JPH07108915B2 - ヒト−マクロファージ遊走阻止因子蛋白質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、精製されたヒト−マク
ロファージ遊走阻止因子（ヒト−ＭＩＦ）、その製造方
法、及びヒト−ＭＩＦを含んで成る医薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒト細胞からのヒト−ＭＩＦは従来活性
なものとしては知られているが、混合物として、そして
生物学的液体中の他の蛋白質と一緒に記載されているに
過ぎず、そして構造的観点からは未だ特徴付けられてい
ない。ＭＩＦはいわゆるリンフォカイン群に属し、この
リンフォカインは生物学的に活性な可溶性ポリペプチド
を含んで成り、このものはリンパ球及び単球又はマクロ
ファージが抗原、マイトジェン等により刺激された場合
にこれらの細胞から分泌される。

【０００３】リンフォカインの他の例として、免疫イン
ターフェロン（γ−インターフェロン）、インターロイ
キン１及び２、並びにマクロファージ活性化因子（ＭＡ
Ｆ）を挙げることができる。これらのリンフォカイン
は、免疫系の種々の細胞タイプの分化、活性化及び増殖
を制御する。知られている技術的状況によれば、ヒト−
ＭＩＦは、マクロファージの遊走能力を阻害するポリペ
プチドの一群から成る。ヒト−ＭＩＦは活性化されたリ
ンパ球、Ｔ−及びＢ−細胞からのみならず、非リンパ性
細胞、例えば成長中の線維芽細胞及びある種の腫瘍細胞
からも分泌される。

【０００４】ＭＩＦは、γ−インターフェロン、マクロ
ファージ活性化因子（ＭＡＦ）及び他のリンフォカイン
から明確に区別される。しかしながら今まで、ヒト−細
胞からのＭＩＦを純粋に調製し、そしてその構造を解明
することは不可能であった。ヒト−ＭＩＦについて、こ
れが約８．５，１８，２７，３６，４５、及び６７kg／
Mol （キロダルトン、kD）の分子量及び約pH５．１及び
２．９の等電点を有する構造的に異るポリペプチドの混
合物らしいことが知られている〔Ｇ．Ｂａｕｍｅｉｓｔ
ｅｒ，Ｈ．Ｓｔｅｆｆｅｎ，Ｕ．Ｆｅｉｇｅ、及びＣ．
Ｓｏｒｇ、イムノバイオロジー（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ）１６０，１５（１９８１）〕。

【０００５】ヒト−ＭＩＦは炎症反応（遅延型過敏性反
応）の初期において決定的な役割を演ずる。このものは
単球及び無活動組織マクロファージが炎症性マクロファ
ージに分化するのを誘導する。従って、精製されたヒト
−ＭＩＦ及びその個々の蛋白質並びにヒト−ＭＩＦを特
異的に結合してその活性を阻害するモノクローナル抗体
は、免疫調節疾患及び慢性炎症疾患の診断及び治療のた
めに重要である。

【０００６】ヒト−ＭＩＦを結合しそしてそれを阻害す
るモノクローナル抗体は、接触湿疹、一次的慢性多発関
節炎及び種々の自己免疫疾患の克服のために有用であ
る。精製されたヒト−ＭＩＦ及びその個々の蛋白質は感
染に対する耐性、例えば結核、らい病又はレーシュマニ
アに対する耐性、及びキャンディダ症に対する耐性、並
びに腫瘍、例えば転移に対する耐性を上昇せしめる。

【０００７】診断及び治療における抗体の用途の範囲は
最近まで非常に限定されていた。抗体は、種々の蛋白質
の複雑な混合物として動物の血清から非常に少量得られ
た。免疫された各動物個体、及び１つの個体でさえ、反
復して免疫された場合には、各場合に種々の組成の抗体
を含有する血清をもたらすので、抗体の標準化は不可能
であった。Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ〔Ｇ．
Ｋｏｅｌｅｒ及びＣ・Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、ネイチュアー
（Ｎａｔｕｒｅ）２５６，４９５（１９７５）〕により
開発された技法を用いて、今や均質な形の抗体、すなわ
ちいわゆるモノクローナル抗体を、細胞培養により工業
的な量において再現性を伴って得ることができるように
なった。

【０００８】適当な骨髄腫細胞と抗原により免疫された
供与体からの抗体産生リンパ球との融合により、無限の
細胞分裂及び無限の増殖を行う能力と均一な抗体を産生
する能力とを共に有するハイブリドーマ細胞が生ずる。
従って、特定の抗原に対する生物の免疫応答を独立さ
せ、そしてハイブリドーマ細胞の連続的培養によりモノ
クローナル抗体を製造することが可能である。

【０００９】ハイブリドーマ技法により特定の抗体を製
造するための多くの例が今まで知られており、そして一
般的手段が原理的に記載されているが、新しい例に特有
の問題点は、特定の場合に技法を適合させること要求す
ることである。このような適合なくしては、所望のハイ
ブリドーマを生成せしめること、該ハイブリドーマが所
望の抗体産生しそして遺伝的に安定であること、及びこ
のようにして製造された抗体が所望の特異性を有するこ
とが保証されない。成功の程度は、原理的には、供与体
の免疫に使用する抗原の種類及び純度、細胞融合の技
法、適当なハイブリドーマセルラインを選択するための
手段、並びに抗体の単離及び精製のための方式及び態様
により左右される。

【００１０】均一なモノクローナル抗体の大量入手を前
提とする抗体の重要な用途、例えば今ハイブリドーマ技
法により可能となった用途はイムノアフィニティークロ
マトグラフィーである。この場合、所望の特異性を有す
る抗体を固体担体上に適用する。多数の異る化合物を含
有する溶液から、抗体によって認識されそしてそれに結
合される構造因子（決定基、エピトープ）を有する化合
物が抗体に結合され、そして従って固体担体に結合され
る。不所望の化合物を含有する溶液を除去した後、抗体
への結合を破壊する試薬により洗浄することによって担
体から所望の化合物を溶出し、そして常法により単離す
る。

【００１１】この発明の課題はヒト−ＭＩＦ及びその個
々の蛋白質を得ることであり、この課題はこの発明のモ
ノクローナル抗体によって解決される。

【００１２】

【本発明の記載】この発明は精製されたヒト−マクロフ
ァージ遊走阻止因子（ヒト−ＭＩＦ）蛋白質に関する。
精製されたヒト−ＭＩＦは、ヒト−ＭＩＦに対する抗体
に認識されそして結合されるエピトープを有するヒト由
来の蛋白質のみを含有する。精製されたヒト−ＭＩＦは
約８、約１４、約２８、及び約４５kg／Mol の分子量を
有する少なくとも４種類の個々の蛋白質、及び場合によ
ってはさらに約４５kg／Mol より大きい分子量を有する
オリゴマー蛋白質凝集体又は他の個々の蛋白質を含んで
成る。精製されたヒト−ＭＩＦは、マクロファージの遊
走を測定する標準的試験方法において活性である。

【００１３】精製されたヒト−ＭＩＦの個々の蛋白質
は、蛋白質分析の常用法、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動）又はゲル濾過ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィ
ー）において均一な、マクロファージの遊走を測定する
標準的試験法において活性な、そして精製されたヒト−
ＭＩＦの構成要素である蛋白質である。個々の蛋白質の
分離及び単離の過程で洗剤又は他の変性剤を添加した場
合、一次構造は変化しないで維持されるが蛋白質の天然
の三次構造が変化し、そしてそれと共にマクロファージ
の遊走を阻害する性質が変化する。

【００１４】このような変性された形の個々の蛋白質も
またこの発明の対象である。精製されたヒト−ＭＩＦの
個々の蛋白質の例として、それぞれ約８kg／Mol 及び約
１４kg／Mol の分子量並びにＮ−端アミノ酸配列：Ｘ₁
−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（５）−Ｇｌｕ−Ｌ
ｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（１０）−Ｓｅｒ−Ｉｌ
ｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ（１５）−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ
−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（ここで、アミノ酸Ｘ₁ の意味を特定
されない）を有する２種類の蛋白質さらには約２８kg／
Mol 、及び約４５kg／Mol の分子量を有する蛋白質を挙
げることができる。

【００１５】この発明は特に、およその分子量８kg／Mo
l を有しそしてＮ−端アミノ酸配列：Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−
Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（５）−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｌ
ａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（１０）−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ
−Ａｓｐ−Ｖａｌ（１５）−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−
Ｔｙｒ−Ｓｅｒ（２０）−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｎ（２５）−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａ
ｌ−Ｔｙｒ（３０）−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ
−Ｌｙｓ（３５）−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−
Ｔｈｒ（４０）−Ｇｌｕ−Ｘ₄₂−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｙ
ｒ（４５）−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ
（５０）−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ
（５５）−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ
（６０）−Ａｓｎ−Ｘ₆₂−Ｘ₆₃−Ｘ₆₄−Ａｌａ（６５）
−Ｖａｌ（ここで、アミノ酸Ｘ₄₂，Ｘ ₆₂，Ｘ₆₃、及びＸ
₆₄は特定されず、しかしＸ₄₂はＳｅｒ又はＣｙｓのみを
意味することができる）を有する精製されたヒト−ＭＩ
Ｆの個々の蛋白質に関する。

【００１６】この発明はさらに、精製されたヒト−ＭＩ
Ｆ及びその個々の蛋白質の製造方法に関し、この方法
は、ヒト−ＭＩＦ含有溶液、例えばヒト細胞の細胞抽出
液、細胞培養上清液又は細胞培養濾液を、所望によりそ
れ自体公知の精製段階の後で、ａ）ヒト−ＭＩＦに特異
的なモノクローナル抗体を有する担体と接触せしめ、非
結合蛋白質及び他の外来性物質を除去し、抗体に結合し
たヒト−ＭＩＦを選択的に切り離し、そして単離し、
ｂ）そして所望により、精製されたヒト−ＭＩＦをその
個々の蛋白質に分離することを特徴とする。

【００１７】ＭＩＦを含有する液、例えばヒト細胞の細
胞抽出液、細胞培養上清液又は細胞培養濾液はそれ自体
公知の方法により調製される。適当なヒト細胞は例えば
単核細胞であり、この細胞は、クエン酸塩又はヘパリン
を添加された静脈血を遠心する際に堆積する白血球の層
である「バフィーコート」から、ロイカフェレシス（ｌ
ｅｕｃａｐｈｅｒｅｓｉｓ）及び／又は密度勾配中での
遠心分離によって得ることができる。

【００１８】単核細胞は適当な助剤、例えばコンカナバ
リンＡ又はフィトヘマグルチニンによりＭＩＦ及び他の
リンフォカインを産生するように刺激されそして常法に
従って約１２〜約７２時間、好ましくは１８〜３６時
間、適当な培地、例えばＲＰＭＩ １６４０培地（これ
には所望によりウシ胎児血清、緩衝剤及び／又は抗生物
質、例えばペニシリンもしくはストレプトマイシンが添
加される）中で、約３７℃において、そして所望により
ＣＯ₂ ガス通気のもとで培養される。ヒト−ＭＩＦを含
有する溶液は、細胞又は細胞培養上清液から、例えば抽
出、濾過及び／又は遠心分離によって得られ、そして所
望により抗生物質及び／又はプロテアーゼ阻害剤の添加
により安定化される。

【００１９】このようなヒト−ＭＩＦ溶液を、段階ａ）
において、担体に結合した抗体と直接接触せしめること
ができ、しかし好ましくは約６kg／Mol 又はこれより小
分子量の分離限界を有する膜上での限外濾過によりあら
かじめ前精製し、濃縮し、場合によっては透析し、そし
て所望によりクロマトグラフィー、例えばＤＥＡＥ−セ
ルロース又はセファデックス（商標）によりさらに精製
する。

【００２０】段階ａ）においては、ヒト−ＭＩＦが溶液
に含有されている他の蛋白質及び外来性物質から分離さ
れ、この場合、ヒト−ＭＩＦに対して特異的な抗体とヒ
ト−ＭＩＦ上の認識される抗原決定基との間の強制的な
相互作用に基く分離作用が用いられる。このために、Ｍ
ＩＦ含有液を、それ自体公知のイムノアフィニティーク
ロマトグラフィー法に従って、ヒト−ＭＩＦに特異的な
モノクローナル抗体が結合している担体と接触せしめ
る。

【００２１】無機物又は有機物を基礎とする適当な担
体、例えば珪酸塩、架橋アガロース、デキストラン、又
は適当に官能化された形のポリアクリルアミドに、それ
自体公知の方法により、後に詳細に記載するこの発明の
モノクローナル抗体又はその誘導体を付加する。例え
ば、活性化されたエステル官能基、例えばＮ−ヒドキシ
サクシンイミドエステル基を含有する担体を水性緩衝液
に懸濁し、モノクローナル抗体の溶液と混合し、次に未
結合モノクローナル抗体を洗浄除去し、そして担体のふ
さがれていない反応性部位を例えば第一級アミン、例え
ばエタノールアミンによりブロックする。

【００２２】担体を、適当な水性溶剤、例えば塩溶液、
例えばＮａＣｌ溶液、又は緩衝液、例えば燐酸緩衝化Ｎ
ａＣｌ溶液、ＮａＨＣＯ₃ 溶液又は３−（Ｎ−モルホリ
ノ）プロパンスルホン酸溶液に懸濁し、そしてヒト−Ｍ
ＩＦを含有する溶液と接触せしめる。例えば、クロマト
グラフカラムに充填し、そしてヒト−ＭＩＦ含有液を導
入し、そして所望により加圧を伴って、担体中にポンプ
通過せしめる。

【００２３】未結合蛋白質及び他の汚染物を、水性液、
例えば約５〜約９のpHを有する緩衝液及び／又は塩溶
液、例えばＮａＣｌ溶液で洗浄除去する。担体上の抗体
に結合したヒト−ＭＩＦを、適当な水性液、例えば約２
〜約５のpH範囲の緩衝液、例えばグリシン緩衝液、又は
種々の混合物もしくは塩溶液、例えば濃ＮＨ₄ ＳＣＮ溶
液のpHグラジエントにより溶出する。得られた精製ヒト
−ＭＩＦ含有液を場合によっては中和し、そしてそれ自
体公知の方法により、例えばセファデックス（商標）上
でのクロマトグラフィー、電気透析、電気泳動濃縮及び
／又は真空濃縮により、精製されたヒト−ＭＩＦを単離
する。

【００２４】所望により段階ｂ）において、精製された
ヒト−ＭＩＦをその個々の蛋白質に分離し、この場合例
えばそれ自体公知の方法に従って、蛋白質混合物をクロ
マトグラフィーにより異なる分子量を有する画分に分離
する。例えば精製されたヒト−ＭＩＦを調製用ドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、均一な分子量画分をゲ
ルから溶出し、そして例えばセファデックス（商標）上
でのクロマトグラフィー、電気泳動濃縮及び／又は真空
濃縮により純粋な形で単離する。精製されたヒト−ＭＩ
Ｆはまた、調製用ゲル濾過ＨＰＬＣにより均一な分子量
画分に分離し、そしてこれから個々の蛋白質を単離する
こともできる。

【００２５】この発明はさらに、ヒト−マクロファージ
遊走阻止因子（ヒト−ＭＩＦ）に対する新規な抗体、及
びその誘導体に関する。このモノクローナル抗体はヒト
−ＭＩＦを結合し、そして／又はその生物学的活性を阻
害する。ヒト−ＭＩＦへのモノクローナル抗体の結合は
イムノアッセイにより便利に決定することができ、例え
ば固体担体上にヒト−ＭＩＦを適用し、この被覆された
担体をモノクローナル抗体溶液と共にインキュベート
し、そしてこれによって結合したモノクローナル抗体
を、ラジオアイソトープ又は酵素で標識した第２の抗体
により表示する方法により決定することができる。

【００２６】すなわち、ヒト−ＭＩＦに結合したモノク
ローナル抗体を、放射能又は酵素−基質反応の測定によ
り決定する。例えば、モノクローナル抗体を担体上に固
定し、ヒト−ＭＩＦ含有溶液と共にインキュベートし、
そして次にこの溶液の残留ヒト−ＭＩＦ活性を測定する
方法もまた適当である。溶液のヒト−ＭＩＦ活性は、そ
れ自体公知の方法により、適当に活性化されたヒト−マ
クロファージの遊走に対する阻害作用を測定することに
より、測定することができる。例えば、タイタープレー
ト上のアガロース滴中に配置されたプローブ溶液中マク
ロファージの試験溶液中での遊走距離を測定する試験方
法を選択することができる。

【００２７】マウス／マウス−、ラット／ラット−、又
はラット／マウス−ハイブリドーマ細胞により産生され
る、ヒト−ＭＩＦに対するモノクローナル抗体が好まし
い。例えば、この発明のモノクローナル抗体として、ハ
イブリドーマセルライン１Ｃ５により産生される１Ｃ５
と称するサブクラスＩｇＧ₁ κのモノクローナル抗体、
及びハイブリドーマセルライン７Ｄ１０により産生され
る７Ｄ１０と称するサブクラスＩｇＧ₂ ａのモノクロー
ナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体１Ｃ５及び７
Ｄ１０はヒト−ＭＩＦの生物学的活性を阻害することな
くヒト−ＭＩＦに結合する。

【００２８】モノクローナル抗体のこの発明の誘導体
は、例えば、ヒト−ＭＩＦの抗原決定基に対するその特
異性を保持している断片、例えばＦａｂ，Ｆａｂ′もし
くはＦ（ａｂ′）₂ 断片；例えば放射性ヨウ素
（ ¹²⁵Ｉ， ¹³¹Ｉ）、炭素（¹⁴Ｃ）、硫黄（³⁵Ｓ）、ト
リチウム（ ³Ｈ）もしくはこれらに類似するものにより
標識された放射性標識モノクローナル抗体；ビオチンも
しくはアビジンとのモノクローナル抗体接合体；又は酵
素、例えばホースラディッシュ−パ−オキシダーゼ、ア
ルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、
グリコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、カーボニ
ックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リ
ゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼもしくはグリコー
ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼとのモノクロー
ナル抗体接合体である。好ましい誘導体は ^{1 25}Ｉで標識
されたモノクローナル抗体、及びビオチンとの抗体接合
体である。

【００２９】この発明はさらに、ヒト−ＭＩＦに対する
モノクローナル抗体及びその誘導体のそれ自体公知の製
造方法に関し、この方法は、前記の抗体を産生するハイ
ブリドーマ細胞を、 ａ）イン−ビトロ培養し、そして培養上清液からモノク
ローナル抗体を単離し、又は ｂ）適当な哺乳動物中でイン−ビボ増幅し、そして該哺
乳動物の体液からモノクローナル抗体を単離し、 ｃ）そして所望により、得られたモノクローナル抗体を
その誘導体に転換する、ことを特徴とする。

【００３０】変法ａ）のイン−ビトロ培養のための適当
な培地は常用の標準培地、例えば、ウシ胎児血清が補充
されている場合があるドゥルベコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）
の変形イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地又はＲＰＭＩ １６
４０培地である。モノクローナル抗体の単離のために、
培養上清液中の蛋白質を硫酸アンモニウム又はこれに類
似するものによって沈澱せしめ、そして常用のクロマト
グラフ法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ＤＥＡＥ−セルロース クロマトグラフィー、又
は免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製す
る。

【００３１】変法ｂ）に従うハイブリドーマ細胞のイン
−ビボ増幅により目的とする抗体を多量に得ることがで
きる。この目的のために、細胞クローンを哺乳動物、好
ましくは同系（Ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）哺乳動物に注射
し、そして１〜３週間後、モノクローナル抗体を該哺乳
動物の体液から単離する。例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス
由来のハイブリドーマ細胞を、場合によってはプリスタ
ンのごとき炭化水素により前処理されたＢａｌｂ／ｃマ
ウスに腹腔内注射し、そして８〜１０日後に該動物から
腹水を採取する。

【００３２】目的とするモノクローナル抗体を該体液か
ら、それ自体公知の方法により、例えば塩化アンモニウ
ム又はこれに類似するものによる沈澱、及びクロマトグ
ラフ精製、例えばＤＥＡＥ−セルロース、ヒドロキシル
アパタイト（ＨＰＨＴ、高速ヒドロキシルアパタイトカ
ラムクロマトグラフィー）、イオン交換樹脂によるクロ
マトグラフィー、ゲル濾過又は免疫アフィニティークロ
マトグラフィーにより単離する。

【００３３】ヒト−ＭＩＦの抗原決定基に対する特異性
が保持されているこの発明のモノクローナル抗体断片、
例えばＦａｂ，Ｆａｂ′又はＦ（ａｂ′）₂ 断片は、そ
れ自体公知の方法により製造することができ、例えば変
法ａ）又はｂ）により得られたモノクローナル抗体をペ
プシンもしくはパパインのごとき酵素により処理し、そ
して／又は化学還元によりジスルフィド結合を切断する
ことにより製造することができる。

【００３４】ヨウ素（ ¹²⁵Ｉ， ¹³¹Ｉ）により放射性標
識されたモノクローナル抗体は、この発明のモノクロー
ナル抗体から、それ自体公知の方法により、例えば放射
性ヨウ化ナトリウム又はヨウ化カリウムと化学的酸化
剤、例えば次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴもしく
はこれらに類似するもの、又は酵素的酸化剤、例えばラ
クトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼとグル
コースとを用いて得られる。

【００３５】この発明の放射性標識されたモノクローナ
ル抗体はまた、それ自体公知の方法により、放射性標識
された炭素（¹⁴Ｃ）、トリチウム（ ³Ｈ）、硫黄
（³⁵Ｓ）又はこれらに類似するものを含有する栄養素、
例えばＬ−（¹⁴Ｃ）−ロイシン、Ｌ−（ ³Ｈ）−ロイシ
ン又はＬ−（³⁵Ｓ）−メチオニンをイン−ビトロ培養の
ための培地に添加し、そして変法ａ）に従ってモノクロ
ーナル抗体を得ることにより製造することができる。

【００３６】酵素標識されたこの発明のモノクローナル
抗体はそれ自体公知の方法により得られ、この方法にお
いては、変法ａ）又はｂ）によって製造されたモノクロ
ーナル抗体と所望の酵素とを、カップリング剤、例えば
グルタルアルデヒド、過ヨウ素酸塩、Ｎ，Ｎ′−ｏ−フ
ェニレンジマレイミド、Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイ
ルオキシ）−サクシンイミド、Ｎ−（３−（２′−ピリ
ジルジチオ）−プロピオンオキシ）−サクシンイミド又
はこれらに類似するものと共に反応せしめる。

【００３７】同様に、この発明のモノクローナル抗体と
アビジンとの接合体が得られる。ビオチンとの接合体が
それ自体公知の方法により得られ、この方法においては
この発明のモノクローナル抗体を例えばビオチン−Ｎ−
ヒドロキシサクシンイミジルエステルと反応せしめる。
この発明はさらに、ヒト−マクロファージ遊走阻止因子
（ヒト−ＭＩＦ）に対するモノクローナル抗体を産生す
ることを特徴とするハイブリドーマセルラインに関す
る。

【００３８】マウス−骨髄腫セルラインとマウス−又は
ラット−リンパ球との雑種である、ヒト−ＭＩＦに対し
て向けられたモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマセルラインが好ましい。パスツール研究所（パリ）
の“Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅｄｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ
ｅｓ”にＮｏ Ｉ−３１６として１９８４年７月１３日
に寄託され、そして１Ｃ５と称するハイブリドーマセル
ラインが非常に好ましい。セルライン１Ｃ５は、マウス
骨髄腫セルラインＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３とＢａ
ｌｂ／ｃマウスの脾臓のＬ−リンパ球との雑種である。
同様に、パスツール研究所（パリ）の“Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ
ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ”にＮｏ Ｉ
−４１８として１９８５年１月２９日に寄託され、そし
て７Ｄ１０と称するハイブリドーマセルラインが好まし
い。

【００３９】セルライン７Ｄ１０は、マウス骨髄腫セル
ラインＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３とＤＡ−ラットの
脾臓のＢ−リンパ球との雑種である。これらのセルライ
ンはいずれも遺伝的に安定であり、不変の特異性を有す
るモノクローナル抗体を分泌し、そして凍結された培養
物を解凍しそして再クローン化することによって活性化
され得る。

【００４０】この発明はさらに、ヒト−ＭＩＦに対する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの製造の
ためのそれ自体公知の方法に関し、この方法は、適当な
哺乳動物をＭＩＦ又はＭＩＦ接合体で免疫し、該哺乳動
物から取り出された抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合せ
しめ、得られたハイブリド細胞をクローン化し、そして
目的とするモノクローナル抗体を産生する細胞クローン
を選択することを特徴とする。

【００４１】抗原としてＭＩＦ含有蛋白質画分又はＭＩ
Ｆ接合体のいずれをも使用することができ、例えばヒト
の単核細胞からのもの、例えば上記のようにして得られ
たＭＩＦ含有蛋白質画分、又はこの蛋白質画分と適当な
免疫原担体、例えば蛋白質、ポリサッカライド、ラテッ
クス粒子もしくは細胞との接合体を用いることができ
る。動物−ＭＩＦ及びヒト−ＭＩＦが同一のエピトープ
を示すことが、当該動物、例えばネズミのＭＩＦを含有
する蛋白質画分を使用するための前提である。

【００４２】接合体はそれ自体公知の方法により、例え
ばカルボジイミド、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒ
ド、Ｎ，Ｎ′−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−（ｍ
−マレイミドベンゾイルオキシ）−サクシンイミド、Ｎ
−（３−（２′−ピリジルジチオ）−プロピオンオキ
シ）−サクシンイミド又はこれらに類似するものを用い
るカップリングにより製造することができる。免疫する
ために、グルタルアルデヒドであらかじめ処理された羊
赤血球とヒト又はマウス細胞からのＭＩＦ含有蛋白質画
分との接合体が好ましい。

【００４３】ヒト−ＭＩＦにより免疫するための好まし
い哺乳動物はマウス又はラット、特にＢａｌｂ／ｃマウ
スである。マウス−ＭＩＦにより免疫するためにはラッ
ト、例えばＤＡ−ラットを用いるのが好ましい。免疫操
作はそれ自体公知の方法により行い、例えば抗原性ヒト
−ＭＩＦ接合体を、所望によりリンパ球産制刺激助剤、
例えば完全フロインドアジュバント又は不完全フロイン
ドアジュバントと共に、１〜１０日の間隔で、３〜８回
非経口的に、例えば腹腔内又は皮下に注射することによ
り行う。さらに、動物を２〜４回の注射により前免疫
し、そして８〜１２ヶ月後にさらに注射を行うこともで
きる。

【００４４】免疫された動物の抗体産生細胞、好ましく
は脾臓細胞を、最後の免疫の２〜６日後に動物から取り
出し、そして融合促進剤の存在下で適当なセルラインの
骨髄腫細胞と融合せしめる。適合な融合のパートナーと
して種々の異る骨髄腫セルライン及びそれから誘導され
たセルラインが知られている。酵素ヒポキサンチン−グ
アニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲ
Ｔ）又は酵素チミジンキナーゼ（ＴＫ）が欠落してお
り、そしてそれ故にヒポキサンチン、アミノプテリン及
びチミジンを含有する選択培地（ＨＡＴ培地）、又はヒ
ポキサンチン及びアザセリンを含有する選択培地中で生
存することができない骨髄腫細胞が好ましい。

【００４５】ＨＡＴ培地又はヒポキサンチン／アザセリ
ン培地中に生存せず、そして免疫グロブリン又はその部
分を分泌しない骨髄腫細胞及びそれから調製されたセル
ライン、例えばセルラインＸ６３−Ａｇ８．６５３、及
びＳｐ２／０−Ａｇ１４が特に好ましい。Ｂａｌｂ／ｃ
マウス由来のセルラインＸ６３−Ａｇ８．６５３はマウ
ス、例えばＢａｌｂ／ｃマウスのリンパ球との融合に適
当であるのみならず、ラット、例えばＤＡラットのリン
パ球との融合のためにも適当である。

【００４６】融合促進剤として、場合によってはＵＶ不
活性化された形であるセンダイウイルス又は他のパラミ
キソウイルス、カルシウムイオン、界面活性脂質、例え
ばリソレシチン、又はポリエチレングリコールを挙げる
ことができる。骨髄腫細胞と、２〜１０倍過剰量の免疫
された動物からの脾臓細胞とを、約１０００〜約６００
０の分子量を有するポリエチレングリコールの約３０〜
約５０％の溶液中で融合せしめるのが好ましい。

【００４７】融合の後、細胞を分離し、そして選択用の
ＨＡＴ培地又はヒポキサンチン／アザセリン培地中で培
養する。この際、ハイブリドーマ細胞は骨髄腫細胞由来
のイン−ビトロ生存能力、及び免疫された動物の抗体産
生細胞由来のＨＧＰＲＴ遺伝子又はＴＫ遺伝子の欠落そ
してそれによる選択培地中での生存能力を兼備するた
め、ハイブリドーマ細胞のみが生存する。

【００４８】ハイブリドーマ細胞増殖のための適当な培
地は常用の標準的培地、例えばドゥルベコの変形イーグ
ル培地又はＲＰＭＩ １６４０培地である。好ましくは
細胞増殖の最初にいわゆるフィーダー細胞、例えば正常
な腹腔性のマウス浸出細胞、脾細胞、骨髄マクロファー
ジ又はこれらに類するものを添加する。ハイブリドーマ
細胞の上に通常の骨髄腫細胞が増殖するのを防止するた
めに、規則的な間隔で上記の培地に選択用のＨＡＴ培地
又はヒポキサンチン／アザセリン培地を補充する。

【００４９】次に、ハイブリドーマ細胞の細胞培養上清
液を、それが目的モノクローナル抗体を含有するか否か
について試験する。このために好ましくは、すでに記載
されているように、ラジオイムノアッセイ、エンザイム
イムノアッセイ、及び／又はＭＩＦ活性の決定を用い
る。このようにして選択した細胞クローンを常用の標準
的培地中で培養し、そして所望によりそれ自体公知の方
法で凍結し、そして／又は限界稀釈法によりもしくは寒
天上での分散により再クローン化する。

【００５０】この発明はさらに、特に生物学的液体中又
は細胞表面上のヒト−マクロファージ遊走阻止因子（ヒ
ト−ＭＩＦ）の定量的測定のためにヒト−ＭＩＦに対す
るモノクローナル抗体を使用することに関する。例え
ば、この発明のモノクローナル抗体は、抗原（ヒト−Ｍ
ＩＦ）とモノクローナル抗体との間の結合相互作用を用
いるそれ自体公知のイムノアッセイ法のいずれかにおい
て使用することができる。このような測定方法の例とし
て、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイム
ノアッセイ、免疫螢光試験、ラテックス凝集試験、又は
血球凝集試験を挙げることができる。

【００５１】この発明の抗体は、それ自体として、又は
放射性標識誘導体として、場合によっては他の標識抗体
及び／又は蛋白質と組合わせて、ラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）において使用することができる。ＲＩＡの公
知の変法のいずれか、例えば均一相中でのＲＩＡ、固相
もしくは不均一相ＲＩＡ、又はシングルＲＩＡもしくは
ダブル（サンドイッチ）ＲＩＡを用いてヒト−ＭＩＦの
直接又は間接（競争的）測定を行うことができる。

【００５２】好ましいＲＩＡにおいては、適当な担体、
例えばタイタープレートのプラスチック表面、又は例え
ばポリスチレン、ポリプロピレンもしくはポリ塩化ビニ
ル製の試験管、ガラス製もしくはプラスチック製のビー
ズ、濾紙、デキストラン−、セルロースアセテート、も
しくはニトロセルロース−シート、又はこれらに類似す
るものに、ヒト−ＭＩＦを含有する試験液又は標準液
を、単純吸着により又は場合によっては担体を例えばグ
ルタルアルデヒドもしくはブロムシアンで活性化した後
に被覆し、そしてこの発明のモノクローナル抗体とイン
キュベートしそして次に第２の抗体溶液とインキュベー
トする。

【００５３】この場合、第２の抗体、例えばラビット抗
−マウス免疫グロブリンがこの発明のモノクローナル抗
体を認識し、そしてこれと結合する。結合した第２抗体
の量を、第２抗体が放射性標識されている場合には直接
に、又はこの第２抗体に対して高い親和性を有する放射
性標識された蛋白質、例えばスタフィロコッカス・アウ
レウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕ
ｓ）由来のプロテインＡとの反応の後に、決定する。

【００５４】この発明のモノクローナル抗体はそれ自体
として、又は酵素標識された誘導体としてエンザイムイ
ムノアッセイにおいて使用される。このようなイムノア
ッセイ法は、例えば、この発明のモノクローナル抗体の
エピトープを認識しそして結合するそれ自体公知の酵素
標識された抗体、又は酵素標識されたこの発明のモノク
ローナル抗体誘導体を使用する試験方法である。

【００５５】酵素標識された抗体のほかに、抗体−ビオ
チン接合体及びアビジン−酵素接合体も使用される。エ
ンザイムイムノアッセイにおいて使用する酵素の例とし
てホースラディッシュ−パーオキシダーゼ、アルカリ性
ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、カーボニックアン
ヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチー
ム、マレートデヒドロゲナーゼ、又はグルコース−６−
ホスフェートデヒドロゲナーゼを挙げることができる。

【００５６】ＥＬＩＳＡ法（エンザイム・リンクド・イ
ムノソルベント・アッセイ）が好ましく、この方法にお
いては、担体（これは例えばシングルＲＩＡ試験につい
て前記したものであり、そして場合によっては赤血球が
付加されている）に単純吸着により、又は場合によって
は担体もしくは担体に結合した赤血球をグルタルアルデ
ヒドにより活性化した後に、ヒト−ＭＩＦ含有試験液又
は標準液を被覆し、あるいはヒト−ＭＩＦを測定すべき
細胞を付加し、そして次にこの担体をこの発明のモノク
ローナル抗体と共にインキュベートしそして次にこの発
明のモノクローナル抗体を認識しそして結合する酵素標
識された第２の担体の溶液と共にインキュベートする。
この場合、結合した第２抗体、例えばパーオキシダーゼ
で標識されたラビット抗−マウス免疫グロブリンの量
を、酵素基質を用いる発色により可視化し、そして決定
する。

【００５７】次のＥＬＩＳＡ法が特に好ましい。すなわ
ち、担体、例えばシングルＲＩＡ法について前記した担
体に、単純吸着により、又は場合によっては担体をグル
タルアルデヒドもしくはブロムシアンにより活性化した
後、この発明のモノクローナル抗体の溶液を被覆し、次
にこの担体をヒト−ＭＩＦ含有試験液又は標識液とイン
キュベートし、そして次にヒト−ＭＩＦの他のエピトー
プを認識する場合がある酵素で標識されたこの発明の担
体の溶液と共にインキュベートするか、あるいは好まし
くはビオチンと接合したこの発明の抗体の溶液とインキ
ュベートしそして次にアビジン−酵素接合体と共にイン
キュベートする。この際、結合した酵素標識又はビオチ
ン標識された担体が、酵素基質を用いる発色により可視
化されそして決定される。

【００５８】この発明のエンザイムイムノアッセイにお
ける好ましい酵素基質５−アミノサリチル酸、ｏ−フェ
ニレンジアミン、３，３′−ジメトキシベンジジン、
３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン、２，
２′−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチアゾリン−
６−スルホン酸）又はこれらに類似するもの及び過酸化
水素により発色することができるホースラディッシュ−
パーオキシダーゼ、並びに酵素基質ｐ−ニトロフェニル
ホスフェートからｐ−ニトロフェノールを遊離せしめる
アルカリ性ホスファターゼである。

【００５９】ヒト−ＭＩＦの定性的又は定量的測定のた
めの、ヒト−ＭＩＦに対するモノクローナル抗体及びそ
の誘導体のこの発明の使用には、前記以外のそれ自体公
知のイムノアッセイ、例えば螢光物質と抗体接合体又は
抗原接合体を用いる免疫螢光法、抗体又は抗原で被覆さ
れたラテックス粒子を用いるラテックス凝集法、抗体又
は抗原で被覆された赤血球を用いる血球凝集法、等が含
まれる。

【００６０】前記のイムノアッセイは、生物学的溶液、
特にヒトの血液中に存在するか、又は固定された形で細
胞表面上に存在するヒト−ＭＩＦの量の決定に使用する
ことができ、そしてこれによって免疫調節障害を有する
患者の診断が容易になる。例えば、血液中にヒト−ＭＩ
Ｆが存在せず又はその量が平均以下である場合、低い感
染耐性について、原因となる免疫調節障害を診断するこ
とができる。さらに、ＭＩＦは特定の組織タイプ及び特
定の病理状態においてのみ生ずる（次の表）から、病理
組織中、例えば黒色腫、肉芽腫及び肥厚中のヒト−ＭＩ
Ｆの測定が簡単な診断を可能にする。

【００６１】

【表１】

【００６２】この発明はさらに、ヒト−マクロファージ
遊走阻止因子（ヒト−ＭＩＦ）の定性的及び定量的測定
のための試験キットに関し、このキットは、ヒト−ＭＩ
Ｆに対するモノクローナル抗体及び／又はその誘導体、
並びに場合によっては付属物を含んで成ることを特徴と
する。ラジオイムノアッセイのためのこの発明の試験キ
ットは、例えば適当な担体、この発明の抗体又は放射性
標識されたこの発明の抗体誘導体の場合によっては凍結
された又は濃縮された溶液、放射性標識されている場合
がある第２抗体及び／又は場合によっては、スタフィロ
コッカス・アウレウス由来の放射性標識されたプロテイ
ンＡ、精製されたヒト−ＭＩＦ又はその個々の蛋白質の
標準溶液、緩衝液、グルタルアルデヒドを含有する固定
液、非特異的結合及び凝集体形成を防止するための洗
剤、ピペット、反応器、換算曲線等を含む。

【００６３】エンザイムイムノアッセイのためのこの発
明の試験キットは例えば、適当な担体、この発明のモノ
クローナル抗体の場合によっては凍結された又は濃縮さ
れた溶液、酵素標準又はビオチン標識されているこの発
明の抗体誘導体、この発明のモノクローナル抗体を認識
しそして結合する酵素標識された抗体の場合によっては
凍結された又は濃縮された溶液、アビジン−酵素接合体
の場合によっては凍結された又は濃縮された溶液、固体
の形又は溶解した形の酵素基質、精製されたヒト−ＭＩ
Ｆ又はその個々の蛋白質の標準溶液、緩衝液、グルタル
アルデヒドを含有する固定液、洗剤、ピペット、反応
器、換算曲線等を含む。

【００６４】この発明はさらに、ヒト−ＭＩＦを精製す
るための、ヒト−ＭＩＦに対するモノクローナル抗体及
びその誘導体の使用に関する。例えば、モノクローナル
抗体とヒト−ＭＩＦの抗原決定基との間の結合相互作用
に基く分離作用を利用するそれ自体公知の技法を用いて
ヒト−ＭＩＦを分離することができる。好ましい分離方
法は、前に記載した免疫アフィニティークロマトグラフ
ィーである。

【００６５】この発明はさらに、医療的に有効な量の精
製されたヒト−ＭＩＦ、その個々の蛋白質、ヒト−ＭＩ
Ｆに対するモノクローナル抗体又はこのようなモノクロ
ーナル抗体の誘導体、及び有意量の医薬担体を含んで成
る医薬に関する。モノクローナル抗体の適当な誘導体
は、ヒト−ＭＩＦの抗原決定基に対するその特異性を保
持している断片、例えばＦａｂ，Ｆａｂ′又はＦ（ａ
ｂ′）₂ 断片である。

【００６６】この発明の医薬は、経腸投与により、例え
ば鼻内投与、直腸投与又は経口投与により、そして好ま
しくは非経腸投与により、例えば筋肉内投与、皮下投
与、又は静脈内投与により、温血動物、例えばヒトに投
与される。意図される投与方法に依存して、この医薬は
単位投与形、例えばアンプル、バイアル、坐薬、糖衣丸
剤、錠剤、カプセル、又は流体もしくは固体の形の鼻内
スプレーとして存在することができる。

【００６７】医療的に有効なこの化合物の投与すべき量
は、温血動物、例えばヒトの状態、例えば体重、疾患の
種類及び重症度、並びに一般的状態、さらには投与方法
に依存し、そして治療に当る医師による評価に従う。ヒ
ト−ＭＩＦ及びその活性な個々の蛋白質の有効量は０．
００１〜１μｇ／kg体重／日の範囲であり、ヒト−ＭＩ
Ｆに対するモノクローナル抗体及びその誘導体は０．０
０１〜１mg／kg体重／日の範囲である。

【００６８】この発明の医薬は常用の無機又は有機の固
体又は液体の医薬として許容される担体を、場合によっ
ては他の医薬として活性な化合物及び／又は助剤と共に
含有する。活性物質の溶液又は懸濁液、特に等張溶液又
は懸濁液、さらには使用直前に水に溶解する凍結乾燥品
が好ましい。医薬は殺菌することができ、そして／又は
防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、溶解促進剤、増粘
剤、浸透圧調節塩及び／又は緩衝剤、さらには他の蛋白
質、例えばヒト−血清アルブミン又はヒト−血漿標品を
含有することができる。

【００６９】医薬として有効な量のヒト−ＭＩＦ又はそ
の個々の蛋白質を含有する水性分散体中リポゾームの形
の医薬が好ましい。特に、可能な限り均一な大きさの集
団からなり、約２．０×１０^-8〜５．０×１０^-6ｍの直
径を有し、リピド成分、例えば両親媒性リピド、例えば
ホスホリピド、例えばレシチン、ケフアリン又はホスフ
アチジル酸、及び場合によっては中性リピド、例えばコ
レステロールから成る１又は複数の２重層から構成され
ており、そしてこの発明の精製されたヒト−ＭＩＦ又は
その個々の蛋白質を含有する水性内部空間を包囲してい
るリポゾームが好ましい。

【００７０】次に例によりこの発明をさらに詳細に説明
するが、これによってこの発明の範囲を限定するもので
はない。例において使用する略号は次の意味を有する。 ＥＬＩＳＡ エンザイムアッセイ（エンザイムリンクド
イムノソルベントアッセイ） ＨＡＴ ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジ
ン ＨＰＬＣ 高圧液体クロマトグラフィー ＨＴ ヒポキサンチン／チミジン ＭＩＦ マクロファージ遊走阻止因子 ＰＢＳ 燐酸緩衝化生理的食塩水 ＲＩＡ ラジオイムノアッセイ ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動 ＳＲＢＣ 羊赤血球 トリス（Ｔｒｉｓ） トリス−（ヒドロキシメチル）−
アミノメタン ｒｐｍ 回転数／分

【００７１】例１ ヒト−ＭＩＦを含有する蛋白質画分
の取得 単核細胞を、“バフィーコード”、すなわちクエン酸塩
又はヘパリンを添加した静脈血の遠心分離により堆積す
る白血球層から得、そしてロイカフェレシス（Ｌｅｕｃ
ａｐｈｅｒｅｓｉｓ）及びＩＢＭ血球分離機（ＩＢＭ
２９９７）中でのフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（商標）
−グラジエントでの連続遠心分離から成る２段階法によ
り精製する〔Ｕ．Ｆｅｉｇｅ及びＣ．Ｓｏｒｇ、ジャー
ナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ）６６，１６１（１９８
４）〕。

【００７２】単核細胞をスピンナー（Ｓｐｉｎｎｅｒ）
培地（セロメド）中で洗浄し、そして培養器底cm² 当り
０．１７mlのＲＰＭＩ １６４０培地中５×１０⁶ 細胞
の濃度において２時間、１６⁶ 個の細胞当り０．６７μ
ｇのコンカナバリンＡにより刺激する。ＲＭＭＩ １６
４０培地の更新及びそれに続く３７℃にて２０時間の５
％ ＣＯ₃ を通気しながらのインキュベーションを行い
リンフォカインを含有する培養上清液を得る。これを、
４℃、１７，０００rpm （ＳＳ ３４ローター、ソルバ
ル遠心機）にて３０分間遠心分離する。

【００７３】無細胞上清液を、０．０５ＭのＮＨ₄ ＨＣ
Ｏ₃ 中で平衡化されたセファデックスＧ２５（商標）上
で脱塩し、そして次に蛋白質含有画分を凍結乾燥する。
この凍結乾燥物を、０．１Ｍ ＮａＣｌが添加されてい
る０．０１燐酸ナトリウム緩衝液pH７．５に入れ、そし
て同じ緩衝液中でセファデックスＧ１００を用いてクロ
マトグラフ処理する。８〜１４kg／Mol （キロダルト
ン）の範囲の分子量を有する蛋白質を含有するヒト−Ｍ
ＩＦ−含有画分を一緒にし、そしてローターベーパー中
で１６倍濃縮する。

【００７４】例２ ハイブリドーマ細胞の調製 ２．１ ヒトＭＩＦ含有蛋白質画分と羊赤血球との接合 ２．５mlの包装された羊赤血球〔羊赤血球細胞、ＳＲＢ
Ｃ、ベーリングベルケ（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ）〕
を２０mlのＰＢＳに懸濁する。このＳＲＢＣ懸濁液１０
０μｌを、ＰＢＳ中グルタルアルデヒドの溶液９００μ
ｌと共に、グルタルアルデヒドの最終濃度が０．０５％
となるようにして５分間インキュベートする。このよう
にして前処理したＳＲＢＣを氷冷蒸留水で２回洗浄し、
遠心分離し、そして例１からのヒト−ＭＩＦ含有画分３
００μｌと共に２０℃にて１時間インキュベートする。
この懸濁液を免疫処理のために使用する。

【００７５】２．２ 免疫処理 Ｂａｌｂ／ｃマウスを、０，７、及び１０日目に、例
２．１からのヒト−ＭＩＦと結合したＳＲＢＣ懸濁液
０．５mlずつを、０．５mlずつの完全フロインドアジュ
バンドと共に３回注射することにより免疫する。この場
合、注射量の半分を腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射し、そし
て他の半分は４部分に分けて皮下（ｓ．ｃ．）注射す
る。１３日目及び１４日目に、アジュバントを伴わない
で０．５mlずつの接合体懸濁液をさらに２回ｉ．ｐ．投
与により“追加（ｂｏｏｓｔｅｒ）”免疫注射する。１
８日目に、処理されたマウスの脾臓を摘出する。

【００７６】２．３ 細胞融合 Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの方法〔Ｇ．Ｋｏ
ｅｈｌｅｒ及びＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、ネイチュアー
（Ｎａｔｕｒｅ）２５６，４９５（１９７５）〕に従っ
て、１０⁸ 個の脾臓リンパ球を、ドゥルベコの変形イー
グル培地中３５％ポリエチレングリコール４０００（メ
ルク、ダルムスタット）及び９．７％ジメチルスルホキ
シドの溶液１．５ml中で３．３×１０⁷ 個のマウス骨髄
腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３〔Ｊ．Ｆ．Ｋｅａ
ｒｎｅｙ，Ａ．Ｒａｄｂｒｕｃｈ，Ｂ．Ｌｉｅｓｅｇａ
ｎｇ及びＫ．Ｒａｊｅｗｓｋｙ、ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１２３，１５４８
（１９７９）〕と混合する。

【００７７】融合の後、細胞をファルコン３０４０の９
６−ウエルプレートの６００個のウエル中にプレート
し、そしてリトルフィールドのＨＡＭ培地（ヒポキサン
チン／アミノプテリン／チミジン標準培地）〔Ｊ．Ｗ．
Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ，サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）１４５，７０９（１９７４）〕中でフィーダー細胞
としての骨髄マクロファージと共に培養する。ＨＡＴ培
地中で１０日間培養した後、ＲＰＭＩ １６４０ ＨＴ
培地中で培養を継続する。

【００７８】例３ 抗体特異性についてのハイブリドー
マ細胞の試験 ３．１ γ−グロブリンの検出 ハイブリドーマ細胞培養液の上清液をＥＬＩＳＡ（エン
ザイム・リンクド・イムノソルベント・アッセイ）にお
いて試験する。この方法においては、ラビットから得ら
れ、パーオキシダーゼと接合されており、そしてマウス
γ−グロブリンを認識しそしてこれを結合する第２の抗
体を用いる。１０３個のハイブリドーマセルラインの内
７２個のクローンがγ−グロブリンを産生する。

【００７９】３．２ 目的とする分子量範囲の蛋白質に
対する特異性 同系マウスの赤血球（ホール当り１００μｌのＰＢＳ中
１×１０⁶ 個の赤血球）を、ポリ−Ｌ−リジン（２５mg
／ml）で被覆された９６−ウエルプレート（ダイナテッ
ク・ミクロタイター）に適用し、そして４℃にて一夜イ
ンキュベートする。ＰＢＳで反復洗浄することにより未
結合赤血球を除去する。こうして結合した赤血球を例
２．１に記載したようにしてグルタルアルデヒド中で固
定し、洗浄、そして８〜１４kg／Mol の分子量範囲のヒ
ト−ＭＩＦ含有画分（例１）とインキュベートする。反
復洗浄によって未結合蛋白質を除去し、そしてこのプレ
ートを０．１％ ＮａＮ₃ を含有するＰＢＳ中に貯蔵す
る。

【００８０】プレートをハイブリドーマ細胞の培養上清
液とインキュベートし、そして次にアルカリ性ホスファ
ターゼと結合したラビット抗−マウス免疫グロブリン第
２抗体とインキュベートし、そして２−アミノ−２−エ
チル−１，３−プロパンジオール緩衝液中ｐ−ニトロフ
ェニルホスフェート（セルバ）により発色せしめる。放
出されたｐ−ニトロフェノールを４０５nmにおいて分光
的に検出する。このＥＬＩＳＡ法により、例１からのヒ
ト−ＭＩＦ含有分子量画分に結合するモノクローナル抗
体が同定される。γ−グロブリンを分泌する７２個の細
胞クローンの内１５クローンがこの測定において結合さ
れるモノクローナル抗体を産生する。

【００８１】３．３ ヒト−ＭＩＦに対する特異性 例３．２に従って同定されたクローンの培養上清液から
のγ−グロブリンを硫酸アンモニウムを用いて５０％飽
和において沈澱せしめ、そしてこの沈澱物をＰＢＳに入
れ、そして製造者により指示された方法によりＡｆｆｉ
−Ｇｅｌ（商標）１０（ビオーラド）に結合せしめた。

【００８２】こうして固定化したγ−グロブリンを４℃
にて一夜、コンカナバリンＡにより刺激された単核細胞
のヒト−ＭＩＦ含有上清液（例１）と共にインキュベー
トし、そして次にＩＥＣ遠心分離機中で３０００rpm ，
４℃にて１０分間遠心する。次に上清液を、例４のＭＩ
Ｆ試験におけるヒト−ＭＩＦの残留量について試験す
る。この方法において、ヒト−ＭＩＦに対するモノクロ
ーナル抗体を産生するＩＣ５と称するセルラインが同定
される。

【００８３】例４ ヒト−マクロファージ遊走阻止因子
についての試験（ＭＩＦ試験） ４．１ パーコル（Ｐｅｒｃｏｌｌ）グラジエントの調
製 密度１．００７のパーコル（商標、ファルマシア）９
部、１０倍濃縮されたエール（Ｅａｒｌ）のＭＥＭ（セ
ロメド）１部、及びスピンナー培地（セロメド）１０倍
を、ソルバル遠心分離機（デュポン）中で１２，０００
rpm ，２０℃にて１２分間混合する。

【００８４】４．２ ＭＩＦ試薬のための標的細胞の取
得 ９〜１２の供与体からの“バフィーコート”すなわち白
血球の細胞濃縮物を１：２の比率でスピンナー培地（セ
ロメド）により稀釈し、２０℃に加熱し、そしてフィコ
ール・パク（Ｆｉｃｏｌｌ ｐａｑｕｅ）（商標、ファ
ルマシア）上で２０℃にて製造者によって指示された方
法で分離する。中間相の単核細胞を遠心分離した後、同
じ培地で２回洗浄し、そして次にＩＥＣ遠心分離機中で
２０℃，１６００rpm にて４０分間にわたり遠心するこ
とにより、例４．１に従って調製したパーコルグラジエ
ント中で単球とリンパ球とに分離する。単球をスピンナ
ー培地で３回洗浄し、２０％のウマ血清が添加されてい
るマッコイ（ＭｃＣｏｙ）培地（セロメド）に入れ、そ
してテフロンバッグ中の同じ培地中で７％ ＣＯ₂を通
しながら３７℃にて一夜培養する。

【００８５】４．３ ＭＩＦ試験の実施 例４．２からの培養された単球をドゥルベコのＭＥＭ
（セロメド）中で２回洗浄し、そして細胞濃度が５×１
０⁵ 細胞／mlとなるように、２倍濃度のドゥルベコＭＥ
Ｍ １部及び０．４％アガロース（マイルス）１部の混
合物中に入れる。この細胞懸濁液を、ハミルトンシリン
ジにより、９６−ウエルプレート（ファルコン、ミクロ
テストIII ）の内側の６０ウエルに１μｌの滴として移
す。４℃にて１５分間の後アガロースが固化する。次
に、試験すべきサンプル溶液１００μｌを各ウエルに加
える。対照溶液として、１％のウマ血清が加えられてい
るドゥルベコＭＥＭを使用する。試験すべきサンプル溶
液の稀釈物を同じ培地中で調製する。プレートを、７％
ＣＯ₂ を通気しながら湿潤雰囲気下で３７℃にて１５
時間インキュベートする。

【００８６】アガロース滴からの単球の遊走を、顕微鏡
の接眼レンズ中の目盛付網目印により測定する。この測
定は、滴の縁に接するように網目の１つの軸を配置し、
そして滴の縁から細胞の遊走限界までの距離をそれに対
して垂直な軸を用いて測定することにより実施する。目
盛により測定された対照溶液における細胞の遊走を１０
０％の遊走又は０％の遊走阻害とする。サンプル溶液に
おいて達成された遊走距離を、それに関して遊走阻害％
として表示する。サンプル溶液の生物学的活性をＭＩＦ
単位として表示する。ＭＩＦ単位は、前記の試験方法に
おいて３０％の遊走阻害を生じさせる生物学的活性とし
て定義される。従って、サンプル溶液のＭＩＦ単位の数
値は、正確に３０％の遊走阻害を生じさせるために溶液
を稀釈しなければならないその稀釈係数に対応する。

【００８７】例５ 腹水からのモノクローナル抗体の単
離及び精製 Ｂａｌｂ／ｃマウスを０．４mlのプリスタン（カール・
ロス）により腹腔内前処理する。１週間後、２〜５×１
０⁶ 個のクローン化ハイブリドーマ細胞を腹腔内注射す
る。各マウスから反復して腹水を採取し、そして−８０
℃にて凍結する。集められた液を解凍し、そして４℃、
１６，０００rpm にて３０分間遠心分離する。脂肪を吸
引濾去し、そして残った破片を含有しない上清液に、０
℃にて撹拌しながら、５０％の濃度に達するまで、飽和
硫酸アンモニウム溶液をゆっくりと滴加する。

【００８８】こうして沈澱した粗免疫グロブリン画分
を、ＤＥＡＥ Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ（商標、ビ
オーラド）上で０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（pH８．２）を
用いて、製造者により特定された方法によりクロマトグ
ラフ処理する。活性画分を集め、そしてアミコンＸＭ５
０フィルター（アミコン）を用いて濃縮する。

【００８９】例６ 抗体カラムの調製 Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １０（商標、ビオーラド）を、製造
者により特定された方法に従って、冷蒸留水及びカップ
リング緩衝液pH７．５〔ＭＯＰＳ，３−（Ｎ−モルホリ
ノ）プロパンスルホン酸〕により洗浄する。カップリン
グ緩衝液（１ml）中上記ゲルの５０％懸濁液をプラスチ
ックチューブに移し、同じ量の精製抗体溶液（２０mgの
モノクローナル抗体１Ｃ５）と混合し、そして室温にて
４時間回転せしめる。次にゲルをカップリング緩衝液で
洗浄する。

【００９０】まだ遊離している活性部位をブロックする
ため、ゲル１ml当り０．１mlの１Ｍエタノールアミン−
ＨＣｌ（pH８．０）により室温にて２時間ゲルを処理
し、そしてゲル１ml当り１０ｍモルのナトリウムアジド
を含有するＰＢＳにより洗浄し、そしてこの中で４℃に
て保持する。カップリングの程度を２８０nmにおける吸
収を測定することにより決定する。これはゲル１ml当り
１２〜３０mgのモノクローナル抗体である。

【００９１】例７ ヒト−ＭＩＦ蛋白質の単離及び精製 ７．１ ヒト−ＭＩＦの製造 例１に記載した方法に従って、１０¹¹個の単核細胞をバ
フィーコートから単離し、そしてコンカナバリンＡ（ｃ
ｏｎ Ａ）で刺激してリンフォカインを産生せしめる。
刺激された細胞を、２４時間、３７℃にて、５％ ＣＯ
₂ を通気しながら、６０００cm² の培養面積を有するＮ
ｕｎｃ積層槽中で、各場合に面積cm² 当り０．２５mlの
ＲＰＭＩ １６４０培地中５×１０⁶ 細胞の細胞濃度に
おいて培養する。次に、細胞培養上清液を３５０００×
ｇ，４℃にて３０分間遠心分離する。次に、透明な上清
液にフェニルメタンスルホニルフルオリド、セリンプロ
テアーゼ阻害剤（最終濃度５０μモル／ｌ）、及びナト
リウムアジド（最終濃度０．０５％）を加える。

【００９２】７．２ 細胞培養上清液の濃縮 例７．１からの細胞培養上清液を、アミコン攪拌セル中
ＹＭＳメンブラン（各目分離限界：分子量５kg／Mol ）
上での限外濾過により１５倍に濃縮する。蛋白質の吸着
による損失を回避し、そして生ずる可能性のある凝集を
防止するために、限外濾過はトリトンＸ−１００（商
標）（アルキル−フェニルポリエチレングリコール、ロ
ーム・アンド・ハース）を添加して行う。トリトンＸ−
１００の最終濃度は約０．２ｗ／ｖ％とする。濃縮物を
３５０００×ｇにて遠心分離し、そして０．２５μｍの
フィルター（ミリポア）を通して濾過する。

【００９３】７．３ イムノアフィニティークロマトグ
ラフィー 例７．２からの１ｌのリンフォカイン濃縮物を、４℃に
て、約１０ml／時の流速で、ゲルml当り１２mgの抗体の
カップリングの程度を有するゲル４mlを収容する抗体カ
ラム（例６）に、ポンプを用いて通す。非特異的に結合
した蛋白質及び随伴する物質を、１００mlのＰＢＳ／
０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．２％トリトンＸ−１００／
０．０２％ナトリウムアジド、pH７．３により洗浄し、
そして次に２０mlのＰＢＳにより、そして最後に１０ml
／０．１Ｍ ＮａＣｌにより１５ml／時の流速で洗浄す
ることによりカラムから溶出する。

【００９４】特異的に結合したヒト−ＭＩＦ蛋白質を
０．１Ｍグリシンヒドロクロリド／０．１Ｍ ＮａＣ
ｌ，pH２．６の溶液で溶出する。この溶出は２８０nmに
おける吸収の自動測定（ユビコードＳ，ＬＫＳインスト
ルメンツ）により監視する。吸着による損失を回避する
ため、溶出液を１００μｌの３％ ＳＤＳ溶液を収容す
るポリプロピレンチューブ中に３mlずつの画分として集
める。蛋白質含有画分を集め、そして１Ｍトリス溶液の
添加により中和する。

【００９５】７．４ 電気透析、電気泳動濃縮 “ＩＳＣＯエレクトロフォレティック・コンセントレー
ター”モデル１７５０（Ｉｓｃｏ社）及び分子量３．５
kg／Mol の名目分離限界を有するスペクトラポール（商
標）膜（スペクトラム・メディカル・インダストリーズ
社）を用いて、例７．３からの中和された溶出液を２５
ｍモルの酢酸アンモニウム／０．０１％ＳＤＳ，pH８．
３に対して透析し、そして同時に０．２mlの容量に濃縮
する。透析された濃縮物を真空遠心機（スピード・バク
・コンセントレーター、サバント社）中で蒸発により濃
縮乾固して酢酸アンモニウムを除去する。

【００９６】７．５ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によるＭＩＦ蛋白質の分
析 透析された濃縮物（例７．４）のアリコート（約２％）
を、Ｌａｅｍｍｌｉ法〔Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ、ネイ
チュアー（Ｎａｔｕｒｅ）２２７，６８０−６８５（１
９７０）〕に従って、１５％ポリアクリルアミドスラブ
ゲル上での電気泳動にかける。

【００９７】蛋白質バンドを、クマッシーブリリアント
ブル−（フルカ）による染色及びＣ．Ｒ．Ｍｅｒｒｉｌ
等〔アナリティカル・ビオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．）１１０，２０１（１９８１）〕に従う
銀染色法により可視化する。これによれば、抗体カラム
から溶出された物質は分子量が約８kg／Mol の蛋白質及
び約１４kg／Mol の蛋白質、並びに相対的に非常に少量
の分子量が約２８kg／Mol の蛋白質及び約４５kg／Mol
の蛋白質を有する。

【００９８】７．６ イムノアフィニティークロマトグ
ラフィーにより単離された蛋白質のＭＩＦ活性の特徴付
け ヒト−ＭＩＦの個々の蛋白質の低損失調製分離及び単離
は洗浄、例えばＳＤＳの存在下で有利に行われる（例
７．３，７．４及び７．７を参照のこと）。蛋白質のＭ
ＩＦ活性はＳＤＳとの相互作用により破壊される。ＭＩ
Ｆ活性は、次のようにして生合成的に放射性標識された
リンフォカインにより個々の分子量画分に帰属せしめ
る。

【００９９】１０⁸ 個のヒト単核細胞を、３μｇ／mlの
コンカナバリンＡを含有するＲＰＭＩ １６４０培地５
mlに懸濁し、そして２５cm² の面積を有する細胞培養器
〔ヌンコロン（商標）ＴＣ２５〕中で５％ ＣＯ₃ を通
気しながら３７℃にて２時間インキュベートする。次に
培地を除去し、そして細胞をロイシン不含ＲＰＭＩ１６
４０培地中で２０時間培養し、これに１０μCi／mlのＬ
−〔Ｕ−¹⁴Ｃ〕ロイシンを加える。放射性細胞培養上清
液を５００mlの非標識ヒト−ＭＩＦ含有細胞培養上清
（例７．１）と一緒にし、そして例７．２に記載したよ
うにして１５倍に濃縮する。

【０１００】例７．３と同様にして、０．５mlのゲルを
収容するカラムを用いてイムノアフィニティークロマト
グラフィーにより単離し、ＳＤＳを加えないで溶出液を
集める。１Ｍトリス溶液で中和した後、溶出液を５０ｍ
モルの炭酸水素アンモニウム中セファデックスＧ−２５
カラム（ファルマシア）上でのクロマトグラフィーに移
し、そして凍結する。残渣を０．５mlのＰＢＳに溶解
し、そして約３５０００×ｇにおいて遠心する。０．１
mlのアリコートをＢｉｏ−Ｓｉｌ（商標）ＴＳＫ−１２
５カラム（７．５×３００mm，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い
るＨＰＬＣにより画分する。

【０１０１】画分を、放射能を測定し（標識された蛋白
質として）、そしてＭＩＦ活性を決定する（例４）こと
により特徴付ける。放射能及びＭＩＦ活性が、約８kg／
Mol及び約１４kg／Mol の分子量領域に対応する位置の
画分に存在する。放射性溶出液の他のアリコートを例
７．５と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける。放射性
蛋白質をオートラジオグラフィーにより可視化する。約
８kg／Mol 及び約１４kg／Mol の分子量領域に強いバン
ドが現われ、そして約２８kg／Mol 及び約４５kg／Mol
の領域に弱いバンドが現われる。

【０１０２】７．７ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるヒト−Ｍ
ＩＦ蛋白質の調製的分離及び電気溶出による単離 約５０ｌの細胞培養上清液から成る例７．４に従って調
製された材料を、垂直スラブゲル電気泳動系でのＬａｅ
ｍｍｌｉ法〔ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ）２２７，６
８０（１９７０）〕に従う不連続緩衝液系においてＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより分離する。サンプルを、０．０５ト
リス−ＨＣｌ／３ｗ／ｖ％ ＳＤＳ／０．０２Ｍジチオ
スレイトール／１０ｖ／ｖ％グルセリン（pH６．８）か
ら成る組成の緩衝液３００μｌ中に溶解し、そして幅
１．５cm、厚さ１．５cmの、１５％アクリルアミドを含
有するゲルに適用する。

【０１０３】ゲル中の遊離基及び酸化剤によって生ずる
可能性がある蛋白質の誘導体化を回避するため、ナトリ
ウムチオグリコレートを０．１ｍモルの濃度になるよう
にカソード緩衝液に加える〔Ｍ．Ｗ．Ｈｕｎｋａｐｉｌ
ｌｅｒ等、メソッズ・イン・エンチモロジー（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）９１，２２７
（１９８３）を参照のこと〕。蛋白質を可視化するた
め、ゲルを氷冷した０．２５Ｍ ＫＣｌ溶液中に５分間
置く〔Ｄ．Ａ．Ｈａｇｅｒ及びＲ．Ｒ．Ｂｕｒｇｅｓ
ｓ、アナリティカル・ビオチミストリー（Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．）１０９，７６（１９８０）を参照のこ
と〕。

【０１０４】８kg／Mol 及び１４kg／Mol の分子量領域
の可視バンドを切り取り、そしてＢｈｏｗｎ等〔アナリ
ティカル・ビオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．）１０３，１８４（１９８０）〕により記載された
技法を用いて蛋白質をゲルから溶出する。この目的のた
め、スペクトロポール（商標）膜（スペクトラム・メデ
ィカル・インダストリーズ、名目分離限界３．５kg／Mo
l ）を有する“ＩＳＣＯエレクトロホーレティック・コ
ンセントレーター”モデル１７５０（ＩＳＣＯ社）中
で、０．０５Ｍ酢酸アンモニウム１０．０１％ ＳＤＳ
を用いて、２ワットの出力において８時間にわたって溶
出する。

【０１０５】溶出した蛋白質は約１５０μｌの容量でサ
ンプリングカップ中に見出され、そして緩衝物質（グリ
シン．トリス）を含有しない。酢酸アンモニウムを除去
するため、電気溶出液を真空遠心機（スピード・バク・
コンセントレーター、サバント社）中での蒸発により濃
縮乾固する。溶出された蛋白質の均一性及び収量を、各
場合に約５％の溶出液を分析用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ例７．
５）にかけることにより試験する。この際、既知の分子
量を有する規定された量の蛋白質をサンプルと平行して
電気泳動にかける。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、８kg／Mol の
分子量領域からの溶出液中の均一蛋白質バンド、及び１
４kg／Mol の分子量領域からの溶出液中の均一バンドを
示す。

【０１０６】７．８ ゲル濾過ＨＰＬＣによるヒト−Ｍ
ＩＦ蛋白質の調製的分離及び単離 例７．２からのヒト−ＭＩＦ含有培養上清液の濃縮液２
ｌを、約１５ml／時の流速で、ゲルml当り約１２mgのＩ
Ｃ５抗体のカップリングの程度を有するゲル５mlを収容
する抗体カラム（例６）に、ポンプにより通す。例７．
３と同様にしてカラムを洗浄し、そして特異的に結合し
たヒト−ＭＩＦ蛋白質を０．１Ｍグリシンヒドロクロリ
ド１０．１Ｍ ＮａＣｌ（pH２．６）により溶出する。
溶出液は、ＳＤＳを添加してないポリプロピレンチュー
ブ中に画分して集める。溶出液は２８０nmにおける吸収
の測定、及びＭＩＦ活性の検出（例４）により監視す
る。

【０１０７】４バッチ（合計８ｌの培養上清濃縮液から
成る）からの一緒にした溶出液を、０．００５Ｍ酢酸ア
ンモニウム（pH７．５）に対して透析し、そして例７．
４と同様にして同時に０．２mlの容量に濃縮する。この
濃縮物を、Ｓｉ３００Ｐｏｌｙｏｌ（商標）０．００３
mmを収容する０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（pH７．５）
で平衡化されたＨＰＬＣカラム（セルバ、ハイデルベル
グ、西独）に導入し、そして４０バールの圧力及び０．
３ml／分の通流速度で０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（pH
７．５）により溶出する。

【０１０８】２８０nmにおける吸収の測定、ＭＩＦ活性
の決定（例４）、及び例１０のエンザイムイムノアッセ
イにより溶出を監視する。蛋白質含有量及びＭＩＦ活性
に関する主要部分が約８kg／Mol 及び約１４kg／Mol の
分子量領域に対応する位置の画分に見出され、一層少い
部分が約２８kg／Mol 及び約４５kg／Mol の分子量領域
の画分中に見出される。酢酸アンモニウムを除去するた
め、ヒト−ＭＩＦ蛋白質を含有する画分を反復して凍結
乾燥する。

【０１０９】例８ アミノ酸配列分析 ８．１ 分子量８kg／Mol のＭＩＦ蛋白質 例７．７からの分子量８kg／Mol の精製蛋白質を“ガス
−フェーズ・プロテイン・シークエンサー・モデル４７
０”（アプライド・ビオシステムス）を用いて、Ｍ．
Ｗ．Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ及びＬ．Ｅ．Ｈｏｏｄ〔メ
ソッズ・イン・エンチモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）９１，３９９（１９８３）〕
に従って配列決定する。

【０１１０】フェニルチオヒダントイン−（ＰＴＨ）−
アミノ酸へのアニリノ−チアゾリノン誘導体の再配置
を、５０℃にて２５％トリフルオロ酢酸で処理すること
により行う。ＰＴＨアミノ酸をゾルバックス（Ｚｏｒｂ
ａｘ）ＣＮ（商標）カラム（デュポン、２００×４．６
mm）上で分析する〔Ｒ．Ｋｎｅｃｈｔ等、アナリティカ
ル・ビオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）
１３０，６５（１９８３）を参照のこと〕。次のような
明確なＮ−端アミノ酸配列が見出される。Ｍｅｔ−Ｌｅ
ｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（５）−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−
Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（１０）−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉ
ｌｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ（１５）−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙ
ｓ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ（２０）−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ
−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（２５）−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−
Ｖａｌ−Ｔｙｒ（３０）−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｙｓ（３５）−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｕ−Ｔｈｒ（４０）−Ｇｌｕ−Ｘ₄₂−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−
Ｔｙｒ（４５）−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｙ（５０）−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｐｈ
ｅ（５５）−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ
（６０）−Ａｓｎ−Ｘ₆₂−Ｘ₆₃−Ｘ₆₄−Ａｌａ（６５）
−Ｖａｌこの配列中、Ｘ₄₂はＳｅｒ又はＣｙｓである。
Ｘ₆₂，Ｘ₆₃及びＸ₆₄は特定されていないアミノ酸を示
す。

【０１１１】８．２ 分子量１４kg／Mol のＭＩＦ蛋白
質 例７．７からの分子量１４kg／Mol の精製蛋白質を例
８．１と同様にして配列決定する。次のような明確なＮ
−端アミノ酸配列が見出される。 Ｘ₁ −Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（５）−Ｇｌｕ
−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（１０）−Ｓｅｒ−
Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ（１５）−Ｔｙｒ−Ｈ
ｉｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ この配列中Ｘ₁ は特定されていないアミノ酸を示す。

【０１１２】例９ マウスＭＩＦに対するモノクローナ
ル抗体の製造 ９．１ マウスＭＩＦを含有する蛋白質画分の取得 Ｃ．Ｓｏｒｇ〔モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）１７，５６５（１
９８０）〕により記載された方法に従って、１００匹の
Ｂａｌｂ／ｃマウスからの脾臓細胞をコンカナバリンＡ
で刺激することにより細胞上清液を得、これをセファデ
ックスＧ−１００上でクロマトグラフ処理することによ
り４０〜７０kg／Mol の範囲の分子量のマウス−ＭＩＦ
蛋白質を含有する溶液約５０mlを得る。

【０１１３】９．２ 羊赤血球へのマウス−ＭＩＦ含有
蛋白質画分の接合 例９．１からの画分を４．５mlの合計容量に濃縮し、そ
して例２．１と同様にして、グルタルアルデヒドにより
前処理された羊赤血球（ＳＲＢＣ）に連結する。

【０１１４】９．３ ラットの免疫 ０，１０，４３、及び３０９日目に、例９．２からのマ
ウスＭＩＦと連結された０．５mlずつのＳＲＢＣを、
０．５mlずつの完全フロインドアジュバントと一緒に７
回注射することにより、ＤＡラットを免疫する。この場
合注射量の半分を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、そして他
の半分は４分割して皮下（ｓ．ｃ．）注射する。さら
に、３１２，３１３、及び３１４日目に、０．５mlずつ
の接合体懸濁液をアジュバントを伴わないで“追加”免
疫注射（ｉ．ｐ．）する。処理されたラットの脾臓を３
１７日目に摘出する。

【０１１５】９．４ 細胞融合 例２．３と同様にして、免疫されたラットの脾臓リンパ
球１．１４×１０⁸ 個を３．５×１０⁷ 個のマウス骨髄
腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合せしめ、そ
してＨＡＴ培地中で培養する。

【０１１６】９．５ 所望の特異性を有する抗体を分泌
するハイブリドーマ細胞の選択 例３．１及び３．２に記載した方法と同様にして、例
９．４に従って得られた２４４個のハイブリドーマセル
ラインから、ラット赤血球に連結された（例９．２と同
様にして連結する）マウスＭＩＦを含有する画分からの
蛋白質に結合するモノクローナル抗体を分泌する４９ク
ローンを選択する。これら４９細胞クローンの培養上清
液からのγ−グロブリンを、例３．３の方法に従ってＡ
ｆｆｉ−Ｇｅｌ（商標）１０（ビオーラド）に連結し、
そしてコンカナバリンＡで刺激された脾臓細胞のマウス
−ＭＩＦ含有上清液（例９．１）と共にインキュベート
する。

【０１１７】次に、上清液をマウス−ＭＩＦのその残留
量について試験する。この目的のために、マウス−ＭＩ
Ｆの含量を例４．３と同様にして行われるＭＩＦ試験に
より決定する。しかしながらこの場合、培養されたヒト
単球の代りに、１０％ ＦＣＳを含有するドゥルベコＭ
ＥＭに入れられそしてアガロース滴中に固定されたマウ
ス腹腔マクロファージを使用する。

【０１１８】この選択法を用いて、マウス−ＭＩＦに対
するモノクローナル抗体を産生する６個のハイブリドー
マセルライン、特に７Ｄ１０と称する細胞クローンが同
定される。これらの抗体はまた例４に従うＭＩＦ試験に
おいてヒト−ＭＩＦと結合し、従って交差活性を示す。

【０１１９】９．６ 腹水からのモノクローナル抗体の
単離及び精製 例５と同様にして、プリスタンにより前処理されたＢａ
ｌｂ／ｃマウス（nu／nu）に、１×１０⁷ 個のクローン
化ハイブリドーマ細胞を腹腔内注射し、そして腹水から
抗体を得る。

【０１２０】例１０ ヒト−ＭＩＦの決定のためのエン
ザイムイムノアッセイ（ＭＩＦ−ＥＬＩＳＡ） １０μｇ／mlの濃度の精製された抗体溶液ＩＣ５（抗−
ヒト−ＭＩＦ）１００μｌを９６−ウエルミクロタイタ
ープレート（コスター、テクノラマ）の各ウエル中で３
７℃にて１時間インキュベートする。ＰＧＴ−２０−緩
衝液〔０．２％ゼラチン（メルク）及び０．０５％トゥ
イーン２０が添加されているＰＢＳ〕により３回洗浄
し、そしてプレート底のなお存在する蛋白質反応性結合
部位を、ウエル当り２５０μｌのＰＧＴ−２０−緩衝液
との３７℃にて１時間にわたるインキュベーションによ
り飽和する。

【０１２１】試験溶液の一連の稀釈物５０μｌ又はヒト
−ＭＩＦを含有する標準溶液をミクロタイタープレート
のウエル中で３７℃にて１時間インキュベートする。未
結合部分をＰＧＦ−２０−緩衝液で３回洗浄して除去
し、そして次に抗体７Ｄ１０（抗−マウス−ＭＩＦ、ヒ
ト−ＭＩＦと交差反応性である）とビオチンＮ−ヒドロ
キシサクシンイミジルエステルとから調製され（マデッ
ク、ビオチンと抗体７Ｄ１０とのモル比＝４〜７：１）
そしてセファデックスＧ−２５上で精製された接合体
（１０μｇ／ml）のＰＢＳ中溶液をウエル中で３７℃に
て３０分間インキュベートする。

【０１２２】プレートをＰＧＴ−２０−緩衝液により３
回洗浄した後、プレートに結合したビオチン−抗体接合
体を、アビジン−ホースラディッシュパーオキシダーゼ
接合体（０．３μｇ／ml）（シグマ）の１：３０００稀
釈溶液１００μｌとインキュベートすることにより反応
せしめる。プレートを洗浄した後、２，２′−アジノ−
ビス−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン
酸）ジアンモニウム塩の溶液（ＡＢＴＳ、ベーリンガー
マンハイム、１６μｌの３０％ Ｈ₂ Ｏ₂ を含有する１
００mlのクエン酸／燐酸緩衝液、０．０５Ｍクエン酸
塩、０．１Ｍ Ｎａ ₂ ＨＰＯ₄ ，pH４．０中５５mg）に
よる発色、及び４０５nmにおける光度計による測定によ
り、捕捉された酵素の量を決定する。

【０１２３】ビオチン−抗体７Ｄ１０接合体の代りに、
同様にして調製されたビオチン−抗体ＩＣ５接合体を使
用することができる。しかし、この方法により行われる
ＥＬＩＳＡはヒト−ＭＩＦに対して低い感度を有する。

【０１２４】例１１ ＭＩＦ−ＥＬＩＳＡ用の試験キッ
ト 例１０に記載したエンザイムイムノアッセイ用試験キッ
トは次のものを含む。 ・ポリプロピレンミクロタイタープレート。 ・モノクローナル抗体ＩＣ５の溶液（１０μｇ／ml）２
０ml。 ・モノクローナル抗体７Ｄ１０のビオチン接合体（ビオ
チンと抗体７Ｄ１０とのモル比＝５：１，１０μｇ／m
l）１０ml。 ・アビジン−ホースラディッシュパーオキシダーゼ接合
体（０．３μｇ／ml）１ml。 ・２，２′−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチアゾ
リン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩１１mg。 ・クエン酸／燐酸緩衝液（０．０５Ｍクエン酸塩／０．
１Ｍ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ）２０ml。 ・３０％ Ｈ₂ Ｏ₂ １ml。 ・ＰＢＳ １００ml。 ・ＰＧＴ−２０−緩衝液（０．２％ゼラチン及び０．０
５％トゥイーン２０を含有するＰＢＳ）２００ml。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＥ Ｃ１２Ｎ 5/10 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者 ゲルト ブルマイスター ドイツ連邦共和国，4400 ミュンスター, フォン エスマーチ−シュトラーセ 56, ウニベルジタート−ハウトクリニーク内 (72)発明者 ラヨス ターツァイ ドイツ連邦共和国，7889 グレンザッハ− ビーレン，ムテンザーシュトラーセ 25 (72)発明者 バルター ビーゼンダンガー スイス国，4142 ミュンヘンシュタイン, スタイングリュベンベグ 12

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の性質： （１）ヒト−ＭＩＦに対する抗体により認識されそして
   それに結合されるエピトープを有するヒト−由来の蛋白
   質であり、 （２）マクロファージの遊走が測定される標準的試験方
   法において活性であり、そして （３）次のＮ−末端部分アミノ酸配列： Ｘ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ
   −Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−
   Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｙ 〔配列中、Ｘが決定されていないアミノ酸であり、そし
   てＹは決定されていないアミノ酸配列であり、蛋白質の
   分子量が約１４kg／Mol であるか；あるいはＸがＭｅｔ
   であり、そしてＹが次のアミノ酸配列： Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｌ
   ｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａ
   ｌ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
   −Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−
   Ｘ₄₂−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｙ
   ｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ
   −Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−
   Ａｓｎ−Ｘ₆₂−Ｘ₆₃−Ｘ₆₄−Ａｌａ−Ｖａｌ（ここで、
   アミノ酸Ｘ₄₂，Ｘ₆₂，Ｘ₆₃及びＸ ₆₄は特定されず、しか
   しＸ₄₂はＳｅｒ又はＣｙｓのみを意味することができ
   る）で表わされるアミノ酸配列であり、蛋白質の分子量
   が約８kg／Mol である〕を有する、ことを特徴とするヒ
   ト−マクロファージ遊走阻止因子蛋白質。
2. 【請求項２】 次の性質： （１）ヒト−ＭＩＦに対する抗体により認識されそして
   それに結合されるエピトープを有するヒト−由来の蛋白
   質であり、 （２）マクロファージの遊走が測定される標準的試験方
   法において活性であり、そして （３）次のＮ−末端部分アミノ酸配列： Ｘ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ
   −Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−
   Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｙ 〔配列中、Ｘが特定されていないアミノ酸であり、そし
   てＹは決定されていないアミノ酸配列であり、蛋白質の
   分子量が約１４kg／Mol であるか；あるいはＸがＭｅｔ
   であり、そしてＹが次のアミノ酸配列： Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｌ
   ｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａ
   ｌ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
   −Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−
   Ｘ₄₂−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｙ
   ｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ
   −Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−
   Ａｓｎ−Ｘ₆₂−Ｘ₆₃−Ｘ₆₄−Ａｌａ−Ｖａｌ（ここで、
   アミノ酸Ｘ₄₂，Ｘ₆₂，Ｘ₆₃及びＸ ₆₄は特定されず、しか
   しＸ₄₂はＳｅｒ又はＣｙｓのみを意味することができ
   る）で表わされるアミノ酸配列であり、蛋白質の分子量
   が約８kg／Mol である〕を有する、ことを特徴とするヒ
   ト−マクロファージ遊走阻止因子蛋白質の製造方法であ
   って、所望によりそれ自体公知の精製段階の後に、ヒト
   −ＭＩＦを含有する溶液を、 ａ）ヒト−ＭＩＦに対して特異的なモノクローナル抗体
   を有する支持体と接触せしめ、非結合蛋白質及び他の外
   来性物質を除去し、前記抗体に結合したヒト−ＭＩＦを
   選択的に切り離しそして単離し、そして ｂ）精製されたヒト−ＭＩＦを個々の蛋白質に分離す
   る、ことを特徴とする方法。
3. 【請求項３】 次の性質： （１）ヒト−ＭＩＦに対する抗体により認識されそして
   それに結合されるエピトープを有するヒト−由来の蛋白
   質であり、 （２）マクロファージの遊走が測定される標準的試験方
   法において活性であり、そして （３）次のＮ−末端部分アミノ酸配列： Ｘ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ
   −Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−
   Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｙ 〔配列中、Ｘが特定されていないアミノ酸であり、そし
   てＹは特定されていないアミノ酸配列であり、蛋白質の
   分子量が約１４kg／Mol であるか；あるいはＸがＭｅｔ
   であり、そしてＹが次のアミノ酸配列： Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｌ
   ｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａ
   ｌ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
   −Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−
   Ｘ₄₂−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｙ
   ｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ
   −Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−
   Ａｓｎ−Ｘ₆₂−Ｘ₆₃−Ｘ₆₄−Ａｌａ−Ｖａｌ（ここで、
   アミノ酸Ｘ₄₂，Ｘ₆₂，Ｘ₆₃及びＸ ₆₄は特定されず、しか
   しＸ₄₂はＳｅｒ又はＣｙｓのみを意味することができ
   る）で表わされるアミノ酸配列であり、蛋白質の分子量
   が約８kg／Mol である〕を有する、ことを特徴とするヒ
   ト−マクロファージ遊走阻止因子蛋白質をリポゾーム中
   に含んで成るマクロファージ遊走阻止剤。