JPH01225495A - 抗ｇ−ｃｓｆ誘導体、ｎｄ２８モノクローナル抗体 - Google Patents
抗ｇ−ｃｓｆ誘導体、ｎｄ２８モノクローナル抗体Info
- Publication number
- JPH01225495A JPH01225495A JP63051357A JP5135788A JPH01225495A JP H01225495 A JPH01225495 A JP H01225495A JP 63051357 A JP63051357 A JP 63051357A JP 5135788 A JP5135788 A JP 5135788A JP H01225495 A JPH01225495 A JP H01225495A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- derivative
- csf
- monoclonal antibody
- mouse
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 claims abstract 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 8
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 30
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 abstract description 13
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 abstract 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 28
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 21
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 8
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010025568 Nucleophosmin Proteins 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 2
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- -1 ammonium (ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) Chemical compound 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 229940066827 pertussis vaccine Drugs 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- PYHRZPFZZDCOPH-QXGOIDDHSA-N (S)-amphetamine sulfate Chemical compound [H+].[H+].[O-]S([O-])(=O)=O.C[C@H](N)CC1=CC=CC=C1.C[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 PYHRZPFZZDCOPH-QXGOIDDHSA-N 0.000 description 1
- PLVPPLCLBIEYEA-WAYWQWQTSA-N (z)-3-(1h-indol-3-yl)prop-2-enoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(\C=C/C(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-WAYWQWQTSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930003270 Vitamin B Natural products 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N bakuchiol Chemical compound CC(C)=CCC[C@@](C)(C=C)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000010200 folin Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N indoleacrylic acid Natural products C1=CC=C2C(C=CC(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 1
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/243—Colony Stimulating Factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ヒ）Ｉｆｆ粒球コロニー刺激因子（以下Ｇ−
ＣＳＦと略記する）誘導体、ＮＤ２８の精製や定量に有
用な抗Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８上２８モノクローナ
ル抗 従来の技術 天然型Ｇ−Ｃ８Ｆに対するモノクローナル抗体は特願昭
６２−１２７２１に開示されているが、Ｇ−ＣＳＦ！５
！導体、Ｎ Ｄ ２ ８ ＋．Ｊｔｔルーｖ−／ りｏ
−ナル抗体は知られていない。
ＣＳＦと略記する）誘導体、ＮＤ２８の精製や定量に有
用な抗Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８上２８モノクローナ
ル抗 従来の技術 天然型Ｇ−Ｃ８Ｆに対するモノクローナル抗体は特願昭
６２−１２７２１に開示されているが、Ｇ−ＣＳＦ！５
！導体、Ｎ Ｄ ２ ８ ＋．Ｊｔｔルーｖ−／ りｏ
−ナル抗体は知られていない。
Ｇ−Ｃ５Ｆ誘導体、ＮＤ２ ８は、天然型Ｇ−Ｃ９Ｆに
比べて第１． ３， ４． ５および１７番目の
アミノ酸であるスレオニン（Ｔｈｒ）、ロイシン（Ｌｅ
ｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）および
システィン（Ｃｙｓ）の残基が、それぞれアラニン（Ａ
ｌａ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）、
アルギニン（Ａｒｇ）およびセリン（Ｓｅｒ）の残基に
置換している。
比べて第１． ３， ４． ５および１７番目の
アミノ酸であるスレオニン（Ｔｈｒ）、ロイシン（Ｌｅ
ｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）および
システィン（Ｃｙｓ）の残基が、それぞれアラニン（Ａ
ｌａ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）、
アルギニン（Ａｒｇ）およびセリン（Ｓｅｒ）の残基に
置換している。
発明が解決しようとする課題
組換えＤＮＡ技術の発達により、Ｇ−ＣＳＦ誘導体、Ｎ
Ｄ２８を微生物たとえば大腸菌により製造し大量に供給
することが可能となった。
Ｄ２８を微生物たとえば大腸菌により製造し大量に供給
することが可能となった。
組換えＤＮＡ技術により製造したＧ−ＣＳＦ誘導体、Ｎ
Ｄ２８の確実な評価および薬剤としての開発のために、
優れた精製手段および簡便で高精度の定景法が求められ
ている。
Ｄ２８の確実な評価および薬剤としての開発のために、
優れた精製手段および簡便で高精度の定景法が求められ
ている。
課題を解決するための手段
本発明者は、Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８の精製、定量
などに使えるモノクローナル抗体を得るべく研究した。
などに使えるモノクローナル抗体を得るべく研究した。
その結果、第１表で示されるＧ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２
８でマウスを免疫して得られる肺細胞とマウスの骨髄腫
細胞とを通常の方法で融合させて得られるハイブリドー
マが、該Ｇ−ＣＳＦ、１導体、ＮＤ２８に対してのみ反
応するモノクローナル抗体を生成し、該モノクローナル
抗体はその精製、定量に使用することができることを見
出し本発明を完成した。
８でマウスを免疫して得られる肺細胞とマウスの骨髄腫
細胞とを通常の方法で融合させて得られるハイブリドー
マが、該Ｇ−ＣＳＦ、１導体、ＮＤ２８に対してのみ反
応するモノクローナル抗体を生成し、該モノクローナル
抗体はその精製、定量に使用することができることを見
出し本発明を完成した。
二８ ご８ ＦＪｇ ”ｍ２
Ｍ♀ ＝ま４１１”＋ −１ｌ＋
’已ヨ 虱８ ：Ｒ３、ｊ呂 Σ８＠
ｖｌｗ −、Ｊ −。
Ｍ♀ ＝ま４１１”＋ −１ｌ＋
’已ヨ 虱８ ：Ｒ３、ｊ呂 Σ８＠
ｖｌｗ −、Ｊ −。
滅 ← −−φ −く５％
＜ ！！Ｓ ！！８７ 、！ｅ
！以下、本発明の詳細な説明する。
＜ ！！Ｓ ！！８７ 、！ｅ
！以下、本発明の詳細な説明する。
本発明のモノクローナル抗体の製造は次のとおりに行う
。
。
（１） 免疫化動物細胞の調製
マウス、ラットなどをＧ−ＣＳＦｔｓ導体、ＮＤ２８で
免疫して、その動物から肺細胞を調製する。
免疫して、その動物から肺細胞を調製する。
Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８は、組換えＤＮＡ技術で大
腸菌で製造したちのく参考例１）を使用する。
腸菌で製造したちのく参考例１）を使用する。
免疫の方法は、８〜１０週令のマウスの皮下あるいは、
静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば
、フロイントの完全アジュバント （Ｃｏｍｐｌｅｔｅ
Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）あるいは、水
酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕ととも
に咳Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８１０■〜１０ｈｇ／匹
を投与する。以後１〜２週問おきに、該Ｇ−ＣＳ Ｆｔ
ｓ導体、ＮＤ２８を２〜１０回投与する。
静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば
、フロイントの完全アジュバント （Ｃｏｍｐｌｅｔｅ
Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）あるいは、水
酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕ととも
に咳Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８１０■〜１０ｈｇ／匹
を投与する。以後１〜２週問おきに、該Ｇ−ＣＳ Ｆｔ
ｓ導体、ＮＤ２８を２〜１０回投与する。
各免疫後１週間で、眼底静脈叢より採血し、血清中の抗
Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８抗体価を以下に示す固相法
による酵素免疫測定法で調べる。
Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８抗体価を以下に示す固相法
による酵素免疫測定法で調べる。
抗体価の測定法は、固相酵素免疫測定法（酵素免疫測定
法：医学書院列１９７８年）によった。
法：医学書院列１９７８年）によった。
９６大のＥＩＡ用プレー） ［ＦＩｏｗ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ社（米）製］に、特異抗原ＣＧ−ＣＳＦ誘導体
、ＮＤ２８が１０４／ｍｌとなるようフォスフェートバ
ッファー・セイライン（ＰＢＳ） （リン酸２ナトリ
ウム １．８３ｇ、リン酸ｌカリウム０．２１ｇ１食塩
７．６５ｇ、蒸留水１１、ｐＨ７，２）で希釈した溶液
、交差反応をみる場合には、Ｇ−Ｃ５Ｆｍ導体、ＮＤ２
８のかわりに他の抗原あるいはＢ Ｓ Ａ／Ｐ Ｂ Ｓ
溶液を用いる〕を１００ｄ／穴ずつ分注し、４℃で一晩
放置して抗原をプレート穴底面にコートさせ、その後１
％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液２００ｍ／穴を分注し、４℃で一
晩放置して、プレート底面上の蛋白質結合性残基をＢＳ
Ａでコートする。上記プレートをＰＢＳでよく洗浄後、
第１抗体として、段階希釈した試料（マウス抗血清、ハ
イブリドーマ培養上清、精製抗体）を５０Ａｄ！／穴分
注し、４℃で一晩または室温で３〜４時間放置する。
ｔｏｒｙ社（米）製］に、特異抗原ＣＧ−ＣＳＦ誘導体
、ＮＤ２８が１０４／ｍｌとなるようフォスフェートバ
ッファー・セイライン（ＰＢＳ） （リン酸２ナトリ
ウム １．８３ｇ、リン酸ｌカリウム０．２１ｇ１食塩
７．６５ｇ、蒸留水１１、ｐＨ７，２）で希釈した溶液
、交差反応をみる場合には、Ｇ−Ｃ５Ｆｍ導体、ＮＤ２
８のかわりに他の抗原あるいはＢ Ｓ Ａ／Ｐ Ｂ Ｓ
溶液を用いる〕を１００ｄ／穴ずつ分注し、４℃で一晩
放置して抗原をプレート穴底面にコートさせ、その後１
％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液２００ｍ／穴を分注し、４℃で一
晩放置して、プレート底面上の蛋白質結合性残基をＢＳ
Ａでコートする。上記プレートをＰＢＳでよく洗浄後、
第１抗体として、段階希釈した試料（マウス抗血清、ハ
イブリドーマ培養上清、精製抗体）を５０Ａｄ！／穴分
注し、４℃で一晩または室温で３〜４時間放置する。
ＰＢＳで６回洗浄した後、第２抗体として、ウサギの抗
マウスイムノグロブリン−ペルオキシダーゼ結合物ＣＤ
ＡＫＯ社製、販売：協和メデックス〕の４００倍希釈液
を１００ｍ／穴分注し、室温で２時間放置する。ＰＢＳ
で洗浄後、ＡＢＴＳ基質液（２，２’−アジノビス（３
−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ニアンモ
ニウム５５０ｍｇを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，
２）１１に溶かした溶液に、使用直前に過酸化水素１ｍ
／ｍｌを加えた溶液〕を１００４を加え、発色をＯＤ＜
＋ｓｎｍで測定する。
マウスイムノグロブリン−ペルオキシダーゼ結合物ＣＤ
ＡＫＯ社製、販売：協和メデックス〕の４００倍希釈液
を１００ｍ／穴分注し、室温で２時間放置する。ＰＢＳ
で洗浄後、ＡＢＴＳ基質液（２，２’−アジノビス（３
−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ニアンモ
ニウム５５０ｍｇを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，
２）１１に溶かした溶液に、使用直前に過酸化水素１ｍ
／ｍｌを加えた溶液〕を１００４を加え、発色をＯＤ＜
＋ｓｎｍで測定する。
Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８に対する抗体価が、正常マ
ウス血清の１０’倍以上（４１５ｒｏｗでのＯＤ値）に
なったマウスを免疫化動物細胞の供給源として使う。
ウス血清の１０’倍以上（４１５ｒｏｗでのＯＤ値）に
なったマウスを免疫化動物細胞の供給源として使う。
細胞融合に供するために、免疫マウスに融合処理の３〜
４日前にＧ−Ｃ５Ｆ誘導体、ＮＤ２８１００Ｍ／匹腹腔
内投与し、追腹腔内投与膵臓を摘出し、肺細胞を調製す
る。
４日前にＧ−Ｃ５Ｆ誘導体、ＮＤ２８１００Ｍ／匹腹腔
内投与し、追腹腔内投与膵臓を摘出し、肺細胞を調製す
る。
Ｃ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３ Ａｇ８−
Ｕｌ （Ｐ３−Ｕｌ）ＣＣｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ
ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄｌｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ ８１ １７ （１９７８）］ Ｐ ３−
ＮＳ Ｉ／１−Ａｇ４．１ （ＮＳ−１） （Ｅｕ
ｒｏｐｅａｎ Ｊ。
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３ Ａｇ８−
Ｕｌ （Ｐ３−Ｕｌ）ＣＣｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ
ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄｌｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ ８１ １７ （１９７８）］ Ｐ ３−
ＮＳ Ｉ／１−Ａｇ４．１ （ＮＳ−１） （Ｅｕ
ｒｏｐｅａｎ Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６ ５１１−５１９（１９７
６＞ ］ ＳＰ２１０−Ａｇ １４ （ＳＰ−２）
［Ｎａｔｕｒｅ ２７６ ．２６９−２７０（１９７８
）］ 、 Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ３．６５３（６５３）
（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｆｆ １２３．１５４８
−１５５０（１９７９）） 、 Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ
３ （Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ ２５６．４９５−４９
７（１９７５）］などが用いられる。これらの細胞株は
、８−アザグアニン培地［：ＲＰＭＩ−１６４０培地に
グルタミン（１，５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール
（５ｘ １ （１’Ｍ） 、ジェンタマイシン（ｌ Ｏ
ｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（１０％）を加
えた正常培地に、さらに８−アザグアニン（１５■／ｍ
ｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日
前に正常培地に継代し、融合当日２Ｘ１０’以上の細胞
数を確保する。
６＞ ］ ＳＰ２１０−Ａｇ １４ （ＳＰ−２）
［Ｎａｔｕｒｅ ２７６ ．２６９−２７０（１９７８
）］ 、 Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ３．６５３（６５３）
（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｆｆ １２３．１５４８
−１５５０（１９７９）） 、 Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ
３ （Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ ２５６．４９５−４９
７（１９７５）］などが用いられる。これらの細胞株は
、８−アザグアニン培地［：ＲＰＭＩ−１６４０培地に
グルタミン（１，５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール
（５ｘ １ （１’Ｍ） 、ジェンタマイシン（ｌ Ｏ
ｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（１０％）を加
えた正常培地に、さらに８−アザグアニン（１５■／ｍ
ｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日
前に正常培地に継代し、融合当日２Ｘ１０’以上の細胞
数を確保する。
（３）細胞融合
（１）で免疫したマウスに１００ｍ／匹のＧ−ＣＳＦ誘
導体、ＮＤ２８を腹腔的投与し、３〜４日後に膵臓を摘
出し、肺細胞を調製する。この肺細胞と（２）で得られ
る骨髄腫細胞をＭＥＭ培地（日永製薬社製）またはＰＢ
Ｓでよく洗浄し、細胞数が、陣細胞：骨髄腫細胞＝５〜
１０：１になるように混合し、遠心分離にかける。上清
を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、撹拌しなが
らポリエチレングリコール（ＰＥＧ−１０００〜４００
０） １〜４ｇ、ＭＥＭ培地１〜４ｍｌ、ジメチルス
ルホキシド（口ｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）０
．５〜１．０ｍｌの混液０．１〜１．０ｍｌ／ ｌ Ｏ
”肺細胞を加え、０．５〜１０分後にＭＥＭ培地０．５
〜３ｍｌを加える。その後０．５〜２分毎にＭＥＭ培地
０．５〜３ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を３０〜６
０ｍ１加える。遠心後、上清を揄で、ゆるやかに細胞を
ほぐした後、正常培地５０〜２００ｍ１を加え、メスピ
ペットでゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を培養
用プレートに半容量／穴ずつ分注し、３〜７％ＣＯ□イ
ンキュベーター中、３５〜４０℃で１０〜３０時間培養
する。培養プレートに半容ｌ／穴のＨＡＴ培地〔正常培
地にヒポキサンチン（１０−’〜１０−’Ｍ） 、チミ
ジン（１０−’〜ｌ Ｏ−’Ｍ）およびアミノプテリン
（１０−”〜１’０−’Ｍ）を加えた培地〕を加え、さ
らに１０〜３０時間培養する。以後１〜３日間日間１０
註３０ 培養上清半容量を揄で、新たに同量のＨＡＴ培地を加え
、ＣＯ２インキユベータ−中、３５〜４０℃で１０〜１
４日間培養する。
導体、ＮＤ２８を腹腔的投与し、３〜４日後に膵臓を摘
出し、肺細胞を調製する。この肺細胞と（２）で得られ
る骨髄腫細胞をＭＥＭ培地（日永製薬社製）またはＰＢ
Ｓでよく洗浄し、細胞数が、陣細胞：骨髄腫細胞＝５〜
１０：１になるように混合し、遠心分離にかける。上清
を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、撹拌しなが
らポリエチレングリコール（ＰＥＧ−１０００〜４００
０） １〜４ｇ、ＭＥＭ培地１〜４ｍｌ、ジメチルス
ルホキシド（口ｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）０
．５〜１．０ｍｌの混液０．１〜１．０ｍｌ／ ｌ Ｏ
”肺細胞を加え、０．５〜１０分後にＭＥＭ培地０．５
〜３ｍｌを加える。その後０．５〜２分毎にＭＥＭ培地
０．５〜３ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を３０〜６
０ｍ１加える。遠心後、上清を揄で、ゆるやかに細胞を
ほぐした後、正常培地５０〜２００ｍ１を加え、メスピ
ペットでゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を培養
用プレートに半容量／穴ずつ分注し、３〜７％ＣＯ□イ
ンキュベーター中、３５〜４０℃で１０〜３０時間培養
する。培養プレートに半容ｌ／穴のＨＡＴ培地〔正常培
地にヒポキサンチン（１０−’〜１０−’Ｍ） 、チミ
ジン（１０−’〜ｌ Ｏ−’Ｍ）およびアミノプテリン
（１０−”〜１’０−’Ｍ）を加えた培地〕を加え、さ
らに１０〜３０時間培養する。以後１〜３日間日間１０
註３０ 培養上清半容量を揄で、新たに同量のＨＡＴ培地を加え
、ＣＯ２インキユベータ−中、３５〜４０℃で１０〜１
４日間培養する。
コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴につ
いて、上清半容量を揄て、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からア
ミノプテリンを除いた培地）を同量加え、以後１〜３日
間１０〜３０時間口ごとにＨＴ培地への変換を行う。
いて、上清半容量を揄て、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からア
ミノプテリンを除いた培地）を同量加え、以後１〜３日
間１０〜３０時間口ごとにＨＴ培地への変換を行う。
ＨＴ培地で３〜４日培養後、培養上清の一部をとり上記
の酵素免疫測定法により、抗Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２
８抗体価を測定する。
の酵素免疫測定法により、抗Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２
８抗体価を測定する。
抗体価の認められた穴について、限界希釈法によりクロ
ーニングを２〜４回繰り返し、安定して抗体価の認めら
れたものを、抗Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８モノクロー
ナル抗体産土ハ産生リドーマ株として選択する。
ーニングを２〜４回繰り返し、安定して抗体価の認めら
れたものを、抗Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８モノクロー
ナル抗体産土ハ産生リドーマ株として選択する。
（４）モノクローナル抗体の調製
ブリスタン処理した８〜ｌＯ週令ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス
に（３）で得られた抗Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８モノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２〜４Ｘ１０’
個／匹を腹腔内注射する。
に（３）で得られた抗Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８モノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２〜４Ｘ１０’
個／匹を腹腔内注射する。
１０〜２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。
このマウスから腹水を採取し、遠心して固形分を除去後
、５０％硫安塩析、４０％硫安塩析をし、ＰＢＳ （ｐ
Ｈ７，２）で１〜２日間透析する。
、５０％硫安塩析、４０％硫安塩析をし、ＰＢＳ （ｐ
Ｈ７，２）で１〜２日間透析する。
この透析画分を粗精製モノクローナル抗体として分離し
、定量用に供することができる。
、定量用に供することができる。
さらに精製が必要な場合には、ＤＥＡＥ−セアロース力
うム、プロティンＡ−セファロースカラムなどに通塔し
、ＩｇＧ画分を集める。
うム、プロティンＡ−セファロースカラムなどに通塔し
、ＩｇＧ画分を集める。
抗体のイソタイプ、サブクラスの決定は、０ｕｃｈｔｅ
ｒ Ｉｏｎｙ法（免疫学実験入門、生物化学実験法１５
．学会出版センター刊、ｐ７４．１９８１年）によって
行う。
ｒ Ｉｏｎｙ法（免疫学実験入門、生物化学実験法１５
．学会出版センター刊、ｐ７４．１９８１年）によって
行う。
蛋白質の定量は、フォーリン法および２８０ｎｍでの吸
光度［１，４（ＯＤ２ｓ。）ζイムノグロブリン１ｍｇ
／ｍｌ〕より算出する。
光度［１，４（ＯＤ２ｓ。）ζイムノグロブリン１ｍｇ
／ｍｌ〕より算出する。
本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして
ＫＭ−４９８と命名したハイプリドーマ株から得られる
モノクローナル抗体ＫＭ−４９８は、ＩｇＧ＋に属する
ことを同定した。
ＫＭ−４９８と命名したハイプリドーマ株から得られる
モノクローナル抗体ＫＭ−４９８は、ＩｇＧ＋に属する
ことを同定した。
ＫＭ−４９８の抗原特異性は実施例に示すとおりである
。
。
本発明のモノクローナル抗体を用いるＧ−ＣＳＦ誘導体
、ＮＤ２８の精製方法の一例を示せば次のとおりである
。
、ＮＤ２８の精製方法の一例を示せば次のとおりである
。
本発明のモノクローナル抗体１０ｍｇをＰＢＳ１〜１０
ｍ１にとかしＣＮＢ ｒ活性化セファロース−４８（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製
）などの担体１ｍｌと反応させ、固定化モノクローナル
抗体を得る。この固定化モノクローナル抗体をカラムに
充填後、これに組換えＤＮＡ技術により製造したＧ−Ｃ
ＳＦ誘導体、ＮＤ２８（３ｍｇ以下）を含む溶液を通塔
する。この操作で９５〜１００％のＧ＝−ＣＳＦ誘導体
、ＮＤ２８がカラムに吸着される。溶媒、たとえば、７
Ｍ尿素とＩＭ ＮａＣ１とを含む溶液（ｐＨ７，０）
で溶出すると、吸着量の約８０％のＧ−ＣＳＦ誘導体、
ＮＤ２８が溶出する。−回の通塔により約５，０００倍
の精製が可能である。これに対して、天然型Ｇ−ＣＳＦ
は全く本抗体カラムに吸着されない。
ｍ１にとかしＣＮＢ ｒ活性化セファロース−４８（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製
）などの担体１ｍｌと反応させ、固定化モノクローナル
抗体を得る。この固定化モノクローナル抗体をカラムに
充填後、これに組換えＤＮＡ技術により製造したＧ−Ｃ
ＳＦ誘導体、ＮＤ２８（３ｍｇ以下）を含む溶液を通塔
する。この操作で９５〜１００％のＧ＝−ＣＳＦ誘導体
、ＮＤ２８がカラムに吸着される。溶媒、たとえば、７
Ｍ尿素とＩＭ ＮａＣ１とを含む溶液（ｐＨ７，０）
で溶出すると、吸着量の約８０％のＧ−ＣＳＦ誘導体、
ＮＤ２８が溶出する。−回の通塔により約５，０００倍
の精製が可能である。これに対して、天然型Ｇ−ＣＳＦ
は全く本抗体カラムに吸着されない。
本発明のモノクローナル抗体は固相サンドウィッチ法に
よる酵素免疫測定法などによりＧ−Ｃ５Ｆ誘導体、ＮＤ
２８を定量するために使用できる。
よる酵素免疫測定法などによりＧ−Ｃ５Ｆ誘導体、ＮＤ
２８を定量するために使用できる。
実施例１
（１）免疫マウス牌細胞の調製
８週令のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（静岡県実験動物農業協
同組合）５匹にアジュバントとして水酸化アルミニウム
ゲル２ ｍｇ／匹および百日咳菌死菌ワクチン（千葉系
血清研究所）ＩＸＩＯ’細胞／匹を、抗原として第１表
のＧ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８ １００■／匹を腹腔的
投与し免疫した。
同組合）５匹にアジュバントとして水酸化アルミニウム
ゲル２ ｍｇ／匹および百日咳菌死菌ワクチン（千葉系
血清研究所）ＩＸＩＯ’細胞／匹を、抗原として第１表
のＧ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８ １００■／匹を腹腔的
投与し免疫した。
以後、２週問おきに、該Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８
１００縄／匹を腹腔内に投与し、２回目以降の免疫を
かけた。３回目の免疫以降、免疫の５〜７日後に眼底静
脈叢より採血し、血清中の抗Ｇ−Ｃ５ＦＩＩ４導体、Ｎ
Ｄ２８抗体価を前記の固相法による酵素免疫測定法で調
べた。
１００縄／匹を腹腔内に投与し、２回目以降の免疫を
かけた。３回目の免疫以降、免疫の５〜７日後に眼底静
脈叢より採血し、血清中の抗Ｇ−Ｃ５ＦＩＩ４導体、Ｎ
Ｄ２８抗体価を前記の固相法による酵素免疫測定法で調
べた。
３回免疫以降５匹全例で抗体価が認められたが、ＩｇＧ
クラスのモノクローナル抗体を効率よく得るために、総
計５回の免疫を行った。
クラスのモノクローナル抗体を効率よく得るために、総
計５回の免疫を行った。
５回目の免疫後、Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８１０Ｌｃ
ｇ／匹を腹腔的投与して追加免疫し、３日後このマウス
から牌細胞を調製して細胞融合に用いた。
ｇ／匹を腹腔的投与して追加免疫し、３日後このマウス
から牌細胞を調製して細胞融合に用いた。
（２）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｕｒを正
常培地ｆ：ＲＰＭｒ−１６４０にグルタミン１．５ｍＭ
、２−メルカプトエタノール５Ｘ １０−’Ｍ、ジェン
タマイシン１０■／ｍｌおよび牛胎児血清０．１ ｍｌ
／ｍｌを加えた培地〕に培養し、４日後に２Ｘ１０’以
上の細胞を得た。
常培地ｆ：ＲＰＭｒ−１６４０にグルタミン１．５ｍＭ
、２−メルカプトエタノール５Ｘ １０−’Ｍ、ジェン
タマイシン１０■／ｍｌおよび牛胎児血清０．１ ｍｌ
／ｍｌを加えた培地〕に培養し、４日後に２Ｘ１０’以
上の細胞を得た。
（３）ハイブリドーマの作製
ＭＥＭ （日永製薬社製）でよく洗浄した免疫マウス肺
細胞１ｘ１０＠個とマウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｕｔ ２
Ｘ１０’個を混合し、１．２ＱＯｒｐｍで５分間遠心分
離にかけた。
細胞１ｘ１０＠個とマウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｕｔ ２
Ｘ１０’個を混合し、１．２ＱＯｒｐｍで５分間遠心分
離にかけた。
沈澱として得られた肺細胞とＰ３−Ｕｌの混合した細胞
群をよくほぐした後、撹拌しながら３７℃、ポリエチレ
ングリコール−１，０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇＳ
ＭＥＭ２ｍｌおよびＤＭ５０ ０．７ｍｌの混液０．５
ｍｌを加え、１分後にＭＥＭｌｍｌを加えた。その後Ｍ
ＥＭ１ｍｌを１分毎に５回加えた後、ＭＥＭを全容量が
５０ｍ１となるように加えた。９００ ｒｐｍで遠心分
離後、上ｉｆｆを捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、
正常培地ＩＱＱｍｌを加え、１０ｍｌメスピペットでゆ
るやかに細胞を懸濁した。
群をよくほぐした後、撹拌しながら３７℃、ポリエチレ
ングリコール−１，０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇＳ
ＭＥＭ２ｍｌおよびＤＭ５０ ０．７ｍｌの混液０．５
ｍｌを加え、１分後にＭＥＭｌｍｌを加えた。その後Ｍ
ＥＭ１ｍｌを１分毎に５回加えた後、ＭＥＭを全容量が
５０ｍ１となるように加えた。９００ ｒｐｍで遠心分
離後、上ｉｆｆを捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、
正常培地ＩＱＱｍｌを加え、１０ｍｌメスピペットでゆ
るやかに細胞を懸濁した。
懸濁液を２４穴培養用プレート［Ｆｌｏｗ ｔ、ａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ社（米）製〕に１ ｍｌ／穴ずつ分注し、
５％Ｃ０２インキユベーター中、３７℃で２４時間培養
した。培養プレートに１ｍｌ／穴のＩ（へＴ培地〔上記
正常培地にヒポキサンチンｌ Ｏ−’Ｍ、チミジ７１、
５ Ｘ １０−’Ｍおよびアミノブチリ７４ Ｘ ｔｏ
−’Ｍを加えた培地〕を加え、さらに２４時間培養した
。培養上清１ｍｌを捨て、新たにＨへＴ培地１ｍｌを加
え、３７℃でさらに２４時間培養した。
ｒａｔｏｒｙ社（米）製〕に１ ｍｌ／穴ずつ分注し、
５％Ｃ０２インキユベーター中、３７℃で２４時間培養
した。培養プレートに１ｍｌ／穴のＩ（へＴ培地〔上記
正常培地にヒポキサンチンｌ Ｏ−’Ｍ、チミジ７１、
５ Ｘ １０−’Ｍおよびアミノブチリ７４ Ｘ ｔｏ
−’Ｍを加えた培地〕を加え、さらに２４時間培養した
。培養上清１ｍｌを捨て、新たにＨへＴ培地１ｍｌを加
え、３７℃でさらに２４時間培養した。
培養上清１ｍｌを捨て、ＨＡＴ培地培地１警ｌえ、３７
℃でさらに１０〜１４日間培養した。
℃でさらに１０〜１４日間培養した。
コロニー状に生育してきた融合網η包のみられる穴につ
いて、上清１ｍｌを捨て、ＨＴ培地〔上記ＨＡＴ培地よ
りアミノプテリンを除いた培地〕を１ｍ＋加えて３７℃
で培養した。以後２日間同様にＨＴ培地への交換を行い
、培養を続け４日後、培養上清の一部を採取し、抗Ｇ−
Ｃ５Ｆ誘導体、ＮＯ３８抗体価を上記の固相酵素免疫測
定法により測定した。
いて、上清１ｍｌを捨て、ＨＴ培地〔上記ＨＡＴ培地よ
りアミノプテリンを除いた培地〕を１ｍ＋加えて３７℃
で培養した。以後２日間同様にＨＴ培地への交換を行い
、培養を続け４日後、培養上清の一部を採取し、抗Ｇ−
Ｃ５Ｆ誘導体、ＮＯ３８抗体価を上記の固相酵素免疫測
定法により測定した。
抗体価の認められた穴については、限界希釈法によりク
ローニングを２回繰り返し、安定して抗体価の認められ
たクローンを抗Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＯ３８モノクロ一
ナル抗体産生ハイブリドーマ株としてＫＭ−４９８を選
択した。
ローニングを２回繰り返し、安定して抗体価の認められ
たクローンを抗Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＯ３８モノクロ一
ナル抗体産生ハイブリドーマ株としてＫＭ−４９８を選
択した。
ハイプリドーマ株ＫＭ−４９８は工業技術院微生物工業
技術研究所にｍｕｒｉｎｅ Ｂ ｃｅｌｌ ｈｙｂｒｉ
ｄｏｍａＫＭ−４９８ＦＯＲＭ ＢＰ−１６６５として
昭和６３年１月２０日付で寄託しである。
技術研究所にｍｕｒｉｎｅ Ｂ ｃｅｌｌ ｈｙｂｒｉ
ｄｏｍａＫＭ−４９８ＦＯＲＭ ＢＰ−１６６５として
昭和６３年１月２０日付で寄託しである。
（４）モノクローナル抗体の部分精製
プリスタン処理［： ２．６．１０．１４−テトラメチ
ルペンタデカン（２，６，１０，１４−ｔｅｔｒａｍｅ
ｔｈｙ Ｉｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）［］、５ｍｌ／匹
を腹腔内投与し、２週間飼育する。〕した８週令ＢＡＬ
Ｂ／ｃ雌マウスに上記で得られたハイプリドーマ株各４
Ｘ１０’細り０７匹を腹腔内注射した。１０〜２１日後
にハイプリドーマ株は腹水癌化する。１０〜２１日後に
腹水のたまったマウスから腹水（４〜１０ｍ１）を採取
し、遠心分離して固形分を除去した。上清を５０％硫安
塩析、４０％硫安塩析し、ＰＢＳ（ｐＨ７，２）で２日
間透析した。これを粗精製モノクローナル抗体ＫＭ−４
９８とした。
ルペンタデカン（２，６，１０，１４−ｔｅｔｒａｍｅ
ｔｈｙ Ｉｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）［］、５ｍｌ／匹
を腹腔内投与し、２週間飼育する。〕した８週令ＢＡＬ
Ｂ／ｃ雌マウスに上記で得られたハイプリドーマ株各４
Ｘ１０’細り０７匹を腹腔内注射した。１０〜２１日後
にハイプリドーマ株は腹水癌化する。１０〜２１日後に
腹水のたまったマウスから腹水（４〜１０ｍ１）を採取
し、遠心分離して固形分を除去した。上清を５０％硫安
塩析、４０％硫安塩析し、ＰＢＳ（ｐＨ７，２）で２日
間透析した。これを粗精製モノクローナル抗体ＫＭ−４
９８とした。
（５）粗精製モノクローナル抗体の抗原特異性固相酵素
免疫測定法により粗精製モノクローナル抗体の抗原特異
性を測定した。抗原としては第１表７７）Ｇ−ＣＳＦｍ
導体、ＮＯ２８（７）ｌｉか、組換えＤＮＡ技術天然型
Ｇ−ＣＳＦ（ネイチャー （Ｎａｔａｒｅ） ３１９．
４１５（１９８６）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）
２３２ 、６１（１９８６））ホスト大腸菌由来夾雑タ
ンパクおよび牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（生化学工業
社製）を用いた。結果を第２表に示す。
免疫測定法により粗精製モノクローナル抗体の抗原特異
性を測定した。抗原としては第１表７７）Ｇ−ＣＳＦｍ
導体、ＮＯ２８（７）ｌｉか、組換えＤＮＡ技術天然型
Ｇ−ＣＳＦ（ネイチャー （Ｎａｔａｒｅ） ３１９．
４１５（１９８６）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）
２３２ 、６１（１９８６））ホスト大腸菌由来夾雑タ
ンパクおよび牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（生化学工業
社製）を用いた。結果を第２表に示す。
第 ２ 表
Ｎ口２８
正常マウス血清 Ｘｌ０−２０．０２０ ０．０１５
０．０１０ ０．０６０粗精製モノクロ一ナル抗体を
ＤＥＡＥセファロースカラムに通塔後溶出し、ＩｇＧ画
分を集め精製モノクローナル抗体とした。
０．０１０ ０．０６０粗精製モノクロ一ナル抗体を
ＤＥＡＥセファロースカラムに通塔後溶出し、ＩｇＧ画
分を集め精製モノクローナル抗体とした。
（６）モノクローナル抗体の分類
０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ法（免疫学実験入門、生物化学
実験法１５．学会出版センター刊 ｐ、７５ １９８１
年）でＫＭ−４９８の抗体のイソタイプを調べたところ
、抗体がＩｇＧクラスに属するモノクローナル抗体であ
り、さらにＫＭ−４９８はＩ ｇ Ｇ ＋クラスの抗体
であると同定された。
実験法１５．学会出版センター刊 ｐ、７５ １９８１
年）でＫＭ−４９８の抗体のイソタイプを調べたところ
、抗体がＩｇＧクラスに属するモノクローナル抗体であ
り、さらにＫＭ−４９８はＩ ｇ Ｇ ＋クラスの抗体
であると同定された。
実施例２
実施例１で得られた抗Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８モノ
クローナル抗体ＫＭ−４９８のｌｏｍｇ／ＰＢＳをＣＮ
Ｂｒ活性化セファロース−４８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）１ｍｌと反応させ
、固定化モノクローナル抗体を得た。この固定化モノク
ローナル抗体をカラムに充填し、そのカラムに３．０ｍ
ｇのＧ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８を含んだ培養抽出物５
ｍｌを通塔したところ、２．６ｍｇ（８７％）のＧ−Ｃ
ＳＦ誘導体、ＮＤ２８がカラムに吸着した。
クローナル抗体ＫＭ−４９８のｌｏｍｇ／ＰＢＳをＣＮ
Ｂｒ活性化セファロース−４８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）１ｍｌと反応させ
、固定化モノクローナル抗体を得た。この固定化モノク
ローナル抗体をカラムに充填し、そのカラムに３．０ｍ
ｇのＧ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８を含んだ培養抽出物５
ｍｌを通塔したところ、２．６ｍｇ（８７％）のＧ−Ｃ
ＳＦ誘導体、ＮＤ２８がカラムに吸着した。
次にＰＢＳで洗浄後７Ｍ尿素とＩＭＮａＣＪ！とを含む
溶液で溶出したところ、２．１０ｍｇ（吸着量の８１％
）のＧ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８が溶出した。この−回
の通塔により、Ｇ−Ｃ９Ｆ誘導体、ＮＤ２８が約５，０
００倍精製された。
溶液で溶出したところ、２．１０ｍｇ（吸着量の８１％
）のＧ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８が溶出した。この−回
の通塔により、Ｇ−Ｃ９Ｆ誘導体、ＮＤ２８が約５，０
００倍精製された。
一方天然型Ｇ−ＣＳＦは、全く本抗体カラムに吸着しな
かった。
かった。
実施例３
天然型Ｇ−ＣＳＦをウサギに免疫して得た、抗Ｇ−ＣＳ
Ｆウサギ抗血清を第１抗体として、１１００Ｂ ／ ｍ
ｌの濃度で９６穴ＥＩＡ用プレー） ＣＦｌｏｗＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ社（米）製〕に５０ＪＪｉ／穴ずつ分
注した。４℃で２４時間放置し、プレートの穴の底面に
第１抗体をコートした。ついで、プレート穴の底面の蛋
白結合基の残りを覆うため、１％牛血清アルブミン／Ｐ
ＢＳを２００ｄ／穴ずつ分注し、４℃で２４時間放置し
た。レジン水でよく洗浄後、７５〜５鴻／ｍｌのＧ−Ｃ
ＳＦ誘導体、ＮＤ２８を５０４／穴ずつ分注し、室温に
２時間放置した。
Ｆウサギ抗血清を第１抗体として、１１００Ｂ ／ ｍ
ｌの濃度で９６穴ＥＩＡ用プレー） ＣＦｌｏｗＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ社（米）製〕に５０ＪＪｉ／穴ずつ分
注した。４℃で２４時間放置し、プレートの穴の底面に
第１抗体をコートした。ついで、プレート穴の底面の蛋
白結合基の残りを覆うため、１％牛血清アルブミン／Ｐ
ＢＳを２００ｄ／穴ずつ分注し、４℃で２４時間放置し
た。レジン水でよく洗浄後、７５〜５鴻／ｍｌのＧ−Ｃ
ＳＦ誘導体、ＮＤ２８を５０４／穴ずつ分注し、室温に
２時間放置した。
ＰＢＳでよく洗浄した後、第２抗体として、ビオチン化
ＫＭ −４９８（１０ｑ／ｍｌ）を５０塊／穴加え、４
℃で１晩放置し、ＰＢＳでよく洗浄した後、アビジン−
ビオチン−ペルオキシダーゼ〔ベクトール（ＶＢＣＴＯ
Ｒ）社製〕（１０ｘ／ｉｔ） １００４／穴加え、室
温で１時間放置した後、ＰＢＳで洗浄した。次にＡＢＴ
Ｓ基質液を１００ｍ／穴加え、室温で３０分間反応させ
、５％ＳＤＳ溶液１００ｄ／穴を加え反応を停止した。
ＫＭ −４９８（１０ｑ／ｍｌ）を５０塊／穴加え、４
℃で１晩放置し、ＰＢＳでよく洗浄した後、アビジン−
ビオチン−ペルオキシダーゼ〔ベクトール（ＶＢＣＴＯ
Ｒ）社製〕（１０ｘ／ｉｔ） １００４／穴加え、室
温で１時間放置した後、ＰＢＳで洗浄した。次にＡＢＴ
Ｓ基質液を１００ｍ／穴加え、室温で３０分間反応させ
、５％ＳＤＳ溶液１００ｄ／穴を加え反応を停止した。
各人の発色を吸光度計（ＯＤ、１ｓ）で測定した。
その結果、第１図に示した様に、５〜５０■／ｍｌの範
囲でＧ−ＣＳ ＦｉＡ導体、ＮＤ２８を定量することが
可能であった。この系に、Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８
の代わりに、天然型Ｇ−ＣＳＦを加えても、全く反応し
なかった。
囲でＧ−ＣＳ ＦｉＡ導体、ＮＤ２８を定量することが
可能であった。この系に、Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８
の代わりに、天然型Ｇ−ＣＳＦを加えても、全く反応し
なかった。
参考例１゜
ＮＤ２８をコードする組換え体プラスミド匹［ＢＤ２８
（特願昭６２−３２６３８４）を含む大腸菌菌株エシェ
リヒア・コリＥＣｆ ＢＤ２８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
４７９）をＬＧ培地〔バタトトリプトンｌｏｇ、酵母エ
キス５ｇ％ＮａＣｊ！５ｇ、グルコースＩｇを水ｌｌに
溶かし、ＮａＯＨにてｐＨを７．０とする。〕で３７℃
、１８時間培養し、この培養液５ｍｌを２５■／ｍ＋の
トリプトファンと５０ｇ／＋ｎｌのアンピシリンを含む
ＭＣＧ培地［：Ｎａ、ＨＰＯｎ ０．６％、ＫＨ２ＰＯ
４０，３％、ＮａＣｌ１ Ｏ，５％、力ずミノ酸０．５
％、Ｍ ｇ Ｓ Ｏ５１ｍＭ、ビタミンＢ＋ ４ｑ／
ｍ１ＳｐＨ７，２］ １００ｍ１に接種し、３０℃で
４〜８時間培養後、トリプトファンの誘導物質である３
β−インドールアクリル酸（３β−１ｎｄｏ１ｅａｃｒ
ｙｌｉｃａｃｉｄ）をｌＯμｇ／ｍｌ加え、さらに２〜
１２時間培養を続けた。培養液を８，０００ｒｐｍ 、
１０分間遠心して集菌し、３０ｍＭ ＮａＣｊ７．
３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ７，５）緩衝液
で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝液３０ｍ１に懸濁し、
０℃で超音波破砕（ＢＲ八へ５ＯＮＳＯＮＩＣＰＯＩＤ
ＲＣＯＭＰＡＮＹ社５ＯＮＩＰＩＩＥＲＣＢＬＬ ＤＩ
ＳＲＩＩＰＴＯＲ２００，０ＵＴＰ［ＩＴ Ｃ０ＮＴＲ
０Ｌ２．１０分間処理）シタ。これを９．００ Ｏｒｐ
ｍ 、 ３０分間遠心して菌体残渣を得た。この菌体残
渣からマーストンらの方法ＣＦ。
（特願昭６２−３２６３８４）を含む大腸菌菌株エシェ
リヒア・コリＥＣｆ ＢＤ２８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
４７９）をＬＧ培地〔バタトトリプトンｌｏｇ、酵母エ
キス５ｇ％ＮａＣｊ！５ｇ、グルコースＩｇを水ｌｌに
溶かし、ＮａＯＨにてｐＨを７．０とする。〕で３７℃
、１８時間培養し、この培養液５ｍｌを２５■／ｍ＋の
トリプトファンと５０ｇ／＋ｎｌのアンピシリンを含む
ＭＣＧ培地［：Ｎａ、ＨＰＯｎ ０．６％、ＫＨ２ＰＯ
４０，３％、ＮａＣｌ１ Ｏ，５％、力ずミノ酸０．５
％、Ｍ ｇ Ｓ Ｏ５１ｍＭ、ビタミンＢ＋ ４ｑ／
ｍ１ＳｐＨ７，２］ １００ｍ１に接種し、３０℃で
４〜８時間培養後、トリプトファンの誘導物質である３
β−インドールアクリル酸（３β−１ｎｄｏ１ｅａｃｒ
ｙｌｉｃａｃｉｄ）をｌＯμｇ／ｍｌ加え、さらに２〜
１２時間培養を続けた。培養液を８，０００ｒｐｍ 、
１０分間遠心して集菌し、３０ｍＭ ＮａＣｊ７．
３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ７，５）緩衝液
で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝液３０ｍ１に懸濁し、
０℃で超音波破砕（ＢＲ八へ５ＯＮＳＯＮＩＣＰＯＩＤ
ＲＣＯＭＰＡＮＹ社５ＯＮＩＰＩＩＥＲＣＢＬＬ ＤＩ
ＳＲＩＩＰＴＯＲ２００，０ＵＴＰ［ＩＴ Ｃ０ＮＴＲ
０Ｌ２．１０分間処理）シタ。これを９．００ Ｏｒｐ
ｍ 、 ３０分間遠心して菌体残渣を得た。この菌体残
渣からマーストンらの方法ＣＦ。
＾、 ０． Ｍａｒｓｔｏｎ ら： ＢＩＤ／ＴＥ
ＣＨＮＯＬＯＧＹ ２ ．８００（１９８４） ：
１によりＧ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８を抽出・精製・可
溶化・再生した。
ＣＨＮＯＬＯＧＹ ２ ．８００（１９８４） ：
１によりＧ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８を抽出・精製・可
溶化・再生した。
発明の効果
本発明のモノクローナル抗体を用いて、第１表に示した
Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８を効率よく精製し、特異的
かつ高感度、簡便、迅速に定量することができる。
Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８を効率よく精製し、特異的
かつ高感度、簡便、迅速に定量することができる。
第１図はＧ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８の含有量と４１５
ｎｍの吸光度の関係を示す。○は、Ｇ−ＣＳＦ誘導体、
ＮＤ２８、・は、天然型Ｇ−ＣＳＦを示す。 特許出願人 （１０２）協和醗酵工業株式会社代表者
加 藤 幹 夫
ｎｍの吸光度の関係を示す。○は、Ｇ−ＣＳＦ誘導体、
ＮＤ２８、・は、天然型Ｇ−ＣＳＦを示す。 特許出願人 （１０２）協和醗酵工業株式会社代表者
加 藤 幹 夫
Claims (4)
- （１）ヒト顆粒球コロニー刺激因子（以下Ｇ−ＣＳＦと
略記する）誘導体、ＮＤ２８に対する抗Ｇ−ＣＳＦ誘導
体、ＮＤ２８モノクローナル抗体。 - （２）Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８が第１表のアミノ酸
配列１〜１７４で示されるものであることを特徴とする
請求項１記載のモノクローナル抗体。 - （３）抗Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８モノクローナル抗
体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、
Ｇ−ＣＳＦ誘導体、ＮＤ２８含有物質からＧ−ＣＳＦ誘
導体、ＮＤ２８を単離することからなるＧ−ＣＳＦ誘導
体、ＮＤ２８の精製法。 - （４）抗Ｇ−ＣＳＦモノクローナル抗体を用い、固相サ
ンドウィッチ法による酵素免疫測定法によりＧ−ＣＳＦ
誘導体、ＮＤ２８を定量する方法。
Priority Applications (12)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63051357A JP2618618B2 (ja) | 1988-03-04 | 1988-03-04 | 抗ｇ−ｃｓｆ誘導体、ｎｄ２８モノクローナル抗体 |
| CA 592543 CA1337050C (en) | 1988-03-04 | 1989-03-02 | Monoclonal antibody selectively binding to novel g-csf derivative |
| EP19890103765 EP0331186B1 (en) | 1988-03-04 | 1989-03-03 | Monoclonal antibody selectively binding to novel g-csf derivative |
| US07/318,527 US5194592A (en) | 1986-12-23 | 1989-03-03 | Monoclonal antibodies to novel polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
| DE1989617338 DE68917338T2 (de) | 1988-03-04 | 1989-03-03 | Monoklonaler Antikörper mit selektiver Bindung an ein neues g-csf-Derivat. |
| US07/337,002 US5214132A (en) | 1986-12-23 | 1989-04-12 | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
| US07/994,924 US5362853A (en) | 1986-12-23 | 1992-12-22 | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
| US08/274,433 US6027720A (en) | 1986-12-23 | 1994-07-13 | G-CSF conjugate |
| US08/434,402 US5714581A (en) | 1986-12-23 | 1995-05-03 | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
| US08/434,411 US5681720A (en) | 1986-12-23 | 1995-05-03 | DNA encoding human granulocyte colony stimulating factor plasmids and host cells comprising same, and methods of expressing the encoded polypeptide |
| US08/783,288 US5795968A (en) | 1986-12-23 | 1997-01-10 | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
| US08/890,640 US5994518A (en) | 1986-12-23 | 1997-07-09 | Method of producing a polypeptide having human granulocyte colony stimulating factor activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63051357A JP2618618B2 (ja) | 1988-03-04 | 1988-03-04 | 抗ｇ−ｃｓｆ誘導体、ｎｄ２８モノクローナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01225495A true JPH01225495A (ja) | 1989-09-08 |
| JP2618618B2 JP2618618B2 (ja) | 1997-06-11 |
Family
ID=12884686
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63051357A Expired - Lifetime JP2618618B2 (ja) | 1986-12-23 | 1988-03-04 | 抗ｇ−ｃｓｆ誘導体、ｎｄ２８モノクローナル抗体 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0331186B1 (ja) |
| JP (1) | JP2618618B2 (ja) |
| CA (1) | CA1337050C (ja) |
| DE (1) | DE68917338T2 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3708151B2 (ja) * | 1994-12-15 | 2005-10-19 | 協和醗酵工業株式会社 | Ｐｅｇ化したヒト顆粒球コロニー刺激因子の定量法 |
| US8435939B2 (en) | 2000-09-05 | 2013-05-07 | Biokine Therapeutics Ltd. | Polypeptide anti-HIV agent containing the same |
| EP1541585B1 (en) | 2002-08-27 | 2013-01-30 | Biokine Therapeutics Ltd. | Cxcr4 antagonist and use thereof |
| EP3011961B1 (en) | 2006-12-21 | 2020-11-11 | Biokine Therapeutics LTD. | 4f-benzoyl-tn14003 for the mobilisation of hematopoietic progenitor cells in view of transplantation |
| EP2396023A2 (en) | 2009-02-11 | 2011-12-21 | Yeda Research and Development Co. Ltd. | Short beta-defensin-derived peptides |
| JP5715622B2 (ja) | 2009-06-14 | 2015-05-07 | バイオカイン セラピューティックス リミテッド | 血小板レベルを増大させるためのペプチド療法 |
| JP5840148B2 (ja) | 2010-03-04 | 2016-01-06 | フェニックス インク． | 変性させることなく可溶性組換えインターフェロンタンパク質を産生する方法 |
| US8455218B2 (en) | 2010-04-01 | 2013-06-04 | Pfenex, Inc. | Methods for G-CSF production in a Pseudomonas host cell |
| EP2841084B1 (en) | 2012-04-24 | 2018-05-30 | Biokine Therapeutics Ltd. | Cxcr4 antagonist peptide for use in the treatment of large cell lung cancer |
| JP2018521983A (ja) | 2015-07-16 | 2018-08-09 | バイオカイン セラピューティックス リミテッド | がんを治療するための組成物および方法 |
| BR112018016924A2 (pt) | 2016-02-23 | 2019-01-02 | Biokine Therapeutics Ltd | método de seleção de regime de tratamento para indivíduo que tem leucemia mieloide aguda (lma), método de maximização de resposta ao tratamento de leucemia mieloide aguda (lma), método de tratamento de lma, antagonista de cxcr4 e agente quimioterápico no tratamento de lma |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4810643A (en) * | 1985-08-23 | 1989-03-07 | Kirin- Amgen Inc. | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
| JPH0630619B2 (ja) * | 1985-12-03 | 1994-04-27 | 中外製薬株式会社 | モノクロ−ナル抗ヒト顆粒球コロニ−刺激因子抗体 |
-
1988
- 1988-03-04 JP JP63051357A patent/JP2618618B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-03-02 CA CA 592543 patent/CA1337050C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-03 DE DE1989617338 patent/DE68917338T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-03 EP EP19890103765 patent/EP0331186B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0331186A2 (en) | 1989-09-06 |
| DE68917338D1 (de) | 1994-09-15 |
| DE68917338T2 (de) | 1995-04-27 |
| EP0331186A3 (en) | 1990-09-12 |
| CA1337050C (en) | 1995-09-19 |
| JP2618618B2 (ja) | 1997-06-11 |
| EP0331186B1 (en) | 1994-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS60231624A (ja) | ヒト‐レニンに対するモノクローナル抗体及びその使用 | |
| US5648077A (en) | Treatment of patients infected with hepatitis B virus with a human monoclonal antibody | |
| JPH07501210A (ja) | Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの有用な抗原に関する方法と組成 | |
| JPH05505112A (ja) | Ａｉｄｓ、ａｒｃおよびｈｉｖ感染の予防および治療に有用な抗ｃｄ４抗体ホモログ | |
| US4786592A (en) | Neisseria gonorrhoeae lectin useful as a vaccine and diagnostic marker and means for producing this lectin | |
| JPS60120825A (ja) | 抗プロテインｃモノクロ−ナル抗体およびそれを産生するハイブリド−マ | |
| JPH01225495A (ja) | 抗ｇ−ｃｓｆ誘導体、ｎｄ２８モノクローナル抗体 | |
| JPS60190721A (ja) | 抗腫瘍特異的単クロ−ン性抗体の製造法 | |
| JPH0630619B2 (ja) | モノクロ−ナル抗ヒト顆粒球コロニ−刺激因子抗体 | |
| JPS59172496A (ja) | モノクロ−ナル抗体 | |
| KR100245542B1 (ko) | 응고 인자 xiii 또는 xiiia의 정제방법 및 인자 xiiia에 대한 모노클로날 항체 | |
| CN110894235A (zh) | 一种抗隐球菌夹膜多糖的兔源单克隆抗体及其应用 | |
| CN109400709B (zh) | 双功能抗体及其用途 | |
| JPS63180860A (ja) | 抗ｇ−ｃｓｆモノクロ−ナル抗体 | |
| CN114920842B (zh) | 特异性结合pv-1蛋白的抗体或其抗原结合片段及其应用 | |
| JPH0659231B2 (ja) | 単一クローン抗体 | |
| JP2519561B2 (ja) | 酸性糖タンパク質 | |
| WO2000077049A1 (fr) | Anticorps antifucoidan | |
| JPS60258128A (ja) | ラツトモノクロ−ナル抗体 | |
| JPH0794475B2 (ja) | 純粋なエリスロポエチンの製造法 | |
| JPS608228A (ja) | モノクロ−ナル抗体 | |
| JPS62143693A (ja) | 魚類の成長ホルモンに対するモノクロ−ナル抗体 | |
| JPH06125784A (ja) | モノクローナル抗体，ハイブリドーマ，その製造法および用途 | |
| JPS62232394A (ja) | 大腸菌由来外膜蛋白ｆ単量体に対するモノクロ−ナル抗体、およびそれを産生するハイブリド−マ | |
| CN115948346A (zh) | 一株能稳定分泌抗芋螺毒素μ-KIIIA-CTX单克隆抗体的杂交瘤细胞株 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |