DK171646B1 - Renset human-makrofag-migrationsinhiberingsfaktor (human-MIF) og dens enkeltproteiner, fremgangsmådetil fremstilling deraf, monoklonale antistoffer mod human-MIF og fremgangsmåde til den fremstilling,hybridomacellelinier, der producerer monoklonale antistoffer mod human-MIF, deres anvendelse og fremgangsmåde til deres fremstilling samt farmaceutiske præparater indeholdende renset human-MIF eller - Google Patents

Description

DK 171646 B1

Opfindelsen angår renset human-makrofag-migrationsinhibe-ringsfaktor (human-MIF) og dens enkeltproteiner, en fremgangsmåde til fremstilling af renset human-MIF og dens enkeltproteiner, hidtil ukendte monoklonale antistoffer mod 5 human-MIF, en fremgangsmåde til fremstilling af disse monoklonale antistoffer, hybridomacellelinier, som producerer disse monoklonale antistoffer, en fremgangsmåde til fremstilling af hybridomacellelinerne, anvendelsen af de monoklonale antistoffer til kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af 10 human-MIF, anvendelsen af de monoklonale antistoffer til rensning af human-MIF, samt farmaceutiske præparater indeholdende renset human-MIF, dens enkeltproteiner eller monoklonale antistoffer mod human-MIF.

Human-MIF fra menneskeceller er ganske vist kendt som aktivt princip, men er dog hidtil kun beskrevet som blanding og sammen med andre proteiner i biologiske væsker og er ikke karakteriseret med hensyn til struktur. MIF hører til gruppen af de såkaldte lymphokiner, som omfatter biologisk aktive, op-20 løselige polypeptider, der udskilles af lymphocyter og mono-cyter eller makrofager, når disse stimuleres af antigener, mitogener eller lignende. Andre eksempler på lymphokiner er immun-interferon (γ-interferon), interleukin 1 og 2 og makro-fag-aktiverende faktor (MAF). Disse lymphokiner regulerer dif-25 ferentieringen, aktiveringen og prolifereringen af forskellige celletyper i immunsystemet.

Ifølge den kendte teknik består human-MIF af en gruppe polypeptider, som hæmmer makrofagernes bevægelsesevne. Human-MIF 30 secerneres ikke kun af aktiverede lymphocyter, T- og B-celler, men også af ikke-lymphoide celler, f.eks. af voksende fibro-blaster og visse tumorceller. MIF er klart forskelligt fra γ-interferon, makrofag-aktiverende faktor (MAF) og andre lymphokiner. Det har imidlertid hidtil ikke været muligt at ren-35 fremstille MIF fra humane celler og at klarlægge dens struktur. Det er kendt, at human-MIF sandsynligvis består af en blanding af strukturbeslægtede polypeptider med en molekyl- 2 DK 171646 B1 vægt på hhv. ca. 8,5, 18, 27, 36, 45 og 67 kg/mol (kilo-dalton) og et isoelektrisk punkt ved pH 5,1 og 2,9, jvf. G. Burmeister, H. Steffen, U. Feige og C. Sorg, Immunobiology 160, 15 (1981).

5 Human-MIF spiller en afgørende rolle i den tidlige fase af en inflammationsreaktion ("delayed type hypersensitivity reaction") . Den inducerer differentieringen af monocyter og hvilende vævsmakrofager til funtionsklare inflammationsmakrofager. Renset human-MIF og dens enkelte proteiner og monoklonale an-10 tistoffer, som specifikt binder human-MIF og hæmmer dens aktivitet, har derfor betydning for diagnosen og behandlingen af immunregulationssygdomme og kroniske inflammationssygdomme. Monoklonale antistoffer, som binder og hæmmer human-MIF, er værdifulde ved bekæmpelsen af kontakteksem, primær kronisk 15 polyarthritis og forskellige autoimmunsygdomme. Renset human-MIF og dens enkelte proteiner kan forøge infektresistensen f.eks. mod tuberkulose, lepra eller leishmaniose og mod can-didose, samt resistensen mod tumorer, især mod metastaser.

Anvendelsen af antistoffer til diagnose og behandling har ind-20 til for nylig været kraftigt begrænset med hensyn til anvendelsesområde. Antistoffer er blevet udvundet i små mængder fra animalsk serum som komplex blanding af forskellige proteiner. Det har ikke været muligt at standardisere antistofferne, da det enkelte immuniserede dyr og også det enkelte individ ved 25 gentagen immunisering hver gang danner et serum med antistoffer med forskellig sammensætning. Ved anvendelse af teknikken udviklet af Kohier og Milstein, jvf. G. Kohier og C. Milstein, Nature 256, 495 (1975), er det nu blevet muligt at udvinde antistoffer i homogen form, dvs. såkaldte monoklonale antistof-30 fer på reproducerbar måde i industrielle mængder fra cellekulturer. Med fusion af egnede myeloma-celler med antistofproducerende lymphocyter fra en med antigen immuniseret donor dannes hybridoma-celler, som forbinder evnen til ubegrænset celledeling og til ubegrænset vækst in vitro med produktionen af 35 et homogent antistof. Det er således muligt at gøre en organismes immunrespons specifikt med hensyn til et bestemt anti- 3 DK 171646 B1 gen og at fremstille antistoffer ved permanent dyrkning af hybridoma-celler.

Selvom der idag kendes mange eksempler på fremstillingen af specifikke antistoffer ved hybridoma-teknik og den generelle 5 metode principielt er beskrevet, optræder der dog ved hvert nyt eksempel specifikke problemer, som kræver en udvikling af teknikken til det specielle tilfælde. Uden en sådan udvikling har man ikke vished for, at de ønskede hybridomaceller i det hele taget dannes, at de er genetisk stabile, danner de 10 ønskede antistoffer og at de på denne måde fremstillede antistoffer har den ønskede specificitet. Resultatet påvirkes i princippet af arten og af renheden af det til immuniseringen af donoren anvendte antigen, cellefusionsteknikken, fremgangsmåden ved selektionen af egnede hybridomacellelinier og måden 15 og arten af isoleringen og rensningen af antistofferne.

En vigtig anvendelse af antistoffer, der forudsætter rådighed over homogene monoklonale antistoffer i store mængder, som det nu er muligt at fremstille ved hjælp af hybridomatek-nikken, er immunaffinitetskromatografi. Ved denne teknik an-20 vendes antistoffer med en ønsket specificitet på et fast bæremateriale. Fra en opløsning, som indeholder flere forskellige forbindelser, bindes selektivt de forbindelser til antistofferne og dermed til det faste bæremateriale, som indeholder et strukturelement (determinant, epitop), som genkendes og 25 bindes af antistoffet. Efter fjernelse af opløsningen med de uønskede forbindelser, frigøres de ønskede forbindelser fra bærematerialet ved udvaskning med reagenser, som bryder bindingen til antistoffet, og de ønskede forbindelser isoleres ved hjælp af klassiske metoder.

30 Et formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe human-MIF og dens enkelte proteiner. Dette opnås ved hjælp af de monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen.

Opfindelsen angår renset human-makrofag-migrationsinhiberings-faktor (human-MIF) og dens enkeltproteiner.

4 DK 171646 B1

Den rensede human-MIF ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at den kun indeholder proteiner af human oprindelse, som udviser epitoper, der genkendes og bindes af det mono-klonale antistof 1C5 mod human-MIF, og er aktivt i stan-5 dardtestmetoder, hvor der foretages måling af vandringen af makrofager.

Renset human-MIF består af mindst fire enkeltproteiner med en molekylvægt på hhv. ca. 8, ca. 14, ca. 28 og ca. 45 kg/mol 10 og eventuelt andre enkeltproteiner eller oligomere proteinaggregater med en molekylvægt på mere end ca. 45 kg/mol.

Enkeltproteiner af renset human-MIF er proteiner, der er homogene ved de gængse proteinanalysemetoder, f.eks. SDS-PAGE 15 (natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-gel-elektrophorese) eller gel-filtration-HPLC (højtryksvæskekromatografi), som er aktive ved standard-testmetoder til måling af makrofagers vandring eller bevægelse, og som er bestanddele af renset human-MIF.

Hvis der under adskillelsen og isoleringen af de enkelte pro-20 teiner tilsættes detergenter eller andre denaturerende reagenser, sker der en ændring af proteinernes naturlige tertiærstruktur og dermed deres evne til at hæmme makrofagernes bevægelse, selvom primærstrukturen forbliver uændret. Sådanne denaturerede former for enkeltproteiner er ligeledes omfat-25 tet af opfindelsen. Som eksempler på enkeltproteiner af renset human-MIF er de to proteiner med molekylvægt på hhv. ca.

8 kg/mol og ca. 14 kg/mol og den N-terminale aminosyresekvens X^-leu-thr-glu-leu-glu-lys-ala-leu-asn-ser-ile-ile-asp-vÅ-tyr-his-lys-tyr, hvori betydningen af aminosyren ikke er fast-30 lagt, samt proteiner med en molekylvægt på ca. 28 kg/mol og ca. 45 kg/mol.

I første række angår opfindelsen enkeltproteinet fra renset human-MIF med en omtrentlig molekylvægt på 8 kg/mol og den 35 N-terminale aminosyresekvens met-leu-thr-glu-leu-glu-lys-ala-, 10 15 20 leu-asn-ser-ile-ile-asp-val-tyr-his-lys-tyr-ser-leu-ile-lys-25 30 35 gly-asn-phe-his-ala-val-tyr-arg-asp-asp-leu-lys-lys-leu-leu-40 ,45 , 50 glu-thr-glu-X42-pro-gln-tyr-ile-arg-lys-lys-gly-ala-asp- 55 60 6J5 , , val-trp-phe-lys-glu-leu-asp-ile-asn-X^-Xg 3-X64-aIa-val,hvor 5 DK 171646 B1 betydningen af aminosyrerne X42, X62# X63 X64 er ^ast" lagt, men hvor X42 kun kan betyde ser eller cys.

5 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af renset human-MIF og dens enkeltproteiner er ejendommelig ved, at en human-MIF-holdig opløsning, eventuelt efter i og for sig kendte rensningstrin, a) bringes i kontakt med bæremateriale med på human-MIF 10 specifikke monoklonale antistoffer, ikke-bundne proteiner og andre fremmedstoffer fjernes, og den til antistofferne bundne human-MIF fraspaltes selektivt og isoleres og b) om ønsket, den rensede human-MIF adskilles i dens enkeltproteiner.

15

Opløsninger, f.eks. celleekstrakter, cellekultursupernatanter eller cellekulturfiltrater fra humanceller, der indeholder MIF, fremstilles under anvendelse af i og for sig kendte fremgangsmåder. Egnede humanceller er eksempelvis mononukleære 20 celler, der kan udvindes af "buffy coat", som er det lag af hvide blodlegemer, der udskilles ved centrifugeringen af citrat- eller heparintilsat venøst blod, ved leukapherese og/ eller centrifugering i en vægtfyldegradient. De mononukleære celler provokeres ved hjælp af egnede hjælpestoffer, f.eks.

25 concanavalin A eller phytohemagglutinin, til produktion af MIF og andre lymphokiner og dyrkes under anvendelse af gængse metoder i fra ca. 12 til ca. 72 timer, fortrinsvis fra 18 til 36 timer i egnede kulturmedier, eksempelvis mediet RPMI 1640, der om ønsket er tilsat føtal kalveserum, pufferopløs-30 ninger og/eller antibiotika, såsom penicillin eller streptomycin, ved ca. 37°C og om ønsket under CC^-beluftning. Opløsninger indholdende human-MIF udvindes fra cellerne og/eller cellekultursupernatanterne f.eks. ved ekstraktion, filtrering og /eller.centrifugering og stabiliseres om ønsket 35 ved tilsætning af antibiotika og/eller protease-inhibitorer. Sådanne human-MIF-opløsninger kan bringes direkte i kontakt med antistoffer bundet til bæremateriale i trin a), men de forrenses fortrinsvis forinden ved ultrafiltrering med mem- 6 DK 171646 B1 braner med en adskillelsesgrænse ved en molekylvægt på ca.

6 kg/mol eller mindre, opkoncentreres, hvorpå de eventuelt dialyseres og om ønsket renses yderligere ved kromatografi, f.eks. på DEAE-cellulose eller "Sephadex"®.

5 I trin a) adskilles human-MIF fra andre proteiner og fremmedstoffer, som forekommer i opløsningen, idet adskillelsesvirkningen, som beror på skiftevis binding mellem to monoklonale antistoffer, specifikt udnyttes på human-MIF og de genkendte antigene determinanter på human-MIF. Til dette formål bringes 10 opløsningen indeholdende human-MIF på i og for sig kendt måde ved inmunaffinitets-krcnatografi i kontakt med et bæremateriale, hvortil der er bundet human-MIF-specifikke monoklonale antistoffer.

Et egnet bæremateriale på uorganisk eller organisk basis, f.eks. 15 silikater, tværbundet agarose, dextran eller polyacrylamid på egnet funktionaliseret form, belægges på i og for sig kendt måde, eventuelt efter forudgående aktivering, med de nedenfor beskrevne monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen eller deres derivater. Man kan eksempelvis suspendere et bæremate-20 riale, som indeholder aktiverede efterfunktioner, f.eks.

N-hydroxy succ in imidester-grupper, i en vandig pufferopløsning, hvorpå der tilsættes en opløsning af det monoklonale antistof, hvorpå ikke-bundne monoklonale antistoffer udvaskes og ubesatte reaktive steder på bærematerialet blokeres med f.eks. en 25 primær amin, såsom ethanolamin. Bærematerialet suspenderes i et egnet vandigt opløsningsmiddel, f.eks. en saltopløsning, såsom en NaCl-opløsning, eller en pufferopløsning, såsom phos-phatpufret NaCl-opløsning, NaHC03-opløsning eller 3-(N-morpho-lino) propansulfonsyreopløsning, og bringes i kontakt med den 30 human-MIF-holdige opløsning, f.eks. anbragt i en kromatografisøjle, hvor den human-MIF-holdige opløsning påsættes og pumpes gennem bærematerialet, eventuelt under anvendelse af tryk. Ikke-bundne proteiner og andre urenheder vaskes bort med vandige opløsninger, f.eks. pufferopløsninger i pH-området fra 35 ca. 5 til ca. 9 og/eller saltopløsninger, f.eks. NaCl-opløsning. Den til antistoffet på bærematerialet bundne human-MIF

7 DK 171646 B1 elueres med egnede vandige opløsninger, f.eks. pufferopløsninger i pH-området fra ca. 2 til ca. 5, såsom glycin-puffer, eller pH-gradienter af forskellig sammensætning eller saltopløsninger, f.eks. koncentreret NH4SCN-opløsning.‘ De fremkomne 5 opløsninger, som indeholder renset human-MIF, neutraliseres eventuelt, hvorefter der foretages isolering af den rensede human-MIF under anvendelse af i og for sig kendte fremgangsmåder, f.eks. ved kromatografi på "Sephadex"®, elektrodialyse, elektrophoretisk koncentrering og/eller vakuumcentrifugering.

10

Eventuelt adskilles i trin b) den rensede human-MIF i enkelt-proteiner, idet man eksempelvis på i og for sig kendt måde adskiller proteinblandingen kromatografisk i fraktioner med forskellig molekylvægt. Den rensede human-MIF opdeles eksem-15 pelvis ved præparativ natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-gel-elektrophorese (SDS-PAGE), hvorefter homogene molekylvægtsfraktioner elueres fra gelen og isoleres i ren form, f.eks. ved kromatografi på "Sephadex"®, elektrophoretisk koncentrering og/eller vakuumcentrifugering. Den rensede human-MIF kan 20 også adskilles eller opspaltes ved præparativ gel-filtration-HPLC i homogene molekylvægtsfraktioner, hvorfra enkeltproteinerne kan isoleres.

Som tidligere anført angår opfindelsen endvidere hidtil 25 ukendte monoklonale antistoffer mod human-makrofag-migra-tionsinhiberingsfaktor (human-MIF).

De monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen binder og/eller hæmmer den biologiske aktivitet af human-MIF. Bindingen af 30 monoklonale antistoffer til human-MIF bestemmes med fordel ved en immunoanalyse, f.eks. med et testudstyr, hvor human-MIF anbringes på en fast bærer, den belagte bærer inkuberes med en monoklonal antistofopløsning, hvorved bundne monoklonale antistoffer fremkaldes med et andet antistof, der er 35 markeret med en radioaktiv isotop eller et enzym. Monoklonale antistoffer bundet til human-MIF bestemmes således ved måling af radioaktiviteten eller ved en enzymsubstrat-reak- 8 DK 171646 B1 tion. Man kan eksempelvis også anvende et testudstyr, hvor de monoklonale antistoffer fikseres på en bærer, inkuberes med en human-MIF-holdig opløsning, hvorefter restindholdet af human-MIF-aktivitet i denne opløsning bestemmes.

5

Human-MIF-aktiviteten i en opløsning måles på i og for sig kendt måde ved bestemmelse af den hæmmende virkning på bevægelsen eller vandringen af passende aktiverede humane makrofager. Der kan eksempelvis vælges en forsøgsopstilling/ hvor 10 man måler vandringsstradcningen af makrofager anbragt i agaro-sedråber på titerplader i en prøveopløsning.

Der foretrækkes monoklonale antistoffer mod human-MIF, som produceres af mus/mus-, rotte/rotte- eller rotte/mus-hybrido-15 maceller. Som eksempler på sådanne foretrukne monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen kan nævnes det monoklonale antistof hørende til underklassen IgG^k med betegnelsen 1C5, som produceres af hybridomacellelinien 1C5, og det monoklonale antistof hørende til underklassen IgG2a me<^ kete9nelsen 7D10, 20 der produceres af hybridomacellelinien 7D10. De monoklonale antistoffer 1C5 og 7D10 bindes til human-MIF uden at hæmme dens biologiske aktivitet.

Derivater af monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen er 25 eksempelvis fragmenter, såsom fab, fab' eller f(ab')2-frag-menter, som bevarer deres specificitet for de antigene determinanter hos human-MIF, radioaktivt mærkede monoklonale anti- 125 stoffer, som eksempelvis er mærket ved radioaktivt jod ( I, 131 14 35 3 I), kulstof ( C), svovl ( S), tritium (JH) eller lignen- 30 de, monoklonale antistof-konjugater med biotin eller avidin eller monoklonale antistof-konjugater med enzymer, såsom pe- berrodsperoxidase, alkalisk fosfatase, β-D-galactosidase, glucose-oxidase, glucoamylase, carboanhydrase, acetylchlolin- esterase, lysozym, malat-dehydrogenase eller glucose-6-fos- 35 fat-dehydrogenase. Foretrukne derivater er monoklonale anti- 125 stoffer mærket med jod og antistof-konjugater med biotin.

9 DK 171646 B1

Opfindelsen angår som nævnt også en i og for sig kendt fremgangsmåde til fremstilling af de monoklonale antistoffer mod human-MIF, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at hybridomaceller, som produceret disse mono-5 klonale antistoffer, a) dyrkes in vitro, og de monoklonale antistoffer isoleres fra dyrkningssupernatanterne eller b) formeres in vivo i et egnet pattedyr, og de monoklonale antistoffer isoleres fra dette pattedyrs 1egernsvæsker.

10

Egnede dyrkningsmedier til in vitro dyrkningen ifølge fremgangsmåde a) er de gængse standarddyrkningsmedier, eksempelvis Dulbecco's Modified Eagles-medium eller RPMI 1640-medi-um, eventuelt tilsat totalt kalveserum. Til isolering af de 15 monoklonale antistoffer findes proteinerne i dyrkningssupernatanterne med ammoniumsulfat eller lignende, hvorpå de renses ved anvendelse af de gængse kromatografiske metoder, f.eks. gelfiltrering, jonbytterkromatografi, kromatografi på DEAE-cellulose eller immunuaffinitetskromatografi.

20

Der kan fremstilles store mængder af de ønskede antistoffer ved formering af hybridomacellerne in vivo ifølge fremgangsmåde b). Ved denne fremgangsmåde injiceres cellekloner i pattedyr, fortrinsvis i syngene pattedyr, og efter 1-3 uger iso-25 leres de monoklonale antistoffer fra legemsvæskerne fra disse pattedyr. Man kan eksempélvis injicere hybridomaceller stammende fra Balb/c-mus intraperitonalt i eventuelt med et car-bonhydrid, såsom pristan, forbehandlede Balb/c-mus og efter 8-10 dage udtage ascitesvæske fra disse dyr. De ønskede mono-30 klonale antistoffer isoleres fra legemsvæskerne under anvendelse af kendte fremgangsmåder, f.eks. ved fældning med ammoniumsulfat eller lignende og kromatografisk rensning, f.eks. over DEAE-cellulose, hydroxylapatit (HPHT, high performance hydroxylapatite column chromatography), jonbytterharpiks, ved 35 gelfiltrering eller ved immunaffinitetskromatografi.

10 DK 171646 B1

Fragmenter af monoklonale antistoffer, f.eks. fab, fab' eller f(ab1)2-fragmenter, som bibeholder deres specificitet for de antigene determinanter hos human-MIF, fremstilles på i og for sig kendt måde, f.eks. ved behandling åf monoklonale 5 antistoffer fremstillet ifølge fremgangsmåde a) eller b) med enzymer, såsom pepsin eller papain, og/eller ved spaltning af disulfid-bindinger ved kemisk reduktion.

125 131

Monoklonale antistoffer mærket med radioaktivt jod ( I, I) 10 fås fra de omhandlede monoklonale antistoffer ved i og for sig kendt jodering, eksempelvis med radioaktivt natrium- eller kaliumiodid og et kemisk oxidationsmiddel, såsom natriumhypo-chlorit, chloramin T eller lignende, eller et enzymatisk oxidationsmiddel, såsom lactoperoxidase, glucoseoxidase og glu-15 cose. Radioaktivt mærkede monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen fremstilles også ved, at man på kendt måde til dyrkningsmedierne for in vitro-dyrkningen sætter radioaktivt mær- 14 kede næringsstoffer indeholdende radioaktivt kulstof ( C), tritium (^H), svovl (^S) eller lignende, f.eks. L-(^C)-leu-3 35 20 cin, L-( H)-leucin eller L-( S)-methionin, og isolerer de monoklonale antistoffer efter fremgangsmåde a).

Enzymmærkede monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen fremstilles på i og for sig kendt måde, idet man omsætter monoklo-25 nåle antistoffer fremstillet ifølge fremgangsmåde a) eller b) og det ønskede enzym med koblingsreagens, eksempelvis glutar-aldehyd, periodat, Ν,Ν'-o-phenylendimaleimid, N-(m-maleimido-benzoyloxy)-succinimid, N-(3-(2'-pyridyldithio)-propionoxy)-succinimid eller lignende. På tilsvarende måde får man konju-30 gater af monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen med avi-din. Konjugater med biotin fremstilles under anvendelse af kendte fremgangsmåder, idet man omsætter monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen med f.eks. biotin-N-hydroxysuccinimi-dylester.

Hybridomacellelinierne ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de producerer monoklonale antistoffer mod human-MIF.

35 11 DK 171646 B1

Der foretrækkes monoklonale, mod human-MIF rettede antistofproducerende hybridoma-cellelinier, som er hybrider af muse-myeloma-cellelinier og muse- eller rotte-lymfocyter.

5 Specielt foretrækkes hybridoma-cellelinien med betegnelsen 1C5, der er deponeret den 13. juli 1984 i samlingen "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" i Pasteur Instituttet i Paris under nummeret 1-316. Cellelinien 1C5 er en hybrid af mus-myeloma-cellelinien P3-X63-Ag8.653 og en B-lym-10 focyt fra milten af en balb/c-mus. Ligeledes foretrækkes hybridoma-cellelinien med betegnelsen 7D10, som den 29. januar 1985 er deponeret i samlingen "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" i Pasteur Instituttet i Paris under deponeringsnummeret 1-418. Cellelinien 7D10 er en hybrid af 15 mus-myeloma-cellelinien P3-X63-Ag8.653 og en B-lymfocyt fra milten af en DA-rotte. De to cellelinier er stabile i genetisk henseende, udskiller monoklonale antistoffer med konstant specificitet og kan aktiveres fra dybfrosne kulturer ved optøning og re-kloning.

20

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af hybri-domaceller, som producerer monoklonale antistoffer mod human-MIF, er ejendommelig ved, at man immuniserer egnede pattedyr med MIF eller MIF-konjugater, fusionerer de antistofproduce-25 rende celler udtaget fra pattedyret med myelomaceller, kloner de dannede hybridomaceller og selekterer de cellekloner, som producerer de ønskede monoklonale antistoffer.

Som antigener kan anvendes en vilkårlig MIF-holdig protein-30 fraktion eller MIF-konjugat, f.eks. fra humane mononukleære celler, såsom MIF-holdige protein-fraktioner eller konjugater af disse protein-fraktioner udvundet som beskrevet ovenfor med egnede immunogene bærere, f.eks. proteiner, polysaccha-rider, latexpartikler eller celler. Det er en forudsætning 3 5 for anvendelsen af animalske, f.eks. murine, MIF-holdige proteinfraktioner, at det pågældende animalske MIF og human-MIF har identiske epitoper. Konjugater fremstilles under anvendel- 12 DK 171646 B1 se af i og for sig kendte fremgangsmåder, f.eks. ved kobling med carbodiimider, periodat, glutaraldehyd, Ν,Ν'-o-phenylen-dimaleimid, N-(m-maleimidobenzoyloxy)-succinimid, N-(3-(2'-pyridyldithio)-propionoxy)-succinimid eller lignende. Til im-5 muniseringen anvendes fortrinsvis konjugater af méd glutaraldehyd forbehandlede fåre-erythrocyter og MIF-holdige proteinfraktioner fra humane celler eller fra museceller.

De foretrukne pattedyr til immuniseringen med human-MIF er mus eller rotter, især balb/c-mus. Til immuniseringen med 10 mus-MIF anvendes fortrinsvis rotter, f.eks. DA-rotter. Immuniseringen gennemføres på i og for sig kendt måde, f.eks. idet man indgiver tre til otte injektioner parenteralt, f.eks. intraperitonealt og subkutant med antigene human-MIF-konjuga-ter med intervaller på fra en til ti dage, om ønsket sammen 15 med et hjælpestof, som fremmer lymfocytproduktionen, f.eks. komplet eller inkomplet Freund's Adjuvans. Det er også muligt at forimmunisere dyrene ved hjælp af to til fire injektioner og først efter en pause på 8 til 12 måneder at foretage yderligere injektioner.

20 Antistofproducerende celler fra de immuniserede dyr, fortrinsvis miltceller, udtages to til seks dage efter den sidste immunisering af dyrene, og de udtagne celler fusioneres med my-eloma-celler af en egnet cellelinie i nærværelse af en fusionspromotor. Som egende fusionspartnere kendes flere forskel-25 lige myeloma-cellelinier og deraf afledte cellelinier. Der foretrækkes myeloma-celler, som mangler enzymet hypoxanthin-guanin-fosforibosyl-transferase (HGPRT) eller enzymet thymi-din-kinase (TK), og som derfor ikke overlever i et selektivt dyrkningsmedium, som indeholder hypoxanthin, aminopterin og 30 thymidin (HAT-medium) eller hypoxanthin og azaserin. Specielt foretrækkes myeloma-celler og deraf afledte cellelinier, som ikke overlever i HAT-medium eller hypoxanthin/azaserin-medi-um, og som ikke udskiller immunoglobuliner eller dele deraf, f.eks. cellelinierne X63-Ag8.653 og Sp2/0-Agl4. Cellelinien 35 X63-Ag8.653, som stammer fra balb/c-mus, er ikke blot egnet til fusionen med lymfocyter fra mus, f.eks. balb/c-mus, men 13 DK 171646 B1 også med lymfocyter fra rotter, såsom DA-rotter.

Som fusionspromotorer kan anvendes sendai-virus eller andre paramyxovira, eventuelt på UV-inaktiveret form, calcium-ioner, overfladeaktive lipider, såsom lysolecithin, eliter piolyethyl-5 englykol. Fortrinsvis fusioneres myeloma-celler med et totil ti-dobbelt overskud af miltceller fra immuniserede dyr i en opløsning, som indeholder fra ca. 30 til ca. 50 % poly-ethylenglykol med en molekylvægt mellem ca. 1000 og ca. 6000.

Efter fusionen opdeles cellerne, hvorpå de dyrkes i selektivt 10 HAT-medium eller hypoxanthin/azaserin-medium, hvorved der kun overlever hybridoma-celler, fordi disse forener evnen til vækst in vitro fra myeloma-cellerne og de manglende HGPRT-eller TK-gener fra antistofproducerende celler fra de immuniserede dyr og dermed evnen til at overleve i det selektive 15 medium.

Egnede dyrkningsmedier til ekspansionen af hybridoma-cellerne er de sædvanlige standard-dyrkningsmedier, f.eks. Dulbecco's Modified Eagles-medium eller RPMI 1640-medium. Til initiering af cellevæksten tilsættes fortrinsvis såkaldte feeder-celler, 20 f.eks. normale peritoneale muse-exsudatceller, miltceller, knoglemarv-makrofager og lignende. Med regelmæssige mellemrum suppleres det pågældende dyrkningsmedium med selektivt HAT-medium eller hypoxanthin/azaserin-medium for at forhindre en overvoksning af hybridoma-cellerne med sædvanlige myeloma-25 celler.

Cellekultursupernatanterne fra hybridoma-cellerne undersøges for indhold af de ønskede monoklonale antistoffer. Til dette formål anvendes fortrinsvis en radioimmunoanalyse, en enzym-immunoanalyse og/eller en bestemmelse af MIF-aktiviteten som 30 beskrevet ovenfor. De på denne måde udvalgte cellekloner dyrkes i de sædvanlige standardmedier og dybfryses om ønsket på i og for sig kendt måde og/eller reklones ved begrænsende fortynding og/eller anbringelse på agar.

14 DK 171646 B1

Opfindelsen angår som nævnt tillige anvendelsen af de mono-klonale antistoffer mod human-MIF til kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af human-MIF, især i biologiske væsker og på celleoverflader. De monoklonale antistoffer Ifølge opfin-5 delsen kan eksempelvis anvendes i en vilkårlig af de kendte immunoanalyser, som er baseret på den bindende vekselvirkning mellem antigen (human-MIF) og monoklonale antistoffer. Som eksempler på sådanne analyser kan nævnes radioimmunoanalyse (RIA), enzym-immunoanalyse, immuno-fluorescent-test, latex-10 agglutination eller hæmagglutination.

Antistofferne ifølge opfindelsen kan anvendes som sådanne eller som radioaktivt mærkede derivater eventuelt i kombination med andre mærkede antistoffer og/eller proteiner i en radio-15 immunoanalyse (RIA). Der kan anvendes en vilkårlig af de kendte udførelsesformer for RIA, f.eks RIA i homogen fase, RIA i fast fase eller heterogenfase, enkelt RIA eller dobbelt (sandwich) RIA med direkte eller indirekte (kompetitiv) bestemmelse af human-MIF.

20

Fortrinsvis anvender man en RIA, ved hvilken en egnet bærer, eksempelvis er, plastoverflade på en titerplade eller et testrør, f.eks. af polystyren, polypropylen eller polyvinylchlor-id, glas- eller plast-perler, filtrerpapir, dextran-, cellu-25 loseacetat- eller nitrocellulose-blade eller lignende belægges med en human-MIF-holdig prøve- eller standard-opløsning ved simpel adsorption eller eventuelt efter aktivering af bæreren, f.eks. med glutaraldehyd eller bromcyan, hvorpå der inkuberes med en opløsning af et monoklonalt antistof ifølge 30 opfindelsen og derpå med en opløsning af et andet antistof, hvorved det andet antistof, f.eks. et kanin-anti-mus-immuno-globulin, genkender og binder det monoklonale antistof ifølge opfindelsen. Mængden af det bundne andet antistof bestemmes ved måling af den bundne radioaktivitet enten direkte, når 35 det andet antistof er radioaktivt mærket, eller efter fremkaldelse med et radioaktivt mærket protein med stor affinitet til dette andet antistof, f.eks. 125I-mærket protein A fra 15 DK 171646 B1

Staphylococcus aureus.

De monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen kan anvendes som sådanne eller som enzymmærkéde derivater i‘en enzym-im-5 munoanalyse. Sådanne immunoanalyser er eksempelvis testanordninger, hvor der anvendes i og for sig kendte enzymmærkede antistoffer, som genkender og binder epitoperne i de monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen, eller enzymmærkede monoklonale antistof-derivater ifølge opfindelsen. I stedet for en-10 zymmærkede antistoffer kan der også anvendes antistof-biotin-konjugater sammen med avidin-enzym-konjugater. Som eksempler på enzymer, der kan anvendes i enzymimmunoanalyser, kan nævnes peberrods-peroxidase, alkalisk fosfatase, β-D-galactosid-ase, glucose-oxidase, glucoamylase, carboanhydrase, acetyl-15 cholinesterase, lysocym, malat-dehydrogenase eller glucose- 6-fosfat-dehydrogenase.

Der foretrækkes en ELISA-test (enzyme-linked immunosorbent assay), ved hvilken en bærer, som er beskrevet ovenfor i for-20 bindelse med en enkelt RIA-test, og som eventuelt er belagt med erythrocyter enten belægges med en human-MIF-holdig prøve- eller standardopløsning ved simpel adsorption eller eventuelt efter aktivering af bæreren eller de bærer-bundne erythrocyter med glutaraldehyd eller belægges med celler, som 25 skal undersøges for human-MIF, hvorpå denne bærer inkuberes med en opløsning af et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen og derpå med en opløsning af et enzymmærket andet antistof, som genkender og binder det monoklonale antistof ifølge opfindelsen. Mængden af det bundne andet antistof, f.eks. et 30 peroxidase-mærket kanin-anti-muse-immunoglobulin, synliggøres og bestemmes ved fremkaldelse med enzym-substrat.

Især foretrækkes en ELISA-test (enzyme-linked immunosorbent assay), ved hvilken man belægger en bærer som beskrevet oven-35 for i forbindelse med en enkelt RIA-test med en opløsning af et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen ved enkel adsorption eller eventuelt efter aktivering af bæreren, f.eks. med glutaraldehyd eller bromcyan, hvorpå denne bærer inkuberes 16 DK 171646 B1 med en human-MIF-holdig prøve- eller standard-opløsning og derpå enten med en opløsning af et enzymmærket antistof ifølge opfindelsen, som eventuelt genkender en anden epitop fra human-MIF, eller fortrinsvis med en opløsning af‘ et med bio-5 tin konjugeret antistof ifølge opfindelsen efterfulgt af en opløsning af et avidin-enzym-konjugat. Derved synliggøres og bestemmes mængden af det bundne enzym- eller biotin-mærkede antistof ved fremkaldelse med enzymsubstrat.

10 Foretrukne enzymer ved enzym-immunoanalyserne ifølge opfindelsen er peberrods-peroxidase, der eksempelvis kan fremkaldes med enzymsubstraterne 5-aminosalicylsyre, o-phenylendi-amin, 3,3'-dimethoxybenzidin, 3,3',5,51-tetramethylbenzidin, 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsyre) eller lig-15 nende og hydrogenperoxid, og alkalisk fosfatase, der eksempelvis kan frigøre p-nitrophenol fra enzymsubstratet p-nitrophe-nylfosfat.

Anvendelsen ifølge opfindelsen af monoklonale antistoffer 20 mod human-MIF til kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af human-MIF omfatter også andre i og for sig kendte immunoana-lyser, eksempelvis immunofluorescent-analyser under anvendelse af antistof- eller antigen-konjugater med fluorescerende stoffer, latex-agglutination med antistof- eller anti-25 gen-belagte latex-partikler eller hæmagglutination med antistof- eller antigenbelagte røde blodlegemer eller lignende.

De beskrevne immunoanalyser kan anvendes til bestemmelse af tilstedeværende mængder af human-MIF i biologiske væsker, 30 især i menneskeblod, eller på celleoverflader i fikseret form og letter dermed diagnosen af sygdomme forårsaget af immunreguleringsforstyrrelser. Eksempelvis kan der ved lav infektionsresistens diagnosticeres en dermed forbundet immunreguleringsforstyrrelse, når der i blodet ikke forekommer 35 noget human-MIF eller mængder deraf, som ligger under gennemsnittet. Endelig kan bestemmelsen af human-MIF i patologiske væv, f.eks. i melanomer, granulomer og hyperplasier, mu- 17 DK 171646 B1 liggøre en simpel diagnose, da MIF kun forekommer i bestemte vævstyper og kun ved bestemte patologiske tilstande, jvf. nedenstående tabel.

5 Tabel: Binding af det monoklonale antistof 1C5 til frosne vævssnit.

Normale væv: A) Lever 10 B) Milt + (kun få celler) C) Hud + (kun få makrofager) D) Lunge -

Patologiske væv: 15 e) Primær melanoma (meget celleinfiltrat) ++ (celleinfiltrat)

Melanoma-metastaser (lidt celleinfiltrat) + (kun få celler)

Melanoma-mikrometastaser (i lymfeknuder) 20 f) BCG-granuloma (1, 3 eller 5 uger efter podning) + G) Sézary-syndrom + H) Syringolymfoid hyperplasie + I) Subakut eksem 25 J) Hypereosinophilt syndrom + Binding påvist, - ingen binding påvist

Testudstyret ifølge opfindelsen til kvalitativ og kvantitativ 30 bestemmelse af human-MIF er ejendommeligt ved, at det indeholder monoklonale antistoffer mod human-MIF og eventuelt hjælpemidler.

Testudstyr ifølge opfindelsen til en radioimmunoanalyse 35 indeholder eksempelvis en egnet bærer, eventuelt frysetørrede eller koncentrerede opløsninger af et antistof ifølge opfindelsen, opløsninger af et eventuelt radioaktivt mærket 18 DK 171646 B1 andet antistof og/eller eventuelt opløsninger af radioaktivt mærket protein A fra Staphylococcus aureus, standardopløsninger af renset human-MIF eller enkeltproteiner deraf, pufferopløsninger, fikseropløsninger indeholdende glutar'aldehyd, de-5 tergenter til forhindring af uspecifik adsorption og aggregatdannelse, pipetter, reaktionsbeholdere, justerkurver og lignende.

Testudstyr ifølge opfindelsen til en enzym-immunoanalyse in-10 deholder eksempelvis en egnet bærer, eventuelt frysetørrede eller koncentrerede opløsninger af et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen, af et enzymmærket eller biotinmærket antistof-derivat ifølge opfindelsen, eventuelt frysetørrede eller koncentrerede opløsninger af et enzymmærket antistof, som 15 genkender og binder det monoklonale antistof ifølge opfindelsen, eventuelt frysetørrede eller koncentrerede opløsninger af avidin-enzym-konjugater, enzym-substrater på fast eller opløst form, standardopløsninger af renset human-MIF eller af enkeltproteiner deraf, pufferopløsninger, fiks.eropløsning-20 er indeholdende glutaraldehyd, detergenter, pipetter, reaktionsbeholdere, justerkurver og lignende.

Opfindelsen angår som nævnt desuden anvendelsen af de monoklonale antistoffer mod human-MIF til rensning af human-25 MIF. Eksempelvis kan human-MIF isoleres under anvendelse af kendte adskillelsesmetoder, hvis adskillelsesvirkning er baseret på den skiftevise binding mellem monoklonale antistoffer og antigene determinanter fra human-MIF. En foretrukket adskillelsesmetode er immunaffinitetskromatografi som 30 beskrevet ovenfor.

De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de indeholder en terapeutisk virksom mængde renset human-MIF eller dens enkeltproteiner ifølge opfindel-35 sen og en signifikant mængde af et farmaceutisk hjælpemiddel.

DK 171646 B1 19

O

De farmaceutiske præparater er præparater til enteral, f.eks. nasal, rektal eller oral samt fortrinsvis parenteral, f.eks. intramuskulær, subkutan eller intravenøs indgift til mennesker og varmblodede dyr. Afhængig af den tilsigtede indgifts-5 måde kan de farmaceutiske præparater foreligge på dosisenhedsform, f.eks. i ampuller, hætteglas, suppositorier, dragéer, tabletter, kapsler eller nasalspray i flydende eller fast form.

10 Mængden af de terapeutisk virksomme forbindelser, som skal indgives, afhænger af det pågældende varmblodede dyrs eller menneskes tilstand, f.eks. legemsvægten, sygdommens art og sværhedsgrad og almentilstanden, endvidere af indgiftsmåden, og doseringen foretages efter anvisninger af den læge, som 15 behandler sygdommen. En virksom dosis af human-MIF og dens aktive enkeltproteiner er af størrelsesordenen 0,001-1 pg pr. kg legemsvægt pr. dag, og for raonoklonale antistoffer mod human-MIF og derivater deraf i området 0,001-1 mg pr. kg legemsvægt pr. dag.

20

De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen indeholder de sædvanlige uorganiske eller organiske, faste eller flydende farmaceutisk anvendelige bærestoffer, eventuelt sammen med andre terapeutisk virkende forbindelser og/eller hjælpestof-25 fer. Man anvender fortrinsvis opløsninger eller suspensioner af det aktive stof, især isotoniske vandige opløsninger eller suspensioner, endvidere også lyofiliserede præparater, som opløses i vand kort tid før brugen. De farmaceutiske præparater kan være steriliserede og/eller indeholde konserveringsmidler, 30 stabiliseringsmidler, fugtemidler, emulgeringsmidler, opløse-lighedsfremmende stoffer, viskositetsforøgende stoffer, salte til regulering af det osmotiske tryk og/eller puffere, endvidere også andre proteiner, f.eks. human-serum-albumin eller humane blodplasmapræparater.

35 20 DK 171646 B1

Der foretrækkes farmaceutiske præparater i form af liposomer i vandig dispersion indeholdende en terapeutisk virksom mængde renset human-MIF eller enkeltproteiner deraf. Særlig velegnede er liposomer med en population af størst mulig homogen —8 ~ „c 5 størrelse og en diameter fra ca. 2,0 x 10 til 5,0 x 10~ m bestående af et eller flere dobbeltlag lipidkomponenter, f.eks. amfipatiske lipider, såsom fosfolipider, f.eks. lecithin, kaphalin eller fosfatidsyre, og eventuelt neutrale lipider, f.eks. cholesterol, som omslutter et vandigt indre rum med 10 renset human-MIF ifølge opfindelsen eller enkeltproteiner deraf. Der foretrækkes liposomer af en blanding af syntetisk fosfatidyl serin og fosfatidylcholin.

Opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende eksempler.

I eksemplerne har de anvendte forkortelser følgende betydning-15 er: ELISA Enzymanalyse (enzyme-linked immunosorbent assay) HAT Hypoxanthin/aminopterin/thymidin HPLC Højtryksvæskekromatografi HT hypoxanthin/thymidin 20 MIF Makrofag-migrationsinhiberingsfaktor PBS Fosfatpufferet fysiologisk natriumchloridopløs- ning RIA Radioimmunoanalyse SDS Natriumdodecylsulfat 25 SDS-PAGE SDS-polyacrylamid-gel-elektroforese SRBC Fåreerythrocyter

Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan upm Omdrejninger pr. minut.

Eksempel 1

30 Udvinding af en proteinfraktion, som indeholder human-MIF

Mononukleære celler udvindes fra såkaldt "buffy coat", som er det lag af hvide blodlegemer, der udskilles ved centrifugeringen af citrat- eller heparin-behandlet venøst blod, og 21 DK 171646 B1 de udvundne mononukleære celler renses ved en to-trinsmetode bestående af leukapherese og kontinuerlig centrifugering over en "Ficoll"®-gradient i en IBM blodcelleseparator (IBM 2997), jvf. U. Feige og C. Sorg# J. Immunol. Methods _66, 161 (1984) .

5 De mononukleære celler vaskes i et spinnermedium: (seromed) hvorpå de stimuleres i en koncentration på 5 x 106 celler i 2 0,17 ml RPMI 1640 medium pr. cm dyrkningsbeholderareal i to timer med 0,67 pg concanavalin A pr. 10^ celler. RPMI 1640 mediet udskiftes med en ny portion, hvorpå der inkuberes i 20 10 timer ved 37°C med 5% CC^-beluftning, hvorved der fås en kultur supernatant, som indeholder lymphokinerne. Kultursuperna-tanten centrifugeres i 30 minutter ved 17.000 omdrejninger pr. minut (SS34 rotor, Sorvall-centrifuge) ved 4°C. Den cellefri supernatant afsaltes over "Sephadex"® G25, som er æquilibre-15 ret i 0,05M NH^HCOg, hvorpå den proteinholdige fraktion lyo-philiseres. Lyophilisatet optages i 0,01M natriumphosphatpuf-fer pH 7,5 tilsat 0,1M NaCl, og der kromatograferes i samme puffer over "Sephadex"® G100. Fraktionerne indeholdende human-MIF, som omfatter proteiner i molekylvægtområdet 8-14 kg/mol 20 (kilo-Dalton), hældes sammen og opkoncentreres ved en faktor 16 ved inddampning på en rotationsfordamper.

Eksempel 2

Fremstilling af hybridomacellerne 2.1 Konjugation af human-MIF indeholdende proteinfraktioner med 25 fåreerythrocyter.

2,5 ml pakkede fåreerythrocyter (sheep red blood cells, SRBC, Behringwerke) suspenderes i 20 ml PBS. 100 ul af denne SRBC-suspension inkuberes med 900 μΐ glutaraldehydopløsning i PBS i 5 minutter, således at slutkoncentrationen af glutaraldehyd 30 er 0,05%. Det på denne måde forbehandlede SRBC vaskes to gange med iskoldt destilleret vand, centrifugeres og inkuberes derpå i en time ved 20°C med 300 μΐ af den human-MIF-holdige fraktion fra eksempel 1. Denne suspension anvendes til immuniseringen .

22 DK 171646 B1 2.2 Immunisering

Balb/c-mus immuniseres ved 3 injektioner på hver 0,5 ml af den med human-MIF koblede SRBC-suspension fra eksempel 2.1 sammen med 0,5 ml komplet Freund's adjuvans på dag 0, 7 dg 10. Halvde-5 len af injektionsmængden injiceres intraperitonealt (i.p.), og den anden halvdel injiceres subkutant (s.c.) opdelt i fire portioner. To yderligere injektioner ("booster") hver på 0,5 ml konjugatsuspension uden adjuvans indgives intraperitonealt dag 13 og dag 14. På dag 18 udtages milten fra de behandlede 10 mus.

2.3 Cellefusion I overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Kohier og Milstein (G. Kohier og C. Milstein, Nature 256, 495 (1975)) blandes 108 7 miltlymfocyter med 3,3 x 10 musemyelomaceller P3-X63-Ag8.653 15 (J.F. Kearney, A. Radbruch, B. Liesegang og K. Rajewsky, J.

Immunol. 123, 1548 (1979)) i 1,5 ml 35% polyethylenglykolop-løsning 4000 (Merck, Darmstadt) og 9,7% dimethylsulfoxid i Dulbecco's Modified Eagle Medium. Efter fusionen anbringes cellerne i 600 huller på falcon 3040 96-hullers-plader og dyrkes 20 i Littlefields HAT-medium (hypoxanthin/aminopterin/thymidin-standardmedium) (J.W. Littlefield, Science 145, 709 (1974)) sammen med knoglemarvsmakrofager som Feeder-celler. Efter 10 dage i HAT-medium fortsættes dyrkningen i RPMI 1640 HT-medium.

Eksempel 3 25 Testning af hybridomacellerne for antistofspecificitet.

3.1 γ-globulin-påvisning

Supernatanterne fra hybridomacellekulturerne testes i en ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), ved hvilken der anvendes et med peroxidase konjugeret andet antistof fra kaniner, som 30 genkender og binder muse-y-globulin. Ud af 103 hybridomacelle-linier producerer 72 kloner γ-globuliner.

23 DK 171646 B1 3.2 Specificitet over for proteiner i det ønskede molekylvagt-område g

Syngene museerythrocyter (1 x 10 erythrocyter i 100 pi PBS pr. hul) anbringes på 96-hullers-plader (Dynatech Microtiter) 5 belagt med poly-L-lysin (25 mg/ml)/ og den inkuberes natten over ved 4°C. Ikke bundne erythrocyter fjernes ved flere ganges vaskning med PBS. De således bundne erythrocyter fikser es. som beskrevet i eksempel 2.1 i glutaraldehyd, vaskes, hvorpå der inkuberes med de human-MIF-holdige fraktioner i molekyl-10 vægtsområdet 8 til 14 kg/Mol (eksempel 1). Ikke bundet protein fjernes ved flere ganges vask, og pladerne anbringes i PBS indeholdende 0,1% NaN^. Pladerne inkuberes med kultursuperna-tanten fra hybridomacellerne og derpå med alkalisk phosphata-sekoblet kanin-anti-mus-immunglobulin-andet-antistof, og der 15 fremkaldes med p-nitrophenylphosphat i 2-amino-2-ethyl-l,3-propandiol-puffer (serva). Den frigjorte p-nitrophenol påvises fotometrisk ved 405 nm. Ved hjælp af den beskrevne ELISA genkendes monoklonale antistoffer, som binder til de erythro-cytkoblede proteiner i den human-MIF-indeholdende molekylvægts-20 fraktion fra eksempel 1. Af de 72 cellekloner, som udskiller γ-globuliner, producerer 15 kloner monoklonale antistoffer, som bindes ved denne analyse.

3.3 Specificitet over for human-MIF

γ-Globuliner fra dyrkningssupernatanterne fra de ifølge eksem-25 pel 3.2 identificerede kloner fældes med ammoniumsulfat ved 50% mætning, udfældningerne optages i PBS, hvorpå der kobles til "Affi-Gel"® 10 (Bio-Rad) under anvendelse af producentens forskrift. De således immobiliserede γ-globuliner inkuberes natten over ved 4°C med human-MIF-holdige supernatanter fra 30 med concanavalin A stimulerede mononukleære celler (eksempel 1), hvorpå der centrifugeres ved 3000 omdrejninger pr. minut og 4°C i 10 minutter i en IEC-centrifuge. Supernatanten testes derpå for restindhold af human-MIF ved anvendelse af MIF-testen ifølge eksempel 4. På denne måde identificeres en cel-35 lelinie med betegnelsen 1C5, som producerer monoklonale anti- 24 DK 171646 B1 stoffer mod human-MIF.

Eksempel 4

Test for human-roakrofag-migrationslnhiberingsfaktor (MIF-test) 4.1 Fremstilling af percoll-gradlenten 5 9 Dele "Percoll"· med en vægtfylde på 1,007 (pharmacia) 1 del 10-dobbelt koncentreret MEM Earl's Medium (seromed) og 10 dele spindermedium (seromed) blandes i 12 minutter ved 12.000 omdrejninger pr. minut i en sorvall centrifuge (DuPont) ved 20°C.

4.2 Målcelleudvinding til MIF-testen 10 Såkaldt "Buffy coat", som er et cellekoncentrat af hvide blodlegemer, fra 9-12 donore fortyndes med spinder-medium (seromed) i forholdet 1:2, blandingen opvarmes til 20°C og adskilles på "Ficoll paque"® (pharmacia) ved 20°C under anvendelse af producentens forskrift. De mononukleære celler fra interfasen 15 vaskes efter centrifugeringen to gange med det samme medium, hvorpå de adskilles i monocyter og lymphocyter i en ifølge eksempel 4.1 fremstillet percoll-gradient ved centrifugering i 40 minutter ved 20°C og 1600 omdrejninger pr. minut i en IEC-centrifuge. Monocyterne vaskes tre gange med spinder-me-20 dium, optages i McCoy's medium (seromed) tilsat 20% hesteserum og dyrkes natten ved 37°C og en C02~beluftning på 7% i samme medium i teflon-poser.

4.3 Gennemførelse af MIF-testen

De dyrkede monocyter fra eksempel 4.2 vaskes to gange i MEM- 25 dulbecco medium (seromed) og optages i en blanding af en del dobbeltkoncentreret MEM-dulbecco medium og en del 0,4% agarose 5 (miles), således at cellekoncentrationen udgør 5x10 celler pr. ml. Denne cellesuspension pipetteres dråbevis til 1 μΐ ved hjælp af en Hamilton-sprøjte til de inderste 60 huller 30 i en 96-hullers-plade (falcon, microtest III). Efter 15 mi- 25 DK 171646 B1 nutter ved 4°C er agarosen størknet. Derefter sættes til hvert hul 100 μΐ af prøveopløsningen. Som kontrolopløsning anvendes MEM-dulbecco medium, som et:tilsat 1% hesteserum. Der fremstilles fortyndninger af prøveopløsningerne i samme medium. Pladen 5 inkuberes i 15 timer ved 37°C i en fugtig atmosfære ved en C02-beluftning på 7%.

Monocyternes vandring fra agarose-dråberne måles ved hjælp af et skalainddelt trådkors i okularet i et mikroskop. Målingen gennemføres således, at man anbringer den ene akse i trådkor-10 set tangentielt til dråberanden og med den derpå vinkelret stående akse bestemmer strækningen fra dråberanden til vandringsgrænsen for cellerne. Cellernes vandring i kontrolopløsning, målt i skaladele, defineres som 100% vandring eller 0% vandringshæmning. Beregnet herpå udtrykkes de i prøveopløsning-15 erne opnåede vandringsretninger som procentvis hæmning af vandringen. En prøveopløsnings biologiske aktivitet udtrykkes 1 MIF-enheder. En MIF-enhed er defineret som den biologiske aktivitet, som ved den beskrevne test fremkalder en vandringshæmning på 30%. Antallet af MIF-enhéder i en prøveopløsning 20 svarer følgelig til den faktor, hvormed denne opløsning skal fortyndes, for at man netop opnår en vandringshæmning på 30%.

Eksempel 5

Isolering og rensning af monoklonale antistoffer fra ascites.

Balb/c mus forbehandles intraperitonealt med 0,4 ml pristan 25 (Carl Roth). Efter en uges forløb injiceres intraperitonealt 2 - 5 x 10^ klonede hybridoma-celler. Ascitesvæske udtages gentagne gange fra hver mus, og væskerne fryses ved -80°C.

Den samlede væske optøes og centrifugeres i 30 minutter ved 4°C med 16.000 omdrejninger pr. minut. Fedtet frasuges, og 30 til den tilbageblevne debris-fri supernatant sættes langsomt og dråbevis under omrøring ved 0°C en mættet ammoniumsulfat-opløsning,indtil koncentrationen er 50%. Den derved udfældede rå immunglobulinfraktion kromatograferes ved 0,1M tris-HCl (pH-værdi 8,2) over DEAE "Affi-Gel Blue"® (Bio-Rad) under 26 DK 171646 B1 anvendelse af producentens forskrift. Aktive fraktioner hældes sammen og koncentreres på et amicon XM50-filter (amicon).

Eksempel 6

Fremstilling af en antistofsøjle 5 "Affi-Gel"® 10 (Bio-Rad) vaskes under anvendelse af producentens forskrift med koldt destilleret vand og koblingspuffer pH 7,5 (MOPS, 3-(N-morpholino)propansulfonsyre). En 50% suspension af gelen i koblingspuffer (1 ml) overføres til et plastikrør, blandes med den samme mængde renset antistofopløs-10 ning (20 mg monoklonalt antistof 1C5) og røret roteres i 4 timer ved stuetemperatur. Derefter vaskes gelen med koblingspuffer. Til blokering af de stadigt frie aktive steder behandles gelen med 0,1 ml 1M ethanolamin-HCl (pH 8,0) pr. ml gel i 2 timer ved stuetemperatur, hvorpå der vaskes med PBS indehol-15 dende 10 mM natriumacid pr. ml gel, og der foretages opbevaring i samme væske ved 4°C. Koblingsgraden bestemmes ved måling af extinktionen ved 280 nm og udgør 12 til 30 mg monoklonalt antistof pr. ml gel.

Eksempie 7

20 Isolering og rensning af human-MIF-proteiner 7.1 Produktion af human-MIF

1011 mononukleære celler isoleres under anvendelse af den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde fra såkaldt "buffy coat”, og der foretages stimulering med concanavalin A (conA) til 25 lymphokinproduktion. De stimulerede celler dyrkes i nunc-be- 2 holderstabler med et dyrkningsareal på 6.000 cm ved en cellekoncentration på 5 x 10^ celler i 0,25 ml medium RPMI 1640 2 o pr. cm overflade ved 37 C i 24 timer og med en C02”beluft-ning på 5%. Derpå centrifugeres celledyrkningssupernatanten 30 i 30 minutter ved 35.000 G og 4°C. Til den klare supernatant sættes phenylmethansulfonylfluorid, en serinprotease-inhibi- 27 DK 171646 B1 tor, (slutkoncentration: 50 μΜοΙ/l) og natriumazid (slutkon-centration: 0,05%).

7.2 Koncentrering af celledyrkningssupernatanten.

Celledyrkningssupernatanterne fra eksempel 7.1 koncentreres 5 med en faktor 15 ved ultrafiltrering i en amicon rørcelle over en YMS-raembran (nominel adskillelsesgrænse: molekylvægt 5 kg/Mol). For at undgå tab ved adsorption og for at modvirke en eventuel aggregering af proteinerne gennemføres ultrafiltreringen under tilsætning af "Triton"® X-100 (alkylphenyl-10 polyethylenglykol, Rohm & Haas), idet slutkoncentrationen af "Triton"® X-100 udgør ca. 0,2% (w/r). Koncentratet centrifugeres ved 35.000 G og filtreres gennem et 0,25 pm filter (milliporet).

7.3 Immunaffinitetskromatografi

15 1 1 af lymphokinkoncentratet fra eksempel 7.2 pumpes ved 4°C

med en strømningshastighed på ca. 10 ml pr. time gennem en antistofsøjle (eksempel 6) indeholdende 4 ml gel med en koblingsgrad på 12 mg antistof pr. ml gel. Uspicifikt bundne proteiner og ledsagestoffer elueres fra søjlen ved vaskning 20 med 100 ml PBS/ 0,5 M NaCl/ 0,2% "Triton"® X-100/ 0,02% natriumazid, pH 7,3, derefter med 20 ml PBS og til sidst med 10 ml 0,1 M NaCl med en strømningshastighed på 15 ml pr. time. De specifikt bundne human-MIF-proteiner elueres med en opløsning af 0,1 M glycin-hydrochlorid (0,1 M NaCl, pH-værdi 25 2,6, idet elueringen følges ved automatisk måling af absorp tionen ved 280 nm (Uvicord S, LKB Instruments). For at undgå tab ved adsorption opfanges eluatet fraktionsvis (3 ml) i polypropylen-rør, som hver indeholder 100 μΐ 3% SDS-opløsning.

De proteinholdige fraktioner hældes sammen og neutraliseres 30 ved tilsætning af 1 M tris-opløsning.

7.4 Elektrodialyse, elektroforetisk koncentrering

Det neutraliserede eluat fra eksempel 7.3 elueres på en "ISCO

28 DK 171646 B1

Electrophoretic Concentrator" model 1750 (Isco. Inc.) og en "Spectrapor"® -membran (Spectrum Medical Industries) med en nominel adskillelsesgrænse molekylvægt 3,5 kg/Mol mod 25 mM ammoniumacetat/O,01% SDS, pH-værdi 8,3, og der koncentreres 5 samtidig til et rumfang på 0,2 ml. Det dialyserede koncentrat inddampes til tørhed i en vacuumcentrifuge (Speed Vac Concentrator, Savant Inc.) for at fjerne ammoniumacetatet.

7.5 Analyse af MIF-proteinerne ved SDS-polyacrylamidgelelek-troforese (SDS-PAGE).

10 En portion (ca. 2%) af det dialyserede koncentrat (eksempel 7.4) underkastes en elektroforese på 15% polyacrylamid-pla-degel under anvendelse af fremgangsmåde ifølge Laemmli (U.K. Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)). Proteinbåndene gøres synlige ved farvning med comassie brillantblåt (Fluka) og med 15 sølvfarvningsmetode ifølge C.R. Merril et al. (Anal. Biochem. 110, 201 (1981)). Det fra antistofsøjlen eluerede materiale indeholder derefter proteiner med en molekylvægt på ca. „ 8 kg/Mol og ca. 14 kg/Mol, endvidere relativt små mængder med en molekylvægt på ca. 28 kg/Mol og ca. 45 kg/Mol.

20 7.6 Karakterisering af MIF-aktiviteten af de ved immunaffini- tetskromatografi isolerede proteiner.

En tabsfattig præparativ adskillelse og isolering af enkeltproteinerne i human-MIF gennemføres fordelagtigt i nærværelse af et detergens, f.eks. af SDS (se eksempel 7.3, 7.4 og 7.7).

25 Proteinernes MIF-aktivitet nedbrydes ved vekselvirkning med SDS. MIF-aktiviteten tillægges de enkelte molekylvægtsfraktioner ved hjælp af biosyntetisk radioaktivt mærkede lymphoki- g ner på følgende måde: 10 humane mononukleære celler suspenderes i 5 ml RPMI 1640 medium, som indeholder 3 pg concanava-30 lin A pr. ml, og der inkuberes i en cellekulturbeholder med en overflade på 25 cm ("Nuncolon"®TC 25) i 2 timer ved 37°C under en CC^-beluftning på 5%. Derefter fjernes mediet, og cellerne dyrkes i 20 timer i leucin-frit RPMI 1640 medium, 14 som er tilsat 10 pCi L-[U- C] leucin (amersham) pr. ml. Den 29 DK 171646 B1 radioaktive cellekultursupernatant blandes med 500 ml ikke-mærket cellekultursupernatant/ som indeholder human-MIF (eksempel 7.1), og der koncentreres til en faktor 15 som beskrevet i eksempel 7.2. Analogt med den i eksempel 7.3 be^ 5 skrevne fremgangsmåde isoleres human-MIF-proteinérne ved immunaffinitetskromatografi med en søjle, som indeholder 0,5 ml gel, idet eluatet opfanges uden SDS-tilsætning. Efter neutralisering med 1 M tris-opløsning overføres eluatet ved kromatografi på en "Sephadex"*G 25 søjle (pharmacia) i 50 mM ammo-10 niohydrogencarbonatopløsning og lyofiliseres. Remanensen opløses i 0,5 ml PBS og centrifugeres ved ca. 35.000 G. En portion på 0,1 ml fraktioneres ved hjælp af HPLC på en "Bio-Sil”® TSK-125 søjle (7,5 x 300 mm, biorad). Fraktionerne karakteriseres ved måling af radioaktiviteten (som udtryk for mærkede 15 proteiner) og ved bestemmelse af MIF-aktiviteten (eksempel 4). Radioaktiviteten og MIF-aktiviteten findes i de samme fraktioner, hvis position svarer til molekylvægtsområderen på hhv. ca. 8 kg/Mol og ca. 14 kg/Mol. En portion af det radioaktive eluat underkastes SDS-PAGE analogt med den i eksempel 7.5 be-20 skrevne fremgangsmåde. De radioaktive proteiner gøres synlige ved autoradiografi. Der fremkommer kraftige bånd i molekylvægtsområderne på hhv. ca. 8 kg/Mol og ca. 14 kg/Mol og svagere bånd i områderne på hhv. ca. 28 kg/Mol og ca. 45 kg/Mol.

7.7 Præparativ adskillelse af human-MIF-proteinerne ved SDS-25 PAGE og isolering ved elektroeluering.

Et ifølge eksempel 7.4 fremstillet materiale udfra ca. 50 1 cellekultursupernatanter adskilles ved SDS-PAGE i et diskontinuerligt puffersystem under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Laemmli (Nature 227, 680 (1970)) i et vertikalt slab-30 gel-elektroforese-system. Prøven opløses i 300 μΐ af en pufferopløsning med sammensætningen 0,05 M tris.HCl/ 3% (v/r) SDS/ 0,02 M dithiothreitol/10% (r/r) glycerol, pH-værdi 6,8, og påføresi en bredde på 1,5 cm på den 1,5 mm tykke gel indeholdende 15% acrylamid. For at forebygge en eventuel derivati-35 sering af proteinerne med frie radikaler og oxidationsmidler i gelen, sættes natriumthioglycolat til katodepufferen i en 30 DK 171646 B1 koncentration på 0,1 mM, jvf. M.W. Hunkapiller et al.,

Methods in Enzymology 91, 227 (1983). Til synliggørelse af proteinerne anbringes gelen i 5 minutter i en iskold 0,25 M KCL-opløsning, jvf. D.A. Hager og R.R. Burgess, Anal. Biochem.

5 109, 76 (1980). Der udskæres synlige bånd i molekylvægtsområ det på hhv. 8 kg/Mol og 14 kg/Mol, og proteinerne elueres fra gelen under anvendelse af den af Bhown et al. beskrevne teknik, jvf. Anal. Biochem 103, 184 (1980). Hertil elueres proteinerne i en "ISCO Electrophoretic Concentrator", model 1750 10 (Isco Inc.) med en "Spectropro"®-membran (Spectrum Medical

Industries, nominel adskillelsesgrænse 3,5 kg/Mol) ved en kapacitet på 2 watt med 0,05 M ammoniumaccetat/ 0,01% SDS i 8 timer. De eluerede proteiner findes i den såkaldte "sampling cup" i et rumfang på ca. 150 μΐ og er fri for pufferstoffer 15 (glycin, tris). Til fjernelse af ammoniumaccetatet inddampes elektroeluatet til tørhed i en vacuumcentrifuge (Speed Vac Concentrator, Savant Inc.).

Homogeniteten af de eluerede proteiner og udbytterne efterprøves, idet ca. 5% af eluatet underkastes en analytisk SDS-20 PAGE (eksempel 7.5), idet der parallelt med prøverne foretages elektroforese af definerede mængder af proteiner med kendte molekylvægte. SDS-PAGE viser i eluatet fra molekylvægtsområdet 8 kg/Mol et homogent proteinbånd og i eluatet fra molekylvægtsområdet 14 kg/Mol et homogent bånd.

25 7.8 Præparativ adskillelse og isolering af human-MIF-protei- nerne ved gel-filtrering-HPLC.

2 1 koncentrat af human-MIF-holdig kultursupernatant fra eksempel 7.2 pumpes med en strømningshastighed på ca. 15 ml pr. time gennem en antistofsøjle (eksempel 6) indeholdende 5 ml 30 gel med en koblingsgrad på ca. 12 mg 1C5 antistof pr. ml gel. Søjlen vaskes analogt med den i eksempel 7.3 beskrevne fremgangsmåde, og de specifikt bundne human-MIF-proteiner elueres med 0,1 M glycin-hydrochlorid/ 0,1 M NaCl, pH-værdi 2,6, idet eluatet opfanges fraktionsvis i polypropylenrør uden tilsæt-35 ning af SDS. Elueringen følges med måling af absorptionen ved 31 DK 171646 B1 280 nm og ved bestemmelse af MIF-aktiviteten (eksempel 4).

De sammenblandede eluater fra 4 blandinger (fra ialt 8 1 kul-tursupernatantkoncentrat) dialyseres analogt med den i eksempel 7.4 beskrevne fremgangsmåde mod 0,005 M ammoniumåcetat, 5 pH-værdi 7,5, og koncentreres samtidig til et rumfang på 0,2 ml. Koncentratet anbringes på en med 0,05 M ammoniumacetat, pH-værdi 7,5, æquilibreret HPLC-søjle (9,5 mm x 500mm) indeholdende "Si 300 Polyol"® 0,003 ram (Serva, Heidelberg, BRD), og der elueres ved et tryk på 40 bar og en gennemstrøm-10 ningshastighed på 0,03 ml pr. minut med 0,05 M ammoniumacetat, pH-værdi 7,5. Elueringen følges ved måling af absorptionen ved 280 nm, ved bestemmelse af MIF-aktiviteten (eksempel 4) og ved enzymimmunoanalysen ifølge eksempel 10. Hovedmængden af proteinindholdet og MIF-aktiviteten forekommer i fraktio-15 ner, hvis position svarer molekylvægtsområder på hhv. ca.

8 kg/Mol og ca. 14 kg/Mol. Mindre mængder bestemmes i fraktioner i molekylvægtsområdet på hhv. ca. 28 kg/Mol og ca. 45 kg/Mol. Til fjernelse af ammoniumacetatet gentages lyofilise-ringen af de human-MIF-protein-holdige fraktioner.

20 Eksempel 8

Aminosyresekvensanalyse 8.1 MIF-protein med molekylvægt på 8 kg/Mol

Det rensede protein med en molekylvægt på 8 kg/Mol fra eksempel 7.7 sekvenseres med en "Gas-phase Protein Sequencer Model 25 470" (Applied Biosystems) under anvendelse af fremgangsmåden ifølge M.W. Hunkapiller og L.E. Hood, jvf. Methods in Enzymo-logy 9_1, 399 (1983) . Omlejringen af anilino-thiacolinon-deri-vaterne til phenylthiohydantoin-(PTH)-aminosyrer gennemføres ved behandling med 25% trifluoreddikesyre ved 50°C. PTH-ami-30 nosyrerne analyseres på en "Zorbax CN"® søjle (Du Pont, 200 x 4,6 mm), jvf. R. Knecht et al., Anal. Biochem. 130, 65 (1983). Følgende entydige N-terminale aminosyresekvens bestemmes : 32 DK 171646 B1 5 10 15

Met-leu-thr-glu-leu-glu-lys-ala-leu-asn-ser-ile-ile-asp-val- 20 25 30 tyr-his-lys-tyr-ser-leu-ile-lys-gly-asn-phe-his-ala-val-tyr- 35 40 45 arg-asp-asp-leu-lys-lys-leu-leu-glu-thr-glu-X^2”Pro~9ln“tyr” ile-arg-lys-lys-gfy-ala-asp-val-trp-jMe-lys-glu-leu-asp-ife- 5 asn-X.-o-Xc-.-X^.-afa-val.

62 63 64 X^2 betyder ser eller cys. X^* xg3 °9 X64 an9Fiver ubestemte aminosyrer.

8.2 MIF-protein med molekylvægt på 14 kg/Mol

Det rensede protein med en molekylvægt på 14 kg/Mol fra ek-10 sempel 7.7 sekvenseres analogt med den oven for i eksempel 8.1 beskrevne fremgangsmåde. Følgende entydige N-terminale aminosyresekvens bestemmes: 5 10 15 X^-leu-thr-glu-leu-glu-lys-ala-leu-asn-ser-ile-ile-asp-val- tyr-his-lys-tyr 15 X^ betyder en ubestemt aminosyre.

Eksempel 9

Fremstilling af monoklonale antistoffer mod muse-MIF.

9.1 Udvinding af protein-fraktioner indeholdende muse-MIF.

Under anvendelse af den af C. Sorg (Molecular Immunology 17, 20 565 (1980)) beskrevne fremgangsmåde fremstilles ved stimule ring af miltceller fra 100 balb/c-mus med concanavalin A en cellesupernatant, der efter kromatografi på "Sephadex"® G 100 giver ca. 50 ml af en opløsning, som indeholder muse-MIF-pro-teiner i molekylvægtsområdet fra 40 til 70 kg/Mol.

25 9.2 Konjugering af muse-MIF indeholdende proteinfraktioner med fåreerythrocyter.

Fraktionerne fra eksempel 9.1 inddampes til et samlet rumfang på 4,5 ml og kobles analogt med den i eksempel 2.1 beskrevne fremgangsmåde med glutaraldehydbehandlede fåreerythro- 33 DK 171646 B1 cyter (SRBC).

9.3 Immunisering af rotter.

DA-rotter immuniseres véd syv injektioner af 0,5'ml af den med muse-MIF-koblede SRBC-suspension fra eksempel 9.2 sammen 5 med 0,5 ml komplet Freund's adjuvans på dag 0, 10, 43 og ;309. Halvdelen af injektionsmængden indgives intraperitonealt (i.p), og den anden halvdel indgives subkutant i fire portioner (s.c). Yderligere ("booster") injektioner af 0,5 ml konjugatsuspen-sion uden adjuvans indgives intraperitonealt på dag 312, dag 10 313 og dag 314. På dag 317 udtages milten fra de behandlede rotter.

9.4 Cellefusion.

Analogt med den i eksempel 2.3 beskrevne fremgangsmåde fusio- g neres 1,14 x 10 miltlymfocyter fra immuniserede rotter med 7 15 3,5 x 10 musemyleomaceller P3-X63-Af8.653, og der foretages dyrkning i HAT-medium.

9.5 Selektionering af hybridomaceller, som udskiller antistoffer med ønsket specificitet.

Analogt med den i eksempel 3.1 og 3.2 beskrevne fremgangsmå-20 de udvælges blandt de ialt 244 ifølge eksempel 9.4 udvundne hybridomacellelinier 49 kloner, som udskiller monoklonale antistoffer, der binder til med rotteerythrocyter koblede proteiner (kobling analog eksempel 9.2) fra fraktioner indeholdende muse-MIF. γ-Globuliner fra kultursupernatanterne fra disse 25 49 cellekloner kobles under anvendelse af fremgangsmåden iføl ge eksempel 3.3 på "Affi-Gel"® 10 (bio-rad) og inkuberes med muse-MIF-holdige supernatanter fra med concanavalin A stimulerede miltceller (eksempel 9.1). Supernatanten testes derefter for restindhold af muse-MIF. Indholdet af muse-MIF bestem-30 mes ved en analogtmed eksempel 4.3 gennemført MIF-test, idet der i stedet for de dyrkede human-monocyter dog anvendes peri-toneale muse-makrofager, som optages i MEM-dulbecco medium in- 34 DK 171646 B1 deholdende 10% FCS og fikseres i agarase-dråber.

Ved hjælp af denne selektioneringsfremgangsmåde identificeres 6 hybridomacellelinier, herunder celleklonen med betegnelsen 7D10, som producerer monoklonale antistoffer mod'musé-MIF.

5 Disse antistoffer binder ligeledes human-MIF i en MIF-test ifølge eksempel 4, dvs. de udviser krydsaktivitet.

9.6 Isolering og rensning af de monoklonale antistoffer fra ascites.

Analogt med den i eksempel 5 beskrevne fremgangsmåde injice-10 res med pristan forbehandlede balb/c-mus (nu/nu) intraperito- 7 nealt med 1 x 10 klonede hybridoma-celler, og antistofferne udvindes fra ascitesvæsken.

Eksempel 10

Enzymimmunoanalyse til bestemmelse af human-MIF (MIF-ELISA) .

15 Portioner på 100 μΐ af en renset antistofopløsning 1C5 (anti-human-MIF) med en koncentration på 10 pg/ml inkuberes i hullerne på en 96-huUers-mikrotiterplade (Costar, Technorama) i 1 time ved 37°C. Pladerne vaskes tre gange med PGT-20-puffer (PBS tilsat 0,2% gelatine (Merck) og 0,05% "Tween"® 20) og 20 afmættes for endnu tilstedeværende proteinreaktive bindingssteder i pladebunden ved inkubation med 250 μΐ PGT-20-puffer pr. hul i 1 time ved 37°C. Portioner på 50 μΐ af fortyndningsrækker af en prøveopløsning og en standardopløsning indeholdende human-MIF inkuberes ihullerne i mikrotiterpladerne i 1 time ved 25 37°C. Ikke-bundne dele bortvaskes ved vaskning tre gange med PGT-20-puffer, hvorpå der inkuberes med 50|il af en opløsning af et af antistof 7D10 (antimuse-MIF, krydsreaktivt med human-MIF) og biotin-N-hydroxysuccinimidylester (Medac, mol-forhold biotin til antistof 7D10 =4-7:1) i PBS fremstillet og 30 over "Sephadex"® G 25 renset konjugat (10 pg/ml i fordybningerne i 30 minuter ved 37°C. Efter vaskning af pladerne tre gange med PGT-20-puffer omsættes de på pladerne bundne biotin- 35 DK 171646 B1 antistof-konjugater ved inkubation (30 minutter ved 37°C) med 100 μ.1 af en 1:3000 gange fortyndet opløsning af et avidin-peberrodsperoxidase-konjugat (0,3 μΐ/ml) (sigma). Den optagne mængde enzym bestemmes efter vaskning af pladen ved frem-5 kaldelse (30 minutter ved 37°C) med en opløsning af 2,2'-aci-no-bis-(3-ethylbenzothiacolin-6-sulfonsyre)-diammoniumsalt (ABTS, Boehringer Mannheim, 55 mg i 100 ml citrat/phosphat-puffer, 0,05 M citrat, 0,1 M Na2HP04, pH-værdi 4,0, indeholdende 16 μΐ 30% H202) og en fotometrisk måling ved 405 nm.

10 i stedet for biotin-antistof 7D10-konjugatet kan der også anvendes ét analogt fremstillet biotin-antistof lC5-konjugat, men en på denne måde gennemført ELISA viser dog en ringere følsomhed for human-MIF.

Eksempel 11 15 Testudstyr for MIF-ELISA.

Et testudstyr for den i eksempel 10 beskrevne enzymimmunoana-lyse indeholder følgende: mikrotiterplader af polypropylen 20 ml opløsning af det monoklonale antistof 1C5 (10 pg/ml) 20 10 ml opløsning af et biotin-konjugat med det monoklonale antistof 7D10 (molforhold biotin til antistof 7D10 = 5: 1, 10 pg/ml) 1 ml opløsning af et avidin-peberrodsperoxidase-konjugat (0,3 pg/ml) 25 li mg 2,2-acino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsyre)-diammoniumsalt 20 ml citrat/phosphat-puffer (0,05 M citrat / 0,1 M Na2HP04)

1 ml 30% H202 100 ml PBS

30 200 ml PTG-20-puffer (PBS indeholdende 0,2% gelatine og 0,05% "Tween"® 20).

Claims (22)

1. Renset human-MIF, kendetegnet ved, at den kun indeholder proteiner af human oprindelse, som udviser epitoper, der genkendes og bindes af det monoklonalé anti- 5 stof 1C5 mod human-MIF, og er aktivt i standardtestmetoder, hvor der foretages måling af vandringen af makrofager, og dens enkeltproteiner.

2. Renset human-MIF ifølge krav 1, kendeteg- 10 net ved, at den består af mindst fire enkeltproteiner med en molekylvægt på ca. 8, ca. 14, ca. 28 og ca. 45 kg/mol og eventuelt andre enkeltproteiner eller oligomere proteinaggregater med en molekylvægt på mere end ca. 45 kg/mol.

3. Protein ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har den N-terminale aminosyresekvens X^-leu-thr-glu-leu-glu-lys-ala-leu-asn-ser-ile-ile-asp-val-tyr-his-lys-tyr, hvori betydningen af aminosyren X1 ikke er fastlagt. 20

4 . Protein ifølge krav 1 eller 3, kendetegnet ved, at det har den N-terminale aminosyresekvens met-leu-thr-glu-leu-glu-lys-ala-leu-a^sn-ser-ile-ile-asp-val-tyr-his-lys- tyr-s2er-leu-ile-lys-gly-a2sn-phe-his-ala-val-tyr-arg-asp-asp- 35 40 45 leu-lys-lys-leu-leu-glu-tnr-glu-X^-pro-gln-tyr-ile-arg-lys- 25 lys-g^Py-ala-asp-val-trp-p^e-lys-glu-leu-asp-iTe-asn-X62-X62~ Xg^-a^a-val, hvori betydningen af aminosyrerne X^2, X62' X63 og Xg^ ikke er fastlagt, idet dog X^2 kun kan betyde ser eller cys.

5. Protein ifølge krav 1, 3 eller 4, kendetegnet ved, at det har en omtrentlig molekylvægt på 8 kg/Mol.

6. Protein ifølge krav 1 eller 3, kendetegnet ved, at det har en omtrentlig molekylvægt på 14 kg/Mol. 35 DK 171646 Bl

7. Fremgangsmåde til fremstilling af renset human-MIF og dens enkeltproteiner, kendetegnet ved, at en human-MIF-holdig opløsning, eventuelt efter i og for sig kendte rensningstrin, 5 a) bringes i kontakt med bæremateriale med på human-MIF specifikke monoklonale antistoffer, ikke-bundne proteiner og andre fremmedstoffer fjernes, og den til antistofferne bundne human-MIF fraspaltes selektivt og isoleres og b) om ønsket, den rensede human-MIF adskilles i dens enkelt-10 proteiner.

8. Monoklonale antistoffer mod human-makrofag-migrations-inhiberingsfaktor (human-MIF).

9. Monoklonalt antistof ifølge krav 8, kendeteg net ved, at det er det monoklonale antistof 1C5.

10. Monoklonalt antistof ifølge krav 8, kendetegnet ved, at det er det monoklonale antistof 7D10. 20

11. Fremgangsmåde til fremstilling af monoklonale antistoffer ifølge krav 8, kendetegnet ved, at hybri-domaceller, som producerer disse monoklonale antistoffer, a) dyrkes in vitro, og de monoklonale antistoffer isoleres 25 fra dyrkningssupernatanterne eller b) formeres in vivo i et egnet pattedyr, og de monoklonale antistoffer isoleres fra dette pattedyrs legemsvæsker.

12. Hybridomacellelinier, kendetegnet ved, at 30 de producerer monoklonale antistoffer mod human-MIF.

13. Hybridomacelleliner ifølge krav 12, kendetegnet ved, at de er hybrider af musemyelomaceller og muse-lymfocyter. 35 DK 171646 B1

14. Hybridomacellelinier ifølge krav 12, kendetegnet ved, at de er hybrider af musemyelornaceller og rotte-lyrafocyter.

15. Hybridomacellelinie ifølge krav 12, kendeteg net ved, at den er hybridomacellelinien 1C5, som er deponeret i "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" i Pasteur Instituttet i Paris under nummeret 1-316.

16. Hybridomacellelinie ifølge krav 12, kendeteg net ved, at den er hybridomacellelinien 7D10, der er deponeret i "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" i Pasteur Instituttet i Paris under nummeret 1-418.

17. Fremgangsmåde til fremstilling af hybridomaceller ifølge krav 12, kendetegnet ved, at man immuniserer egnede pattedyr med MIF eller MIF-konjugater, fusionerer antistofproducerende celler udtaget fra pattedyret med myelo-maceller, kloner de dannede hybridomaceller og selekterer 20 de cellekloner, som producerer de ønskede antistoffer.

18. Anvendelse af monoklonale antistoffer ifølge krav 8 til kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af human-MIF.

19. Testudstyr til kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af human-MIF, kendetegnet ved, at det indeholder monoklonale antistoffer ifølge krav 8 og eventuelt hjælpemidler .

20. Anvendelse af monoklonale antistoffer og derivater ifølge krav 8 til rensning af human-MIF.

21. Farmaceutiske præparater, kendetegnet ved, at de indeholder en terapeutisk virksom mængde renset 35 human-MIF eller dens enkeltproteiner ifølge krav 1 og en signifikant mængde farmaceutisk hjælpemiddel. DK 171646 B1

22. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder en terapeutisk virksom mængde monoklonalt antistof mod human-MIF ifølge krav 8 og en signifikant mængde farmaceutisk hjælpemiddel. 5