JPS62232394A - 大腸菌由来外膜蛋白ｆ単量体に対するモノクロ−ナル抗体、およびそれを産生するハイブリド−マ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ハイブリドーマにより産生される新規なモノ
クローナル抗体に関する。

更に詳しくは、本発明は、ハイブリドーマにより産生さ
れる新規な抗大腸菌外膜蛋白Ｆ単量体抗体、該抗体を産
生ずるハイブリドーマおよび該抗体を用いたダラム陰性
桿菌の検出方法に関する。

以下、本明細書において、大腸菌外膜蛋白Ｆ単量体をＯ
ｍｐＦと、抗大腸菌外膜蛋白Ｆ単量体モノクローナル抗
体を抗ＯｍｐＦモノクローナル抗体と記す。

ＯｍｐＦは、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
の主要な外膜蛋白で、分子量３０〜４０にダルトンの単
量体として単離されている（Ｕｅｍｕｒａ　ｅｔ、　ａ
ｌ；Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、
　４１３　、１６３−１７６、１９７５　）。

さらにＯｍｐＦ遺伝子が単離され全ＤＮＡ塩基配列が決
定されたことにより、ＯｍｐＦが３４０ケのアミノ酸か
ら成ること、およびその全アミノ酸−次配列が明らかに
なった（Ｉｎｏｋｕｃｈｉ　ｅｔ、ａｌ；Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１０．　６９５７−６９６８
　、１９８２　）。

ＯｍｐＦは、三量体としてペプチドグリカン層と非共有
結合して細菌表層構造を形成している他、ＯｍｐＦと組
成・性質の非常によく似た大腸菌外膜蛋白Ｃとともに外
膜中に親水性低分子物質の透過孔を形成している。　す
なわち、大腸菌の構造維持および機能発現の両面におい
て重要な役割を担っている。

ＯｍｐＦは、特に低張条件下で増殖した大腸菌の外膜に
存在することが知られている（Ｋａｗａｊｉｅｔ、ａｌ
、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４０．８４３−８
４７．１９７９　）。

また、○ｍｐＣ欠損変異株においてＯｍｐＦが主要な外
膜蛋白として機能する。

ＯｍｐＦを抗原として選択的に認識するモノクローナル
抗体を提供できればこれを使用することによって、食品
や生体試料等の標品に混在するダラム陰性桿菌、特に大
腸菌を検出することができる。

また、該抗体をアフィニティクロマトグラフィーに用い
ることによりワクチン製造等の目的にＯｍｐＦ抗原を精
製することができるなど、産業上利用価値が高い。

本発明は、大腸菌由来外膜蛋白Ｆ単量体（ＯｍｐＦ）と
反応するモノクローナル抗体、該抗体を産生ずるハイブ
リドーマ、および該抗体を利用した細菌の検出法を提供
する。

以下、本発明の詳細な説明する。

抗原としての大腸菌由来外膜蛋白Ｆ単量体（ＯｍｐＦ）
とは、大腸菌からＴＯｋｕｎａｇａらの方法（Ｅｕｒ、
　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、９５　、４４１−４４８．
１９７９　）によって単離・精製されるアミノ酸残基３
４０ケからなるＭＷ３７，０８２の外膜蛋白（Ｉｎｏｋ
ｕｃｈｉ　ｅｔ、ａｌ；　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　
Ｒｅｓ、　１０．　６９５７−６９６８　、１９８２　
）を意味する。

本発明のハイブリドーマは、Ｋｄｈｌｅｒら（Ｎａｔｕ
ｒｅ益鉦、　４９５−４９７．１９７５）の方法として
知られている手法によって樹立される。　すなわち、Ｏ
ｍｐＦでマウスを免疫した後、このマウスの肺臓細胞を
マウス骨髄腫細胞と融合させる。　その後、生合成阻害
剤を含む選択培地を用いた培養において増殖してくる融
合細胞を得る。　その培養上清中に含まれる抗体活性を
、通常の免疫学的測定法、主としてＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ
　（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ−ｓｏ
ｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ　）法によってスクリーニング
し、ＯｍｐＦと特異的に反応する抗体を産生ずる細胞株
を得る。　次いで、軟寒天（ｓｏｆｔ　ａｇａｒ）法、
限界希釈法（ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　）
法、又はシングルセルマニュピレーション（ｓｉｎｇｌ
ｅ　ｃｅｌｌ　ｍａｎｉｐｕ　−１ａｔｉｏｎ）法の手
法によりクローニングを行い、ＯｍｐＦとのみ反応する
抗体を分泌し、かつモノクローン（単一性クローン）由
来の細胞株、いわゆるハイブリドーマを得る。

本発明の抗体は、該ハイブリドーマを組織培養用プレー
トに接種して、無血清培地や血清を含む通常の動物細胞
用培地で培養することによって、又はプリスタンを前投
与したマウス等の動物に接種し、生体内培養することに
よって得る。　得られた抗体は、通常の蛋白精製に用い
られる生化学的手法、例えば硫酸アンモニウムによる沈
澱法、イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法お
よびアフィニティクロマトグラフィー法によって精製さ
れる。

該抗体を利用したダラム陰性桿菌、特に大腸菌の検出に
は、通常、抗原抗体複合体を検出する時に用いられる一
般的な手法が使用される。　その−例をあげれば、以下
のごとくになる。

大腸菌の汚染が想定される食品や生体試料の適当量を採
取する。　　１００°Ｃにて５分間以上加熱処理した試
料に、適宜希釈された該抗体を加え反応させる。　洗浄
後、　試料中の菌体と結合した抗体を放射性同位元素標
識されたブドウ球菌由来プロティンＡと反応させ、形成
された複合体をガンマカウンターにて測定することによ
って大腸菌を検出する。　更には、既知数冊の大腸菌を
含む試料を用い検量線を作成し、それと比較することに
よって検体試料中の大腸菌数を定量的に測定できる。

さらに、該抗体はアフィニティクロマトグラフィーへ応
用され、ＯｍｐＦの精製に利用される。

以下に本発明の実施例を挙げ、さらに詳細に本発明を説
明する。　本発明は、もちろん、以下の実施例のみに限
定されるものではな（、通常、行われる変更、改善を含
むものである。

実施例１゜ 抗ＯｍｐＦモノクローナル抗体の作成 （１）　抗原の調製 大腸菌　Ｅ、ｃｏｌｔ　　Ｋ　　１２の誘導体　ＭＣ−
ＭＣ−４１００（Ｏ欠損株；Ｏｚａｗａ　　ｅｔ、　ａ
ｌ。

Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１５４．６６９−６７
５．１９８３　）より、Ｕｅｍｕｒａ　　ｅｔ、　ａｌ
　（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　
４１３゜１６３−１７６、１９７５）の方法およびＴＯ
ｋｕｎａｇａ　　らＥｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　９５　、４４１−４４８．１９７９　）の方法に準じ
て精製ＯｍｐＦ標品を調製した。　マウス免疫およびア
ッセイに抗原として用いたＯｍｐＦ標品は、ウレア−３
ＤＳ・ポリアクリルアミド・スラブゲル電気泳動による
分析で単一バンドを示した。　又該０ｍｐＦ標品中のリ
ボ多＄７！（ＬＰＳ）の含量は、蛋白比０．５％（Ｗ／
Ｗ）以下であった。

精製ＯｍｐＦの調製法を以下に示す。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＭＣ−４１００を０．２％グルコー
ス加ＬＢ培地（０，２％グルコース、Ｂａｃｔｏ−ｔｒ
ｙｐｔｏｎｅＩ％、ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　０．
５％、ＮａＣｌ！０．５％、ｐＨ７，０）中で培養し、
対数増殖期に集菌した。　超音波によって細菌破砕し、
１４，０００ｘｇ　　１０分間の遠心分離操作で未破砕
菌体を除去、その上清を１００．ＯＯＯｘｇ４０分間超
遠心分離することによって細菌壁（ｃｅｌｌ　ｅｎｖｅ
ｌｏｐｅ）画分を得た。　細菌壁画骨を２％ドデシル硫
酸ナトリウム塩（ＳＤＳ）　、１０％グリセロール（ｇ
ｌｙｃｅｒｏｌ）　、０．０１％２−メルカプトエタノ
ール（２−ＭＥ）を含む１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（
Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｌ；　ｐＨ７，５）に９．ｆｊ５し
、５０°Ｃ１３０分間加熱処理、続いて１００，０００
ｘｇ　　４０分間の条件にて遠心分離した。

その沈査を０．０５Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｊり、１
％ＳＤＳ、０．０１％２−ＭＥ含有１０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて洗浄後、０．５ＭＮａＣ１
，４％ＳＤＳ、０．０１％２−ＭＥ、、１０％グリセロ
ール含有１０ｍＭ１−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）
に懸濁して３７°０３０分間振盪することによって抽出
、１００．Ｏｏｏｘｇ　　４０分間の遠心分離により上
清を得た。

次いで、セファクリルＳ−３００（ファルマシア）を用
いたゲル濾過にて精製した。　　０．３ＭＮａＣ１，０
，０５％２−ＭＥ、０．２５％ＳＤＳ、５ｍＭＥＤＴＡ
、３ｍＭＮａＮ、を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ７，５）にて溶出されてくる両分を集めた。　　１
００’Ｃ，５分間加熱処理後、再度、セファクリルＳ−
３００カラムクロマトグラフイーによって精製し、５０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，０に対して４日間
（１，５Ｎの緩衝液を４回交換）透析して精製ＯｍｐＦ
を得た。

（２）免疫膵臓細胞の調製 フロイントの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’　ｓｃ
ｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ；　Ｆ　ＣＡ）と混
和した抗原ＯｍｐＦ１００μｇをＢＡＬＢ／Ｃ７ウス（
雌、４週令）へ腹腔内投与した。　その後、２週間隔に
て２度、フロイントの不完全アジュバントド（Ｆｒｅｕ
ｎｄ’ｓ　ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ；
　　Ｆ　Ｉ　Ａ）と混和したＯｍｐＦ５０μｇを腹腔内
投与した。

約１カ月後、５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，０に溶解さ
れたＯｍｐＦ５Ｑμｇを静脈内投与することによって追
加免疫した。　その３日後に肺臓を摘出、イーグルのＭ
ＥＭ培地（牛丼化学）に懸濁された肺臓細胞を得た。

（３）　細胞融合 マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８・Ｕｌ（Ｐ３Ｕ１
）を１０％ウシ胎児血清ＦＣ３（Ｇｉｂｃｏ）加ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地（牛丼化学）中で培養し、対数増殖期
で細胞を集め細胞融合に用いた。　融合方法は、ＫＢｈ
　ｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ。

」茜、　４９５−４９７．１９７５　）の方法に準じた
。　即ち、肺臓細胞と骨髄腫細胞とを１０：１の比率で
血清不合のＰＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、７分間１
，０００ｒｐｍ（トミー精工ＣＤ−１０ＯＲ）にて遠心
分離した。　沈査に、３７°Ｃに保温された４５％（Ｗ
／Ｗ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ”）６０００の
溶液１ｍｌを１分間かけて添加し、さらに室温（２３±
３°Ｃ）にて８分間インキュベートした。　次いで、血
清不含ＲＰＭＩ−１６４０培地８ｍｌを１　ｍ　ｌ　／
　ｍ　ｉ　ｎの割合で加え懸濁した。　　更に血清不含
ＲＰＭＩ−１６４０培地Ｉ　Ｑｍｌを徐々に加えＰＥＧ
を希釈した。

７分間　１．００Ｏｒｐｍで遠心分離し、その後マウス
骨髄腫細胞として６ｘｌＯ’／ｍｌの細胞濃度が得られ
るように、１０％ＦＣ３−ＲＰＭＩ−１６４０培地に再
懸濁し、９６六マイクロプレート（住友ベークライトＭ
Ｓ−３０９６Ｆ）に０．２ｍｌ／穴あて分注した。　こ
の融合細胞を５％ＣＯｔにおいて３７°Ｃで培養した。

　細胞融合の１日後に、半分量の培地を新たなＨＡＴ培
地（１０−’Ｍヒボキサンチン、４　Ｘ　１０−’Ｍア
ミノプテリン、１．６　ｘ　１０−５Ｍチミジンを含む
ＲＰＭＩ−１６４０培地）と交換した。　以後、２日毎
にＨＡＴ培地による半量交換を３回行った。

１０日後には、約８７％のマイクロプレート穴で、細胞
の増殖が観察された。

（４）　抗ＯｍｐＦ抗体のアッセイ 細胞融合１１日後、ハイブリドーマ細胞の培養上清中の
ＯｍｐＦに対する抗体の存在を酵素免疫定量法、いわゆ
るＥＬＩＳＡ法にてスクリーニングした。すなわち、０
　、１　Ｍ　ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅｂｕｆｆｅｒ　　
ｐ　Ｈ９，６に溶解されたＯｍｐＦ溶液１００μβをポ
リ塩化ビニール９６六マイクロプレー　ト　（Ｆａｌｃ
ｏｎ　　Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ　　　ｍ　　ｆｌｅｘｉｂ
ｌｅ　　ａｓｓａｙｐｌａｔｅ；　　Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ；以下ｐｖｃアッセイブレートと略す
）に分注、３７”Ｃ２時間インキュベーション後溶液を
除去し、次いでＰＶＣアッセイプレートを乾燥させた。

　非特異的結合を防ぐ為に同様の操作により牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ）を吸着させ、抗原プレートとして用い
た。

１％ＢＳＡ、　　　０．０５％　（Ｖ／Ｖ）　　Ｔｗ　
ｅ　ｅ　ｎ　２０　（牛丼化学）を含むリン酸緩衝生理
食塩水ｐＨ７，２（以下ＰＢＳＴと略す）にて適宜希釈
した培養上清を１ウエルあたり１００μｌ加えて、２時
間３７”Ｃにて培養した。　その後、ＰＢＳＴにて３回
洗浄し、次いでカルシウム・マグネシウム不含のリン酸
緩衝生理食塩水ｐＨ７，２（以下ＰＢＳ　（−）と略す
）にて１０３倍希釈されたａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓ
ｐｈａｔａｓｅ標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ　ｉｍｍｕｎ
ｏｇｌｏ−ｂｕｌｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　（Ｎｅｗ　
Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　）を１ウエルあたり
１００μｌ加え、２時間３７”Ｃにて培養した。　ＰＢ
ＳＴにて５回洗浄後、バラニトロフェニル　ピロフォス
フエイト（ρａｒａｎｉＬｒｏ−ｐｈｅｎｙｌ　ｐｙｒ
ｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｐ　Ｎ　Ｐ　Ｐ　）　）を基質
として、１５分間３７°Ｃにてインキュベートすること
により発色させ、マルチスキャン（Ｔ　ｉ　ｔｅｒｔｅ
ｃｋＭｕｌｔｉｓｋａｎ　ＭＣＣ，Ｆｌｏｗ　Ｌａｂ、
）にて４０５ｎｒｎでの吸光度を測定した。

アッセイの結果、１３ウエルで陽性を示した（細胞増殖
ウェルに対して約２％であった）。

代表的な陽性例を表１に記す。

表１ ３Ａ３　　１．３１　　０．０６　　０．１１３Ｆ２　
　１．２８　　０．０８　　０．１０４ＡＩ２　　１．
１６　　０，０７　　０．１１５Ｄ８　　１．２４　　
０．０７　　０．１１５Ｈ１００，８７、０，０７０，
１２ ７Ｂ１２　　１．２５　　０．０８　　０．１３７Ｃ１
１，５５０，０９０，１４ ７Ｄ５　　１．２１　　０．０７　　０．１１７Ｆ７　
　１．４８　　０．０８　　０．１２８Ａ８　　１．１
０　　０．０７　　０．１１８Ａ９　　１．２９　　０
．０？　　　０．１３８Ｃ９１，１１０，０９０，１３ ０ｍｐＦへの結合を示した１３ウエルの培養上清は、い
ずれもＯｍｐＣおよびＢＳＡに結合しなかった。　この
ことは、特異性の高いことを示している。

（５）　抗ＯｍｐＦ抗体産生ハイプリドーマのクローニ
ング ＯｍｐＦに対し高い結合能を示す抗体を産生している１
３ケのハイブリドーマをそれぞれ、ＢＡＬＢ／Ｃマウス
の胸腺細胞をフィーダーＦｉｌ（ｌｘ１０６／ウェル）
として用いた９６六マイクロプレートにてＧａｇｎｏｎ
　ｅｔ、　ａｌ　　（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａ
１Ｍｅｔｈｏｄｓユ、　２６７−２６９．１９８５　）
方法に準じた単細胞マニュビレーション（ｓｉｎｇｌｅ
　ｃｅｌｌ　ｍａｎｉｐｕｌａ−Ｌｉｏｎ）法によりク
ローニングした。

（６）抗ＯｍｐＦ抗体産生ハイブリドーマの培養および
精製 クローニング後、培養にて増殖させたハイブリドーマ５
ｘｌＯｂ細胞を２週間前にブリスタン投与したＢＡＬＢ
／Ｃマウスの腹腔内へ接種した。

１０〜１４日後、マウスの腹腔より腹水を採取し、５０
％飽和硫酸アンモニウムによる沈澱法で抗ＯｍｐＦモノ
クローナル抗体を単離した。

１５分間１０，０００ｘｇ遠心分離により得た沈澱を４
０ｍＭＮａＣｌを含む少量の２０ｍＭ）リス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７，８）に溶解、透析チューブを用いて２０ｍ
ＭＮａＣｊ！含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７
，８）に対して４℃にて１晩透析した。　透析内液を１
５分間１０，０００ｘｇ遠心分離した上清を２０ｍＭＮ
ａＣ１含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）
で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（ＤＥ−５２、ワ・
ノドマン・ケミカル・セパレーション）カラムクロマト
グラフィーに負荷した後、ＮａＣ１濃度を２０ｍＭから
４００ｍＭへ連続的に上げて溶出させＩｇＧ画分を得た
。

（７）　腹水の抗体価 クローン化させたハイブリドーマのマウス腹水をＰＢＳ
Ｔで１０４倍希釈し、（４）項記載のＥＬＩＳＡ法にて
、ＯｍｐＦおよびＯｍｐＣに対する抗体価を測定した（
表２）。

表２．。

３Ｆ２／ＩＡ９　　　　　１，８４　　　０．００８Ｃ
９／６Ｄ１　　　　　１．３８　　　０．０１５Ｄ８／
ＩＣ３１，１１０，０５ ７Ｂ１２．／４Ｅ３　　　１．６３　　　０．０４７Ｆ
７１５Ｆ４　　　　　１．７７　　　０．０３７Ｃ１／
３Ｄ３　　　　　１．７６　　　０．０２８Ａ８／４Ｄ
４　　　　　１．１８　　　０．０５（８）抗体の免疫
グロブリンクラスの同定ハイブリドーマ培養上清７５μ
ｌを、オフタロニーの二重免疫拡散法に基づくモノクロ
ーナル抗体タイピングキット（生化学工業）に対して、
室温（２３±３℃）にて２４時間インキュベートし、抗
原抗体沈降物を観察し、サブクラスを同定した。　　抗
血清としては、マウス免疫グロブリンγ１、γ２１、γ
２ｂｓ　γ３、αおよびμに対するヒツジボリクローナ
ル抗体（Ｍｉｌｅｓ　）を用いた。

代表的な抗ＯｍｐＦモノクローナル抗体のサブクラスを
表３に示す。

表３ 抗Ｏｍ　Ｆモノクローナル抗体　サブクラス７　Ｂ　１
２／４Ｅ３　　　　　　　１ｇＧ＋７Ｆ７／りＦ４　　
　　　　　　１ｇＯ□８Ａ８／４Ｄ４　　　　　　　　
１ｇＧ。

実施例２ 抗ＯｍｐＦモノクローナル抗体のニブトープ同定 （１）キメラ抗原の調製 ＯｍｐＦおよびＯｍｐＣ（ＯｍｐＦに類似した大腸菌由
来外膜蛋白）遺伝子が単離され、その全ＤＮＡ塩基配列
が決定された（Ｉｎｏｋｕｃｈｉ　ｅｔ、　ａｌ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１０＋　６９
５７−６９６８．１９８２およびＭｉｚｕｎｏ　ｅｔ、
ａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ＋、、２５８　、６
９３２−６９４０゜１９８３　）。

両遺伝子は、６９％のＤＮＡ塩基相同性を示した。　水
島らは、この高いＤＮＡ塩基相同性に基づいた細胞内組
み換え（江　ｖｉｖｏ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏ
ｍｂｉｎａｔｉｏｎ　）現象を利用してＯｍｐｌ；’−
ＯｍｐＣキメラ遺伝子を作製し、ＯｍｐＦ−ＯｍｐＣキ
メラ蛋白として大腸菌で発現することに成功した（Ｎｏ
ｇａｍｉ　ｅｔ、　ａｌ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、、　１６４．７９７−８０１、１９８５　）。　また
、水島らは、同様の原理および手法により、ＯｍｐＣ−
ＯｍｐＦキメラ遺伝子およびキメラ蛋白も作製した。

キメラ遺伝子の構築、キメラ遺伝子の発現に関するデー
タは、Ｎｏｇａｍ　ｉ　　らの前述の論文に詳しい。

ＯｍｐＦ−ＯｍｐＣキメラ蛋白およびＯｍｐＣ−Ｏｍｐ
Ｆキメラ蛋白抗原の調製は、実施例１−（１）に記述し
たごとく行われた。

実施例１にて得られた抗ＯｍｐＦモノクローナル抗体の
ニブトープを同定する目的で表４に記載されるキメラ蛋
白が抗原として使用われた。

実験に用いたキメラ蛍白の性状及び対応するキメラ遺伝
子の組み換え部位を図４−７に示す。

表４　ニブトープの同定に用いられたＯ　ｍ　ｐ　Ｃお
よびＯｍｐＦのキメラ蛋白抗原 ＯｍｐＦ−ＱｍｐＣキメラ蛍白　＃４１０＃４０３ ＃４６２ ＃４５１ ＯｍｐＣ−ＯｍｐＦキメラ蛋白　＃　５＃　１ ＃　６ ＃１４ ＃１０ ＃　３ ＃１７ ＃２６ ＃　７ ＃１１ ＃　２ （２）キメラ抗原を用いたＥＬＩＳＡ 実施例１−（４）に記載した方法にて、抗原プレートの
作製および酵素免疫学的測定（ＥＬＩＳＡ）を行った。

　抗原として、ＯｍｐＦやＯｍｐｃ精製標品、それに加
えて実施例２−　（１）のごと（調製されたＯｍｐＦ−
ＯｍｐＣキメラ蛋白およびＯｍｐＣ−ＯｍｐＦキメラ蛋
白を用いた。

ＥＬＩＳＡの実験結果を表５に示す。

（３）　キメラ抗原を用いたイムノブロッテング分析 ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣおよびこれらのキメラ蛋白５μｇを
、それぞれ０．１％ＳＤＳ、８Ｍ尿素、８％ポリアクリ
ルアミドから成る通常の尿素−３ＤＳポリアクリルアミ
ド・スラブ。ゲルにて、０．１９Ｍグリシン、０．１％
ＳＤＳを含む０．０２５Ｍ）リス溶液の泳動用緩衝液を
用い、最初の一時間１０ｍＡｍｐ　ｓ、次いで４時間２
０ＴＩＡｍｐ　ｓの電流で電気泳動した。　この条件下
、ＯｍｐＦ、キメラ蛋白、ＯｍｐＣの順の易動性で陽極
側へ移動、分離された。　その後、ゲルをトランスファ
ーバッファー（２５ｍＭ）リス・１９２ｍＭグリシンｐ
　Ｈ８，３，２０％　（Ｖ／Ｖ）メタノール）に４″Ｃ
−夜浸漬した。　次いで、ニトロセ／Ｌ１０−ス膜（Ｂ
ｉｏｒａｄ）へ電気的（３０Ｖ。

４．５　ｈ　ｒ）に、室温にてトランスファーし、２％
ＢＳＡ含有０．９％Ｎａ　Ｃｊ！加５０ｍＭ）リス−塩
酸緩衝液ｐＨ８，０（ＴＢＳと略す）で室温、１時間イ
ンキュベートすることによりブロッキングした。　更に
、０．１％ＢＳＡ、１０％ＦＣ８含有ＴＢＳで室温、１
時間インキュベートすることによりブロッキングされた
ニトロセルロース膜を１０３倍希釈された各抗ＯｍｐＣ
モノクローナル抗体（マウス腹水）の水溶液において３
７°Ｃ１時間、続いて４”Ｃ−夜インキユベートした。

０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ　（ｐＨ８，０）
でニトロセルロース膜を５回洗浄した後、第２抗体（１
％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｓｎ２０含有ＰＢＳにて３
，０００倍希釈されたペルオキシダーゼ標識抗マウスイ
ムノグロブリン抗体）と３７６０１時間インキュベート
した。　同様に、０．０５％’ｌ’ｗｅｅｎ２０含有Ｔ
ＢＳ　（ｐＨ８，０）で５回洗浄後、発色試薬（０，５
ｍｇ／ｍｆクロロナフトール、２０％メタノール、　　
０．０３％Ｈ，Ｏ□を含むＴＢＳ、ｐＨ７，５）を添加
し発色させた。　一部のＯｍｐＦ−ＯｍｐＣ遺伝子、特
に中央部にてＤＮＡ組み換えの生じている同キメラ遺伝
子は大腸菌において発現しているものの、そのキメラ蛍
白は外膜画分に回収されなかった。　新生キメラ蛋白（
ｎａｓｃｅｎｔ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）
の細胞内安定性、移動（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　）および
外膜への集合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）の過程のいずれかに
異常がある為と考えられた。　この場合には、大腸菌内
で３ＳＳ−メチオニン標識された新生キメラ蛋白を抗原
として用い、抗ＯｍｐＣモノクローナル抗体によって形
成される抗原抗体複合体を免疫沈降させた後、５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびフルオログラフ
ィーすることによって結合性を判定した。

イムノブロッティングまたはフルオログラフィー法によ
り判定された抗ＯｍｐＦモノクローナル抗体の、各キメ
ラ蛋白抗原への結合性の結果を表６に示す。

表７ 表６　抗ＯｍｐＦモノクローナル抗体７Ｂ１２／４Ｅ３
のＯｍｐＦ、ＯｍｐＣおよびそれらのキメラ蛋白抗原へ
の結合性 抗原　　　　　　　　７Ｂ１２／４Ｅ３０ｍｐＣ− ＯｍｐＦ−ＯｍｐＣキメラ蛋白 ＃４１０　　　　　− ＃４０３　　　　　− ＃４６２　　　　　− ＃４５１　　　　　　＋ ＯｍＦ　　　　　　　　　　　　　＋ ＋：結合性あり、　−：結合性なし く４）ニブトープの同定 実施例２−　（２）および（３）の結果より、各抗Ｏｍ
ｐＦモノクローナル抗体の抗原認識部位（ニブトープ）
は、表７のどと（同定される。

地でＬ字管を用いて３７°０６時間振盪培養した。

モノクロ−ＯｍｐＦ ナル　　　　アミノ　　　　　　　配置７Ｂ１２／４Ｅ
３　　　＃　８１−１１８　　　ペプチド１７Ｆ７１５
Ｆ４　　　＃　２９９−３４０　　ペプチド■８Ａ８／
４Ｄ４　　　＃　２９９−３４０　　ペプチド■なお、
本発明のハイブリドーマ７Ｂ１２／４Ｅ３．８　Ａ　８
／４　Ｄ　４および７　Ｆ　７１５　Ｆ　４について、
工業技術院微生物技術研究所へ寄託申請を行ったが、受
託を拒否された。

実施例３ 抗ＯｍｐＦモノクローナル抗体の大腸菌検出への応用 （１）　大腸菌の調製 大腸菌Ｅ、　ｃｏｌｔ　　Ｋ　−１２誘導体ＭＣ４１０
０（ＯｍｐＣ欠損株）をプレイン・ハート・インフュー
ジョン・ブロース＜ＢＨＩＢ、田水製薬）培この前培養
液を坂ロフラスコ中の新しいＡ培地（１１あたりｎｕｔ
ｒｉｅｎｔ　ｂｒｏｔｈ　７ｇ　、　ｙｅａｓｔ　ｅｘ
ｔｒａｃｔＩｇ、グリセロール２ｇ、ＫｚＨＰＯ４３，
７ｇ、およびＫ　ＨｚＰ　０４１　、　３　ｇを含む）
に接種し３７９Ｃ１８時間振盪培養後、遠心分離（４，
０００Ｘｇ、１５分間）することによって菌を集めた。

　　１％ＢＳＡ加リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）（ＫｚＨ
ＰＯａ３．７ｇおよびＫ　Ｈ！Ｐ　０゜１．３ｇ／ｊ２
）で−回洗浄、次いで１％ＢＳＡ加リン酸緩衝液（ｐＨ
７，２）（ＫｚＨＰｏ、３．７ｇ、オヨびＫＨｚＰＯ４
１，３ｇ／ｊ’）に懸濁し、クレット光電光度計（富士
工業）を用いてクレット単位（Ｋｌｅｔｔ　ｃｏｎｓｔ
ａｎｔ）が７５０（約４×１０１０ＣＦＵ／ｒｒｊ２）
になるように菌懸濁液を調製した。　５分間１００℃加
熱処理して以後の実験に用いた。

（２）大腸菌の検出法 （１）において調製された菌懸濁液０．９ｍｊｌ！へあ
らかじめ１％ＢＳＡ加ハンクス液ｐＨ７，４にて１０−
１０’倍希釈された各抗ＯｍｐＦモノクローナル抗体７
Ｂ１２／４Ｅ３　　（マウス腹水）０．１ｍｌを加え３
７°Ｃ％　１　ｈ　ｒインキュベートした。　遠心分離
（３，ＯＯＯＸｇ、１０分間）によって同ハンクス液で
３回洗浄後、０．２ｍｌの同ハンクス液に懸濁し、次い
でＩＺＪ−プロティンＡ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　　０
　、０１　ｍ　ｌを加え３７℃、１　ｈ　ｒインキュベ
ートした。　次いで３回洗浄後、抗原抗体複合体の１．
ｓ　Ｈ量をγ−カウンター（アロ力ＫＫ）にて測定した
。

抗Ｏｍｐ　Ｆモノクローナル抗体７Ｂ　１２／４Ｅ３お
よび骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１のＥ、　ｃｏｌｉ　　ＭＣ４１
００菌体への結合性を表８に示す。

表８ 腹水　　　　　　希釈　　　　　　′。合抗ＯｍｐＦモ
ノ　　１０　　　　２３％クローナル抗体　　１０”　
　　　　　２１％７Ｂ１２／４Ｅ３　１０’　　　　　
　１７％Ｐ３Ｕ１　　　　　１０　　　　　５％（陰性
対照）　　　　　１０”　　　　　　３％１０４　　　
　３％

【図面の簡単な説明】

図１は、ペプチド■のアミノ酸配列を示す図である。 図２は、ペプチド■のアミノ酸配列を示す図である。 図３は、ＯｍｐＦ−ＯｍｐＣキメラ遺伝子の組み換え部
位を示す図である。 図４は、ＯｍｐＣ−ＯｍｐＦキメラ遺伝子の組み換え部
位を示す図である。 図５は、ＯｍｐＦ−ＯｍｐＣキメラ遺伝子およびＯｍｐ
Ｃ−ＯｍｐＦキメラ遺伝子の組み換え部位および制限酵
素による切断個所を示す図である。 図中、線で囲んだ部分は組み換え部位を表す。 図６は、ＯｍｐＦのＤＮＡ塩基配列およびそれに対応す
るアミノ酸配列を表す図である。 完 図１ へ１ａＴｈｒＴｙｒＴｙｒＰｈｅＡｓｎＬｙｓＡｓｎＭ
ｅｔＳｅｒＴｈｒＴｙｒＶａｌ八５ｐＴｙｒ１１ｅ１１
ｅＡｓｎＧ１ｎｌｌｅ八５ｐＳｅｒＡｓｐＡｓｎＬｙｓ
ＬｅｕＧ１ｙＶａｌＧｌｙＳｅｒ八５ｐＡｓｐ丁ｈｒＶ
ａｌハ１ａＶａｌＧ１ｙＩｌｅＶａｌＴｙｒ１ｎＰｈｅ 図３　　各ＯｍｐＦ−ＯｍｐＣキメラ遺伝子の組み換え
部位Ｍｌｕｉ　　　　　　　　Ｐｖｕロ ロ＝コＯｍｐＣ由来　　■ＯｍｒＩＦ由来　？乏コ組換
え部位図５　　（その２） ＮｒｕＩ １ｎｃ１１ １’　ｌ’　ＣＴＡ　Ｔ　ＣＡ　に　ＴＴ　Ａ　ＴＧ　
Ａ　ＴＴＡ　ＣＧ　ＡｃＲＩ ＴＴＡ己二Δ凸ＴＧＧＣＧＴＡＡＣＴＡＡＣＡＡＣａｅ
Ｉ Ａ　（ｊ　（ｊ　’ｌ”ｌ”　ｌ’　に　Ｇけｌ’　Ａ
　Ｉ−ＣＧ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　ＣＧ　Ａ図５　
　（その４） Ｃ１ａＩ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）大腸菌由来外膜蛋白Ｆ単量体と反応するモノクロ
   ーナル抗体
2. （２）図１に示される大腸菌由来外膜蛋白Ｆ単量体のア
   ミノ酸配列第８１−１１８から成るペプチドを特異的に
   認識するモノクローナル抗体７Ｂ１２／４Ｅ３である特
   許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体
3. （３）図２に示される大腸菌由来外膜蛋白Ｆ単量体のア
   ミノ酸配列第２９９−３４０から成るペプチドを特異的
   に認識する特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル
   抗体
4. （４）モノクローナル抗体７Ｆ７／５Ｆ４として特定さ
   れる特許請求の範囲第３項記載のモノクローナル抗体
5. （５）モノクローナル抗体８Ａ８／４Ｄ４として特定さ
   れる特許請求の範囲第３項記載のモノクローナル抗体
6. （６）大腸菌由来外膜蛋白Ｆ単量体と反応するモノクロ
   ーナル抗体を産生するハイブリドーマ
7. （７）図１に示される大腸菌由来外膜蛋白Ｆ単量体のア
   ミノ酸配列第８１−１１８から成るペプチドを特異的に
   認識するモノクローナル抗体７Ｂ１２／４Ｅ３を産生す
   るハイブリドーマ７Ｂ１２／４Ｅ３である特許請求の範
   囲第６項記載のハイブリドーマ
8. （８）図２に示される大腸菌由来外膜蛋白Ｆ単量体のア
   ミノ酸配列第２９９−３４０から成るペプチドを特異的
   に認識するモノクローナル抗体を産生する特許請求の範
   囲第６項記載のハイブリドーマ
9. （９）モノクローナル抗体７Ｆ７／５Ｆ４を産生するハ
   イブリドーマ７Ｆ７／５Ｆ４として特定される特許請求
   の範囲第８項記載のハイブリドーマ
10. （１０）モノクローナル抗体８Ａ８／４Ｄ４を産生する
    ハイブリドーマ８Ａ８／４Ｄ４として特定される特許請
    求の範囲第８項記載のハイブリドーマ
11. （１１）大腸菌由来外膜蛋白Ｆ単量体と反応するモノク
    ローナル抗体を用いることを特徴とする大腸菌の検出方
    法