DD230876A1 - Verfahren zur gewinnung monoklonaler antikoerper gegen human-mif - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung eines monoklonalen Antikoerpers mit spezifischer anti-Human-MIF-Aktivitaet. Die Erfindung ist zur Anwendung in der biologischen und humanmedizinischen Grundlagenforschung, zur Diagnose von Immunkrankheiten und zur Anwendung in der Immunpraeparate herstellenden pharmazeutischen Industrie geeignet. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung monoklonaler Antikoerper gegen das Human-Cytokin MIF. Die Aufgabe, ein hinreichend einfaches und zuverlaessig handhabbares Verfahren zur Gewinnung von monoklonalen Antikoerpern gegen Human-MIF, anzugeben, wurde geloest, indem zunaechst Human-MIF aus Ovarialcarcinom isoliert und an a-L-Fucose-Sepharose 4B gekuppelt wurde. Das traegerfixierte MIF-Material diente zur Immunisierung von Maeusen, deren immune Milzzellen mit Myelomzellen der Linie P3-X63-Ag8.653 nach der bekannten Hybridomtechnik fusioniert wurden. Von den erhaltenen Hybridomen wurden nach Ermittlung der spezifischen Antikoerperproduktion schliesslich stabile monoklonale Hybridzellinien selektioniert.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern gegen Human-MIF ist von beträchtlicher Bedeutung sowohl für die Cytokin-Analytik als auch für die Diagnose von Immunkrankheiten des Menschen. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt also in der humanmedizinischen Forschung und nachgelagert in der Immuntherapie sowie in der Immunpräparate herstellenden pharmazeutischen Industrie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Der Makrophagen-wanderungshemmende Faktor (MIF-Macrophage migration inhibitory factor) beeinflußt die Wanderung von Makrophagen. Er spielt in der zellulären Immunantwort des tierischen und menschlichen Organismus eine Rolle, z. B. wurde er bei Tumorabwehrreaktionen des Wirts, bei Autoimmunerkrankungen und bei allergischen Reaktionen vom verzögerten Typ nachgewiesen.

Der Makrophagen-wanderungshemmende Faktor konnte z. B. in Kulturüberständen sensibilisierter Lymphozyten (David, J. R., Proc. natn. Acad. Sei, USA, 56,72,1966; Preece, A.W.: Clin. exp. Immun. 18,543,1974; W.Zschiesche et al.: Agents and Actions 8,515,1978), im Mäuseserum nach Tiloroninduktion (Mayer, G. D. et. al.: Science 169,1215,1970; W.Zschiesche et. al.: Agents and Actions 8,515,1978) und im Aszites tumortragender Ratten bestimmt werden (Fahlbusch, B. et. al.: Actabiol. med.germ.40, 785,1981; W.Zschiesche et. al.: Acta virol. 24,37,1980).

Bei allen oben genannten immunologischen Abwehrreaktionen werden neben dem MIF hoch weitere Cytokine gebildet, die ebenfalls auf Makrophagen einwirken. Mit herkömmlichen biochemischen Methoden konnte eine Trennung der Faktoren voneinander jedoch nicht erreicht werden. Bekannt sind Versuche, mit Hilfe von polyvalenten Anti-Lymphokinantikörpern über eine Antikörperbindungsreaktion in vitro eine Trennung der einzelnen Faktoren durchzuführen.

So wurden von Onazaki, K. et. al. (Cell. Immun. 55,465,1980) Antikörper gegen Meerschweinchen-MIF und von Block, L H. et. al.

(J. exp. Med. 147,541,1978) und von Brandt, E. (Patent EP 0020090) gegen Human-MIF gewonnen.

Auf diese Weise wu rden polyvalente Antikörper gegen MIF erhalten. Diese sind mit dem Nachteil behaftet, daß sie zusätzlich zur Reaktion mit MIF auch mit anderen Faktoren kreuzreagieren.

Bekannt ist weiterhin die sogenannte Hybridomtechnik (Köhler, G. et. al.: Nature, 256,495,1975; Eur. J. Immunol. 6,511,1976; Milstein, C. et. al.: Nature 266,550,1977), mit der es erstmals möglich war, monoklonale Antikörper gegen zelluläre und Proteinantigene, (Luben, R. A. et. al., J. Clin. Invest. 64,337,1979), so z. B. gegen den osteoklastaktivierenden Faktor, der wie MIF ein schwaches Antigen ist, herzustellen, d. h. Antikörper, die nur gegen eine Antigendeterminante gerichtet sind.

Hingegen ist die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen MIF über die Bildung von Hybridomen bisher nicht bekannt.

Bekannt ist außerdem, daß MIF am Makrophagen über einen fukosehaltigen Rezeptor gebunden wird. (Remold, H.H.: J. exp.

Med. 138,1065,1973). Schließlich ist auch beschrieben, daß das Cytokin MIF über eine a-L-Fucose-Sepharose-Säule affinitätschromatografisch angereichert werden kann.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung bezweckt, monoklonale Antikörper gegen das Human-Cytokin MIF bereitzustellen. Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein hinreichend einfaches und zuverlässig handhabbares Verfahren zur Gewinnung von monoklonalen Antikörpern, die gegen das Human-Cytokin MIF wirksam sind, anzugeben.

Erfindungsgemäß wurde diese Aufgabe gelöst, indem zunächst aus tumorbedingten Hurnan-Aszites, vorzugsweise aus Human-Ovarialkarzinom-Aszites, ein Makrophagen-wanderungshemmender Faktor (MIF) durch a-L-Fukose-Sepharose 4B affinitätschromatografisch angereichert wird, wobei zum Nachweis der MIF-Aktivität der Agarosetropfen-Test nach B. Fahlbusch et. al. (Acta biol. med. germ. 38 (1979), eingesetzt wird.

Zur anschließenden Immunisierung von weiblichen Balb/c- oder AB/Jena-Mäusen (6 bis 12 Wochen, vorzugsweise 8 Wochen, alt) wird direkt die MIF-gekuppelte Sepharose verwendet. Die Antigen-Applikation wird über mehrfache intraperitoneale Verabreichung von 0,2ml MIF-Fucose-Sepharose-Suspension in PBS.durchgeführt. 3 bis 5 Tage nach der letzten Verabreichung wird aus den hyperimmunen Milzen der Mäuse eine Zellsuspension hergestellt. In der Proportion 10:1 werden immune

Milzzellen und Myelomzellen (P3-X63-Ag8.653), die als Zellinie zur Verfügung standen, vorzugsweise 10⁸ immune

Milzzellen und 10⁷ Myelomzellen zusammen in proteinfreiem Medium, vorzugsweise in Medium RPMI 1640 oder DMEM,

gewaschen, und das Zeil-Sediment wird zur Zellfusionierung verwendet.

Die Fusion wird nach der an sich bekannten Hybridomtechnik in der Modifikation von Galfre durchgeführt. Auf diese Weise entstehen unter anderem Verschmelzungsprodukte aus den antikörperproduzierenden Milzzellen und den Myelomzellen, Hybridome genannt, die die Antikörper-Synthese permanent beibehalten.

Die Hybridom-Zellüberstände werden 3 bis 5 Wochen nach der Fusion auf Antikörperproduktion getestet, und zwar durch einen unspezifischen RIA und einen anschließenden Antigen-spezifischen RIA.

Von durch diese Tests ausgewählten Hybridomen mit hinreichend starker MIF-Antikörperproduktion werden durch mehrfache Einzelzell-Klonierungen sodann stabile monoklonale Hybridzellinien selektioniert.

Auf diese Weise ist insbesondere die stabile, mehrfach klonierte Hybridomlinie 29/24 B11 erhalten worden, die den erfindungsgemäßen neuen Antikörper, den monoklonalen MIF-Antikörper, permanent in einer Menge > 200ng/ml in der

Zellkultur synthetisiert. ___ '

Die weitere Aufarbeitung des neuen MIF-Antikörpers erfolgt auf an sich bekannte Weise entweder aus den Kulturüberständen der stabilen monoklonalen Hybridzellinien oder aus der Aszitesflüssigkeit von Mäusen, denen Hybridomeder mehrfach klonierten monoklonalen Zellinien, vorzugsweise der Hybridomlinie 29/24 B11, inokuliert worden sind, durch Fällung, vorzugsweise durch Fällung mit 50%igem Ammmoniumsulfat.

Erfolgt die Aufarbeitung aus dem Aszites von Hybridom-tragenden Mäusen, so sind hier weibliche thymuslose AB/Jena-Mäuse (nu/nu) dann einzusetzen, wenn für die voranstehende Milzzellpräparation weibliche AB/Jena-Mäuse herangezogen worden

Ergänzend zu den genannten Radioimmuntests ist der erhaltene monoklonale Antikörper mit Hilfe eines affinitätschromatografischen Verfahrens auf seine anti-MIF-Aktivität prüfbar, indem der Antikörper an BrCN-Sepharose 4B gekuppelt und anschließend das Antigen MIF über die Säule geschickt wird. Der Antikörper bindet das MIF-Antigen. Durch Zugabe von 0,1 M Essigsäure ist das Antigen wieder ablösbar und seine biologische Aktivität im Migrationshemmtest (Agarosetropfentest) nachweisbar.

(Siehe Anlage).

Der verfahrensgemäß hergestellte monoklonale Antikörper gegen Anlage zu Seite 4 der Erfindungsbeschreibung Es wurde weiterhin der Nachweis geführt, daß der anti-MIF-Effekt der Hybridomlinie 29/24B11 tatsächlich auf ein synthetisiertes Immunglobulin zurückzuführen ist. Dazu wurde die Hybridomlinie 29/24B11 für 24 Stunden in Gegenwart von 5 bis lO/^Ci/ml L-¹⁴C-Leucin (spezifische Aktivität 240mCi/mM) in serumfreiem Medium (ohne Leucin) inkubiert. Der daraus resultierende Hybridomüberstand wurde mittels Polyacrylamid-SDS-EIektrophorese unter reduzierenden Bedingungen untersucht. Es waren 2 radioaktive Peaks nachweisbar. Der erste mit einem Molekulargewicht von 28000 entspricht der leichten Kette und der zweite mit einem Molekulargewicht von 60000 entspricht der schweren Kette eines biosynthetisch markierten γ-Globulins (vergleiche

Abbildung 3). _

Abb.3

2,0-

Ov alb umi η

Myoglobin Cytochrom C

ι ι	I I	6	1 I	gel	10 cm
2	k		8		length

Human-MIF ist einsetzbar sowohl als Reagenz in der Cytokin-Analytik (Nachweis und Gewinnung von MIF aus biologischen Flüssigkeiten, Abtrennung des MIF von anderen Cytokinen) als auch als Diagnostikum von Immunkrankheiten des Menschen. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung besitzt die Vorteile,

— monoklonale Antikörper gegen das schwache Antigen Human-MIF bereitzustellen,

— einen monoklonalen Antikörper zu liefern, der spezifisch nur mit MIF reagiert (keine Kreuzreaktion mit anderen Cytokinen),

— einen MIF-Antikörper in unbegrenzter Menge und einheitlicher Qualität zur Verfügung zu stellen.

\ — 3 — OW/ t I

Ausführungsbeispiel

1. Antigenpräparation

Ein Makrophagen-wanderungshemmender Faktor wurde aus dem Aszites einer Ovarialcarzinompatientin (Stadium IV der Krankheit, unbehandelt); in folgender Weise angereichert: 1 ml zellfreier Aszites (=0C5) wird auf eine a-L-Fukose-Sepharose 4B-Säule(10cm χ 0,5cm) aufgetragen.

Das erste Eluat (nichtgebundener Anteil) weist keine MIF-Aktivität mehr auf. (Abb. 1) Diese kann nach Eluierung mitO,5M a-L-Fukose wieder von der Säule abgelöst werden.

Die MIF-Aktivität wurde mit dem Agarosetropfentest nach Fahlbusch, B. et. al. (Acta. biol. med. germ. 38,1453,1979) nachgewiesen.

Um die Antigenität des Faktors zu erhöhen, wurde unmittelbar die MIF-gebundene Sepharose zur intraperitionealen Applikation von Mäusen verwendet.

2. Immunisierung und Zelifusion

a) Milzzellpräparation für die Fusionierung

8 Wochen alte weibliche AB/Jena-Mäuse (institutseigene SPF-Zucht) erhielten an den Tagen 0,7,14,21 und 63 je 0,2 ml Suspension von MIF-Fucose-Sepharose(£500E MIF, d.h. bis zu einer Verdünnung von 1:500 ist eine signifikante Wanderungshemmung noch nachweisbar) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) intraperitoneal. 4 Tage nach der letzten Injektion wurden die Milzen entnommen und eine Milzzellsuspension hergestellt. Die Milzzellen wurden in proteinfreiem Medium (RPMI 1640 mit 2OmM HEPES-Puffer, pH 7,2) gewaschen.

b) Bereitstellung von Myelomzeilen für die Fusionierung

Für die Fusionierung wurde die permanent in vitro wachsende Balb/c P3-X63-Ag8.653 Myelomzellinie, die von der MOPC-21 Linie abstammt und an Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase (HPRT E.2.2.4.2.8) defizient ist, eingesetzt.

Die Myelomzellinie ist ferner dadurch charakterisiert, daß sie keine eigene Immunglobulinsynthese mehr besitzt und ihr Wachstum durch Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-Selektivmedium (HAT-Medium) gehemmt wird. Die Zellen werden in RPM11640 Kulturmedium, das 10%foetales Kälberserum (FKS) enthält, kultiviert.

Vor der Zellfusion wurden die Myelomzeilen einmal in serumfreiem Medium gewaschen.

c) Zellfusionierung

10⁸ Milzzellen wurden mit 10⁷ Myelomzeilen in Gegenwart von 50%Polyäthylenglykol (PEG) 1550 fusioniert, wie von GaIf re, G. et. al., Nature 266,550,1977, beschrieben.

Durch HAT-Selektion nach Littlefield, J. W., Science 145,709,1964, wurden Hybridome gewonnen, deren Zellkulturüberstände3 bis 5 Wochen nach der Zellfusion auf Antikörperproduktion getestet wurden.

d) Nachweismethoden der Antikörperproduktion

Mit einem unspezifischen Radioimmuntest (RIA) wurde die Immunglobulinsynthese erfaßt, und die Klone mit einer Synthese-Leistung von mehr als 20 ng/ml wurden auf anti-MIF-Antikörperproduktion geprüft. Dazu dienten folgende Teste:

a) spezifische RIA

MIF-beschichtete PVC-Folien wuden mit Hybridomüberständen inkubiert. Das gebundene Mäuse-gammaglobulin (antigenspezifisch) wurde mit Hilfe von ¹²⁵J-markiertem anti-Mäuse-gammaglobulin nachgewiesen.

b) spezifischer Nachweis von anti-MIF-Aktivität im biologischen Test

Zur Anreicherung von Gammaglobulin aus Hybridomüberständen wurden diese an anti-Mäuse-gammaglobulin beschichtete Folien gekuppelt. Danach wurde angereichertes MIF-Material zugegeben.

Bei Anwesenheit eines anti-MIF-Antikörpers wird die MIF-Aktivität völlig oder teilweise neutralisiert, wie im Agarosetropfentest nachgewiesen wurde. Bei negativen Proben behält die MIF-Probe ihre volle Aktivität. Auf diese Weise wurden anti-MIF-produzierende Klone mit einer Syntheseleistung von mehr als 200 ng/ml selektioniert.

Nach dieser Ermittlung von anti-MIF-synthetisierenden Hybridomen wurden durch mehrfache Subklonierungen monoklonale Hybridzellinien isoliert.

Aus dem so durchgeführten Fusionsexperiment wurden einige anti-MIF-produzierende Hybridzellinien, darunter Klon 29/24B11 und Abkömmlinge, erhalten.

Die stabile, mehrfach klonierte Hybridomlinie 29/24B11 synthetisiert den Antikörper permanent in der Zellkultur. Sie vermehrt sich auch in nackten thymuslosen (nu/nu) Mäusen. Der Antikörper konnte nach 3 bis 5 Wochen aus dem Serum oder der Aszitesflüssigkeit gewonnen werden.

Der monoklonale Antikörper wurde zusätzlich auf folgende Weise auf seine anti-MIF-Aktivität geprüft: Der aus Kulturflüssigkeit, Aszites bzw. Serum tumortragender Mäuse isolierte monoklonale Antikörper sowie entsprechende Kontrollen (Kulturüberstand der Myelomzellinie bzw. Kontrollaszites tumorfreier Mäuse) wurden an BrCN-Sepharose4B gekuppelt.

Die gekuppelten Gele wurden in kleine Säulen (10cm χ 0,5cm) gefüllt und mit PBS bzw. Glycin/HCI-Puffer, pH 2,8, im Wechsel gewaschen. Anschließend wurden je 1 ml zellfreier Aszites einer Ovarialcarcinompatientin (OC5) auf die Säule aufgetragen und mit PBS, pH7,2, solange gewaschen bis die Extinktion bei 280 nm null beträgt. Das erste Eluat (nichtgebundener Anteil) wird in Verdünnungen von 1:20,1:40 und 1:80 im MIF-Agarosetropfentest eingesetzt.

Das gebundene Antigen (MIF) wird mit 0,1 M Essigsäure durch Spülen der Säule abgelöst (2. Eluat). Dieses Eluat wurde gegen PBS dialysiert und bei einer Verdünnung von 1:40 ebenfalls im biologischen MIF-Test untersucht. (Abb. 2). Legende zu den Abbildungen 1 und 2 ' ·'

Abb. 1 Affinitätschromatografie von 1 ml Ovarialtumoraszites an -L-Fucose-Sepharose 6B Waschen der Säule mit PBS, pH 7,4 (Fraktion I und II) und Elution mitO,5M -L-Fucose in PBS, pH7,4 (Fraktion III).

a) 1:10 b) 1:50 c) 1:100 d) 1:200 e) 1:400 f) 1:800 Abb. 2 Nachweis der Bindung von MIF durch einen monoklonalen Antikörper aus Aszites (A) oder durch Immunglobulin aus Kontrollaszites (B), die an BrCN-Sepharose 4B gekuppelt wurden.

C = Wanderungshemmwert des aufgetragenen MIF-Materials.

Claims (2)

1. - I — ViVI *♦ I

   Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Gewinnung monoklonaler Antikörper gegen Human-MIF mit Hilfe der Hybridomtechnik, gekennzeichnet dadurch, daß Cytokin MIF, gewonnen aus tumorbedingtem Human-Aszites, durch an sich bekannte a-L-Fukose-Sepharose 4B-Affinitätschromatografie angereichert wird, so gewonnenes Träger- gebundenes MIF-M ate rial zur Immunisierung von 6 bis 12 Wochen alten weiblichen Balb/c-oder AB/Jena-Mäusen eingesetzt wird, die hyperimmunen Milzzellen im Verhältnis 10:1 mit Myelomzellen der Linie P3-X63-Ag8.653 fusioniert werden, aus den erhaltenen Hybridomen mittels anschließender mehrfacher Einzelzell-Klonierungen stabile monoklonale Hybridzellinien mit einer MIF-Antikörper-Produktion > 200ng/ml selektioniert werden und der gebildete Antikörper gegebenenfalls entweder aus den Kulturüberständen oder aus der Aszitesflüssigkeit Hybridom-tragender Mäuse durch Fällung nach üblichen Methoden gewonnen wird.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß 8 Wochen alt AB/Jena-Mäuse immunisiert werden, 10⁸ immune Milzzellen mit 10⁷ Myelomzellen fusioniert werden, zur Erzeugung des MIF-Antikörpers in vivo thymuslose weibliche AB/ Jena-Mäuse (nu/nu) eingesetzt werden und die Fällung des Antikörpers mit Ammoniumsulfat (50%) durchgeführt wird.

   Hierzu 2 Seiten Abbildungen