（株））
やＴＳＫゲル・エーテル−５ＰＷ（東ソー（株））など
］の使用が好ましい。この他の例としては、通常はゲル
ろ過クロマトグラフィーに用いるアサヒパックＧＳ３２
０ＨやＧＳ５２０Ｈ（旭化成（株））もその疎水性の性
質を生かして疎水クロマトグラフィーに利用できる。吸
着法はバッチ式，カラム式のいずれの方法でもよいが、
二重特異性抗体の大量精製にはカラム式が適している。また、カラム式の吸着法を用いる場合、カラムに通す培
養上清液量はカラム容量１対し、約５０〜５００なかで
も約１００〜２００とするのが望ましい。疎水担体に吸
着された蛋白質（例、ＩｇＧなど免疫グロブリンなど）
画分の溶出は無機塩の濃度を下げることにより行う。溶
出法としては、無機塩の濃度を段階的に下げる段階的溶
出法、あるいは連続的に濃度を下げる濃度勾配溶出法の
いずれを用いてもよい。また、溶出のための塩濃度は所
望蛋白質の吸着に用いた濃度から０％（例、水，緩衝液
などの水溶液）までの間で効率的な溶出が可能である濃
度いずれを選択してもよい。例えば、免疫グロブリンな
どの溶出において、疎水担体としてブチル基を有する疎
水担体を用い、無機塩として硫酸アンモニウムを用いる
場合には、通常硫酸アンモニウムの濃度を飽和度約８〜
２２％、好ましくは約８〜１２％に下げることによりＩ
ｇＧ画分の溶出を行うが、無機塩の濃度は培養に用いる
培地の成分等に応じて適宜選択することができる。特に
、二重特異性抗体精製の場合には、例えばエーテル基を
有する疎水担体が好ましく用いられ、その溶出は無機塩
の濃度をゆるやかに減少させることにより実施され、例
えば硫酸アンモニウム濃度３０％飽和度から０％飽和度
までの濃度勾配溶出法が使用できる。以上の疎水担体に
よる吸着・脱離操作により不純物の大部分を除去しつつ
、蛋白質（例、ＩｇＧなどの免疫グロブリンなど）画分
を一気に濃縮・捕捉することができる。得られた蛋白質
画分のより一層の精製を行うには、自体公知の分離・精
製法を適切に組み合わせて行うことができる。これら公
知の分離・精製法としては、ゲルろ過法，イオン交換ク
ロマトグラフィー，吸着クロマトグラフィー，高速液体
クロマトグラフィーなどが挙げられるが、免疫グロブリ
ンのより一層の精製にはなかでもイオン交換クロマトグ
ラフィー［例、ＣＭ（カルボキシメチル）基を交換基と
するイオン交換クロマトグラフィーなど］、ついで吸着
クロマトグラフィー（例、ヒドロキシアパタイトを担体
とするクロマトグラフィーなど）を組合わせる方法が好
ましく、さらにゲルろ過法を組合わせることにより、一
層高純度の免疫グロブリンを取得することができる。特
に、二重特異性抗体の単離・精製には、本発明の疎水ク
ロマトグラフィーをヒドロキシアパタイトクロマトグラ
フィーなどの吸着クロマトグラフィーと組み合わせるこ
とにより効率的に実施できる。なお、上記各クロマトグ
ラフィーは低圧，中圧，高圧（高速）のいずれの方式を
用いても行うことができる。

【００１４】本発明の精製法により得られる免疫グロブ
リン（例、ＩｇＧなど）は純度が高いので、そのまま、
あるいは他の薬理学的に許容され得る担体，賦形剤，希
釈剤，さらに二重特異性抗体の場合には、該抗体により
標的部位に運搬される薬物（例、ＡＮＳ，ＴＰＡなど）
などとともに医薬組成物（例、注射剤など）としての製
剤化　を行い、温血動物（例、ヒト，サルなど）に対し
て非経口的に安全に投与することができる。該製剤とし
ては、たとえば注射剤あるいは注射投与に用いるための
溶液，凍結品もしくは凍結乾燥品などの形態のものが好
ましい。医薬組成物としての製剤化にあたっては、公知の製剤学
的製造に準じ、所望により製剤学的に許容され得る添加
剤，希釈剤，賦形剤などを用いる。たとえば、注射用水
溶液剤とする場合は、水性溶剤（例、蒸留水），水溶液
溶剤（例、生理的食塩水，リンゲル液），油性溶剤（例
、ゴマ油，オリーブ油）等の溶剤，または所望により溶
解補助剤（例、サリチル酸ナトリウム，酢酸ナトリウム
），緩衝剤（例、クエン酸ナトリウム，グリセリン），
等張化剤（例、ブドウ糖，転化糖），安定剤（例、ヒト
血清アルブミン，ポリエチレングリコール），保存剤（
例、ベンジルアルコール，フェノール），無痛化剤（例
、塩化ベンザルコニウム，塩酸プロカイン）等の添加剤
を用いて、常套手段により製造される。また、たとえば
固型状注射用製剤とするには、希釈剤（例、蒸留水，生
理的食塩水，ブドウ糖），賦形剤［例、カルボキシメチ
ルセルロース（ＣＭＣ），アルギン酸ナトリウム］，保
存剤（例、ベンジルアルコール，塩化ベンザルコニウム
，フェノール），無痛化剤（ブドウ糖，グルコン酸カル
シウム，塩酸プロカイン）等を混合し、常套手段により
、固型状注射用製剤に製造することができる。さらに、
製剤化にあたっては、ブドウ糖などの単糖類や、アミノ
酸，各種塩類，ヒト血清アルブミンなどを添加しても良
く、その他に等張化剤、ｐＨ調節剤，無痛化剤，防腐剤
などを加えて安定で有効な免疫グロブリン製剤を調製す
ることができる。上記の精製法により得られる抗体、例えば抗ＨＢｓＡｇ
ヒトモノクローナル抗体を投与する場合には、ＨＢｓＡ
ｇ陽性血液による汚染事故や新生児のＢ型肝炎の予防に
、１日量約０．１〜２０ｍｇ／ヒトの投与が適切である
。また上記の精製法により得られる二重特異性抗体、例
えば抗ＡＮＳ−抗ｈＴｆＲ二重特異性抗体を成人の癌患
者に静脈内投与する場合、投与量は１日当り約０．０１
〜２ｍｇ／ｋｇ，好ましくは約０．０２〜０．５ｍｇ／
ｋｇである。また抗ＴＰＡ−抗フィブリン二重特異性抗
体を、例えば心筋梗塞患者に静脈内投与する場合、投与
量は１日当り約０．０２〜１ｍｇ／ｋｇ，好ましくは約
０．０４〜０．４ｍｇ／ｋｇである。一方、診断に供す
る場合にも上記の精製法で得られた二重特異性抗体は、
そのまま、あるいは適当な希釈剤，緩衝剤，安定剤，保
存剤，防腐剤などと混じて使用できる。

【００１５】

【実施例】本発明の明細書および図面において、アミノ
酸等の略号で表示する場合には、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　
　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　による略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を
以下に示す。またアミノ酸に関し光学異性体がある場合
は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。ＳＤＳ　　　　：ドデシル硫酸ナトリウムＧｌｙ　　　
　　　：グリシンＡｌａ　　　　　　：アラニンＶａｌ　　　　　　：バリンＬｅｕ　　　　　　：ロイシンＩｌｅ　　　　　　：イソロイシンＳｅｒ　　　　　　：セリンＴｈｒ　　　　　　：スレオニンＣｙｓ　　　　　　：システインＭｅｔ　　　　　　：メチオニンＧｌｕ　　　　　　：グルタミン酸Ｇｌｎ　　　　　　：グルタミンＡｓｐ　　　　　　：アスパラギン酸Ａｓｎ　　　　　　：アスパラギンＬｙｓ　　　　　　：リジンＡｒｇ　　　　　　：アルギニンＨｉｓ　　　　　　：ヒスチジンＰｈｅ　　　　　　：フェニールアラニンＴｙｒ　　　
　　　：チロシンＴｒｐ　　　　　　：トリプトファンＰｒｏ　　　　　　：プロリンＡｓｘ　　　　　　：Ａｓｐ＋ＡｓｎＧｌｘ　　　　　　：Ｇｌｕ＋Ｇｌｎ以下に参考例，実施例をもって本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明は、これによってなんら限定されるも
のではない。

【００１６】実施例１　抗ＨＢｓＡｇヒトモノクローナ
ル抗体の精製０．１％のＰＥＧ（ポリエチレングリコール）−２００
００を添加したＰＥＧ８６−１培地で、ヒト−ヒトハイ
ブリドーマＨＢＷ−４．１６株の培養を行い、培養終了
後、５℃で一晩静置した。細胞を沈降させたあと、上澄
液をポンプで吸い出し、培養上清１００ｌを得た。この
培養上清に硫酸アンモニウム１７．６ｋｇを添加して溶
解し、３０％飽和硫酸アンモニウム溶液とした。この液
をあらかじめ１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）＋
３０％飽和硫酸アンモニウム溶液で平衡化したブチル−
トヨパール６５０Ｃ（東ソー（株））カラム（１２．５
ｃｍＩ．Ｄ．×２４．５ｃｍ）に注ぎ込み吸着を行った
。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）＋３０％飽和
硫酸アンモニウム溶液１０ｌでカラムを洗浄したあと、
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）＋２０％飽和硫酸
アンモニウム溶液で溶出を行い、１．２ｌの抗体画分を
得た。この抗体画分を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
５，２０ｌ×２回）に対して透析を行った。透析終了後
、内液を遠心分離（１０，０００　ｒｐｍ，３０分）し
た。遠心分離した内液の上清２ｌを、あらかじめ２０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＣＭ−トヨ
パール６５０Ｍ（東ソー（株））のカラム（４．５ｃｍ
Ｉ．Ｄ．×１５．０ｃｍ）に注ぎ込み、吸着を行った。カラムは２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）２ｌで洗
浄し、ついで２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）１ｌ
と２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　６．８）＋１００ｍＭ
ＮａＣｌ　１ｌの間で直線濃度勾配をかけて溶出を行っ
た。主要溶出画分３０２ｍｌを集め抗体画分とした。こ
の画分を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で５２５
ｍｌに希釈し、２回に分けてＨＣＡ（ハイドロキシアパ
タイト）（三井東圧（株））カラム（ガードカラム：２
０．０ｍｍＩ．Ｄ．×３０．０ｍｍ，メインカラム：２
０．０ｍｍＩ．Ｄ．×２５０．０ｍｍ）で処理した。カ
ラムを２０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄したあと、２０ｍＭ
と５００ｍＭのリン酸緩衝液の間で直線濃度勾配をかけ
て高速液体クロマトグラフィーを行った。主要溶出画分
４６ｍｌを抗体画分として集めた。この画分をあらかじ
め２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化したト
ヨパールＨＷ−５５Ｆ（東ソー（株））カラム（５．０
ｃｍＩ．Ｄ．×４７．０ｃｍ）に負荷し、同じ系で展開
を行い、主要溶出画分１５９ｍｌを集めた。この画分を
、あらかじめ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平
衡化しておいたパイロセップ（ダイセル（株））カラム
（１．１ｃｍＩ．Ｄ．×５．０ｃｍ）に通過させ、混在
する可能性のあるエンドトキシンを除去した。通過液に
ＮａＣｌを加え、１５０ｍＭになるようにした。除菌ろ
過を行い、抗ＨＢｓＡｇヒトモノクローナル抗体ＨＢＷ
４精製原液３１３ｍｌ（蛋白質量４３７ｍｇ：Ｌｏｗｒ
ｙ法）を得た。ヒト−ヒトハイブリドーマＷ４７１−７
．２４およびＨＢＷ−６．２０がそれぞれ産生する抗Ｈ
ＢｓＡｇヒトモノクローナル抗体　　Ｗ４７１およびＨ
ＢＷ６についても、上記の抗ＨＢｓＡｇヒトモノクロー
ナル抗体ＨＢＷ４の精製法と同様の方法で取得できた。表１に上記で取得した３種の抗体（ＨＢＷ４，Ｗ４７１
，ＨＢＷ６）の酸分解物のアミノ酸組成分析の結果を示
した。表２に各抗体のＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列分析の
結果を示した。Ｈ鎖はいずれもブロックされており検出
できなかった。表３に各抗体のＣ末端アミノ酸分析の結
果を示した。表４に各抗体の抗体価をＡＵＳＡＢ−ＥＩ
Ａ（ダイナボット社）を用いて測定した結果を示した。表１　　アミノ酸組成分析　　───────────────────────
───　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　組　　　　成　　（％）　　　　　　　　　　　　
　　────────────────────　　　
　アミノ酸　　　　ＨＢＷ４　　　　Ｗ４７１　　　　
ＨＢＷ６　　───────────────────
───────　　　　　　Ａｓｘ　　　　　　　　７
．５２　　　　　　　　８．７２　　　　　　　　８．
４４　　　　　　Ｔｈｒ　　　　　　　　７．５２　　
　　　　　　６．８９　　　　　　　　６．６７　　　
　　　Ｓｅｒ　　　　　　　　８．２４　　　　　　　
　７．８６　　　　　　　　８．２１　　　　　　Ｇｌ
ｘ　　　　　　　１０．４９　　　　　　　１０．７８
　　　　　　　１０．７４　　　　　　Ｐｒｏ　　　　
　　　　７．７４　　　　　　　　７．０５　　　　　
　　　６．６１　　　　　　Ｇｌｙ　　　　　　　　７
．７７　　　　　　　　７．５３　　　　　　　　７．
５３　　　　　　Ａｌａ　　　　　　　　６．４４　　
　　　　　　５．２１　　　　　　　　５．７９　　　
　　　Ｃｙｓ＊　　　　　　　２．９９　　　　　　　
　２．５５　　　　　　　　２．６６　　　　　　Ｖａ
ｌ　　　　　　　　９．７２　　　　　　　　９．６８
　　　　　　　　９．２７　　　　　　Ｍｅｔ　　　　
　　　　０．４１　　　　　　　　０．８８　　　　　
　　　１．１２　　　　　　Ｉｌｅ　　　　　　　　２
．４０　　　　　　　　２．１２　　　　　　　　２．
２３　　　　　　Ｌｅｕ　　　　　　　　７．７８　　
　　　　　　８．１４　　　　　　　　８．０２　　　
　　　Ｔｙｒ　　　　　　　　４．６０　　　　　　　
　４．５９　　　　　　　　４．９１　　　　　　Ｐｈ
ｅ　　　　　　　　２．７４　　　　　　　　３．７８
　　　　　　　　４．０４　　　　　　Ｌｙｓ　　　　
　　　　６．４０　　　　　　　　６．８１　　　　　
　　　６．７０　　　　　　Ｈｉｓ　　　　　　　　２
．４３　　　　　　　　２．３１　　　　　　　　２．
２９　　　　　　Ａｒｇ　　　　　　　　３．０１　　
　　　　　　３．５０　　　　　　　　３．３０　　　
　　　Ｔｒｐ　　　　　　　　１．８０　　　　　　　
　１．６０　　　　　　　　１．４７　　──────
────────────────────＊　　Ｃｙ
ｓＳＯ３Ｈとして測定した。　　表２　　Ｌ鎖のＮ末端アミノ酸配列分析─────
──────────────────────　　Ｓ
ｔｅｐＮｏ．　　　　ＨＢＷ４　　　　　　Ｗ４７１　
　　　　　ＨＢＷ６────────────────
───────────　　　　　１　　　　　　　　
Ｓｅｒ（　８１）　　　　　　Ｇｌｕ（２４８）　　　
　　　Ａｓｐ（１９９）　　　　　２　　　　　　　　
Ｇｌｕ（２５３）　　　　　　Ｉｌｅ（３７７）　　　
　　　Ｉｌｅ（４００）　　　　　３　　　　　　　　
Ｖａｌ（５２１）　　　　　　Ｖａｌ（７３０）　　　
　　　Ｇｌｎ（１２５）　　　　　４　　　　　　　　
Ｓｅｒ（　６９）　　　　　　Ｍｅｔ（７３６）　　　
　　　Ｍｅｔ（４１６）　　　　　５　　　　　　　　
Ｔｙｒ（４０７）　　　　　　Ｔｈｒ（１１２）　　　
　　　Ｔｈｒ（１０５）　　　　　６　　　　　　　　
Ｇｌｕ（２６８）　　　　　　Ｇｌｎ（５３９）　　　
　　　Ｇｌｎ（２６９）　　　　　７　　　　　　　　
Ｌｅｕ（５３３）　　　　　　Ｓｅｒ（　７３）　　　
　　　Ｓｅｒ（　２２）　　　　　８　　　　　　　　
Ｔｈｒ（１００）　　　　　　Ｐｒｏ（５５０）　　　
　　　Ｐｒｏ（３０８）　　　　　９　　　　　　　　
Ｇｌｎ（２４８）　　　　　　Ａｌａ（７０８）　　　
　　　Ｓｅｒ（　９１）　　　　１０　　　　　　　　
Ｐｒｏ（３２０）　　　　　　Ｔｈｒ（１０３）　　　
　　　　Ｘ　　　　　１１　　　　　　　　Ｓｅｒ（　
５９）　　　　　　Ｌｅｕ（６８２）　　　　　　Ｌｅ
ｕ（３７１）　　　　１２　　　　　　　　Ｖａｌ（４
４６）　　　　　　Ｓｅｒ（　６３）　　　　　　Ｓｅ
ｒ（　４９）　　　　１３　　　　　　　　　Ｘ　　　
　　　　　　　　　Ｖａｌ（６７３）　　　　　　Ａｌ
ａ（２２０）　　　　１４　　　　　　　　　Ｘ　　　
　　　　　　　　　Ｓｅｒ（　５８）　　　　　　　Ｘ
　　　　１５　　　　　　　　　Ｘ　　　　　　　　　
　　　Ｐｒｏ（３８５）　　　　　　　Ｘ　　　　１６
　　　　　　　　　Ｘ　　　　　　　　　　　　Ｇｌｙ
（４７４）　　　　　　　Ｘ　　　　１７　　　　　　
　　　Ｘ　　　　　　　　　　　　Ｇｌｕ（２３２）　
　　　　　　Ｘ　　　　１８　　　　　　　　　Ｘ　　
　　　　　　　　　　　Ｘ　　　　　　　　　　　　　
Ｘ　　　　１９　　　　　　　　　Ｘ　　　　　　　　
　　　　　Ｘ　　　　２０　　　　　　　　　Ｘ　　　
　　　　　　　　　　Ｘ──────────────
─────────────　　サフ゛ク゛ルーフ゜　
　　　　　λＩＶ　　　　　　　　　　κＩＩＩ　　　
　　　　　　　κＩ────────────────
───────────Ｘ　：アミノ酸が不明（　　）：検出されたＰＴＨ−アミノ酸、ｐｍｏｌ　　
表３　　Ｃ末端アミノ酸分析　　───────────────────────
────　　　　　　　　　　　　　　　　　　　検出
された　　　回収率　　　　予想される　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　アミノ酸　　　　（ｍｏｌ／
ｍｏｌ）　　アミノ酸　　─────────────
──────────────　　　　　　　　　　　
　Ｈ鎖　　　　Ｇｌｙ　　　　　　　　　０．３７　　
　　　　　　Ｇｌｙ　　ＨＢＷ４　　　　　　　　　　　　Ｌ鎖　　　　Ｓｅｒ　　　　
　　　　　０．５３　　　　　　　　Ｓｅｒ　　　　　
　　　　　　　Ｈ鎖　　　　Ｇｌｙ　　　　　　　　　
０．３８　　　　　　　　Ｇｌｙ　　Ｗ４７１　　　　　　　　　　　　Ｌ鎖　　　　　　−　　　　
　　　　　　−　　　　　　　　　Ｃｙｓ　　　　　　
　　　　　　Ｈ鎖　　　　Ｇｌｙ　　　　　　　　　０
．３１　　　　　　　　Ｇｌｙ　　ＨＢＷ６　　　　　　　　　　　　Ｌ鎖　　　　　　−　　　　
　　　　　　−　　　　　　　　　Ｃｙｓ　　────
───────────────────────　　
　　ヒドラジン分解法：１００℃，５時間　　表４　　
抗体価　　───────────────────────
────　　　　　　　　　　　　　　タンパク濃度　
　　　　　　ＩｇＧ濃度　　　　　　　　　　　　──
───────　　　　　　　　　　　　　　ｌｏｗｒ
ｙ　　　　　Ａ２８０　　　　　（ＥＬＩＳＡ）　　　
　抗体価　　　　　　　　　　　　　（ｍｇ／ｍｌ）　
　　　　　　　　　　　　（ｍｇ／ｍｌ）　　────
───────────────────────　　
　ＨＢＷ４　　　　１．４　　　　　１．５２０　　　
　　　１．０８　　　　　　１０５〜１０６　　　Ｗ４
７１　　　　１．４　　　　　１．３８６　　　　　　
０．８２　　　　　　１０５〜１０６　　　ＨＢＷ６　
　　　１．３　　　　　１．３９１　　　　　　１．１
３　　　　　　１０６〜５×１０６　　───────
────────────────────得られた各
抗体（ＨＢＷ４，Ｗ４７１，ＨＢＷ６）の精製標品を、
それぞれＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（還
元条件：１００ｍＭＤＴＴ（ジチオトレイトール），９
５℃，３分；濃縮用ゲル：６％；分離用ゲル：１２．５
％）およびゲルパーミエイションクロマトグラフィー（
ＧＰＣ）（カラム：ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３０００　ＳＷ（
７．５ｍｍＩ．Ｄ．×６０ｃｍ）；展開緩衝液：１００
ｍＭリン酸緩衝液＋１００ｍＭ　硫酸ナトリウム（ｐＨ
６．８）；流速：　０．５ｍｌ／ｍｉｎ；検出：２８０
ｎｍ；温度：室温；試料注入量：５０μｌ）で分析した
結果を、図１および図２に示す。

【００１７】実施例２　抗ＨＢｓＡｇヒトモノクローナ
ル抗体の精製実施例１で用いた０．１％のＰＥＧ（ポリエチレングリ
コール）−２００００の代りに０．１％のＰＥＧ−４０
００を添加したＰＥＧ８６−１培地でヒト−ヒトハイブ
リドーマＨＢＷ−４．１６株の培養を行い、培養終了後
、５℃で一晩静置した。細胞を沈降させたあと、上澄液
をポンプで吸い出し、培養上清　２４ｌを得た。この培
養上清に硫酸アンモニウム４．２ｋｇを添加して溶解し
、３０％飽和硫酸アンモニウム溶液とした。この液をあ
らかじめ　１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）＋３
０％飽和硫酸アンモニウム溶液で平衡化したブチル−ト
ヨパール６５０Ｃ（東ソー（株））カラム（１０　ｃｍ
Ｉ．Ｄ．×１８．５ｃｍ）に注ぎ込み吸着を行った。　
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）＋３０％飽和硫
酸アンモニウム溶液５ｌ、次いで１００ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ６．８）＋２０％飽和硫酸アンモニウム溶液２
ｌでカラムを洗浄したあと、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）＋１０％飽和硫酸アンモニウム溶液で溶出を
行い、０．８ｌの抗体画分を得た。この抗体画分を１０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５，２０ｌ×２回）に対し
て透析を行った。透析終了後、内液を遠心分離（１０，
０００　ｒｐｍ，３０分）した。遠心分離した内液の上
清１．２５ｌを、あらかじめ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．５）で平衡化したＣＭ−トヨパール６５０Ｍ（東
ソー（株））のカラム（４．５ｃｍＩ．Ｄ．×１５．０
ｃｍ）に注ぎ込み、吸着を行った。カラムは２０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６．８）２ｌで洗浄し、ついで２０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）１ｌと２０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ６．８）＋１００ｍＭ　　ＮａＣｌ　１ｌの
間で直線濃度勾配をかけて溶出を行った。主要溶出画分
３６０ｍｌを集め抗体画分とした。この画分を２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で５００ｍｌに希釈し、Ｈ
ＣＡ（ハイドロキシアパタイト）（三井東圧（株））カ
ラム（ガードカラム：２０．０ｍｍＩ．Ｄ．×３０．０
ｍｍ，メインカラム：２０．０ｍｍ　Ｉ．Ｄ．×２５０
．０ｍｍ）で処理した。カラムを２０ｍＭリン酸緩衝液
で洗浄したあと、２０ｍＭと５００ｍＭのリン酸緩衝液
の間で直線濃度勾配をかけて高速液体クロマトグラフィ
ーを行った。主要溶出画分５０ｍｌを抗体画分として集
めた。この画分を、あらかじめ２０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７．３）で平衡化したトヨパールＨＷ−５５Ｆ（東
ソー（株））カラム（５．０ｃｍＩ．Ｄ．×４７．０ｃ
ｍ）に負荷し、同じ系で展開を行い、主要溶出画分をあ
らかじめ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化
しておいたパイロセップ（ダイセル（株））カラム（１
．１ｃｍＩ．Ｄ．×５．０ｃｍ）に通過させ、混在する
可能性のあるエンドトキシンを除去した。通過液にＮａ
Ｃｌを加え、１５０ｍＭになるようにした。除菌ろ過を
行い、抗ＨＢｓＡｇヒトモノクローナル抗体ＨＢＷ４精
製原液１９１ｍｌ（蛋白質量２１７ｍｇ：Ｌｏｗｒｙ法
）を得た。ヒト−ヒトハイブリドーマＷ４７１−７．２
４およびＨＢＷ−６．２０がそれぞれ産生する抗ＨＢｓ
Ａｇヒトモノクローナル抗体Ｗ４７１およびＨＢＷ６に
ついても、上記の抗ＨＢｓＡｇヒトモノクローナル抗体
ＨＢＷ４の精製法と同様の方法で取得できた。

【００１８】実施例３　　抗ＨＢｓＡｇヒトモノクロー
ナル抗体の精製実施例１で用いたＰＥＧ８６−１培地に０．０３％のＧ
ＦＳ（第２回次世代産業基盤技術シンポジウム−バイオ
テクノロジー　予稿集　　１６１頁，１９８４年参照）
を添加したＰＥＧ８６−２培地でヒト−ヒトハイブリド
ーマＨＢＷ−４．１６株の培養を行い、培養終了後、５
℃で一晩静置した。細胞を沈降させたあと、上澄液をポ
ンプで吸い出し、培養上清１２ｌを得た。この培養上清
に硫酸アンモニウム２．１ｋｇを添加して溶解し、３０
％飽和硫酸アンモニウム溶液とした。この液をあらかじ
め１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）＋３０％飽和
硫酸アンモニウム溶液で平衡化したブチル−トヨパール
６５０Ｃ（東ソー（株））カラム（９．６ｃｍＩ．Ｄ．
×２１ｃｍ）に注ぎ込み吸着を行った。１００ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ６．８）＋３０％飽和硫酸アンモニウム
溶液１０ｌでカラムを洗浄したあと、５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ６．８）＋２０％飽和硫酸アンモニウム溶液
で溶出を行い、１．１ｌの抗体画分を得た。この抗体画
分を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５，２０ｌ×２回
）に対して透析を行った。透析終了後、内液を遠心分離
（１０，０００　ｒｐｍ，　３０分）した。遠心分離し
た内液の上清２ｌを、あらかじめ２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６．５）で平衡化したＣＭ−トヨパール６５０Ｍ
（東ソー（株））のカラム（２．５ｃｍＩ．Ｄ．×２８
ｃｍ）に注ぎ込み、吸着を行った。カラムは２０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６．８）２ｌで洗浄し、ついで２０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）０．５ｌと２０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ６．８）＋１００ｍＭ　　ＮａＣｌ　０
．５ｌの間で直線濃度勾配をかけて溶出を行った。主要
溶出画分１５０ｍｌを集め抗体画分とした。この画分を
２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で３００ｍｌに希
釈し、ＨＣＡ（ハイドロキシアパタイト）（三井東圧（
株））カラム（ガードカラム：４ｍｍＩ．Ｄ．×７５ｍ
ｍ，メインカラム：７．６ｍｍＩ．Ｄ．×１００ｍｍ）
で処理した。カラムを２０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄した
あと、２０ｍＭと５００ｍＭのリン酸緩衝液の間で直線
濃度勾配をかけて高速液体クロマトグラフィーを行った
。主要溶出画分５．５ｍｌを抗体画分として集めた。こ
の画分を、あらかじめ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
３）＋１５０ｍＭ　　ＮａＣｌで平衡化したトヨパール
ＨＷ−５５Ｆ（東ソー（株））カラム（２．５ｃｍＩ．
Ｄ．×６０ｃｍ）に負荷し、同じ系で展開を行い、主要
溶出画分１７．５ｍｌを集めた。除菌ろ過を行い、抗Ｈ
ＢｓＡｇヒトモノクローナル抗体ＨＢＷ４精製原液２７
．５ｍｌ（蛋白質量３４ｍｇ：Ｌｏｗｒｙ法）を得た。ヒト−ヒトハイブリドーマＷ４７１−７．２４およびＨ
ＢＷ−６．２０がそれぞれ産生する抗ＨＢｓＡｇヒトモ
ノクローナル抗体Ｗ４７１およびＨＢＷ６についても、
上記の抗ＨＢｓＡｇヒトモノクローナル抗体ＨＢＷ４の
精製法と同様の方法で取得できた。

【００１９】実施例４　　抗ＨＢｓＡｇヒトモノクロー
ナル抗体の精製実施例１で用いた０．１％のＰＥＧ（ポリエチレングリ
コール）−２００００の代りに０．１％のＰＥＧ−４０
００を添加したＰＥＧ８６−１培地にさらに０．００５
％のＨＳＡを添加した培地でヒト−ヒトハイブリドーマ
ＨＢＷ−４．１６株の培養を行い、培養終了後、５℃で
一晩静置した。細胞を沈降させたあと、上澄液をポンプ
で吸い出し、培養上清１００ｌを得た。この培養上清に
硫酸アンモニウム１７．６ｋｇを添加して溶解し、３０
％飽和硫酸アンモニウム溶液とした。この液をあらかじ
め１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）＋３０％飽和
硫酸アンモニウム溶液で平衡化したブチル−トヨパール
６５０Ｃ（東ソー（株））カラム（１２．５ｃｍＩ．Ｄ
．×２４．５ｃｍ）に注ぎ込み吸着を行った。１００ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）＋３０％飽和硫酸アンモ
ニウム溶液１０ｌ、次いで１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）＋２０％飽和硫酸アンモニウム溶液２ｌでカ
ラムを洗浄したあと、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
８）＋１０％飽和硫酸アンモニウム溶液で溶出を行い、
２ｌの抗体画分を得た。この抗体画分を１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ６．５，２０ｌ×２回）に対して透析を行
った。透析終了後、内液を遠心分離（１０，０００　ｒ
ｐｍ，３０分）した。遠心分離した内液の上清２ｌを、
あらかじめ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡
化したＣＭ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー（株））のカ
ラム（４．５ｃｍＩ．Ｄ．×１５．０ｃｍ）に注ぎ込み
、吸着を行った。カラムは２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．８）２ｌで洗浄し、ついで２０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ６．８）１ｌと２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８
）＋１００ｍＭ　　ＮａＣｌ　１ｌの間で直線濃度勾配
をかけて溶出を行った。主要溶出画分５６６ｍｌを集め
抗体画分とした。この画分を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）で１１００ｍｌに希釈し、５回に分けてＨＣ
Ａ（ハイドロキシアパタイト）（三井東圧（株））カラ
ム（ガードカラム：２０．０ｍｍＩ．Ｄ．×３０．０ｍ
ｍ，メインカラ　ム：２０．０ｍｍ　Ｉ．Ｄ．×２５０
．０ｍｍ）で処理した。カラムを２０ｍＭリン酸緩衝液
　で洗浄したあと、２０ｍＭと５００ｍＭのリン酸緩衝
液の間で直線濃度勾配をかけて高速液体クロマトグラフ
ィーを行った。主要溶出画分４０１ｍｌを抗体画分とし
て集めた。この画分を、あらかじめ２０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．３）で平衡化し　たトヨパールＨＷ−５５
Ｆ（東ソー（株））カラム（５．０ｃｍＩ．Ｄ．×４７
．０ｃｍ）に２回に分けて負荷し、同じ系で展開を行い
、主要溶出画分をあらかじめ２０ｍＭリン　酸緩衝液　
（ｐＨ６．８）で平衡化しておいたパイロセップ（ダイ
セル（株））カラム（１．１ｃｍＩ．Ｄ．×５．０ｃｍ
）に通過させ、混在する可能性のあるエンドトキシンを
除去　した。通過液にＮａＣｌを加え、１５０ｍＭにな
るようにした。除菌ろ過を行い、　抗ＨＢｓＡｇヒトモ
ノクローナル抗体ＨＢＷ４精製原液１３０４ｍｌ（蛋白
質量１，３６１ｍｇ：Ｌｏｗｒｙ法）を得た。ヒト−ヒ
トハイブリドーマＷ４７１−７．２４およびＨＢＷ−６
．２０がそれぞれ産生する抗ＨＢｓＡｇヒトモノクロー
ナル抗体Ｗ４７１およびＨＢＷ６についても、上記の抗
ＨＢｓＡｇヒトモノクローナル抗体ＨＢＷ４の精製法と
同様の方法で取得できた。

【００２０】実施例５　　抗ＨＢｓＡｇヒトモノクロー
ナル抗体の精製実施例１で用いた０．１％のＰＥＧ−２００００の代わ
りに０．１％のＰＥＧ−４０００を添加したＰＥＧ８６
−１培地でヒト−ヒトハイブリドーマＨＢＷ−４．１６
株の培養を行い、培養終了後、５℃で一晩静置した。細
胞を沈降させたあと、上澄液をポンプで吸い出し、培養
上清２５ｌを得た。この培養上清に硫酸アンモニウム４
．４ｋｇを添加して溶解し、３０％飽和硫酸アンモニウ
ム溶液とした。この液をあらかじめ１００ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ６．８）＋３０％飽和硫酸アンモ　ニウム溶
液で平衡化したブチル−セルロファイン（生化学工業（
株））カラム（６ｃｍＩ．Ｄ．×１７ｃｍ）に注ぎ込み
吸着を行った。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
＋３　０％飽和硫酸アンモニウム溶液２ｌでカラムを洗
浄したあと、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）＋２
０％飽和硫酸アンモニウム溶液で溶出を行い、３ｌの抗
体画分　を得た。この抗体画分を１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６．５，２０ｌ×２回）に対して透析を行った。透析終了後、内液を遠心分離（１０，０００　ｒｐｍ，
３０分）した。遠心分　離した内液の上清３．５ｌを、
あらかじめ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡
　化したＣＭ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー（株））の
カラム（３ｃｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ）に注ぎ込み、吸着
を行った。カラムは２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５
）０．１ｌで洗浄　した。ついで２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６．５）と２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）
＋５００ｍＭ　　ＮａＣｌ　の間で直線濃度勾配をかけ
て高速液体クロマトグラフィーを行った。主要溶出画分
５０ｍｌを集め抗体画分とした。この画分を２０ｍＭリ
ン　酸緩衝液（ｐＨ６．８）で１００ｍｌに希釈し、２
回に分けてＨＣＡ（ハイドロキシア　パタイト）（三井
東圧　（株））カラム（ガードカラム：２０．０ｍｍＩ
．Ｄ．×３０．０ｍｍ，メインカラム：２０．０ｍｍ　
Ｉ．Ｄ．×２５０．０ｍｍ）で処理した。カラムを２０ｍＭリン　酸緩衝液で洗浄したあと、２０
ｍＭと５００ｍＭのリン酸緩衝液の間で直線濃度勾配を
かけて高速液体クロマトグラフィーを行った。主要溶出
画分４３ｍｌを抗体画分として集めた。この画分を、あ
らかじめ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で平　衡
化したトヨパールＨＷ−５５Ｆ（東ソー（株））カラム
（５．０ｃｍＩ．Ｄ．×１００ｃｍ）　に負荷し、同じ
系で展開を行い、主要溶出画分２１０ｍｌを集めた。こ
の画分を、あらかじめ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
２）で平衡化しておいたパイロセップ（ダイセル（株）
）カラム（１．５ｃｍＩ．Ｄ．×１１．５ｃｍ）に通過
させ、混在する可能性のあ　るエンドトキシンを除去し
た。通過液にＮａＣｌを加え、１５０ｍＭになるように
　した。除菌ろ過を行い、抗ＨＢｓＡｇヒトモノクロー
ナル抗体ＨＢＷ４精製原液２７１ｍｌ（蛋白質量２７３
ｍｇ：Ｌｏｗｒｙ法）を得た。

【００２１】以下に示す参考例，実施例に記載されてい
るマウスハイブリドーマは、表５に示すとおりＩＦＯお
よびＦＲＩに寄託されている。　　表５　　───────────────────────
────　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　ＩＦＯ　　　　　　ＦＲＩ　　
　　　　　　動物細胞　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（Ｉ
ＦＯ　Ｎｏ．）　　（ＦＥＲＭ　Ｎｏ．）　　────
───────────────────────　　
マウスハイブリドーマ　　ＡＳ６−４４．９　　５０１
８１　　　　　ＢＰ−２２３３　　　　　　　　〃　　
　　　　　　　　　　　　２２Ｃ６　　　　　　５０１
７２　　　　　〃　　２０５４　　　　　　　　〃　　
　　　　　　　　　　　　ＡＴＦ１−１７０　　５０１
８２　　　　　〃　　２２３４　　　　　　　　〃　　
　　　　　　　　　　　　ＦＩＢ１−１１　　　５０１
７４　　　　　〃　　２０８１　　　　　　　　〃　　
　　　　　　　　　　　　ＴＰＡ１−４１　　　５０１
７８　　　　　〃　　２０８５　　　　　　　　〃　　
　　　　　　　　　　　　ＦＴ２−１４　　　　５０１
８０　　　　　〃　　２１５８　　　　　　　　〃　　
　　　　　　　　　　　　ＴＰＡ１−３９　　　５０２
３３　　　　　〃　　２８１９　　　　　　　　〃　　
　　　　　　　　　　　　ＨＲ１−３２　　　　５０２
３４　　　　　〃　　２８１８　　　　　　　　〃　　
　　　　　　　　　　　　ＨＴ２−２６３　　　５０２
３５　　　　　〃　　２８１７　　　　　　　　〃　　
　　　　　　　　　　　　ＬＴ３−１１　　　　５０１
６７　　　　　〃　　１８１３　　　　　　　　〃　　
　　　　　　　　　　　　ＰＬＴ１−１０９　　５０１
６６　　　　　〃　　１８４０　　　　　　　　〃　　
　　　　　　　　　　　　ＦＵ１−７４　　　　５０１
８５　　　　　〃　　２３３４　　─────────
──────────────────ＩＦＯ：財団法
人発酵研究所（大阪）ＦＲＩ：通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所

【
００２２】参考例１　　抗ＡＮＳ抗体測定用ＥＩＡ■　
　固相抗原の調製Ｎ−（γ−マレイミド・ブチリロキシ）−スクシイミド
でマレイミド化したメイタンシノール　　３−α−アミ
ノフェニルアセテートを、予めＮ−サクシミジルピリジ
ルジチオプロピオネートで修飾還元したＨＳＡに添加し
、チオール交換反応で（メイタンシノール　　３−α−
アミノフェニルアセテート）−ＨＳＡ複合体を作製した
。次いでこの蛋白複合体５０μｇ／ｍｌを９６穴マイク
ロプレートに１００μｌ／ウエルの割合で添加し、固相
抗原を調製した。 ■　　アッセイ法被検ハイブリドーマ培養上清１００μｌを上記の抗原感
作プレートに添加し、室温で２時間反応させた。０．０
５％Ｔｗｅｅｎ２０含有２０ｍＭリン酸食塩緩衝液（ｐ
Ｈ７．３；以下，ＰＢＳ−Ｔｗと略記する）でプレート
を十分に洗浄後、ＨＲＰ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体
を添加し、さらに室温で２時間反応させた。洗浄後、酵
素基質としてオルソーフェニレンジアミンおよびＨ２Ｏ
２を含有する０．１Ｍクエン酸緩衝液を各ウエルに加え
、室温で酵素反応を実施した。１Ｎ硫酸で反応停止後、
マルチスキャン（フロー社製）を用いて波長４９２ｎｍ
で発色色素量を測定した。

【００２３】参考例２　　抗ｈＴｆＲ抗体産生ハイブリ
ドーマの作成 ■　　ｈＴｆＲの精製ヒト胎盤組織１．５ｋｇを細かく切断しＰＢＳ（ｐＨ７
．５）中でブレンドしたのち、遠心分離した。得られた
沈渣を４％トリトンＸ−１００含有ＰＢＳ中でホモゲナ
イズし、さらに超音波処理後再び遠心分離した。次いで
上清１００ｍｌ当り約３２ｇの硫酸アンモニウムを添加
し塩析後、抗ｈＴｆ抗体結合カラムに供し０．５ＭＮａ
Ｃｌ含有ＰＢ（ｐＨ７．５）で十分に洗浄した。０．５
Ｍ　ＮａＣｌおよび０．５％トリ　トンＸ−１００含有
０．０２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ１０．０）で溶出した
ｈＴｆＲ画　分を、さらにｈＴｆ結合カラムに供し１Ｍ
　ＮａＣｌ含有ＰＢで洗浄後、１Ｍ　ＮａＣｌおよび１
％トリトンＸ−１００含有０．０５Ｍグリシン緩衝液（
ｐＨ１０．０）で溶　出することによりｈＴｆＲ精製標
品約１．５ｍｇを得た。 ■　　免疫上記のｈＴｆＲ精製標品２００μｇ／ｍｌ生理食塩水溶
液に等量のフロイント完全アジュバンドを添加し十分乳
濁後、ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀，ｎ＝１０：２０μｇ／
ｍｌ／マウス）に腹腔および背部皮下投与し、３週間隔
で追加免疫を実施した。４回の追加免疫後、２週で最大
の血清抗体価を示した個体について、同じｈＴｆＲの抗
原液（３０μｇ／０．１ｍｌ生理食塩水／マウス）を静
脈内投与した。 ■　　細胞融合最終免疫後３日で脾臓を摘出し、脾臓細胞懸濁液を常法
により調製した（約１０８個）。次いでマウス骨髄腫細
胞（Ｐ３Ｕ１）２×１０７個を添加し、ＰＥＧ６０００
を用いてケーラーとミルスタインの方法［ネーチャー（
Ｎａｔｕｒｅ），２５６，４９５（１９７５）］に準じ
て細胞融合に供した。融合終了後、細胞混液をヒポキサ
ンチン・アミノプテリンおよびチミジンを含む、いわゆ
るＨＡＴ培地中に懸濁し、１０日間培養した。以後は、
親細胞の選択が終了次第、ＨＡＴ培地からアミノプテリ
ンを除いたＨＴ培地に代え培養を続けた。 ■　　ハイブリドーマの選択およびクローニング市販の
ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体液２０μｇ／を９６穴マイク
ロプレートに１００μｌずつ分注し４℃で一夜放置後、
さらに２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．３）を添加して
感作プレートを作成した。また■で得たｈＴｆＲ精製標
品を常法に従いＨＲＰ標識後ＥＩＡに用いた［北川常広
：有機合成化学、４２，２８３（１９８４）］。すなわ
ち、上記第２抗体感作プレートにハイブリドーマ培養上
清を添加し室温で２時間反応後、ＰＢＳで洗浄した。次
いでＨＲＰ標識ｈＴｆＲを添加しさらに室温で２時間反
応させた。以下、参考例１−■に記載の方法で酵素反応
を実施し抗体価を測定した。特に結合能の強いハイブリ
ドーマについて限界希釈法によるクローニングを実施し
、抗ｈＴｆＲ抗体産生ハイブリドーマ２２Ｃ６を得た。本抗体のサブクラスはＩｇＧ１（κ鎖）で、ヒト腫瘍細
胞株Ｋ５６２に高い親和性を示した。

【００２４】参考例３　　抗ＡＮＳ抗体産生ハイブリド
ーマの作成 ■　　免疫以下に示すＡＮＳ誘導体ＰＤＭ−３−Ｃ２０−カルボキ
シメチルエーテルをＮ−ヒドロキシスクシンイミドとジ
シクロヘキシルカルボジイミドとで活性エステル化し、
次いでキャリヤ蛋白であるＢＳＡに結合させ免疫原を調
製した。

【化１】上記の（ＰＤＭ−３−Ｃ２０−カルボキシメチルエーテ
ル）−ＢＳＡ複合体２００μｇ／ｍｌ生理食塩水溶液に
等量のフロイント完全アジュバンドを添加し十分乳濁後
、ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀，２０μｇ／０．２ｍｌ／マ
ウス）に腹腔および背部皮下投与し、２〜３週間隔で追
加免疫を実施した。３回の追加免疫後、１０日で最大の
血清抗体価を示した個体について、（ＰＤＭ−３−Ｃ２
０−カルボキシメチルエーテル）−ＢＳＡ複合体液（５
０μｇ／０．１ｍｌ生理食塩水／マウス）を静脈内投与
した。 ■　　細胞融合参考例２−■に記載の方法に従い、細胞融合を実施した
。 ■　　ハイブリドーマの選択およびクローニング（メイ
タンシノール　　３−α−アミノフェニルアセテート）
−ＨＳＡ結合マイクロプレートを用いる参考例１記載の
ＥＩＡでハイブリドーマをスクリーニングし、以下参考
例２−■と同じ方法で抗ＡＮＳ　ＭｏＡｂ産生ハイブリ
ドーマを取得した。これらの中、免疫原であるＰＤＭ−
３−Ｃ２０−カルボキシメチルエーテルのみならず９−
チオメイタンシン，メイタンシン，さらにはＡＮＳにも
強い結合反応を示すＭｏＡｂ産生マウスハイブリドーマ
ＡＳ６−４４．９が得られた。本抗体の免疫グロブリン
クラス，サブクラス，軽鎖の種類はオークターロニー法
，ＥＩＡ法による測定でＩｇＧ１（λ鎖）と決定された
。またＡＮＳの細胞毒性に対する中和能を有していた。

【００２５】参考例４　　抗ＡＮＳ−抗ｈＴｆＲ二重特
異性抗体産生テトラオーマの作成 ■　　細胞融合参考例２および３で取得したハイブリドーマ２２Ｃ６お
よびＡＳ６−４４．９を、それぞれ１．５μｇ／ｍｌの
テトラメチルロダミン・イソチオシアネート（ＴＲＩＴ
Ｃ）および０．５μｇ／ｍｌのフルオレセイン・イソチ
オシアネート（ＦＩＴＣ）で蛍光染色した。次いで、Ｌ
ＳＭ溶液（和光純薬工業Ｋ．Ｋ．販売）を添加し死細胞
を除去したのち、両ハイブリドーマを１：１の割合で混
じ、ＰＥＧ６０００を用いて細胞融合した。３７℃で２
時間インキュベート後、フルオレッセンス・アクティベ
イティッド・セルソーター（ＦＡＣＳ）に供することに
よりフルオレセインおよびローダミンで二重染色された
細胞２５，０００個を分取し、次にフィーダーとしてマ
ウス胸腺細胞を５×１０５個／ウエル播種した９６穴マ
イクロプレートに、上記の二重染色細胞を１０個／ウエ
ルの割合で播種し培養した。 ■　　ハイブリッドハイブリドーマの選択およびクロー
ニング融合後１−２週で細胞増殖のみられたウエルの培養上清
を、下記に示す二重特異性抗体測定用ＥＩＡに供し抗体
活性を測定した。すなわち、参考例１−■で作成した（
メイタンシノール　　３−α−アミノフェニルアセテー
ト）−ＨＳＡ感作プレートに被検ハイブリッド・ハイブ
リドーマ培養上清を添加し、室温で２時間反応後ＰＢＳ
−Ｔｗで洗浄した。次いでビオチン標識した抗マウスＩ
ｇＧ−κ鎖特異抗体を添加し、さらに室温で２時間反応
後、ＨＲＰ標識したアビジンを加えて洗浄し、固相に結
合した酵素活性を参考例１−■に記載の方法で測定した
。高いハイブリッド抗体活性を示したウエルについて限
界希釈法によるクローニングを実施し、目的の二重特異
性抗体産生テトラオーマＡＴＦ１−１７０を取得した。

【００２６】参考例５　　抗フィブリン抗体測定用ＥＩ
Ａ３．３Ｍ尿素，０．０１％ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ
７．３）に溶解したヒトフィブリンモノマー溶液１ｍｇ
／ｍｌを、９６穴マイクロプレートに５０μｌずつ分注
し４℃で一夜放置後、２％カゼイン，０．０１％チメロ
サール含有ＰＢＳ１５０μｌを添加して感作プレートを
作製した。次に１００単位／ｍｌヘパリン，３ｍＭフェ
ニルメチルスルホニルフルオリド含有ＰＢＳに溶解した
ヒトフィブリノーゲン溶液１０ｍｇ／ｍｌを、等量の被
検ハイブリドーマ培養上清と混じ、室温で３０分間反応
後、その１００μｌを上記のフィブリン感作プレートに
添加し室温で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗでプレー
トを十分に洗浄後、ＨＲＰ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗
体を添加し、さらに室温で２時間反応させた。洗浄後、
参考例１−■に記載の方法で抗体価を測定した。

【００２７】参考例６　　抗ＴＰＡ抗体測定用ＥＩＡＴ
ＰＡ　　５μｇ／ｍｌ溶液を９６穴マイクロプレートに
１００μｌずつ分注し４℃で一夜放置後、２％カゼイン
，０．０１％チメロサール含有ＰＢＳ１５０μｌを添加
して感作プレートを作製した。上記の液を除去しＰＢＳ
−Ｔｗで洗浄後、被検ハイブリドーマ培養上清１００μ
ｌを添加し室温で２時間反応させた。以下、参考例１−
■に記載の方法で酵素反応を実施し抗体価を測定した。

【００２８】参考例７　　抗フィブリン−抗ＴＰＡ二重
特異性抗体測定用ＥＩＡ参考例１で作製したフィブリン感作プレートに被検ハイ
ブリッド・ハイブリドーマ培養上清を添加し、室温で２
時間反応させる。次いでＰＢＳ−Ｔｗで洗浄後、ビオチ
ン標識したＴＰＡを添加し、さらに室温で２時間反応さ
せる。次にアビジン−ＨＲＰ複合体を添加し室温で１時
間反応後、固相に結合したＨＲＰ活性を参考例１−■に
示した方法で測定する。

【００２９】参考例８　　抗フィブリン抗体産生ハイブ
リドーマの作成 ■　　免疫原の調製公知の固相合成法によりペプチド合成機（アプライド・
システム，モデル４３０Ａ型）を用いて作製されたヒト
フィブリンβ鎖Ｎ末端ペプチド（１−１１）−Ｃｙｓ　
３．３ｍｇを、予めＮ−（γ−マレイミドブチリルオキ
シサクシニミド）（ＧＭＢＳ）でマレイミド化したＢＳ
Ａ（ＢＳＡ１モル当り１３モルのマレイミド基を導入）
１２ｍｇ／２ｍｌ水溶液に加え３０℃で１時間反応させ
、ヒトフィブリンβ鎖Ｎ末端ペプチド（１−１１）−Ｂ
ＳＡ複合体を得た。次いで生理食塩水で３回透析後（３ｌ×３）、凍結保存
し免疫原として用いた。 ■　　免疫ペプチド−ＢＳＡ複合体１ｍｇ／ｍｌ生理食塩水溶液に
等量のフロイント完全アジュバンドを加え、マウス（♀
，ｎ＝１０：０．１ｍｇ／０．２ｍｌ／マウス）の背部
および腹部皮下への免疫を開始した。追加免疫は免疫原
に等量のフロイント不完全アジュバンドを加えて、２−
３週毎に５回接種し実施した。 ■　　細胞融合参考例２−■に記載の方法に従い、細胞融合を実施した
。 ■　　ハイブリドーマの選択およびクローニング固相に
ヒトフィブリンモノマーを吸着させたマイクロプレート
を用いる参考例５に記載のＥＩＡでハイブリドーマ培養
上清の抗体価を測定した。融合１０日から２０日後でハ
イブリドーマの出現を認め、かつヒトフィブリンに特異
結合する抗体がみられた。特に結合活性の強いハイブリ
ドーマについて、限界希釈法によるクローニングに供し
た。クローン化したハイブリドーマの培養上清を同様に
ＥＩＡのスクリーニングに供し、ヒトフィブリン結合能
の強いものを選択した。これらの結果、高濃度ヒトフィ
ブリノーゲン存在下でフィブリンに特異結合するＭｏＡ
ｂ産生マウスハイブリドーマ　　ＦＩＢ１−１１が得ら
れた。産生される抗体ＦＩＢ１−１１の免疫グロブリン
クラス，サブクラス，軽鎖の種類はオークターロニー法
，ＥＩＡによる測定でＩｇＧ１（κ鎖）と決定された。

【００３０】参考例９　　抗ＴＰＡ抗体産生ハイブリド
ーマの作成 ■　　免疫市販の１本鎖ＴＰＡ（中央科学工業Ｋ．Ｋ．販売）２０
０μｇ／ｍｌ生理食塩水溶液に等量のフロイント完全ア
ジュバンドを添加し十分乳濁後、ＢＡＬＢ／ｃマウス（
♀，２０μｇ／０．２ｍｌ／マウス）に腹腔および背部
皮下投与し、２〜３週間隔で追　加免疫を実施した。３
回の追加免疫後、１０日で最大の血清抗体価を示した個
体について、ＴＰＡ抗原液（５０μｇ／０．１ｍｌ生理
食塩水／マウス）を静脈内投与した。 ■　　細胞融合参考例２−■に記載の方法に従い、細胞融合を実施した
。 ■　　ハイブリドーマの選択およびクローニングＴＰＡ
結合マイクロプレートを用いる参考例６に記載のＥＩＡ
でハイブリドーマをスクリーニングし、以下参考例２−
■と同じ方法で抗ＴＰＡ　ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマ
ＴＰＡ１−３９およびＴＰＡ１−４１が得られた。それぞれの産生する抗体のクラス，サブクラス，軽鎖の
種類はＩｇＧ１（κ鎖）およびＩｇＧ２ｂ（κ鎖）であ
った。

【００３１】参考例１０　　抗ＴＰＡ−抗フィブリン二
重特異性抗体産生テトラオーマの作成参考例８で取得した抗ヒトフィブリン抗体産生ハイブリ
ドーマＦＩＢ１−１１および参考例９で取得した抗ＴＰ
Ａ抗体産生ハイブリドーマＴＰＡ１−４１を、それぞれ
０．５μｇ／ｍｌＦＩＴＣおよび１．５μｇ／ｍｌＴＲ
ＩＴＣで染色し、以下参考例４−■に記載の方法に従い
二重染色細胞を分別・取得した。さらに参考例４−■の
方法に従い、参考例７に記載のＥＩＡを用いてスクリー
ニングし、目的の二重特異性抗体産生テトラオーマＦＴ
２−１４を取得した。

【００３２】参考例１１　　抗ＨＲＰ抗体測定用ＥＩＡ
ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体５μｇ／ｍｌ溶液を９６穴マ
イクロプレートに１００μｌずつ分注し、４℃で一昼夜
放置後、さらに２％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加して感作プ
レートを作製した。ＥＩＡ測定時には、上記の液を除去
し、ＰＢＳで洗浄後、被検ハイブリドーマ培養上清を添
加し、室温で２時間反応させた。次いでＰＢＳで洗浄後
、ＨＲＰを添加し、さらに室温で２時間反応させた。以
下、参考例１−■に記載の方法で酵素反応を実施し、抗
体価を測定した。

【００３３】参考例１２　　抗ＴＰＡ−抗ＨＲＰ二重特
異性抗体測定用ＥＩＡ参考例６で作成したＴＰＡ感作プレートに被検ハイブリ
ドーマ培養上清を添加し、室温で２時間反応させた。次
いでＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰを添加し、さらに室温で２
時間反応させた。以下、参考例１−■に記載の方法で酵
素反応を実施し、抗体価を測定した。

【００３４】参考例１３　　抗ＨＲＰ抗体産生ハイブリ
ドーマの作成 ■　　免疫市販のＨＲＰ（生化学工業株式会社販売）２００μｇ／
ｍｌ生理食塩水溶液に等量のフロイント完全アジュバン
トを添加し十分乳濁後、ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀，２０
μｇ／０．２ｍｌ／マウス）に腹腔および背部皮下投与
し、２〜３週間隔で追加免疫を実施した。３回の追加免
疫後、１０日で最大の血清抗体価を示した個体について
、ＨＲＰの抗原液（５０μｇ／０．１ｍｌ生理食塩水／
マウス）を静脈内投与した。 ■　　細胞融合最終免疫後３日で脾臓を摘出し脾臓細胞を調製し、以下
参考例２−■と同様の方法で細胞融合を実施した。 ■　　ハイブリドーマの選択およびクローニング融合１
０〜２０日後に出現するハイブリドーマの培養上清を、
抗マウスＩｇＧ抗体感作プレートを用いる参考例１１に
記載のＥＩＡに供し、抗ＨＲＰ抗体価を測定した。特に
強い抗体活性を示したハイブリドーマについて限界希釈
法によるクローニングに供した。クローン化したハイブ
リドーマの培養上清を参考例１１に記載のＥＩＡに供し
、ＨＲＰ結合能が強くＨＲＰ酵素活性を中和しない抗Ｈ
ＲＰ抗体産生マウスハイブリドーマＨＲ１−３２を取得
した。産生する抗体はＩｇＧ１（λ鎖）であった。

【００３５】参考例１４　　抗ＴＰＡ−抗ＨＲＰ二重特
異性抗体産生テトラオーマの作成参考例９および１３で取得したハイブリドーマＴＰＡ１
−３９およびＨＲ１−３２を、参考例４−■に従ってそ
れぞれＦＩＴＣおよびＴＲＩＴＣで蛍光標識してから細
胞融合に供した。以下、参考例４−■に従い、参考例１
２に記載のＥＩＡでスクリーニングし、目的の二重特異
性抗体産生テトラオーマＨＴ２−２６３を取得した。

【００３６】参考例１５　　抗ｈＬＴ抗体測定用ＥＩＡ
ｈＬＴ５μｇ／ｍｌ溶液を９６穴マイクロプレートに１
００μｌずつ分注し、４℃で一昼夜放置後、さらに２％
ＢＳＡ含有２０ｍＭ　　ＰＢＳ（ｐＨ７．３）を添加し
て感作プレートを作成した。ＥＩＡ測定時には、上記の
液を除去し、ＰＢＳで洗浄後、被検ハイブリドーマ培養
上清を添加し、室温で２時間反応させた。次いでＰＢＳ
で洗浄後、ＨＲＰ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を添加
し、さらに室温で２時間反応させた。以下、参考例１−
■に記載の方法で酵素反応を実施し、抗体価を測定した
。

【００３７】参考例１６　　抗ｈＬＴ−抗ＨＲＰ二重特
異性抗体測定用ＥＩＡ参考例１５で作成したｈＬＴ感作プレートに被検ハイブ
リッドハイブリドーマ培養上清を添加し、室温で２時間
反応させた。次いでＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰを添加し、
さらに室温で２時間反応させた。以下、参考例１−■に
記載の方法で酵素反応を実施し、抗体価を測定した。

【００３８】参考例１７　　抗ｈＬＴ抗体産生ハイブリ
ドーマの作成 ■　　免疫ｈＬＴ精製標品２００μｇ／ｍｌ生理食塩水溶液に等量
のフロイント完全アジュバンドを添加し十分乳濁後、Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウス（♀，ｎ＝１０：２０μｇ／０．２ｍ
ｌ／マウス）に腹腔および背部皮下投与し、３週間隔で
追加免疫を実施した。４回の追加免疫後、２週で最大の
血清抗体価を示した個体について、同じＬＴの抗原液（
５０μｇ／０．１ｍｌ生理食塩水／マウス）を静脈内投
与した。 ■　　細胞融合最終免疫後３日で脾臓を摘出し、脾臓細胞懸濁液を常法
により調製し、以下参考例２−■と同様の方法で細胞融
合を実施した。 ■　　ハイブリドーマの選択およびクローニング固相に
精製ｈＬＴを吸着させたマイクロプレートを用いる参考
例１５に記載のＥＩＡでハイブリドーマ培養上清の抗体
価を測定した。融合１０日から２０日後でハイブリドー
マの出現を認め、かつｈＬＴに結合する抗体がみられた
。特に結合活性の強いハイブリドーマについて、限界希
釈法によるクローニングに供した。クローン化したハイ
ブリドーマの培養上清を同様にＥＩＡのスクリーニング
に供し、ｈＬＴ結合能の強いものを選択した。この操作
により抗ｈＬＴ抗体産生ハイブリドーマＬＴ３−１１を
取得した。産生する抗体はＩｇＧ２ｂ（κ鎖）であった
。

【００３９】参考例１８　　抗ｈＬＴ−抗ＨＲＰ二重特
異性抗体産生トリオーマの作成 ■　　免疫市販ＨＲＰ２００μｇ／ｍｌ生理食塩水溶液に等量のフ
ロイント完全アジュバンドを添加し十分乳濁後、ＢＡＬ
Ｂ／ｃマウス（♀，２０μｇ／０．２ｍｌ／マウス）に
腹腔および背部皮下投与し、２〜３週間隔で追加免疫を
実施した。３回の追加免疫後、１０日で最大の血清抗体
価を示した個体について、ＨＲＰ抗原液（５０μｇ／０
．１ｍｌ生理食塩水／マウス）を静脈内投与した。 ■　　細胞融合参考例１７で取得した抗ｈＬＴ抗体産生ハイブリドーマ
ＬＴ３−１１をＨＡＴ感受性とするため、８−アザグア
ニン（ＡＺＧ）添加培地での培養、馴化を実施した。す
なわち、１μＭ濃度の８−ＡＺＧおよび１０％ＦＣＳを
含有するイスコフーハムＦ・１２混合培地で培養を開始
し、８−ＡＺＧ濃度を１μＭから順次２〜５倍ずつ上昇
させ培養を続けた。１００μＭの８−ＡＺＧに耐性とな
った株についてＨＡＴ感受性を検討し、抗ｈＬＴ抗体産
生性でかつＨＡＴ感受性株ＬＴＡＧ−１を取得した。上
記のＬＴＡＧ−１に■で得たＨＲＰ免疫マウスの脾臓細
胞を１：５の割合で加え、参考例２−■に記載の要領で
融合を実施した。得られたトリオーマをＨＡＴ培地で選
択培養した結果、融合後、１０〜１５日後にトリオーマ
の増殖を認めた。 ■　　トリオーマの選択およびクローニング培養上清中
の抗体価を参考例１６記載のＥＩＡで測定し、以下参考
例２−■に記載の方法に従い、目的の二重特異性抗体産
生トリオーマＰＬＴ１−１０９を取得した。産生する抗
体はＩｇＧ１（λ鎖）×ＩｇＧ２ｂ（κ鎖）であった。

【００４０】参考例１９　　抗体産生ハイブリドーマの腹水化ＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスもしくはハイブリッドヌードマウス（Ｊｃ
ｌ：ＡＦ−ｎｕ）に０．５ｍｌ鉱油を腹腔内投与し、１
週後に０．５−２．０×１０６個の抗体産生ハイブリド
ーマを腹腔内接種した。約１０−１５日後に腹水の貯溜
がみられたので、これを採取し次いで遠心分離して細胞
成分を除去した。得られた腹水液は抗体の精製に供した
。

【００４１】実施例６　　二重特異性抗体の精製　　■
（１）　　疎水クロマトグラフィー参考例４で取得した抗ＡＮＳ−抗ｈＴｆＲ二重特異性抗
体産生マウステトラオーマＡＴＦ１−１７０を参考例１
９の方法に従いハイブリッドヌードマウスを用いて腹水
化し、得られた腹水液に硫酸アンモニウムを添加して溶
解し３０％飽和液とした。この抗体液を予め０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）−３０％飽和硫酸アンモニウ
ム溶液で平衡化したＴＳＫゲルエーテル−５ＰＷカラム
（７．５×７５ｍｍ）に供し吸着させた。次いで０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）−３０％飽和硫酸アンモ
ニウム溶液３０ｍｌと０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）３０ｍｌとの間で直線濃度勾配（流速１ｍｌ／分）
をかけてＩｇＧ抗体を溶出した。得られた結果は図３（
Ａ）に示した通りであった。３種のＩｇＧピーク（１〜
３）について、参考例４−■記載のＥＩＡで二重特異性
抗体活性を測定したところ、ピーク２のみが有意に抗体
活性を示したので、この画分をＰＢＳに対して透析した
。（２）　　吸着クロマトグラフィー（１）で得られた二重特異性抗体画分（ピーク２）を、
予めリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したＨＣＡカ
ラム（７．６×１００ｍｍ）に供し１０ｍＭと３００ｍ
Ｍとのリン酸カリウム緩衝液の間で直線濃度勾配（流速
１ｍｌ／分）をかけてＩｇＧ抗体を溶出した。得られた
結果は図４に示した通りであった。主要ピークが二重特
異性抗体で一部単特異性抗体が溶出された。この主要ピ
ークから得られた二重特異性抗体の精製標品を、実施例
１記載のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｄ
ＴＴ還元条件下）に供したところ、Ｈ鎖およびＬ鎖、そ
れぞれ単一のバンドが得られた。また同時に、実施例１
記載のＧＰＣ（Ｇ３０００ＳＷカラム）に供したところ
、単一のピークが得られた。

【００４２】実施例７　　二重特異性抗体の精製　　■
参考例１０、１４および１８で取得した抗ＴＰＡ−抗フ
ィブリン、抗ＴＰＡ−抗ＨＲＰおよび抗ｈＬＴ−抗ＨＲ
Ｐ二重特異性抗体産生ポリドーマＦＴ２−１４，ＨＴ２
−２６３およびＰＬＴ１−１０９を、参考例１９の方法
に従いＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて腹水化した。得られ
た腹水液について実施例６−■に記載の方法に従いＴＳ
Ｋゲルエーテル−５ＰＷカラムを用いて、直線濃度勾配
による疎水カラムクロマトグラフィーを実施した。得ら
れた結果はそれぞれ図３（Ｂ）、図３（Ｃ）および図３
（Ｄ）に示した通りであった。ＩｇＧ分子（ピーク番号
で示す）は、早い時期に溶出する他の蛋白とは異なり疎
水カラムに吸着を示した。さらにＩｇＧ分子種間におい
ても分離がみられ、二重特異性抗体［図３（Ｂ）：ピー
ク２、図３（Ｃ）：ピーク２、図３（Ｄ）：ピーク１］
の濃縮・単離が可能となることが分かる。

【００４３】実施例８　　二重特異性抗体の精製　　■
実施例６および７に記載のポリドーマＡＴＦ１−１７０
およびＦＴ２−１４、ＨＴ２−２６３，ＰＬＴ１−１０
９由来の腹水液を、予め０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（
ｐＨ７．５）−３２％飽和硫酸アンモニウム溶液で平衡
化したアサヒパックＧＳ５２０Ｈカラム（７．６×２５
０ｍｍ）に供し吸着させた。次いで０．０５Ｍトリス塩
酸緩衝液−３２％飽和硫酸アンモニウム溶液（ｐＨ７．
５）３０ｍｌと０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）３０ｍｌとの間で直線濃度勾配（流速１ｍｌ／分）
をかけてＩｇＧ抗体を分取した。得られた結果は図５（
Ａ）〜（Ｄ）に示した通りであった。ＩｇＧ抗体は腹水
液中の他の蛋白から分離され、なおかつＩｇＧ分子種間
の相互分離が可能となり、二重特異性抗体含有画分（図
５（Ａ）〜（Ｄ）中、矢印で示したピーク）が得られた
。

【００４４】実施例９　　抗ＨＢｓＡｇヒトモノクロー
ナル抗体の精製実施例１で用いた０．１％のＰＥＧ−２００００の代わ
りに０．１％のＰＥＧ−４０００を添加したＰＥＧ８６
−１培地でヒト−ヒトハイブリドーマＨＢＷ−４．１６
株の培養を行い、培養終了後、遠心機（ベツクマン社，
ＪＣＦ−Ｚロータ）で遠心分離（７，０００ｒｐｍ，３
０ｌ／ｈｒ）し、培養上清１２５ｌを得た。この培　養
上清に硫酸アンモニウム２２ｋｇを添加して溶解し、３
０％飽和硫酸アンモニウム溶液とした。この液をあらか
じめ１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）＋３０％　
飽和硫酸アンモニウム溶液で平衡化したブチル−セルロ
ファイン（生化学工業（株））カラム（１１．３ｃｍＩ
．Ｄ．×１５ｃｍ）に注ぎ込み吸着を行った。１００ｍ
Ｍリン酸　緩衝液（ｐＨ６．８）＋３０％飽和硫酸アン
モニウム溶液２ｌでカラムを洗浄したあ　と、５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）＋２０％飽和硫酸アンモニ
ウム溶液で溶出　を行い、７．５ｌの抗体画分を得た。この抗体画分をペリコンカセットシステム　（ＰＴＧＣ
膜（１０ｋＭＷＣＯ），ミリポア社）を用いて濃縮，脱
塩した。この濃縮液１ｌを４回に分けて、あらかじめ２
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡　化したＣＭ
−トヨパール６５０Ｍ（東ソー（株））のカラム（３ｃ
ｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ）に注ぎ込み、処理を行った。カ
ラムは吸着後２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）０．
５ｌ　で洗浄した。ついで２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．５）と２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）＋５０
０ｍＭ　　ＮａＣｌの間で直線濃度勾配をかけて高速液
体クロマトグラフィーを行った。主要溶出画分１，００
０ｍｌを集め抗体画分とした。この画分を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で２，
０００ｍｌに希釈し、２回に分けてセラミ　ックハイド
ロキシアパタイト（東亜燃料（株））カラム（３０．０
ｍｍＩ．Ｄ．×３０．　０ｍｍ）で処理した。カラムを
２０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄したあと、２０ｍＭと５　
００ｍＭのリン酸緩衝液の間で直線濃度勾配をかけて高
速液体クロマトグラフィ　ーを行った。主要溶出画分３
９０ｍｌを抗体画分として集めた。この画分を、あらか
じめ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）＋１５０ｍＭ
　　ＮａＣｌで平衡化したトヨパールＨＷ−５５Ｆ（東
ソー（株））カラム（５．０ｃｍＩ．Ｄ．×１００ｃｍ
）に負荷し、同じ　系で展開を行い、主要溶出画分４５
０ｍｌを集めた。この画分を、あらかじめ２０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．３）＋１５０ｍＭ　ＮａＣｌで平衡
化しておいたパイロセッ　プＣＡ（ダイセル（株））カ
ラム（１．５ｃｍＩ．Ｄ．×１３ｃｍ）に通過させ、混
在する可能　性のあるエンドトキシンを除去したのち、
１ｍｇ／ｍｌになるように同じ緩衝液で希釈した。除菌
ろ過を行い、抗ＨＢｓＡｇヒトモノクローナル抗体ＨＢ
Ｗ４精製原液３，６７５ｍｌ（蛋白質量３，８６３ｍｇ
：Ｌｏｗｒｙ法）を得た。

【００４５】実施例１０　　抗フィブリン−抗ウロキナ
ーゼ二重特異性抗体の精製１％のＦＣＳを添加したＩ・Ｈ培地でマウステトラオー
マＦＵ１−７４［ＩＦＯ５０１８５，ＦＥＲＭ　　ＢＰ
−２３３４］株の灌流培養を行い、培養上清７ｌを得た
。この上清を限外膜（フィルトロン、富士フィルター社）
を用いて濃縮し、５００ｍｌとした。この濃縮液に８８
ｇの硫酸アンモニウムを添加して溶解し、３０％飽和硫
酸アンモニウム溶液とした。この液を、あらかじめ１０
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）＋３０％飽和硫酸ア
ンモニウム溶液で平衡化したブチル−セルロファイン（
生化学工業（株））カラム（５ｃｍＩ．Ｄ．×５０ｃｍ
）に注ぎ込み吸着を行った。吸着後、１００ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ６．８）＋３０％飽和硫酸アンモニウム溶
液２ｌでカラムを洗浄した後、１００ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６．８）＋２０％飽和硫酸アンモニウムで溶出を
行い、２，０２０ｍｌの抗体画分を得た。この抗体画分
を限外膜（フィルトロン、富士フィルター社）で濃縮、
脱塩し、５００ｍｌにしたあと１０回に分けてＣＢｘ（
ベーカーボンド社）カラム（８ｍｍＩ．Ｄ．×２５ｃｍ
）で処理した。カラムを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６
）で洗浄したのち、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）と
２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）＋５００ｍＭ　ＮａＣ
ｌ溶液との間で直線濃度勾配をかけて、高速液体クロマ
トグラフィーを行った。主要溶出画分２１０ｍｌを抗体
画分として集めた。この画分を蒸留水で３００ｍｌに希
釈し、４回に分けてラセミックヒドロキシアパタイト（
ＴＯＨＮＥＮ（株））カラム（８ｍｍＩ．Ｄ．×１０ｃ
ｍ）で処理した。カラムを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．８）で洗浄した後、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６
．８）と５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）との間
で直線濃度勾配をかけて、高速液体クロマトグラフィー
を行い、抗体画分２１ｍｌを得た。得られた抗体画分を
セントリカットＵ−１０（倉敷紡績（株））で濃縮脱塩
後、上記のセラミックヒドロキシアパタイトカラムで再
度、高速液体クロマトグラフィーを行い、抗体画分７．
８ｍｌを得た。この画分をセントリカットＵ−１０で濃
縮後、２０ｍＭリン酸緩衝液＋１５０ｍＭ　ＮａＣｌ（
ｐＨ７．３）で平衡化したＧ３０００ＳＷカラム（７．
５ｍｍＩ．Ｄ．×６０ｃｍ，東ソー（株））に負荷し、
同じ系で展開を行い主要溶出画分４．３ｍｌを集めた。除菌ろ過を行い抗フィブリン−抗ウロキナーゼ二重特異
性抗体精製原液４．２ｍｌ（Ｔ．Ｕ．ＯＤ２８０＝４．
１６）を得た。得られた抗体精製原液を、それぞれＧＰ
Ｃ（カラム：Ｇ３０００ＳＷカラム（７．５ｍｍＩ．Ｄ
．×６０ｃｍ）；展開緩衝液：２０ｍＭリン酸緩衝液＋
１５０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．３））およびＨＣＡカ
ラムクロマトグラフィー（カラム：セラミックヒドロキ
シアパタイトカラム（８ｍｍＩ．Ｄ．×１０ｃｍ，ＴＯ
ＨＮＥＮ（株））；展開緩衝液：２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６．８）→５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８
）（直線濃度勾配）で分析した結果を、図６および図７
に示す。

【００４６】

【発明の効果】本発明の精製法を用いれば、従来の塩析
法やアフィニティークロマトグラフィーに頼ることなく
、高純度の細胞培養蛋白、特に免疫グロブリン、さらに
ＩｇＧ抗体、またさらには二重特異性ＩｇＧ抗体を効率
的に取得できるので、特に医療の場で有利に用いること
ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例１で得た各抗体の精製標品のＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動のパターンを示す。

【図２】図２は、実施例１で得た各抗体の精製標品のＧ
ＰＣ（ゲルパーミエイションクロマトグラフィー）のパ
ターンを示す。

【図３】図３は実施例６および７で得られた各二重特異
性抗体産生ポリドーマ［図３（Ａ）：ＡＴＦ１−１７０
，図３（Ｂ）：ＦＴ２−１４，図３（Ｃ）：ＨＴ２−２
６３，　図３（Ｄ）：ＰＬＴ１−１０９］の腹水液の疎
水カラム（ＴＳＫゲル　　エーテル−　５ＰＷ）クロマ
トグラフィーのパターンを示す。

【図４】図４は実施例６−（１）の疎水カラムクロマト
グラフィーで得られた二重特異性抗体ＡＴＦ１−１７０
含有画分のＨＣＡカラムクロマトグラフィーのパターン
を示す（破線は硫酸アンモニウムの飽和度を示す）。

【図５】図５は実施例６および７で得られた各二重特異
性抗体産生ポリドーマ［図５（Ａ）：ＡＴＦ１−１７０
，図５（Ｂ）：ＦＴ２−１４，図５（Ｃ）：ＨＴ２−２
６３，　図５（Ｄ）：ＰＬＴ１−１０９］の腹水液の疎
水カラム（アサヒパックＧＳ５２０　Ｈ）クロマトグラ
フィーのパターンを示す（矢印は二重特異性抗体を含有
するピークを示す）。

【図６】図６は、実施例１０で得られた二重特異性抗体
精製原液のＧＰＣのパターンを示す。

【図７】図７は、実施例１０で得られた二重特異性抗体
精製原液のＨＣＡカラムクロマトグラフィーのパターン
を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】動物細胞の培養上清中に蓄積された蛋白質
を無機塩の存在下疎水担体に吸着させ、次いで塩濃度を
下げることにより蛋白質画分を分離・採取することを特
徴とする蛋白質の精製法。
【請求項２】蛋白質がＩｇＧである請求項１記載の精製
法。
【請求項３】塩濃度を直線濃度勾配により下げることを
特徴とする請求項１記載の精製法。
【請求項４】ＩｇＧがＩｇＧ型モノクローナル抗体であ
る請求項２記載の精製法。
【請求項５】ＩｇＧ型モノクローナル抗体がＩｇＧ１型
モノクローナル抗体である請求項４記載の精製法。
【請求項６】モノクローナル抗体がヒトモノクローナル
抗体である請求項４記載の精製法。
【請求項７】モノクローナル抗体が二重特異性モノクロ
ーナル抗体である請求項４記載の精製法。
【請求項８】動物細胞がＩｇＧ型モノクローナル抗体産
生ハイブリドーマである請求項２記載の精製法。
【請求項９】ハイブリドーマがヒト−ヒトハイブリドー
マである請求項８記載の精製法。
【請求項１０】動物細胞が、二重特異性モノクローナル
抗体産生ポリドーマである請求項１記載の精製法。
【請求項１１】ポリドーマがマウスハイブリッドハイブ
リドーマである請求項１０記載の精製法。
【請求項１２】培養上清が液体培地における培養上清で
ある請求項１記載の精製法。
【請求項１３】培養上清がマウス腹水液である請求項１
記載の精製法。
【請求項１４】無機塩が硫酸アンモニウム，硫酸ナトリ
ウムまたは塩化ナトリウムである請求項１記載の精製法
。
【請求項１５】疎水担体がエーテル基，プロピル基，ブ
チル基，オクチル基またはフェニル基を有する疎水担体
である請求項１記載の精製法。
【請求項１６】請求項１記載の蛋白質画分を、さらに吸
着クロマトグラフィーに付すことを特徴とする請求項１
記載の精製法。
【請求項１７】ＩｇＧ型ヒトモノクローナル抗体産生ヒ
ト−ヒトハイブリドーマの液体培地における培養上清中
に蓄積されたＩｇＧ型ヒトモノクローナル抗体を飽和度
約２５〜３２％の硫酸アンモニウムの存在下ブチル基を
有する疎水担体に吸着させ、次いで硫酸アンモニウム濃
度を飽和度約８〜２２％に下げることによりＩｇＧ型ヒ
トモノクローナル抗体画分を分離・採取し、しかる後に
イオン交換クロマトグラフィー、次いで吸着クロマトグ
ラフィーに付して精製することを特徴とするＩｇＧ型ヒ
トモノクローナル抗体の精製法。
【請求項１８】二重特異性抗体産生ポリドーマの液体培
地またはマウス腹水液における培養上清中に蓄積された
二重特異性抗体を飽和度約２５〜３２％の硫酸アンモニ
ウム存在下エーテル基を有する疎水担体に吸着させ、次
いで硫酸アンモニウム濃度を飽和度約０％にまで直線濃
度勾配により下げることにより二重特異性抗体画分を分
離・採取し、さらに吸着クロマトグラフィーに付して精
製することを特徴とする二重特異性抗体の精製法。