JP3821830B2 - Peg化したヒト顆粒球コロニー刺激因子の定量法 - Google Patents
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Description
本発明に用いられるG−CSFの誘導体としては、例えば、特開昭63-267292 に記載のG−CSF誘導体があげられる。その一例として記載されているND28は、G−CSFのアミノ酸配列のうち、第1番目、第3番目、第4番目、第5番目、第17番目のアミノ酸残基がそれぞれアラニン(Ala) 、スレオニン(Thr) 、チロシン(Tyr) 、アルギニン(Arg) 、セリン(Ser) に置換されたポリペプチドである。
PEG分子は、G−CSFまたはG−CSF誘導体分子のアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基またはグアニジノ基と結合する。PEG化したG−CSFまたはPEG化したG−CSF誘導体は、通常PEGが1分子〜5分子結合している。本発明に用いられるPEG化したG−CSFまたはPEG化したG−CSF誘導体は、結合しているPEGの結合数が同一のものを分離して用いるか、または、PEGの結合数が異なるものの混合物をそのまま用いる。
本発明のPEG化したG−CSFまたはその誘導体の定量法は、G−CSFまたはその誘導体およびPEG化したG−CSFまたはその誘導体に反応する抗体(抗体A)を用いた免疫学的測定法によるPEG化したG−CSFまたはその誘導体の定量系(定量系1)、G−CSFと特異的に反応し、PEG化したG−CSFまたはその誘導体およびG−CSF誘導体に反応しない抗体(抗体B)を用いたG−CSFに特異的な定量系(定量系2)およびG−CSF誘導体に特異的に反応し、PEG化したG−CSFまたはその誘導体に反応しない抗体(抗体C)を用いたG−CSF誘導体に特異的な定量系(定量系3)を確立し、定量系1によって求められる値から、定量系2によって求められる値または定量系3によって求められる値を差し引くことにより、PEG化したG−CSFまたはその誘導体のみの量を求めることができる。以下にG−CSF誘導体としてND28を用いた場合の各々の定量系の確立方法について説明する。
(1)抗体Aを用いたG−CSFまたはND28およびPEG化したG−CSFまたはPEG化ND28の定量系の確立
第一抗体として抗体Aを1〜50μg/mlで10〜100μl/穴ずつ96穴プレートに分注し、4℃で一晩放置してプレートにコートする。BSA溶液〔1%のウシ胎児血清(BSA)を含むPBS溶液(リン酸二ナトリウム1.83g、リン酸一カリウム0.21g、食塩7.65g、蒸留水1リットル、pH7.2)〕などでブロッキングした後、段階希釈したPEG化したG−CSFまたはPEG化したND28を50〜100μl/穴ずつ分注し、室温で2時間または4℃で一晩反応させる。PBSまたはPBSに0.05%Tween−20を加えた溶液(PBS−Tween)で洗浄した後、第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質または放射線化合物等で標識した抗体A1〜50μg/mlを50〜100μl/穴ずつ分注し、室温で1〜2時間反応させる。よく洗浄した後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行なう。このようにしてG−CSFまたはND28およびPEG化したG−CSFおよびPEG化したND28の定量系を確立する。
第一抗体として抗体Cを用い、(1)で得られる抗体Aを第二抗体に用いる以外は(1)と同様にしてサンドイッチELISA 法によるND28の定量系を確立する。
(3)抗体Bを用いたG−CSFの定量系の確立
第一抗体として抗体Bを用い、(1)で得られる抗体Aを第二抗体に用いる以外は(1)と同様にしてサンドイッチELISA 法によるG−CSFの定量系を確立する。
次に本発明の方法に用いる抗体A、BおよびCの製造法をG−CSF誘導体としてND28を用いた場合を例にして示す。
(1)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
3〜20週令のマウスまたはラットに組換えDNA技術により大腸菌で生産させたG−CSF、大腸菌で生産させたND28またはND28の部分ペプチド、例えば、ND28の第168〜174番目のアミノ酸配列を有し、N末にシステイン(Cys)を付加したペプチド(PEG−5)、ND28の第59〜70番目のアミノ酸配列を有するが、第64番目のCysがセリン(Ser)に置換され、N末にCysを付加したペプチド(PEG−9)、ND28の第92〜99番目のアミノ酸配列を有し、N末にCysを付加したペプチド(PEG−10)等を免疫する。ND28の部分ペプチドは免疫原性を高める目的で、キーホールリンペットヘモシアニン(以下KLHと略記する)や牛血清アルブミン(BSA)とコンジュゲートし、免疫に用いる。免疫の方法は、動物の皮下、静脈内または腹腔内に適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバント(Complete Freund’s Adjuvant)または、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに投与する。免疫原の投与は、1回目の投与の後1〜2週間おきに5〜10回行う。各投与後3〜7日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が免疫原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法(ELISA法):医学書院刊 1976年〕などで調べる。
免疫原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットから脾臓を摘出して脾細胞を調製し、抗体産生細胞の供給源として供する。
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、8−アザグアニン耐性マウス(BALB/c由来)骨髄腫細胞株P3−X63Ag8−U1(P3−U1)〔カレント・トピックス・イン・ミクロバイオロジィ・アンド・イムノロジィ(Current Topics in Microbiology and Immunology )81, 1-7 (1978)〕、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジィ(European J. Immunology ) 6, 511-519 (1976) 〕、SP2/O−Ag14(SP−2)〔ネイチャー (Nature) 276, 269-270 (1978)〕、P3−X63−Ag8653(653)〔ジャーナル・オブ・イムノロジィ(J. Immunology) 123, 1548-1550 (1979)〕、P3−X63−Ag8(X63)〔ネイチャー (Nature) 256, ,495-497 (1975)〕などが用いられる。これらの細胞株は、8−アザグアニン培地〔RPMI−1640培地にグルタミン(1.5mM)、2−メルカプトエタノール(5×10-5M)、ジェンタマイシン(10μg/ml)および牛胎児血清(FCS)(CSL社製、10%)を加えた培地(以下、正常培地という。)に、さらに8−アザグアニン(15μg/ml)を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の3〜4日前に正常培地に継代し、融合当日2×107 個以上の細胞数を確保する。
(1)で免疫した抗体産生細胞と(2)で得られた骨髄腫細胞をMEM培地(日水製薬社製)またはPBS(リン酸二ナトリウム1.83g、リン酸一カリウム0.21g、食塩7.65g、蒸留水1リットル、pH7.2)でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞:骨髄腫細胞=5〜10:1になるよう混合し、遠心分離(1,200rpm、5分間)した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら37℃でポリエチレングリコール−1,000(PEG−1,000)2g、MEM2mlおよびジメチルスルホキシド0.7mlの混液0.2〜1ml/108 抗体産生細胞を加え、1〜2分間毎にMEM培地1〜2mlを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50mlになるようにする。遠心分離(900rpm、5分間)後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞をHAT培地〔正常培地にヒポキサンチン(10-4M)、チミジン(1.5×10-5M)およびアミノプテリン(4×10-7M )を加えた培地〕100ml中に懸濁する。
培養後、培養上清の一部をとり以下の(4)に記載の酵素免疫測定法などにより、免疫原に対し特異的に反応する穴を選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを2回繰り返し〔1回目は、HT培地(HAT培地からアミノプテリンを除いた培地)、2回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
モノクローナル抗体の選択は以下に示す酵素免疫測定法によるバインディングアッセイにより行う。
G−CSF、ND28またはND28の部分ペプチドをキャリア蛋白質と結合させたもの1〜50μg/mlを10〜100μl/穴ずつ96穴プレートに分注し、4℃で一晩放置してプレートにコートする。コントロールとして大腸菌夾雑蛋白質NY49を同様にプレートにコートする。BSA溶液などでブロッキングした後、ハイブリドーマ培養上清もしくは後記(5)で得られる精製抗体を第一抗体として50〜100μl/穴ずつ分注し、室温で2時間または4℃で一晩反応させる。PBSまたはPBSに0.05%Tween−20を加えた溶液(PBS−Tween)で洗浄した後、第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質または放射線化合物等で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体1〜50μg/mlを50〜100μl/穴ずつ分注し、室温で1〜2時間反応させる。よく洗浄した後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行ない、免疫原に対し特異的に反応する穴を選択する。
プリスタン処理〔2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン(Pristane)0.5mlを腹腔内投与し、2週間飼育する〕した8〜10週令のヌードマウスに(3)で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞2×107 〜5×106 細胞/匹を腹腔内注射する。10〜21日間でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離(3,000rpm、5分間)して固形分を除去後、40〜50%飽和硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法により精製モノクローナル抗体とするか、DEAE−セファロースカラム、プロテインA−カラムあるいはゲル濾過カラムに通塔し、IgGあるいはIgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法および280nmでの吸光度より算出する。
(1)で得られる抗血清または(5)で得られるモノクローナル抗体のPEG化したG−CSFおよびPEG化したND28に対する反応性を酵素免疫測定法により調べる。PEG化したG−CSFおよびPEG化したND28はELISA プレートに吸着されないため、インヒビションアッセイにより調べる。G−CSF、ND28またはND28の部分ペプチドをキャリア蛋白質と結合させたもの1〜50μg/mlを10〜100μl/穴ずつ96穴プレートに分注し、4℃で一晩放置してプレートにコートする。BSA溶液などでブロッキングした後、段階希釈したPEG化したG−CSFまたはPEG化したND28を50〜100μl/穴ずつ分注し、さらに(1)で得られる抗血清または(5)で得られる精製抗体を50〜100μl/穴ずつ分注して混合し、室温で2時間または4℃で一晩反応させる。PBSまたはPBSに0.05%Tween−20を加えた溶液(PBS−Tween)で洗浄した後、第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質または放射線化合物等で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体もしくは抗ラットイムノグロブリン抗体1〜50μg/mlを50〜100μl/穴ずつ分注し、室温で1〜2時間反応させる。よく洗浄した後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行なう。PEG化したG−CSFおよびPEG化したND28によって結合活性が阻害された抗血清あるいはモノクローナル抗体を抗体Aとして選択する。
(5)で得られたモノクローナル抗体のG−CSF、ND28、PEG化したG−CSFおよびPEG化したND28に対する反応性を酵素免疫測定法により調べる。PEG化したG−CSFおよびPEG化したND28に対する反応性は(6)と同様にして行う。G−CSFのみに反応し、PEG化したG−CSFおよびPEG化したND28に反応しないモノクローナル抗体を抗体Bとして選択する。
(7)と同様にしてND28にのみ反応し、PEG化したG−CSFおよびPEG化したND28に反応しないモノクローナル抗体を抗体Cとして選択する。
(9)ウサギ抗ND28抗体の製造
3〜30週令のウサギに1〜1000μg/匹のND28またはキャリア蛋白質と結合させたND28の部分ペプチドを適当なアジュバンドとともに免疫し、血中抗体価の上昇を確認した後、抗血清を採取する。40〜50%飽和硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法により精製し、ウサギ抗ND28抗体とするか、DEAE−セファロースカラムあるいはプロテインA−カラムに通塔しIgG画分を集め、ウサギ抗ND28抗体とする。
8週令のBalb/c雌マウスに組換えDNA技術により大腸菌で生産させたG−CSF、大腸菌で生産させたND28またはND28の部分ペプチドを免疫した。ND28の部分ペプチドは、免疫原性を高める目的で、m-マレイミド- ベンゾイル-n- ハイドロキシサクチル(MBS、ナカライテスク社製)を架橋剤としてKLH(CALBIOCHEM社)とコンジュゲートし、免疫原とした。MBSとの反応のため、ペプチドにはN末にCys を加えて合成した。以下に、免疫原の作製方法を示した。
免疫原に対し十分な抗体価の上昇を示したマウスから、最終免疫3日後に脾臓を摘出した。脾臓をMEM培地(日水製薬社製)中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離(1200rpm、5分間)した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液(pH7.65)で1〜2分間処理し赤血球を除去し、MEM培地で3回洗浄し、細胞融合に用いた。
酵素免疫測定法(バインディングアッセイ)
96穴のEIA 用プレート(グライナー社製)に、G−CSF、ND28、ND28の部分ペプチド−サイログロブリン(THY)コンジュゲート、ネガティブ抗原として大腸菌夾雑蛋白質NY49または免疫原とは異なるペプチド−THYコンジュゲート10μg/mlを50μl/穴分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。ND28の部分ペプチド−THYコンジュゲートはグルタールアルデヒド法を用いて作製した。すなわち、ペプチド1mg を0.1M酢酸アンモニウム緩衝液(PH7.0 )に溶解し、同じ緩衝液に溶解したTHY5mg を加えて全量を1ml にした。攪拌下、0.02M グルタールアルデヒド540 μl を滴下し、室温で5時間攪拌して反応させた。反応後、PBSで一晩透析したものをND28の部分ペプチド−TYHコンジュゲートとした。
8−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株P3−U1を正常培地で培養し、細胞融合時に2×107 以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
(3)ハイブリドーマの作製
(1)で得られたマウス脾細胞と(2)で得られた骨髄腫細胞とを10:1になるよう混合し、遠心分離(1,200rpm、5分間)した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃でポリエチレングリコール−1,000(PEG−1,000)2g、MEM培地2mlおよびジメチルスルホキシド0.7mlの混液0.2〜1ml/108 をマウス脾細胞に加え、1〜2分間毎にMEM培地1〜2mlを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50mlになるようにした。遠心分離(900rpm、5分間)後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞をHAT培地100 ml中に懸濁した。
プリスタン処理した8週令ヌード雌マウス(Balb/c)に(3)で得られたハイブリドーマ株を5〜20×106 細胞/匹それぞれ腹腔内注射した。10〜21日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、腹水を採取(1〜8ml/匹)し、遠心分離(3,000rpm、5分間)して固形分を除去した。モノクローナル抗体がIgMのときは、50%硫酸アンモニウムを用いて塩析し、塩化ナトリウム0.5Mを添加したPBSで透析後、セルロファインGSL2000(生化学工業社製)(ベットボリューム750ml)のカラムに流速15ml/時で通塔しIgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とした。モノクローナル抗体がIgGのときは、カプリル酸沈殿法(Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988) により精製し、精製モノクローナル抗体とした。
(4)で得られたハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体のPEG化したG−CSFおよびPEG化したND28に対する反応性を酵素免疫測定法を用いたインヒビションアッセイにより以下のようにして調べた。なお、以下の実験に用いるPEG化したG−CSFおよびPEG化したND28に結合しているPEGの分子量は約10000であり、G−CSFまたはND28の1分子に対して3分子結合している。
組換えDNA技術により大腸菌で生産させたND28の100μg/匹を20週令のウサギにフロインドの完全アジュバント(Complete Freund Adjuband;ナカライテスク社)とともに1週間間隔で4回皮下投与し、その後1000μg/匹のND28をフロインドの不完全アジュバント(Incomplete Freund Adjuband;ナカライテスク社)とともに2週間間隔で6回投与した。酵素免疫測定法により血中抗体価の上昇を確認後抗血清を採取した。カプリル酸沈殿法および50%飽和硫酸アンモニウムによる塩析によりIgG画分を集め、ウサギ抗ND28抗体とした。図3にウサギ抗ND28抗体のND28、G−CSFおよびPEG化したND28に対する反応性を示す。
(5)で選択されたPEG化したG−CSFおよびPEG化したND28に反応するモノクローナル抗体と(6)で作製したウサギ抗ND28抗体を用い、サンドイッチELISA 法によるPEG化したND28定量系を検討した。第一抗体としてPEG化したG−CSFおよびPEG化したND28に反応するモノクローナル抗体またはウサギ抗ND28抗体10μg/mlを50μl/穴ずつ96穴プレートに分注し、4℃で一晩放置してプレートにコートした。BSA溶液でブロッキングした後、160ng/mlから2倍希釈で0.15625ng/mlまで段階希釈したPEG化ND28を50μl/穴ずつ分注し、4℃で一晩反応させた。洗浄後、第二抗体としてビオチンで標識したPEG化したG−CSFおよびPEG化したND28に反応するモノクローナル抗体またはウサギ抗ND28抗体10μg/mlを50μl/穴ずつ分注し、室温で1〜2時間反応させた。よく洗浄した後、アビジン−ペルオキシダーゼ(VECTOR社)を50μl/穴ずつ分注し、室温で1〜2時間反応させた。PBS−Tweenでよく洗浄した後、(1)と同様にして発色し、OD415nm の吸光度を測定した。16通りの第一抗体と第二抗体の組み合わせのうち、PEG化したND28を最も高感度に検出しうる組合せとして第一抗体がKM509、第二抗体がウサギ抗ND28抗体の組合せを選択した。この組合せを用いた系によるG−CSF、ND28、PEG化G−CSF、PEG化ND28およびインターフェロンγの定量曲線を図4に示した。図4に示したようにこの系はND28、G−CSF、PEG化G−CSFおよびPEG化ND28をいずれも等しい感度で検出することができた。
(3)で得られたハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体のうち、ND28に反応し、G−CSFに反応せず、PEG化したG−CSFおよびPEG化したND28には反応しないモノクローナル抗体であるKM498またはKM511を第一抗体に用い、(6)で作製したウサギ抗ND28抗体を第二抗体に用いてサンドイッチELISA 法によるND28に特異的な定量系を検討した。その結果、第一抗体としてKM511、第二抗体としてウサギ抗ND28抗体の組合せを選択した。この組合せを用いた定量系によるG−CSF、ND28、PEG化G−CSF、PEG化ND28およびインターフェロンγの定量曲線を図5に示した。図5に示したようにこの定量系は、ND28を特異的に定量することができた。
(3)で得られたハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体のうち、G−CSFに反応し、ND28に反応せず、PEG化したG−CSFおよびPEG化したND28には反応しないモノクローナル抗体であるモノクローナル抗体KM343をを第一抗体に用い、(6)で作製したウサギ抗ND28抗体を第二抗体に用いてサンドイッチELISA 法によるG−CSFに特異的な定量系を確立した。この定量系によるG−CSF、ND28、PEG化G−CSF、PEG化ND28およびインターフェロンγの定量曲線を図6に示した。図6に示したようにこの定量系は、G−CSFを特異的に定量することができた。
(7)で確立した定量系1によって求められる値より(8)で確立したND28に特異的な定量系(定量系3)によって求められる値と(9)で確立したG−CSFに特異的な定量系(定量系2)によって求められる値とを差し引くことにより、PEG化したND28を高感度に定量することができた。
(定量系1)の確立
実施例1の(6)で得られた抗ND28抗体よりヒンジ法(酵素免疫測定法、第3版、医学書院刊)を用いてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ND28抗体Fab’を作製した。
第一抗体として、ND28に反応し、G−CSFに反応せず、PEG化したG−CSFおよびPEG化したND28には反応しないモノクローナル抗体であるKM511を用い、第二抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ND28を用いたサンドイッチELISA 法によるND28の定量系を確立した。この定量系によるPEG化ND28およびND28の定量曲線を図8に示した。図8に示したようにこの定量系は、ND28を定量することができた。
実施例1と同様にして、(1)で確立したND28およびPEG化したND28の定量系によって求められる値より(2)で確立したND28に特異的な定量系によって求められる値を差し引くことにより、PEG化したND28を高感度に定量することができた。
実施例2の(3)で確立した定量系を用いて、PEG化したND28を投与したラットの血中のPEG化したND28量の測定を行った。また、実施例2の(2)で確立した定量系を用いて、ND28を投与したラットの血中のND28の量を測定した。PEG化したND28またはND28は、50μg/kgでラットの静脈内に投与し、投与後、経時的に血清を採取して、血清中のPEG化したND28またはND28量を測定した。その結果を図9に示した。図9に示したように、PEG化ND28は、ND28と比較して血中クリアランスが著しく低下した。
Claims (4)
- ヒト顆粒球コロニー刺激因子、その誘導体ND28またはND28の部分ペプチドで非ヒト動物を免疫して得られるヒト顆粒球コロニー刺激因子またはその誘導体ND28およびPEG化したヒト顆粒球コロニー刺激因子またはその誘導体ND28に反応するポリクローナル抗体と、ヒト顆粒球コロニー刺激因子またはその誘導体ND28に特異的に反応し、PEG化したヒト顆粒球コロニー刺激因子またはその誘導体ND28に反応しないモノクローナル抗体とを用いた免疫学的測定法によるPEG化したヒト顆粒球コロニー刺激因子またはその誘導体ND28の定量法。
- 以下の工程からなる免疫学的測定法によるPEG化したヒト顆粒球コロニー刺激因子またはその誘導体ND28の定量法。
[1]ヒト顆粒球コロニー刺激因子、その誘導体ND28またはND28の部分ペプチドで非ヒト動物を免疫して得られるヒト顆粒球コロニー刺激因子またはその誘導体ND28およびPEG化したヒト顆粒球コロニー刺激因子またはその誘導体ND28に反応するポリクローナル抗体を用いて、試料中のヒト顆粒球コロニー刺激因子またはその誘導体ND28およびPEG化したヒト顆粒球コロニー刺激因子またはその誘導体ND28を定量する工程、
[2]ヒト顆粒球コロニー刺激因子またはその誘導体ND28に反応し、PEG化したヒト顆粒球コロニー刺激因子またはその誘導体ND28に反応しないモノクローナル抗体を用いて、[1]の試料中のヒト顆粒球コロニー刺激因子またはその誘導体ND28を定量する工程、
[3][1]の工程で求められる値から、[2]の工程で求められる値を差し引くことにより、試料中に含有されるPEG化したヒト顆粒球コロニー刺激因子またはその誘導体ND28を定量する工程。 - 免疫学的測定法が固相サンドイッチ法による酵素免疫測定法である請求項1または2記載の定量法。
- 定量するPEG化したヒト顆粒球コロニー刺激因子またはその誘導体ND28が血中のものである請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
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