JPH04155258A - Ｉｌ―２抗体及びヒトｉｌ―２の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒトＩＬ−２（インターロイキン−２）活性
を有するポリペプチドとアスカリス抽出蛋白との結合蛋
白からなる免疫抗原、これを利用して得られる抗ヒトＩ
Ｌ−２モノクローナル抗体及び該抗体を利用して、生体
内ヒトＩ　Ｌ−２等の微量のＴＬ−２をも測定可能な高
精度且つ高感度なヒトＩＬ−２の測定方法に関する。

従来の技術 サイト力インは、免疫系の細胞間相互作用における液性
伝達物質で、それ自体は抗体とは異なり外来抗原に非特
異的に作用する液性因子を総称するものであり、主に生
体の液性免疫、細胞性免疫等の増強調節を通じて、生体
防御機構の中心的な調整役を担っている。

上記サイトカインの内、主にＴ細胞、Ｂ細胞系から産生
される一群をリンホカインと呼び、この内特に単球、マ
クロファージ系の細胞から主に産生されるものをモノ力
インと呼び、上記以外の細胞から産生されるものをサイ
ト力インと呼び、之等をそれらの起源細胞の違いによっ
て分類する場合もある。之等とは別にインターロイキン
（ＩＬ）と呼ばれる名称があり、これには代表的にはイ
ンターロイキン〜２　（ＩＬ−２）が包含される。該Ｉ
　Ｌ−２とは、当初レクチン刺激された末梢血リンパ球
培養上清中に存在し、Ｔ細胞の分裂、増殖を促進し、Ｔ
細胞の長期培養を可能とする作用を報告され、Ｔ細胞増
殖抑制因子（Ｔ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏ賢ｔｈｆａｃｔｏｒ
　：　ＴＣＧＦ　）と呼ばれたが、１９７９年の国際リ
ンホカインワークショップにおいて、上記の通りその名
称を統一されたものである。上記ＩＬ−２は、またＴ細
胞の分裂、増殖促進作用の他に、細胞障害性Ｔ細胞の活
性化、Ｂ細胞からのイムノグロブリン産生増強、ＮＫ細
胞、ＬＡＫ細胞等の活性化等の各種の生物活性作用を有
することが判っている。

また最近、ローゼンベルグらによりＩＬ−２の癌治療へ
の応用も試みられており（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　Ｓ。

Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、
、　３１６．８８９　（１９８７））、該Ｉ　Ｌ−２は
臨床応用においても重要なサイトカインとされつつある
。

しかしながら、ＩＬ−２を含めたサイト力インは、上記
したように非常に多くの細胞群に対して働くばかりでな
く、複数のサイトカインがある種の細胞群に対して同じ
作用を持っていることがあり、このため単一のサイト力
インの作用のみでは、免疫系の賦活化を論じることがで
きなくなってき　、ており、現在では多くのサイト力イ
ンが互いに関連し合って複雑なサイトカインネットワー
クを形成して巧妙に生体防御機構を調整しているものと
考えられている。これまでに、ｒ　Ｌ−２を始めとして
ＩＬは既にｒＬ−１〜ｒＬ−１０が報告され、インター
フェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）　、コロ
ニー刺激因子（ＣＳ　Ｆ）等の約２０種近くのサイト力
インの存在が報告されている。

現在、上記したようにサイトカインは、その免疫増強作
用や抗腫瘍作用に注目して治療薬としての応用開発が検
討されているが、その生理活性については、いまだ十分
に解明されているとは言えず、今後も更なる研究が行な
われるものと考えられる。しかるに、こうしたサイト力
インの研究においてその発展を妨げている要因の一つに
感度、特異性、精度、再現性等に優れた測定系のなかっ
たことが挙げられる。即ち、従来サイト力インの定量に
ついては、以下に示すようにサイト力イン自身が持つ生
物活性を指標としたバイオアッセイ法（Ｂｉｏ−ａｓｓ
ａｙ）　Ｍ主流テア−）　タ。

１・　サイト力イン依存性細胞を用いた増殖活性の測定 ２、サイトカインの抗腫瘍性を用いた癌細胞の増殖阻止
活性の測定 ３−サイト力インの作用により二次的に産生されるイム
ノグロブリンＧ（ＩｇＧ）等の液性因子の定量 しかして、現在ＩＬ−２の測定技術としては、上記バイ
オアッセイ法［例えばＪ、　ＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏ
ｄ、　６５．５５　（１９８３）等参照］や免疫学的測
定法［例えばＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄ、
　７４．３９　（１９８４）等参照］が知られており、
特に後者の方法は、前者に比し簡便且つ正確であるとし
て、例えば試験品もしくは工業的に生産したヒトＴＬ−
２標品の測定やそれらを用いた試験系におけるヒトＩＬ
−２濃度の測定等に利用されている。しかしながら、該
方法はその測定感度か低いという致命的欠点を有してお
り、例えば臨床サンプル等の微量のヒトＩＬ−２を含有
するサンプル中の該ヒトＩ　Ｌ−２の測定には到底利用
できない。

かかる臨床サンプル等の上記免疫学的定量法における測
定限界をはるかに越える低濃度サンプル中のヒトＴ　Ｌ
−２含量の測定は、前記バイオアッセイ法に頼らざるを
得ない現状にあるが、このバイオアッセイ法は、操作が
非常に繁雑で、正確性に劣り、更に測定値を干渉する物
質の存在を常に考慮する必要があり、多くの生理活性が
混在する臨床サンプル等においては、実際上、多くの課
題を残している。このため、感度、特異性、精度、再現
性等に優れたヒトＴ　Ｌ−２のイムノアッセイ系の開発
が当業界で望まれている現状にある。

発明が解決しようとする問題点 本発明は、上記現状において、従来技術の欠点を全て解
決し、ヒ）　Ｉ　Ｌ−２に特異性が高く、臨床サンプル
等の低ＩＬ−２含量サンプル中の該Ｉ　Ｌ−２の測定を
も充分可能とする高感度、高精度でしかも簡便な新規な
ヒトＩ　Ｌ−２測定技術、該測定のためのヒトＩＩ、−
２に特異な反応性を有する新しいモノクローナル抗体及
びその免疫原を提供することを目的とする。

問題点を解決するための手段 本発明によれば、ヒトＩ　Ｌ−２活性を有するポリペプ
チドとアスカリス抽出蛋白との結合蛋白（以下これをＩ
Ｔ　Ｌ−２関連蛋白」と言うことがある）からなること
を特徴とする抗ヒトＩ　Ｌ−２抗体製造のための免疫抗
原、該免疫抗原を用いて得られ、ヒ）　Ｉ　Ｌ−２に特
異反応性を有することを特徴とする抗ヒトｒＬ−２モノ
クローナル抗体、及び酵素免疫測定法において、上記モ
ノクローナル抗体を固相化した第１抗体と、抗ヒ）　Ｉ
　Ｌ−２ポリクローナル抗体である第２抗体とを用い、
標識抗体と上記第２抗体とを反応させる３ステ１．プサ
ンドイッチ法を採用することを特徴とする抗ヒトＩ　Ｌ
−２の測定法が提供される。

上記本発明抗原の利用によれば、ヒトＩ　Ｌ−２活性物
とアスカリス抽出蛋白との結合蛋白であるＩＬ−２関連
蛋白を用いたことに基いて、ヒトＩ　Ｌ−２に特異反応
性を有する抗体を容易に大量にしかも安定して収得する
ことができる。

かくして得られる抗体は、これを例えば通常の酵素免疫
測定法としてのサンドイツチ法等における特異抗体とし
て利用することによって、ヒトＩ　Ｌ−２を含む各種臨
床サンプル等の検体中のヒトＩ　Ｌ−２の定量が可能で
あり、ヒトＩ　Ｌ−２に関連する疾患の診断、研究等に
有効である。

また、本発明抗体はこれを例えばアフィニティークロマ
トグラフィー用担体と結合させて、該クロマトグラフィ
ーに利用する等により、ヒトＩＬ−２の特異的精製手段
をも提供し得る。

尚、以下の本明細書において、アミノ酸、ペプチド、そ
の他に関して略号で表示する場合は、ＩＵＰＡＣ及びＩ
ＵＰＡＣ−ＩＵＢによる命名法又は規定或は当該分野に
おける慣用記号に従うものとする。また、アミノ酸等に
関して光学異性体があり得る場合、特に明記しなければ
Ｌ一体を示すものとする。塩基配列における核酸の表示
や制限酵素等の試薬の表示も同様に慣用される略号によ
るものとする。

以下、本発明抗原、これを利用して本発明抗体を製造す
る方法及びかくして得られる本発明抗体の利用による酵
素免疫法につき順次詳述する。

本発明抗体は、特定の融合細胞より得られる。

該融合細胞を得るための一方の親細胞としては、ヒ）　
Ｉ　Ｌ−２関連蛋白で免疫した咄乳動物の免疫細胞を用
いることかできる。該免疫細胞は、ＩＬ−２関連蛋白を
免疫抗原として用いて通常の方法に従い調整される。本
発明抗体の製造に当り、ハプテンとして用いられるヒト
Ｔ　Ｌ−２活性を有するポリペプチドとしては、特に限
定はなく、公知のインビトロで誘導されたヒトＩ　Ｌ−
２を含有する培養上清及びその精製品、例えば特開昭６
２−１８５０９８号公報に記載の遺伝子組換え技術に従
い製造されたヒトＩ　Ｌ−２及びその同効物（リコンビ
ナントヒトＩＬ−２）、例えば特開昭６０−２４６３２
２号公報に記載の天然型ヒトＩＬ−２の一部アミノ酸配
列からなる合成ペプチド等といずれでもよい。之等の内
で特に好ましいものくしては、遺伝子組換え技術に従い
得られるリコニビナントヒトＩ　Ｌ−２もしくはその部
分構造か４なるものを例示できる。

上記ヒトｒＬ−２活性を有するポリペプチド２アスカリ
ス抽出蛋白との結合蛋白は、殊に天然ｊヒトＩ　Ｌ−２
に対して高い特異性及び結合性を力す所望抗体を提供で
きるものであり、上記免疫Ｖ原として好ましいものであ
る。

免疫抗原とするＩ　Ｌ−２関連蛋白の製造は、伊えば既
に公知の遺伝子組換え技術により得られ六リコンビナン
トヒトＩＬ−２（ｒヒトＩＬ−２）をハプテンとして有
利に実施できる。この方法につき以下に詳述する。

上記抗原は、ｒヒトｒ　Ｌ−２をハプテンとし、これを
ハプテン−担体結合試薬の存在下に、適竺−　　な担体
と反応させることにより製造される。上記）　　におい
てハプテンに結合される担体としては、通−常抗原の製
造に当り慣用される高分子の天然もし／　　くは合成の
蛋白質を広く使用できる。該担体としト　　ては、例え
ば馬血清アルブミン、牛血清アルブミン、ウサギ血清ア
ルブミン、人血清アルブミン、・　　ヒツジ血清アルブ
ミン等の動物の血清アルブミンｖ　　類；馬血清グロブ
リン、牛血溝グロブリン、ウサ１　　ギ血清グロブリン
、人血清グロブリン、ヒツジ血Ｃ清グロブリン等の動物
の血清グロブリン類；馬チログロブリン、牛チログロブ
リン、ウサギチログ１　　ロブリン、人チログロブリン
、ヒツジチログロブ′　　リン等の動物のチログロブリ
ン類；馬ヘモグロブリン、牛ヘモグロブリン、ウサギヘ
モグロブリン、人ヘモグロブリン、ヒツジヘモグロブリ
ン等の動物のヘモグロブリン類；キーホールリンペット
ヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）等の動物のヘモシアニン類
；回虫より抽出された蛋白質（アスカ−リス抽出物、特
開昭５６−１６４１４号公報、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ−。

１１１、　２６０−２６８　（１９７３）　、Ｊ、　　
Ｉｍｍｕｎ、、　　１２２．　３０２−３０８　（１９
７９）、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ、、９８．８９３−９００　
（１９６７）及びＡｍ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　
１９９．５７５−５７８　（１９６０）ニ記載されたも
の又は之等を更に精製したもの）；ポリリジン、ポリグ
ルタミン酸、リジン−グルタミン酸共重合体、リジン又
はオルニチンを含む共重合体等を挙げることができる。

ハプテン−担体結合試薬としては、通常抗原の作成に当
り慣用されているものを広く使用できる。

具体的にはチロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架
橋結合させる例えばビスジアゾタイズドベンジジン（Ｂ
ＤＢ）　、ビスジアゾタイズド−３゜３′−ジアニシジ
ン（ＢＤＤ）等のジアゾニウム化合物；アミノ基とアミ
ノ基とを架橋結合させる例えばグリオキサール、マロン
ジアルデヒド、ゲルタールアルデヒド、スクシンアルデ
ヒド、アジボアルデヒド等の脂肪族アルデヒド類：チオ
ール基とチオール基とを架橋結合させる例えばＮ。

Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ、Ｎ’　　−ｍ
−フェニレンジマレイミド等のシマレイミド化合物；ア
ミノ基とチオール基とを架橋結合させる例えばメタマレ
イミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル、４−（マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１
−カルボキシル−Ｎ′−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル等のマレイミドエステル類；アミノ基とカルボキシ
ル基、　　とをアミド結合させる通常のペプチド結合形
成反応に用いられる試薬例えばＮ、　　Ｎ−ジシクロへ
キシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ′　−ジメチル
アミノカルボジイミド、１−エチル−３−ジイソプロピ
ルアミノカルボジイミド、１−シクロへキシル−３−（
２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド等のカ
ルボジイミド類等の脱水縮合剤等を挙げることができる
。

また上記ハプテン−担体結合試薬としては、ｐ−ジアゾ
ニウムフェニル酢酸等のジアゾニウムアリールカルボン
酸類と通常のペプチド結合形成反応試薬例えば上記脱水
縮合剤とを組み合わせたものも使用可能である。

上記免疫抗原の製造は、例えば水溶液もしくはｐＨ７〜
１０の通常の緩衝液中、好ましくはｐＨ８〜９の緩衝液
中、約０〜４０℃、好ましくは室温付近で行ない得る。

該反応は通常約１〜２４時間、好ましくは約２〜５時間
で完結する。上記において用いられる代表的緩衝液とし
ては、次のものを例示できる。

ｏＱ、２Ｎ水酸化ナトリウム−０，２Ｍホウ酸−０，２
Ｍ塩化カリウム緩衝液、 ｏＱ、２Ｍ炭酸ナトリウム−０，２Ｍホウ酸−０，２Ｍ
塩化カリウム緩衝液、 ００．０５Ｍ四ホウ酸ナトリウムー０．２Ｍホウ酸−０
，０５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液、００．１Ｍリン酸二水
素カリウム−０，０５Ｍ四ホウ酸ナトリウム緩衝液。

上記においてハプテン、ハプテン−担体結合試薬及び担
体の使用割合は、適宜決定できるが、通常担体に対して
ハプテンを１〜６倍モル程度、好ましくは１〜５倍モル
程度、及びハプテン−担体結合試薬を１〜１０倍モル程
度用いるのがよい。

上記反収によりハプテン−担体結合試薬を仲介させて担
体とハプテンとが結合したペプチド−担体複合体からな
る所望の免疫抗原が収得される。

反応終了後、得られる抗原は常法に従い、例えば透析法
、ゲル濾過法、分別沈殿法等により容易に単離精製でき
る。

かくして得られる免疫抗原は、通常蛋白質１モルに対し
てハプテンが平均５〜６０モル程度結合したものであり
、いずれも引き続き該抗原に対して特異性の高い抗体の
製造を可能とするものである。

該抗原を用いてポリクローナル抗体を製造するには、常
法に従い、上記免疫抗原を哺乳動物に投与して生体内に
所望抗体（ポリクローナル抗体）を産生させてこれを採
取する方法を採用できる。

また上記免疫抗原を用いて本発明のモノクローナル抗体
を製造する方法は、該免疫抗原で免疫した哺乳動物の形
質細胞（免疫細胞）と哺乳動物のミエローマ細胞との融
合細胞（ハイブリドーマ、ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）を作成
し、これより所望抗体（モノクローナル抗体）を産生ず
るクローンを選択し、該クローンの培養により製造、採
取する方法によることができる。

上記各方法における、操作等はいずれも公知であるｒＨ
ａｎｆｌａｎｄ、　Ｐ、、　Ｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓ、　
Ｌｉｐｉｄｓ、　１５゜１０５　（１９７５）；　Ｈａ
ｎｆｌａｎｄ、　Ｐ、、　Ｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓ、Ｌｉ
ｐｉｄｓ。

１０、２０１　（１９７６）　；　Ｋｏｓｃｉｅｌａｋ
、　Ｊ、、　Ｅｕｒ、　ＪＢｉｏｃｈｅｍ、、　３７．
２１４　（１９７Ｂ）等参照］。

更に、本発明抗体は粗製抗体液、即ち抗体産生ハイブリ
ドーマ培養上清或はマウス腹水そのままで使用できるも
のであり、更には硫酸アンモニウム分画やイオン交換ク
ロマトグラフィー或はプロティンＡ抗原カラム等による
アフィニティクロマトグラフィーにより精製して使用す
ることも可能である。

上記において、免疫抗原、即ちＩ　Ｌ−２関連蛋白で免
疫される哺乳動物としては、特に制限はなく、各種のも
のをいずれも使用できるが、細胞融合に使用するミエロ
ーマ細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、
一般にはマウス、ラット等が有利に用いられる。

免疫は一般的方法により、例えば上記免疫抗原を哺乳動
物に静脈内、皮肉、皮下、腹腔内注射等により投与する
ことにより実施でき乞。より具体的には、免疫抗原を生
理食塩水含有リン酸緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）や生理食塩水
等で適当濃度に希釈し、所望により通常のアジュバント
と併用して、供試動物に２〜１４日毎に数回投与し、投
与量が約１〜５０μｇ／マウス程度になるようにして実
施するのが好ましい。

上記アジュバントとしては百日咳ワクチン、完全フロイ
ンドアジュバント、アラム等を用いることができる。

免疫細胞としては、上記最終投与の約３日後に摘出した
牌臓細胞を使用するのが好ましい。

上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動
物のミエローマ細胞としては、既に公知の種々のもの、
例えばＰ３／Ｘ６３−Ａｇ３　（Ｘ６３）　　［Ｎａｔ
ｕｒｅ、　２５６．４９５−４９７　（１９７５）　〕
、Ｐ　３／Ｘ６３−Ａｇ３．Ｕｌ　（Ｐ３Ｕ１）［（’
ＬｌｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｕｎｏｌｏｇｙ、　８１．１−
７　（１９７Ｂ）］　、Ｐ３／ＮＳ　Ｉ−１−Ａｇｌ−
１−Ａ　Ｓ−１）　　［Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、、　６．５１１−５１９（１９７６）］　、Ｓｐ２
１０−Ａｇ１４　（Ｓｐ２１０）［Ｎａｔｕｒｅ、　２
７６、２６９−２７０　（１９７Ｂ）　］　、Ｆ　Ｑ　
［Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、、　３５．１−２１　（
１９８０）　］等や、ラットにおける２１０．ＲＣＹ３
．Ａｇ１．２．３゜（Ｙ　３）　　［Ｎａｔｕｒｅ、２
７７、１３１−１３３　（１９７９）コ等の骨髄腫細胞
等を使用できる。

上記免疫細胞とミエローマ細胞との融合反応は、公知の
方法、例えばマイルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らの
方法［Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　
Ｖｏｌ、７３．３（１９８１）］等に準じて行なうこと
ができる。より具体的には、上記融合反応は、通常の融
合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、
センダイウィルス（ＨＶＪ）等の存在下に、通常の培地
中で実施され、培地には更に融合効率を高めるためにジ
メチルスルホキシド等の補助剤を必要に応じて添加する
こともできる。また、電気処理（電気融合）による方法
等を適宜採用することもできる。免疫細胞とミエローマ
細胞との使用比は、通常の方法と変りはなく、例えばミ
エローマ細胞に対して免疫細胞を約１〜１０倍程度用い
るのか普通である。融合反応時の培地としては上記ミエ
ローマ細胞の増殖に通常使用される各種のもの、例えば
ＲＰＭ！−１６４０培地、ＭＥＭ培地、その他のこの種
細胞培養に一般に利用されるものを例示でき、通常２等
培地は牛胎児血清（Ｆ　ＣＳ）等の血清補液を抜いてお
くのがよい。融合は上記免疫細胞とミエローマ細胞との
所定量を、上記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に
加温したＰＥＧ溶液、例えば平均分子量１０００〜６０
００程度のものを、通常培地に約３０〜６０Ｗ／Ｖ％の
濃度で加えて混ぜ合せることにより行なわれる。以後、
適当な培地を逐次添加して遠心し上清を除去する操作を
繰返すことにより所望のハイブリドーマが形成される。

得られる所望のハイブリドーマの分離は、通常の選別用
培地、例えばＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテ
リン及びチミジンを含む培地）で培養することにより行
なわれる。該ＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブ
リドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充
分な時間、通常数日〜数週間行なえばよい。かくして得
られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目的
とする抗体の検索及び単一クローン化に供される。

目的抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳＡ法［Ｅｎｇ
ｖａｌｌ、　Ｅ、、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、
７０．４１９−４３９（１９８０）］　、プラーク法、
スポット法、凝集反応法、オ））　９０　二（Ｏｕｃｈ
ｔｅｒｌｏｎｙ）法、ラジーオイムノアッセイ（ＲＴ　
Ａ）法等の一般に抗体の検出に用いられている種々の方
法〔「ハイブリドーマ法とモ、　　ツクローナル抗体」
、株式会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０−５３頁、貼
札５７年３月５日〕に従い実施することかでき、この検
索には前記ｒヒトＴＬ−２が利用できる。

かくして得られるヒｈｌＬ〜２を認識する所望のモノク
ローナル抗体を産生ずるハイブリトーマは、通常の培地
で継代培養することかでき、また液体窒素中で長期間保
存することができる。

上記ハイブリドーマからの本発明モノクローナル抗体の
採取は、該ハイブリドーマを常法に従って、無血清培地
にて培養してその培養上清として得る方法やハイブリド
ーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させ
、その腹水として得る方法等が採用される。前者の方法
は、高純度の抗体を得るのに適しており、後者の方法は
、抗体の大量生産に適している。

また上記のごとくして得られる抗体は、更に塩析、ゲル
濾過法、アフィニティクロマトグラフィー等の通常の手
段により精製することができる。

かくして得られる本発明モノクローナル抗体は、ヒ）Ｉ
Ｌ−２に特異反応性を有するものである。

本発明抗体は、これを利用して、例えば免疫沈降法、ア
フィニティクロマトグラフィー等の通常の精製手段によ
りヒ）ＩＬ−２を簡便且つ特異的に精製することか可能
である。

また本発明抗体の利用によれば、検体中のヒトＩＬ−２
を免疫反応によって特異的に測定することができる。

該測定法としては、通常の競合法、サンドイツチ法によ
るラジオイムノアッセイ（Ｒｒ　Ａ）法、免疫測定法（
ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）　、凝集法等の免疫学的手法が挙げら
れ、２等方法の操作、手順等は、常法と変わるところは
ない。

本発明は、上記本発明モノクローナル抗体を用いた３ス
テップサンドイッチ法をも提供するものである。この方
法は、例えば代表的には以下のごとくして実施される。

即ち、９６ウエルプレート等の適当な担体に固相化させ
た本発明抗体を第１抗体として用い、これとヒトＩＬ−
２標準溶液及び測定物質（臨床サンプル等のヒ）　ｒ　
Ｌ−２を含有する検体）とを、３７℃にて一夜静置反応
させ［第１ステツプ］、次いで、第２抗体としての抗ヒ
トＩ　Ｌ−２家兎抗血清を上記プレートに加え、室温に
て２時間程度反応させることにより、該第２抗体と第１
ステツプでの反応物（本発明抗体と測定物質との反応物
）とを反応させ（第２ステツプ）、更に酵素標識ヤギ抗
家兎ＴｇＧ抗体等の標識抗体の一定量を、上記第２ステ
ツプでの反応物（本発明抗体と測定物質と二次抗体との
反応複合体）と室温にて２時間程度反応させ［第３ステ
ツプ］、次いで上記第３ステツプで得られた反応複合体
と標識抗体との結合体から非結合標識抗体を分離除去し
た後、発色溶液を加えて発色反応させ、ＩＮ硫酸にて発
色反応を停止させ、得られる発色反応液の吸光度を測定
することにより実施される。

かくして検体中のヒｈＴＬ−２を定量することができる
。

上記において、抗ヒトＩＬ〜２モノクローナル抗体の不
溶化は、常法に従い抗体を不溶性担体に、物理的又は化
学的に結合させることにより実施できる。

上記不溶化のための不溶性担体としては、例えばポリス
チレン、セファデックス、イオン交換樹脂、プラスチッ
クチューブ、アミノ共重合体等を使用でき、不溶化は共
有結合法としてのジアゾ法、ペプチド法、アルキル化法
、架橋試薬にょる担体結合法、Ｕｇｉ反応による担体結
合法等の化学反応、或はイオン交換樹脂のような担体を
用いるイオン結合法、ガラスピーズ等の多孔性ガラスを
担体として用いる物理的吸着法等によって行なうことが
できる。

上記二次抗体としての抗ヒ）ＩＬ−２家兎抗血清（ポリ
クローナル抗体）は、ヒトＴＬ−２を認識するもの、即
ちヒトＩ　Ｔ、、　−２に結合性を有するものである限
り特に限定はなく、前記した常法に従って得られるポリ
クローナル抗体を使用できる。

上記第３ステツプに使われる標識抗体は、公知のもので
よく、既に市販のマウス、ラット、モルモット、ウサギ
、ヒツジ、ヤギ、馬、牛等の動物に免疫して得られる抗
体をパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）　、アルカリホスファ
ターゼ等で酵素標識した抗イムノグロブリン抗体が挙げ
られる。第二抗体として家兎抗血清を用いる時は、特に
パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識ヤギ抗家兎ＩｇＧ抗体
が好ましい。

上記測定法において、検体として用いられる臨床サンプ
ルとしては、例えば血清もしくは血漿形態の血液、細胞
組織液、リンパ液、胸腺水、腹水、羊水、胃液、尿、膵
臓液、骨髄液、唾液等の各種体液のいずれでもよいが、
血液、特に血清又は血漿が好ましい。

上記において測定系に利用される溶媒としては、反応に
悪影響を与えない通常のものをいずれも利用でき、例え
ばクエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、
酢酸緩衝液等のｐＨが約５〜９程度の緩衝液の利用か好
ましい。尚、本発明においては、上記溶媒に、約０．　
１〜３Ｑｖ／ｖ％程度の血清（測定対象のヒｈ　Ｉ　Ｌ
−２が含まれていないもの）及び／又は約０．１〜２Ｍ
程度のＮａＣ１を含ませるのが、本発明の目的により合
致していて好ましい。

測定の際の免疫反応条件は、特に制限はなく、通常のこ
の種測定法と同様のものとすることができる。一般には
約４５℃以下、好ましくは約４〜４０℃程度の温度条件
下に、約１〜８０時間程度を要して反応を行なえばよい
。

本発明方法では、上記免疫反応終了後の固相一液相（前
記第３ステップでの反応複合体と標識抗体との結合体−
非結合標識抗体）の分離を、例えば遠心分離、炉別、デ
カンテーション、洗浄等の通常の方法により行なうこと
かできる。

またかくして分離された各物質の酵素標識活性の測定は
、使用した酵素の種類に応じて、公知の各種方法に従い
実施することかできる。その際用いられる発色溶液とし
ては、通常のもの、例えば酵素としてパーオキシダーゼ
を用いる場合には、０−フェニレンジアミン（ＯＰ　Ｄ
）等を用いることができ、発色反応の停止も常法に従い
例えば反応液に１〜４Ｎの硫酸等の適当な酵素活性阻害
剤を添加することにより実施できる。

かくして、本発明方法によれば、臨床サンプル等の微量
のヒトＩＬ−２を含有する試料を検体として、該検体の
ヒ）、　Ｉ　Ｌ　−２量を高精度、高感度をもって、し
かも簡便な操作で定量することができる。

発明の効果 本発明によれば、ヒトＩＬ−２を有利に簡便に測定でき
る測定法、そのための抗体及び免疫抗原を提供できる。

殊に本発明のヒ）ＩＬ−２測定方法は、その測定感度か
極めて高く、特異性に優れており、従って、例えば臨床
サンプル等の極めて低濃度のヒト１Ｌ−２を含有する検
体中の該ヒトＩＬ−２をも正確に測定することができる
。

以下、本発明をより詳しく説明するため、参考例及び実
施例を挙げるが、本発明は之等に限定されない。

尚、各側においてＩＬ−２活性は、ギリス及びスミスノ
方法［Ｇ１１ｌｉｓ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、　
Ｋ、、　Ｊ。

ｆｍｕｎｏｌ、、　１２０．２０２７　（１９７Ｂ）コ
に従ッテ、ＩＬ−２依存マウスＴ細胞（ＣＴＬＬ−２）
を使用して測定された。

参考例　１　　ヒトＩ　Ｌ　−２の製造ヒトＩＬ−２の
製造は、従来公知の一般的な遺伝子組換え技術に従うこ
とかできる。該技術は例えばヒトＩ　１．、−２の製造
［５ｃｉｅｎｃｅ、　２２４．１４３１（１９Ｂ４）　
　　；　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　
Ｒｅｓ、　　Ｃｏｍｍ、、　　１メと９゜６９２　（１
９８５）　；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、。

８０、５９９０　（１９８３）等コ）に利用される方法
に準じることができる。

その例を次に示す。

（１）プラスミドｐＡＴｍ　Ｔ　Ｌ−２−２の構築ヒト
扁桃腺ｃＤＮＡライブラリーより単離されたＴＬ＝２ｃ
ＤＮＡプラスミドｐＨｌＧ５−３［Ｓ、　Ｍａｅｄａ　
ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、
　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍ、、　１１５．１０４０−１０４７　（１９８
３）、大きさ約４．４ｋｂ］を制限酵素）（ｉｎｄｌｌ
［及びｐｖｕｎ−ｃ’切断し、ＩＬ−２ｃＤＮＡを含む
１．２キロベース（ｋ　ｂ）フラグメントをアガロース
ゲル電気泳動法により。

単離精製した。

このＤＮＡフラグメントを更に制限酵素Ｈｇ１Ａ■で切
断し、Ｉ　Ｌ−２の成熟蛋白をコードする０、８ｋｂの
ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動法により
単離精製後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて制限酵素
Ｈｇ１ＡＩによる切断部位をプランエンド（平滑末端）
化した。得られたＤＮＡフラグメントに、合成オリゴヌ
クレオチド［５１ｄ（ＨＯＣＧＡＴＡＡＴＧＧＣＡｏＨ
）３′及び５′末端をリン酸化した５°ｄ（ｐＴＧＣＣ
ＡＴＴＡＴ　ｏＨ）　３°］を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼに
より連結し、このＤＮＡフラグメントをアガロースゲル
電気泳動法により単離精製した。

一方、プラスミドｐＡ　Ｔ　１５３　　［Ｎａｔｕｒｅ
、　２８３゜２１６　（１９８０）、大きさ約３．７ｋ
ｂコを、制限酵素Ｃｌａ　１で切断後、この切断部位に
上記で得られた合成オリゴヌクレオチドを連結させたＤ
ＮＡフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
させ、このもので大腸菌ＨＢＩＯＩ株を形質転換して、
所望のプラスミドｐＡＴｍＩＬ−２−１（４，５ｋｂ）
を有するエシェリヒア・コリＨＢ１０１／ｐＡＴｍ　Ｉ
　Ｌ−２−１を得た。

次いで、得られたプラスミドｐＡＴｍｌＬ−２＝１を、
制限酵素Ｂａｎ１及びＣ１ａ■で切断後、アガロースゲ
ル電気泳動法により０．８ｋｂのＢａｎｌ−Ｃ１ａｌＤ
ＮＡフラグメントを単離精製し、該フラグメントの両末
端を、ＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウフラグメント）
を用いて、プラントエンド化した。

一方、ｃｌ　ａ　１　リンカ−［５’　ｄ　（ＨｏｃＡ
ＴｃＧＡＴＧｏＨ）　３　’、宝酒造社製］の５′末端
をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、上記両
末端をプラントエンド化したＤＮＡフラグメントに、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼで連結後、制限酵素Ｃ１ａＩで切断し
、アガロースゲル電気泳動法により０．８ｋｂのＣ１ａ
Ｉ−Ｃｌａ　ｌフラグメントを得た。

また、プラスミドｐＡＴ１５３　［Ｎａｔｕｒｅ、　２
８３゜２１６　（１９８０）、大きさ約３．７ｋｂ］を
、制限酵素Ｃｌａ　１で切断後、この切断部位に上記で
得られた０、８ｋｂのＣ１ａＩ−Ｃ１ａｌフラグメント
をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、連結物で大腸菌８８１
０１株を形質転換して、所望のプラスミドｐＡＴｍ　Ｉ
　Ｌ−２−２を有するエシェリヒア・コリＨＢ　１０１
／ｐＡＴｍ　Ｉ　Ｌ−２−２を得た。

以上の概略図を第１図に示す。

（２）プラスミドｐ　ｔ　ｒ　ｐ　Ｉ　Ｌ−２Ｄ２−１
１の構築 プラスミドｐＡＴｍ　Ｉ　Ｌ−２−２を、制限酵素Ｃｌ
ａ　ｌ及び５ｔｕＩで切断し、ＩＬ−２成熟蛋白をコー
ドする０、４４ｋｂの５ｔｕＩ−Ｃ１ａＩ　ＤＮＡフラ
グメントをアガロースゲル電気泳動法により単離精製後
、これを制限酵素でＡｌｕＩで部分切断して、０．４ｋ
ｂのＡｌｕＩ−８ｔｕＩ　ＤＮＡ７ラグメントをアガロ
ースゲル電気泳動法により単離精製した。

また、合成オリゴヌクレオチド［５°ｄ（ＨＯＣＧＡＴ
ＡＡＴＧＧＣＡ　ｏＨ）　３’及び５’ｄ（ｐＴＧＣＣ
ＡＴＴＡＴ　ｏＨ）　３’コを、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼでその５′末端をリン酸化し、これを上記０．
４ｋｂの、ａ、１ｕｌ−３ｔｕＩＤＮＡ７ラグメントに
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させた後、制限酵素Ｃ
１ａＩで切断して、０．４ｋｂのＣ１ａｌ−Ｃ１ａＩ　
ＤＮＡ７−ｙグメントをアガロースゲル電気泳動法によ
り単離精製した。

一方、トリプトファン・プロモーターを持つぺフタ−プ
ラスミドｐＴＭ１　［今本文男、代謝第２巻、第２８９
頁（１９８５）、大きさ約４．７ｋｂ］を、制限酵素Ｃ
ｌ８Ｉで切断し、この切断部位に上記０．４ｋｂ（７）
Ｃ１ａＩ−Ｃ１ａＩＤＮＡ７ラグメントをＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結し、このもｅで大腸菌Ｈ８１０１株
を形質転換し、５０μｌ／１１のアンピシリンを含むＬ
Ｂ寒天平板上に出現した大腸菌コロニーについて、ボイ
リング法［Ｔ。

Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　ａ
ｎｄ　Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ｐ３６６　（
Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　（１９８２）コによりプラスミドを単離し制限
酵素による切断フラグメントの大きさを解析して、目的
のプラスミドｐ　ｔ　ｒ　ｐ　ｒ　Ｌ−２Ｄ２−１１を
有する形質転換株［エシェリヒア・コリＨＢＩＯＩ／ｐ
ｔｒｐｒＬ−２Ｄ２−１１コを得た。

以上の概略図を第２図に示す。

上記で得たプラスミドｐ　ｔ　ｒｐ　ＩＬ−２Ｄ２−２
　１１は、天然型ヒトＩＬ−２のアミノ酸配列のＮ末端
から連続番号を付して示すアミノ酸番号の２〜１１の配
列を欠失するポリペプチドをコードする遺伝子が合成開
始コドンＡＴＧの下流に結合さ）　　れた組換えＤＮＡ
である。

（３）形質転換株の培養及び目的ポリペプチドの製造 エシェリヒア・コリＨＢＩＯＩ／ｐｔｒｐｌＬ−２Ｄ２
−１１を、５０μｌ／ｙｌのアンピシリン及び２０μｇ
　／　ｚｌのＬ−トリプトファンを含む、　　ＬＢ培地
１０１１１中で、３７℃で一晩振盪培養させ、この１２
１を１％カザミノ酸及び５０μｇ／ｚｌアンピシリンを
含むＭ９最小培地［０，６％Ｎａ２　ＨＰＯ４，０，３
％ＫＨ２ＰＯ４，０，０２５％ＮａＣ１，０，１％ＮＨ
４Ｃ１゜２ｍＭ　　ＭｇＳＯ４，０，２％グルコース及
び０．１ｍＭ　　ＣａＣＡ’２］　　５０ｙ／に植菌シ
、３７℃で振盪培養した。９時間後に集菌し、５０ｍＭ
トリスＨＣ１緩衝液（ｐＨ８，０）−５０ｍＭＥＤＴＡ
−１５％シュークロース−１％ＳＤＳで溶菌し、遠心分
離により菌体抽出物上清を得た。

このもののＩＬ−２活性を測定した所、該形質転換株の
培養液１　ｚｌ当り、１０４ユニツトのＩＬ−２活性が
認められた。

（４）目的ポリペプチドの精製 上記（３）において、培養終了後、遠心分離により菌体
を集め、生理食塩水で１回洗浄後、同液に懸濁させ、−
８０℃にて凍結保存した。用時に、この凍結品を融解し
た後、等容量の５０ｍＭトリスＨＣＩ　［ｐＨ８，０，
５０％シュークロース含有コを加え、０，１倍容量の１
０■／　７Ａ’リゾチームと０１１倍容量の０．５Ｍ　
　ＥＤＴＡとを加え１５分間放置した。これに５０ｍＭ
トリスＨＣ１［ｐＨ８，０，１５０ｍＭ　　ＥＤＴＡ及
び０．３％トリトンＸ−１００含有］の等容量を加え、
１５分間放置後、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を
行ない、その上清液を除いた後、同液で３回沈渣を洗浄
した。更に５０ｍＭ）リスＨＣＩ［ｐＨ８，０，１５０
ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．３％トリトンＸ−１００及び２
Ｍ　　ＮａＣ１含有］で１回沈渣を洗浄した。５０ｍＭ
トリスＨＣ／［ｐＨ８，０，６Ｍ尿素、１％ツイーン８
０及び１０ｍＭβ−メルカプトエタノール含有］を用い
てこの沈渣を溶解した後、５０ｍＭ）リスＨＣ／［ｐＨ
８，０，２Ｍ尿素、０．２％ツイーン８０及び１０ｍＭ
β−メルカプトエタノール含有］で平衡化したセファク
リールＳ−３００を用いたゲル濾過カラムクロマトグラ
フィーを行ない、溶出画分を集めた。次いで２５ｍＭ酢
酸ナトリウム［ｐＨ６，０，０，２％ツイーン８０含有
］で透析後、同液で平衡化した陽イオン交換カラム［５
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｅ　］　り０７
トグラフイーテ０．２Ｍ　　ＮａＣ１までのイオン強度
変化による溶出を行ない、その分画を集めた。この分画
をＰＢＳで平衡化したスーパーローズ１２（Ｓｕｐｅｒ
ｏｓｅ　１２　）ゲル濾過カラムクロマトグラフィーに
付し、活性画分を採取することにより、天然型ヒトＩＬ
−２のアミノ酸配列のＮ末端より２〜１１番目のアミノ
酸配列を欠失する１２３個のアミノ酸からなるポリペプ
チド（以下これを「ポリペプチドＩ」という）を得た。

該ポリペプチドＩは、ラムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ・Ｕ、　
Ｋ・）らの方法［Ｎａｔｕｒｅ、　２７７、６８０　（
１９７０）コに従う５ＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の結果
、°約１３．５キロダルトン（ＫＤ）の位置に単一のバ
ンドとして泳動された。

参考例　２　　アスカリス抽出蛋白の製造以下の操作は
低温室（約２〜１０℃）で行なわれた。

ブタ回虫（Ａｓｃａｒｉｓ　ｓｕｕｍ）を生理食塩水で
洗浄後、回虫の中心部を切断し、内容物を除去し、生理
食塩水で洗浄した。次いで上記回虫を１〜２ｃｍ毎に細
断し、−８０℃で凍結させた。該凍結物５０ｇに氷水で
冷やした生理食塩水２５０ｙ／を加え、ワーリング・ブ
レンダーで５分間ホモジネート（氷水で冷却しながら行
なう）後、１１００００ｒｐで３０分間遠心分離し、上
清をとり２日間透析［透析液＝５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）に０．１５Ｍ　　ＮａＣ１を含有コした。次
いで更に１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清
をとり、ガーゼ（４枚重ね）でこして浮遊物を除去し、
抽出液２３０ｚｌを得た。該抽出液を凍結乾燥して、目
的とするアスカリス抽出物３．３５ｇを得た。

得られた乾燥品の蛋白量は、ローリ−法［Ｌｏｗｒｙ、
　Ｏ，Ｈ，、Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ、　Ｎ、Ｊ、、　Ｆ
ａｒｒ、　Ａ、Ｊ。

ａｎｄ　Ｒａｎｄａｌｌ、　Ｒ，Ｊ、、　Ｊ、　Ｂｉｏ
ｌ、　Ｃｈｅｍ、、　１９３．２６５−２７５　（１９
５１）］により測定した結果、６２２■／３．３５ｇで
あった。

実施例　１　　ヒ）ＩＬ−２免疫抗原の製造参考例１に
示したように得た２■／　ｙｌのｒヒトＩ　Ｌ−２溶液
［５０ｍＭホウ酸緩衝液、０．１５ＭＮａＣ１を含む、
ｐＨ８，０］のｌ　ｚｌに対して、参考例２で得られた
アスカリス抽出物の２■を加えて溶かした。次いでジシ
クロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）２６５μｇを水
２６５μｌに溶かした液を加え、ｐＨをＩＮ　　ＨＣＩ
で６．５に調整した。反応液を室温で５時間攪拌し、次
いで反応混合物を、水を透析液として４℃で５時間透析
し、更に上記透析操作を４回繰り返した。

得られた透析内液を凍結乾燥してｒヒトＩＬ−２の抗原
［ｒヒトＩＬ−２−アスカリス−ＤＣＣ結合体］の３．
９■を得た。

上記抗原を原料であるアスカリス抽出蛋白及びｒヒトＩ
Ｌ−２と共に、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動に付した後、ニトロセルロースに転写し、抗ｒヒトＴ
　Ｌ−２ポリクローナル抗体を用いて、ウェスタンプロ
ットを行なった結果を第３図に示す。

図においてレーン１は分子量マーカーを（その各分子量
は図の左横に単位ｋにて示しである）、レーン２はアス
カリス抽出蛋白を、レーン３はｒヒトＩ　Ｌ−２を、ま
たレーン４はｒヒトＩ’Ｌ　−２免疫抗原をそれぞれ示
す。

実施例　２　　抗ヒトＴＬ−２モノクローナル抗体の製
造 実施例１で得られた免疫抗原をＰＢＳを用いて１■結合
蛋白質／１１の濃度に調整した後、これに同量のフロイ
ント完全アジュバント液を加えて混合乳化させ、これを
４０Ｍｇ結合蛋白質／マウスずつ、雄性Ｂａ１ｂ、／ｃ
系マウス（８週齢）に皮下投与して免疫した。その後同
様に４回、２週問おきに同融合蛋白質液の同量を同経路
で追加投与して免疫した。

最終免疫の３日後に、各マウスの牌臓を摘出し、摘出牌
臓より牌細胞を取出し、該細胞中に存在する赤血球を、
０．８３％塩化アンモニウム液で４℃下に１〜２分間処
理して融解除去した。

上記で得られた細胞を感作リンパ球細胞として集め、こ
れを３７℃に加温したＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗
浄した。

次に、マウス骨髄腫細胞［Ｐ　３　Ｕ　１、Ｃｕｒｒ　
。

Ｔｏｐｉｃｓ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、、　　７３．　３　　（１９８１）コ　を１５％
ＦＣ８（牛胎児血清）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培
地に８−アザグアニン１００μＭを加えた培地中で、継
代培養し、これをミエローマ細胞として用い洗浄した。

上記牌細胞とミエローマ細胞とを、細胞数比が５＝１に
なるように５０１１のチューブ内で混和し、得られた細
胞混合物を５００Ｘｇで５分間遠心後、上溝をパスツー
ルピペットで完全に除去した。

３７℃に保温した水槽でチューブを暖めながら振盪し、
チューブの底の細胞ペレットをほぐした。

次に、ポリエチレングリコール１５００　（ベージング
・マンハイム・山之内社製、以下ｒＰ　Ｅ　ＧＪという
）１１１を、チューブをゆっくりと回転させながら加え
て１分間放置し、次いで３７℃に保温したＦｅ２を含ま
ないＲＰＭＩ−１６４０培地１１１をゆっくりと１分間
位をかけて加えて１分間放置し、更に固液２ｙｌを加え
て２分間放置し、更に・　　固液４　ｘｉを加え４分間
放置した。

次いで、３７℃に保温した１５％ＦＣ８゜０．０５力価
／ｌ硫酸ストレプトマイシン、６００００Ｕ＃ペニシリ
ンＧカリウム、５４■／ｌゲンタマイシン及びｌＱｍＭ
ピルビン酸ナト＄　リウムを含有するＲＰＭＩ−１６４
０培地（以下・　　これを１完全ＲＰＭＩ培地」という
）８ｙ／を２〜、　３分間かけて加えた後、５００Ｘｇ
で５分間遠心分離した。上清を吸引除去し、３７℃に保
温した完全ＲＰＭＩ培地に、牌細胞ｌＸ１０６個／　ｘ
ｌとなるように懸濁させた。次に、この懸濁液を９６穴
マイクロプレート（コースタ−社製）に０．１１１ずつ
分注し、３７℃、５％Ｃ０２，１００％湿度のインキュ
ベーター内で培養した。

２４時間後、０．１ｙｌずつ１０％ＦＣ８添加ヒホキサ
ンチンｌＸｌ０　　Ｍ、アミノプテリン４×１０　　Ｍ
及びチミジン１．６ｘｌＯＭを含む完全ＲＰＭＩ培地（
以下これをｒＨＡＴ培地」という）を各ウェルに添加し
た。以後、上清を２日目、３日目に０，１ｚＡ’吸引し
、０，１ｙｌの新しいＨＡＴ培地を加えて液替えを行な
った。その後、液替えは２〜３日おきに行なった。６日
目に同様に上清を吸引しｌＸ１０　Ｍヒボキサンチン及
びチミジン１．６Ｘ１０　　Ｍを含む完全ＲＰＭＩ培地
（以下これをｒＨＴ培地」という）に替えた。

以後、完全ＲＰＭＩ培地で増殖維持した。融合後、７〜
１０日間でコロニーが肉眼で観察されるようになり、細
胞が９６ウエルプレートの底面積の１７４を占めた時よ
り、上清中の抗ヒトＩ　Ｌ−２抗体活性を、参考例１で
得たｒヒトＴ　Ｌ−２を固相化した９６ウエルプレート
及びパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリ
ン抗体（ザイメット社製）を用いた酵素免疫測定法 （ＥＬＩＳＡ）でスクリーニングした。

その結果、陽性となったウェルのハイブリドーマを直ち
に限界希釈法［Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ。

７３、３　（１９８１）］によりクローニングした。

即ち、Ｂａ１ｂ／ｃ系マウス胸腺細胞１×１０　個／　
ｘｉを含むように調製した完全ＲＰＭＩ−１６４０培地
の２０１１を用いて、ハイブリドーマを５個／ウェルと
なるように９６ウエルプレートに０．２ｙｌずつ播き、
１回目のクローニングを行なった。７〜１０日後、コロ
ニーが肉眼で観察できるようになった時点において、Ｅ
ＬＩＳＡ法にて各ウェルの上清中の抗体活性をスクリー
ニングして、陽性となるウェルを特定した。

かくして得られた抗ヒトｒ　Ｌ−２抗体活性を有するハ
イブリドーマを、同様にして１個／ウエルとなるように
調製して２回目のクローニングを行ない、再度７〜１４
日後に、ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを行ない、
更に同様に０．５個／ウェルで３回目のクローニング及
びスクリーニングを行なった。

上記により、所望の反応特異性を有する本発明モノクロ
ーナル抗体を産生ずるハイブリドーマ４株を得た。之等
をそれぞれｒＯＡＬ−ＭＩＬ−２１」、ｒＯＡＬ−ＭＩ
　Ｌ−２２Ｊ、ｒＯＡＬ−ＭＩＬ−２３Ｊ及びｒＯＡＬ
−ＭＩＬ−２４Ｊと命名した。

■　上記で得られたクローンＮｏ、ＯＡＬ−ＭＩＬ−２
１〜ＯＡＬ−ＭＩＬ−２４を、完全ＲＰＭＩ培地にて５
％Ｃ０２条件下で、３７℃にて、９６時間培養した。培
養液を３０００ｒ四、１０分間遠心分離して、目的のモ
ノクローナル抗体を含む培養上清を得た。得られたクロ
ーンの内の一株（本発明抗体産生ハイブリドーマＯＡＬ
−ＭＩ　Ｌ−２１）を選定した。

該モノクローナル抗体産生細胞は、通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所（微工研）にｒＯＡＬ−ＭＩＬ
−２１Ｊなる表示で寄託されており、その寄託番号は微
工研菌寄第１１６１９号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１６１９
）Ｊである。

■　また、実施例２で得たクローンＮｏ、ＯＡＬ−ＭＩ
Ｌ−２１の１×１０　個を、予めブリスタン（２，６，
１０，１４−テトラメチルペンタデカン、アルドリッチ
社製）を接種しておいたＢａ１ｂ／ｃ系マウスに腹腔内
投与し、１０〜１４日後に、蓄積された腹水を採取して
、本発明抗体を含む腹水を得た。

該腹水より、プロティンＡ−アガロースゲルを用いた抗
体精製キット（ＭＡＰＳ−ＩＩ　Ｋｉｔ　、バイオ・ラ
ッド社製）により、精製抗体ＯＡＬ−ＭＩＬ−２１を得
た。

以下、上記で得られた本発明抗体の特性を示す。

実施例　３　　本発明抗体の性状 ■　抗体のサブクラス マウスモノクローナル抗体サブクラス同定用キッ）　（
Ｔｈｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅ　Ｌｉｍｌｔｅｄ社
製）を用イテ決定した上記抗体のサブクロスは、ＩｇＧ
、であった。

■　抗体の希釈反応曲線 ５μｇ／ｘｉのｒヒトＩ　Ｌ−２を含む１０ｍＭＰＢＳ
　（０，１４Ｍ　　ＮａＣ／含有、ｐＨ７，２）溶液を
、９６ウエルプレートに１００μｌ／ウエルずつ分注し
、室温にて一夜静置してｒヒトｒＬ−２を固相化した。

次いで、洗浄液［１０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７，２，０，１
４Ｍ　　ＮａＣ１及び０．０５％ツイーン２０含有コに
て３回洗浄後、０．５％ＢＳＡを含むブロック液を３５
０μｌ／ウエルずつ分注し、室温にて４時間以上静置し
てブロッキング処理して、ｒヒトＩ　Ｌ−２固相化プレ
ートを作製した。

次に、上記の精製ＯＡＬ−ＭＩＬ−２１抗体を５００　
ｎｇ／　ｙｌとなるように５０ｍＭ　　ＰＢＳ［０，１
４Ｍ　　ＮａＣ１，０，２％ＢＳＡ。

０．０５％ツイーン２０及び０．０５％チメロザール含
有、ｐＨ７，４］にて希釈し、更に固液にて６段階に亘
り×４倍段階希釈を行ない、５００％ｇ／　ｙｌ　〜０
　、　１２　”ｇ／　ｘｌ（Ｄ　７種濃度の抗体希釈溶
液を調製した。之等の抗体希釈溶液を、ｒヒトＩＬ−２
固相化プレートに２００μｌ／ウエルとなるように分注
し、室温にて４時間静置して反応させた。この後、洗浄
液で３回洗浄し、ＰＯＤ標識ヤギ抗マウスイムノグロブ
リン抗体（ザイメット社製）のＸ３０００倍希釈溶液を
１００μｌ／ウエルずつ分注し、室温にて２時間静置し
て反応させた。更に洗浄液で３回洗浄後、０．０１５％
の過酸化水素を含む１■／　ｘｉの０−フェニレンジア
ミン溶液を１００μｌ／ウエルずっ加え、１０分間発色
反応させ、ＩＮ硫酸にてＰＯＤ酵素反応を停止させた。

各濃度のＯＡＬ−ＭＩＬ−２１抗体溶液の４９２ｎ”に
おける吸光度を求め、これから希釈反応曲線を描いた。

その結果を第４図に示す。

図において、横軸は抗体ＯＡＬ−ＭＩＬ−２１の濃度（
ｎｇ／ｚＡ’）を、また縦軸は吸光度をそれぞれ示す。

参考例　３　　抗ヒトＩ　Ｌ−２家兎抗血清の製造参考
例１で得たｒヒトＩＬ−２をＰＢＳに溶解させて１■／
ｌｌの濃度に調製し、これにフロイントの完全アジュバ
ント液を等量加えて懸濁液を作成した。この懸濁液を数
羽の家兎（Ｎｅｗ−ＺｅａｌａｎｄＷｈｉｔｅ　Ｒａｂ
ｂｉｔ、体重３．　０〜３．　５ｋｇ）にＩＬ−２とし
て１目量２０〜１０００μｇ／ウサギとなる量で、２週
間毎に皮下投与して免疫した。６回投与免疫後、各ウサ
ギより全採血して抗血清を得た。

実施例　４　　　ＥＬＩＳＡ法による標準曲線この例は
、実施例２−■で得られた本発明抗体を第１抗体として
固相化し、これに精製標品ｒヒトＩ　Ｌ−２を溶解した
各標準溶液を反応させ、更に参考例３で得られた抗ヒト
ＩＬ−２家兎抗血清を第２抗体として反応させた後、パ
ーオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識ヤギ抗家兎ＩｇＧ抗体（
バイオ・ラド社製）を反応させ、反応物の標識活性を、
基質としてＯ−フェニレンジアミンを用いて測定する３
ステツプ固相サンドイツチ法によるＥＬ　Ｉ　ＳＡ系で
あり、以下の通り実施された。

即ち、まず本発明抗体をＯ，ＯＬＭ　　ＰＢＳ（ｐＨ７
，２）２０Ｍｇ　／　ｚｌに希釈し、これを９６ウエル
マイクロプレートの各ウェルに１００μｌずつ分注し、
室温にて一晩静置後、０．０５％ツイーン２０を含む洗
浄液［１０ｍＭ　　ＰＢＳ。

ｐＨ７，２］　２５０〜３００μｌ／ウエルで３回洗浄
し、次いで０．５％ＢＳＡ　（牛血清アルブミン）を含
むブロック液［０，１４Ｍ塩化ナトリウム、Ｏ，ＯＩＭ
　　ＰＢＳ、ｐ）１７．２コを３５０μｌ／ウェル加え
て、室温で４時間以上静置してブロッキング処理した後
、２５０〜３００μｌ／ウエルの同洗浄液で３回洗浄し
て、本発明モノクローナル抗体固相化プレートを作成し
た。

次に、抗体固相化プレートを２５０〜３００μｌ／ウエ
ルの同洗浄液で３回洗浄した後、プレートの各ウェルに
１５０μｌの反応用緩衝液［ＩＭ　　ＮａＣ１，２０％
ＦＣ５，１％ＢＳＡ。

１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．０５％チメロザール、０．
０５％ＣＨＡＰＳ　（３−［（３−フロラミドプロピル
）ジメチルアミノコ−１−プロパンスルホネート、同仁
化学研究所製）を含む２５ｍＭＰＢＳ、ｐＨ６，５］を
加え、更に５０ｐｇ／、ｖｌ〜１６００ｐｇ／ｙｌの標
準溶液もしくは検体を５０μｌ／ウエルずつ重層し、３
７℃にて一晩静置して反応させた。更に、プレートを２
５０〜３００μｌ／ウエルの同洗浄液で３回洗浄後、１
０００倍に希釈した抗ヒ）　Ｉ　Ｌ−２家兎抗血清溶液
［０，１Ｍ　　ＮａＣｌ、０．２％ＢＳＡ。

２．５％ノーマル・マウス血清、０．５％ツイーン２０
．０．０５％チメロザールを含む２５ｍＭトリス−塩酸
緩衝液、ｐＨ７，７コを１００μｌ／ウエルずつ加えた
後、室温で２時間反応させ、続いて１０００倍希釈した
パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識・抗家兎１ｇＧ抗体溶
液（バイオ・ラド社製）［０，１４Ｍ　　ＮａＣ１，０
，１％ＢＳＡ、１０％ＦＣ３１０，５％ＣＨＡＰＳ。

０．０５％チメロサールを含む５０ｍＭ　　ＰＢＳ］を
１００μｌ／ウエルずつを加えた後、室温で２時間反応
させた。最後にプレートを同洗浄液で３回洗浄した後、
１■／　ｗｌの０−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）１０
．０１５％Ｈ２Ｏ２溶液を１００μｌ／ウェル加え、室
温で１０〜２０分間反応させた後、ＩＮ硫酸を１００μ
ｌ／ウェル加えて反応を停止させた。各標準溶液の４９
２ｎｍｉこおける吸光度から作成した標準曲線から、各
検体中のヒトＩＬ−２量を求めた。

得られた結果を第５図に示す。

図において縦軸は４９２ｎｔ”における吸光度を、横軸
はヒトＩＬ−２の濃度（ｐｇ／ｙ／）を示す。

該図より、本発明の３ステップサンドイッチ法によるヒ
トＴＬ−２測定系（ＥＬＩＳＡ系）は、５０ｎｇ／ｙ／
（２，５ｎｇ／ウェル）〜１６００ｐ　ｇ／ｚｌ　（８
０ｎｇ／ウェル）の間で良好な用量反応曲線を描けるこ
とが判る。

実施例　５　　ヒトＩ　Ｌ−２モノクロ一ナル抗体の反
応特異性 本発明抗体の反応特異性を、実施例４の本発明測定法に
従って、リコンビナント・ヒトＩＬ−１α［大板製薬社
製］、同ヒトＩＬ−１β［大板製薬社製コ、インターフ
ェロン−α［体厚研究所製］及びインターフェロン−γ
［体厚研究所製］をそれぞれ検体として調べた。

上記検体としてのりコンビナンド・ヒトＩＬ−１α及び
同ヒトＩＬ−１βは０．１５〜１０μｇ／ｌ１１インタ
ーフェロン−α及びインターフェロン−γは１〜５００
万Ｕ　／　ｙｌの各濃度で利用した。

得られた結果を第６図に示す。

図において縦軸は４９２ｎ”における吸光度を、横軸は
ヒトＩ　Ｌ−２濃度（ｐｇ／ｙ／）　、ｒヒトＩＬ−１
ａ及びｒヒトＩＬ−１β濃度（ｔｔｇ／ｙｌ）並びにヒ
トインターフェロン−α及びヒトインターラエロンーγ
濃度（Ｘ１０６単位／１１）をそれぞれ示す。また曲線
（１）がヒトＩ　Ｌ−２であり、曲線（２）がｒヒトＩ
Ｌ−４ａ、ｒヒトＩＬ−１β、ヒトインターフェロン−
α及びヒトインターフェロン−γである。

該図より、本発明抗体は、リコンビナント・ヒ）　Ｉ　
Ｌ−１α、同リコンビナント・ヒトＴＬ−１β、ヒトイ
ンターフェロン−α及びヒトインターフェロン−γとは
いずれも全く交叉反応性を示さず、このことからヒトＩ
Ｌ−２に特異的であることが判る。

参考例　４　　ヒト末梢血リンパ球の分離とホークライ
ードマイトジェン（ＰＷＭ） による刺激試験 ヒト末梢血リンパ球（以下ｒＰＢＬＪという）を、ヒト
末梢ヘパリン加末梢血として採取し、フィコリソバック
（ｆｉｃｏｌｌｉｓｏｐａｑｕｅ）比重遠沈法を用イテ
［Ｂｏｙｕｍ、　Ａ、、　５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｃｌ１
ｎ、　Ｌａｂ。

Ｉｎｖｅｓｔ、、　　　　２１．　５ｕｐｐ１．　９７
．　７７−８９　　（１９６Ｂ）　　コ　、　無菌的に
分離した後、１０％ＦＣ３−ＲＰＭＩ−１６４０培養液
（日永社製）にて３回洗浄し、再び同培養液にて数を調
整した。即ち、４８ウエルマイクロプレート上に上記に
より調整した末梢血リンパ球を最終濃度が１×１０　個
／　ｘｉとなるように各ウェルに０．５ｙ／ずっ加えた
。２〜５分後、ポーライードマイトジェン（ＰＷＭ、豊
年製油社製）を含む１０％ＦＣ８加ＲＰＭＩ−１６４０
培養液（日永社製）を含有されるＰＷＭの最終濃度が４
０ｎｇ　／　ｙｌとなるように加え、３７℃で５％ＣＯ
２存在下で２４時間培養した。

実施例　６　　本発明測定法の精度 ■　添加回収試験 参考例４と同様にして、０．４μｇ／ｙｌ、４μｇ　／
　ｘｉ及び４０ｎｇ　／　ｚｌの各濃度のＰＷＭの存在
下に、ｌＸ１０６細胞／　ｙｌのＰＢＬを２４時間刺激
して得られた培養上清を試料−１〜−３として、添加回
収試験を以下の通り行なった。

即ち、各試料に対してｒヒトＩ　Ｌ−２を最終濃度が７
８．１．３１２．１２５０ｎｇ／ｙｌになるように加え
るか又は無添加として、本発明測定系にてＩ　Ｌ−２量
を測定した。

検体として試料１〜試料３を用いて得られた結果を、下
記第１表に示す。

第　　　１　　　表 試料３ 上記表より、回収率は最低９１％〜最高１０４％の範囲
にあり、その平均は９６％であり、この添加回収試験に
おいてほぼ期待濃度に近い結果が得られていることが判
る。

■　希釈試験 参考例４の方法で、４０μｇ　／　ｘｉのＰＷＭにてＰ
ＢＬを４０時間及び２４時間刺激して得られた培養上清
、４μｇ　／　ｚｌのＰＷＭにてＰＢＬを２４時間刺激
して得られた培養上清、更にＩＬ−２刺激剤としてコン
カナバリンＡ　（ＣＯｎＡ、豊年製油社製）４０μｇ　
／　ｙｌを用いて得られた培養上清のそれぞれを用いて
希釈試験を行なった。

その結果を第７図に示す。

図において縦軸はＩ　Ｌ−２濃度（ｐｇ／ｚｌ）を、横
軸は希釈倍率を示し、図中（１）はＰＷＭ（４０μｇ　
／　ｙｌ、４０時間刺激）を、（２）はＰＷＭ（４０μ
ｇ　／　ｙｌ、２４時間刺激）を、（３：はＰＷＭ　（
４μｇ／ｚｌ、２４時間刺激）を、（４：はＣ０ｎＡ（
４０μｇ　／　ｚｌ使用）をそれぞれ示す。

該図より、希釈試験においても良好な直線を持った希釈
曲線が描けることが判る。

■　再現性試験 本発明測定法を用いて４種のサンプルを用いて同時再現
性試験と日差再現性試験とを行なった。

その結果を第２表（同時再現性試験）及び第３表（日差
再現性試験）に示す。

第　　　２　　　表 〉 第　　　３　　　表 上記各表より、同時再現性の変動係数（ＣＶ値）は５％
以下であり、日差再現性の同Ｃｖ値は１０％以下であり
、いずれも再現性に優れ、実用的であることが判る。

実施例　７　　本発明測定法の利用 ■　各種マイトジェン刺激によるＩ　Ｌ−２の変動の測
定 参考例４の方法で、ＰＷＭ、Ｃ０ｎＡ、リポポリサッカ
ライド（Ｌ　Ｐ　３ＸＥ、　ｃｏｌｉ　Ｏ，５５：Ｂ５
、Ｂｏｉｖｉｎ　ＤＩＦＣＯ，Ｕ、Ｓ、Ａ、社製）及び
フィトへ、トアグリチニンーＰ　（ＰＨＡ−Ｐ、デイフ
コ社製）のそれぞれをマイトジェンとして利用し、之等
のそれぞれで刺激しながらヒトＰＢＬの培養を行なった
。

ＰＷＭ、Ｃ０ｎＡ及びＬＰＳは、最終濃度が４０μｇ／
ｙＬ　ＰＨＡ−Ｐは０．４％（ｖｏｌｕｍ／ｖｏｌｕｍ
　）となる培養液を調製し、それぞれを段階的に倍々希
釈して、１×１０　個／１／のＰＢＬを２４時間培養し
た。培養上清中に産生されるＩＬ−２の濃度を、本発明
ＥＬ　Ｉ　ＳＡ系測定法を用いて測定した。

その結果を第８図に示す。

図において縦軸はＩ　Ｌ−２濃度（ｐｇ／ｚｌ）を、横
軸は各マイトジェンの希釈倍率を示し、図中（１）はＰ
ＷＭを、（２）はＣ０ｎＡを、（３）はＬＰＳを、（４
）はＰＨＡ−Ｐをそれぞれ示す。

該図より、ＬＰＳを除く他の３種のマイトジェンを用い
た時、ＰＢＬからのＩ　Ｌ−２の産生量には、程度の差
はあるが、添加したマイトジェンの濃度に依存してＩＬ
−２産生量が増加していることが判る。

また設定した濃度においては、マイトジェンとしてＰＷ
Ｍ＞Ｃ０ｎＡ＞ＰＨＡ−Ｐの順で、ＰＢＬのＩＬ−２産
生を増強することが認められた。

■　ＰＷＭの濃度によるＩＬ−２産生量の変化上記■に
より、マイトジェンの中でもＰＷＭ刺激によるＰＢＬの
Ｉ　Ｌ−２産生能が最も良かったため、ＰＷＭの濃度変
化による経時的なＰＢＬのＩ　Ｌ−２の産生について検
討した。

即ち、参考例４と同様の方法で、最終濃度が５．５×１
０５個／　ｘｌとなるようにＰＢＬを調製し、これに最
終濃度がＯから０．００５．０．０５．０，５．５及び
５０μｇ／ｘｉという濃度となるようにＰＷＭをそれぞ
れ培養液に添加して培養した。その培養上清を経時的に
４８時間に亘ってサンプリングして、その中に含まれて
いるＩＬ−２の量を本発明ＥＬ　Ｉ　ＳＡ系の測定法に
て測定した。

その結果を第９図に示す。

図において縦軸はＩＬ−２濃度（ｐｇ、／ｚ／）を、横
軸は培養時間（ｈｒ）を示し、図中（１）はＰＷＭ無添
加の場合を、（２）はＰＷＭの０．００５μｇ　／　ｙ
ｌ添加の場合を、（３）はＰＷＭの０．０５μｇ　／　
ｙｌ添加の場合を、（４）はＰＷＭの０．５μｇ　／　
ｚｌ！添加の場合を、（５）はＰＷＭの５μｇ　／　ｙ
ｌ添加の場合を、（６）はＰＷＭの５０μｇ／ｙｌ添加
の場合をそれぞれ示す。

該図より、ＰＢＬは培養液に添加されたＰＷＭに対して
濃度依存的且つ経時的にＩＬ−２の産生量を増加させる
ことが判る。

以上の結果より、本発明ＥＬ　Ｉ　ＳＡ系の測定方法は
、ヒトｒ　Ｌ−２を測定するための感度、特異性及び再
現性とも良好であり、大量の検体の測定も容易で、非常
に実用的な測定系であることが明らかである。また、本
発明の測定法は、ＰＢＬ培養上清等の生体試料中のヒ）
ＩＬ−２を簡便に定量でき、これまでのバイオアッセイ
系にない特徴を持つ測定法であるといえる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐＨｌＧ５−３とプラスミドｐＡ
Ｔ１５３とからプラスミドｐＡＴｍＴＬ＝２−１及びプ
ラスミドｐＡＴｍ　Ｉ　Ｌ−２−２を構築する工程及び
得られる各プラスミドの特徴を示す概略図である。 第２図はプラスミドｐＡＴｍ　ｒ　Ｌ−２−２とプラス
ミドｐＴＭ１とからプラスミドｐｔｒｐＩＬ−２Ｄ２−
１１を構築する工程及び得られるプラスミドの特徴を示
す概略図である。 第３図は実施例１で得た本発明のヒ）　Ｉ　Ｌ−２とア
スカリス抽出蛋白との融合蛋白を含む免疫抗原のウェス
タンプロット法による分析図である。 第４図は実施例３の■に従い求められた本発明モノクロ
ーナル抗体の希釈反応曲線である。 第５図は実施例４に記載の本発明３ステップサンドイッ
チ法に従ってヒトＩ　Ｌ−２を測定する際のＥＬ　Ｉ　
ＳＡ系の標準曲線の一例である。 第６図は実施例５に従い本発明ヒトＩ　Ｌ−２モノクロ
一ナル抗体の反応特異性を調べたグラフである。 第７図は実施例６−■に従う希釈試験の結果を示すグラ
フである。 第８図は実施例７−■に従う本発明方法により、各種マ
イトジェン刺激による培養ＰＢＬ細胞のＩＬ−２産生量
の変動を求めたグラフである。 第９図は実施例７−■に従う本発明方法により、ＰＷＭ
の濃度変化による培養ＰＢＬ細胞のＩＬ−２産生量の経
時的変化を求めたグラフである。 （以　上） 第５図 ＩＬ−２：Ｊ１度　（ｐｇ／ｍｌ） 第６図 ＴＬ−２ｉｔ度（ｐｇ／ｍｌ） 第７図 １１　鴫ジ（イ若孝 第８図 マイトジ　ン、、、オ〕尺侘匪絆 工

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトＩＬ−２活性を有するポリペプチドとアスカ
   リス抽出蛋白との結合蛋白を含有することを特徴とする
   ヒト抗ＩＬ−２抗体製造のための免疫抗原。
2. （２）請求項１に記載の免疫抗原を用いて得られ、ヒト
   ＩＬ−２に特異反応性を有することを特徴とする抗ヒト
   ＩＬ−２モノクローナル抗体。
3. （３）酵素免疫測定法において、請求項２に記載のモノ
   クローナル抗体を固相化した第１抗体と、抗ヒトＩＬ−
   ２ポリクローナル抗体である第２抗体とを用い、標識抗
   体と上記第２抗体とを反応させる３ステップサンドイッ
   チ法を採用することを特徴とするヒトＩＬ−２の測定法
   。